Summary
CRISPR-assosiert protein Cpf1 kan styres av et spesialdesignet CRISPR-RNA (crRNA) for å spalte dobbeltstrenget DNA på ønskede steder, og genererer klissete ender. Basert på denne egenskapen ble en DNA-monteringsstandard (C-Brick) etablert, og en protokoll som beskriver bruken av denne er beskrevet her.
Abstract
CRISPR-assosiert protein Cpf1 spalter dobbeltstrenget DNA under veiledning av CRISPR RNA (crRNA), hvilket gir klebrig endene. På grunn av denne egenskapen har Cpf1 blitt brukt til etablering av en DNA-monteringsstandard kalt C-Brick, som har fordelen av lange anerkjennelsessteder og korte arr. På en standard C-Brick-vektor er det fire Cpf1-anerkjennelsessteder - prefikset (T1 og T2-områder) og suffikset (T3 og T4-områder) - flankerende biologiske DNA-deler. Spaltningen av T2- og T3-områder produserer komplementære klistrede ender, noe som tillater montering av DNA-deler med T2- og T3-steder. Samtidig genereres en kort "GGATCC" arr mellom deler etter montering. Siden det nylig dannede plasmidet igjen inneholder de fire Cpfl-spaltningssteder, tillater metoden den iterative samling av DNA-deler, som ligner de av BioBrick og BglBrick-standarder. En prosedyre som beskriver bruk av C-Brick-standarden for å montere DNA-delerEr beskrevet her. C-Brick-standarden kan brukes mye av forskere, kandidater og studenter, og til og med amatører.
Introduction
Standardiseringen av DNA-biologiske deler er viktig for utviklingen av syntetisk biologi 1 . Utviklingen av en DNA-forsamlingsprosedyre kan erstatte ad hoc- eksperimentelle design og fjerne mange av de uventede utfallene som oppstår under samlingen av genetiske komponenter i større systemer. BioBrick-standarden (BBF RFC 10) var en av de tidligste foreslåtte DNA-monteringsstandardene. Den bruker prefikssekvensen (inneholder EcoRI- og XbaI-kuttsteder) og suffiksekvensen (inneholdende SpeI- og PstI-kuttsteder) 2 , 3 . Fordi XbaI og SpeI har komplementære kohesive ender, kan BioBrick DNA-deler som er kuttet med XbaI og SpeI, slås sammen, og genererer en ny BioBrick for videre iterativ montering.
Noen feil har blitt identifisert ved bruk av BioBrick standard 4 . For eksempel produserer den en 8-bp arrMellom DNA-delene, som ikke tillater konstruksjon av in-fusjonsproteiner. Dessuten må de fire ovennevnte typene av 6-bp restriksjonsseter fjernes fra DNA-delene, hvilket er svært ubeleilig. BglBrick-standarden ble etablert for å løse det første problemet 5 . Det skaper en 6-bp "GGATCT" arr, som produserer Gly-Ser og tillater sammensmelting av flere proteiner eller protein domener. IBrick ble utviklet for å håndtere det andre problemet 6 . Den bruker homing endonucleases (HEs) som gjenkjenner lange DNA-sekvenser. Siden HE-anerkjennelsessidene sjelden eksisterer i naturlige DNA-sekvenser, kan iBrick-standarden brukes til direkte konstruksjon av iBrick-deler uten å modifisere deres DNA-sekvenser. Imidlertid etterlater iBrick-standarden en 21 bp arr mellom DNA-delene, noe som kan være årsaken til dens upopularitet.
I de siste årene har de klyngede regelmessig interspaced korte palindromiske gjentakelser (CRISPR) systemet har utviklet seg raskt 7 , 8 . Blant de CRISPR-assosierte (Cas) -proteinene, er Cas9 endonuklease fra Streptococcus pyogenes nå mye brukt. Det introduserer for det meste dobbeltstrengede DNA-pauser (DSB) med stumpe ender 9 .
I 2015 preget Zhang og kollegaer Cpf1 (CRISPR fra Prevotella og Francisella 1) for første gang. Det tilhører klasse 2 type V CRISPR-Cas-systemet og er en CRISRP RNA (crRNA) -guided endonuclease 10 . I motsetning til Cas9 introduserer Cpf1 en DSB med en 4 eller 5 nt 5 'overheng 10 . Basert på denne egenskapen ble Cpf1 brukt til å utvikle en DNA-monteringsstandard, C-Brick 4 . På en C-Brick-standardvektor flipper fire Cpf1-målsteder av prefikset T1 / T2 og suffiks T3 / T4 de biologiske delene; Dette ligner BioBrick-standarden. Som spaltning av T2 og T3 sider pDanner komplementære klissete ender, er det mulig å utføre den iterative samlingen av DNA-deler samtidig som det oppnås et "GGATCC" arr mellom delene. Spesielt har C-Brick-standarden to hovedfordeler: å gjenkjenne lange målsekvenser og forlate korte arr. Den 6 bp "GGATCC" arr utviklet av C-Brick koder for Gly-Ser, som muliggjør bygging av fusjonsproteiner. Videre er C-Brick-standarden også delvis kompatibel med BglBrick og BioBrick-standardene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling av crRNA
- Fremstilling av crRNA-maler
- Resuspender individuelle oligonukleotider ( Tabell 1 ) i RNase-fri vann til en konsentrasjon på 10 uM.
- Tilsett 22,5 μL toppstrengoligonukleotid (T7-F i tabell 1 ), 22,5 μl bunnstrengoligonukleotid ( Tabell 1 ) og 5 μl 10x annealeringsbuffer til et 0,2 ml PCR-rør. Kontroller at totalvolumet er 50 μL.
MERK: Seks forskjellige bunnstreng-oligonukleotider er vist i tabell 1 , som hver av dem skal være individuelt parret med toppstrengen T7-F. De små bokstaver i tabell 1 representerer sekvensen som skal transkriberes i styresekvensen av crRNA. 10x Taq PCR buffer kan brukes i stedet for 10x annealing buffer. - Sett PCR-røret inn i en termocykler.
- Kjør annealing programmet: initial denaturering ved 95 ° C for5 min og deretter en nedkjøling fra 95-20 ° C, med en 1 ° C reduksjon per minutt på termocykleren.
MERK: Bruk øyeblikkelig prøvene for trinn 1.2.1.
- Transkripsjon og rensing av crRNA
- Tilsett 38 μL RNase-fri vann, 8 μl av malen fra trinn 1.1.4, 20 μl 5x T7 transkripsjonsbuffer, 20 μl NTP-blanding (10 μM), 4 μl rekombinant RNase-inhibitor (RRI) og 10 Μl T7 RNA-polymerase til et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Kontroller at totalvolumet er 100 μL.
- Sett mikrocentrifugerøret i et 37 ° C vannbad over natten (i ca. 16 timer).
- Bruk et RNA opprydding og konsentrasjonssett for å rense det transkriberte RNA; Følg produsentens protokoll.
- Kvantifiser RNAene med UV-Vis-spektrofotometre og fortynn RNA til en konsentrasjon på 10 μM. Bruk prøvene umiddelbart eller lagre dem ved -80 ° C.
MERK: CrRNA-sekvensenS er oppført i tabell 2 .
2. Bygging av C-Brick Parts ( dvs. innsetting av biologiske deler i en C-Brick Standard Vector)
MERK: Dette trinnet har tre delstrinn. For korte biologiske deler ( f.eks. Promotorer og terminatorer), er det best å bruke den direkte PCR-metoden for å sette de biologiske delene inn i en C-Brick standardvektor 4 . Hele vektorsekvensen er vist i tilleggsdata, og prefiks- og suffiksekvensen er vist i figur 1 (trinn 2.1 nedenfor). For biologiske deler som lett kan oppnås via PCR ( f.eks. Med templates av genomisk DNA, plasmider eller de novo syntetiserte DNA-sekvenser), er det best å bruke den sømløse samlefremgangsmåten for å sette de biologiske delene inn i en C-Brick standardvektor (Trinn 2.2 nedenfor). For de delene som er oppnådd fra BioBrick og BglBrick standarder, begrensningEnzymmediert fordøyelse og T4 DNA ligase-mediert ligering kan brukes til å sette de biologiske delene inn i en C-Brick standardvektor (trinn 2.3 nedenfor).
- Konstruksjon via direkte PCR-amplifikasjon
- Design og orden oligonukleotider for PCR amplifisering.
MERK: 5'-enden av oligonukleotidet inneholder sekvensen av DNA-delen og 3'-enden av oligonukleotidet inneholder vektorsekvensen ( dvs. "GGATCCACTAGTCTCTAGCTCG" ved 3'-enden av fremoverstrengen og "GGATCCTTTCTCCTCTTTCTAG" I omvendt streng). Ingen avhengighet eller en overgang på 20-bp kan utformes ved 5'-enden av oligonukleotidet. Spesifikke eksempler finnes i en tidligere studie 4 . - Resuspender individuelle oligonukleotider i ultra rent vann til en konsentrasjon på 10 μM.
- Sett opp PCR-reaksjoner på is i et 0,2 mL PCR-rør: Tilsett 18 μL ultra-rent vann, 25 μl 2 x PCR-buffer, 1 μl dNTPs (10 μM), 2,5 μl hver av de fremre og bakre primere (10 μM) fra trinn 2.1.2, 0,5 μl C-Brick standardvektor (50 ng) som en mal og 0,5 μl Av høyfidelitets DNA-polymerase. Kontroller at totalvolumet er 50 μL.
- Plasser røret direkte i en termocykler og start termocyklerprogrammet. Bruk prøvene umiddelbart eller frys og lagre dem ved -20 ° C.
- Thermocycler program: en syklus i 3 minutter ved 98 ° C; Tretti sykluser i 10 s ved 98 ° C, 20 s ved 55 ° C og 2 minutter ved 72 ° C; Og en syklus i 10 minutter ved 72 ° C. Hold prøven ved 16 ° C.
- Tilsett 9 μl av blandingen fra trinn 2.1.4 til et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Tilsett 1 μl Dpnl og inkuber i 1 time i et 37 ° C vannbad.
MERK: Hvis primrene ikke har noen overlappende sekvenser, tilsatt 0,5 μl T4 polynukleotidkinase (PNK) og 0,5 μl T4 DNA ligase og inkuber iEt 22 ° C vannbad i 1 time. Ellers, hvis primrene inneholder en ~ 20 nt overlappende sekvens, transformerer de DpnI-behandlede produktene direkte til E. coli (DH10B) -kompetente celler (trinn 2.4). Det lineære PCR-produktet vil bli sirkulærisert av rekombinationssystemet i verten. - Bruk prøvene umiddelbart eller oppbevar dem ved -20 ° C.
- Design og orden oligonukleotider for PCR amplifisering.
- Konstruksjon via sømløs montering
- Design og orden oligonukleotider for PCR amplifisering.
MERK: 3'-enden av oligonukleotidet inneholder den terminale sekvensen av DNA-delen, og 5'-enden av oligonukleotidet inneholder terminalen av den lineariserte C-Brick-standardvektor-sekvensen ( dvs. "CTAGAAAGAGGAGAAAGGATCC" for 5'- -end av fremoverstrengen og "CGAGCTAGAGACTAGTGGATCC" for 5'-enden av reversstrengen). Spesifikke eksempler finnes i en tidligere studie 4 . - Tilbakestill individetUal oligonukleotider i ultra rent vann til en konsentrasjon på 10 uM.
- Sett opp PCR-reaksjoner på is i et 0,2 mL PCR-rør: Tilsett 18 μL ultra rent vann, 25 μl 2 x PCR buffer, 1 μL dNTPs (10 μM), 2,5 μl hver av de fremre og bakre primere (10 μM ) Fra trinn 2.2.2, 0,5 μl mal (20-500 ng) og 0,5 μl høyfidelitets DNA-polymerase. Kontroller at totalvolumet er 50 μL.
- Plasser røret direkte i termocykleren og kjør termocyklerprogrammet. Bruk prøvene umiddelbart eller frys og lagre dem ved -20 ° C.
MERK: Still termocyklerprogrammet til: en syklus i 3 minutter ved 98 ° C; 30 sykluser i 10 s ved 98 ° C, 20 s ved 55 ° C (i henhold til primerens annealingstemperatur) og 1 min (i henhold til lengden av de biologiske delene) ved 72 ° C; Og en syklus i 10 minutter ved 72 ° C. Hold prøven ved 16 ° C. - Rens PCR-produktet ved hjelp av en PCR-oppryddingTem kit; Følg produsentens protokoll.
- Fordel C-Brick-standardvektoren med BamHI: Tilsett 34 μL ultrahelt vann, 10 μl plasmid (1 μg), 5 μl 10x buffer og 1 μl BamHI til mikrocentrifugerøret. Inkuber i opptil 2 timer ved 37 ° C i et vannbad.
- Rens det ovennevnte produktet ved hjelp av et system for opprydding av gel Følg produsentens protokoll.
- Tilsett 2 μL lineærisert vektor (50 ng) fra trinn 2.2.7, 5 μl fragment (200 ng) fra trinn 2.2.4, 2 μl 5x sømløs monteringsbuffer og 1 μl sømløs monteringsenzym fra et sømløst forsamlingssett Til en 1,5 ml mikrocentrifugerør. Kontroller at totalvolumet er 10 μl.
- Plasser dette i et 37 ° C vannbad i 30 minutter. Bruk prøvene umiddelbart eller frys og lagre dem ved -20 ° C.
- Design og orden oligonukleotider for PCR amplifisering.
- Konstruksjon via restriksjonsenzym-mediert fordøyelse og T4 DNA ligase-mediert ligering.
MERK: For de delene som er oppnådd fra BioBrick (trinn 2.3.4-2.3.7) og BglBrick (trinn 2.3.1-2.3.3), kan restriksjonsenzym-mediert fordøyelse og T4 DNA ligase-mediert ligering brukes til å sette inn Biologiske deler i en C-Brick standardvektor.- Fordel BglBrick-standarddelene med BamHI og BglII: Tilsett 34 μL ultra rent vann, 10 μl plasmid (2 μg), 5 μl 10x buffer 3, 0,5 μl BamHI og 0,5 μl Bglll til mikrocentrifugerøret. Inkuber i 2 timer i et 37 ° C vannbad.
- Kjør en 1% agaroselelektroforese og rens fragmentet ved hjelp av et system for rensing av gel.
- Liger fragmentet og C-Brick standardvektoren: Tilsett 2 μL linearisert vektor (50 ng) fra trinn 2.1.12 og 6 μl fragment (200 ng) fra trinn 2.3.3 til et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Tilsett 1 μl 10 x T4 DNA ligase buffer og 1 μl T4 DNA ligase. Inkuber i 2 timer ved 22 ° C. Bruk prøvene umiddelbart eller frittE og lagre dem ved -20 ° C.
- Fordel BioBrick-standarddelene med XbaI og SpeI: Tilsett 34 μL ultra-rent vann, 10 μl plasmid (2 μg), 5 μl 10x buffer, 0,5 μl Xbal og 0,5 μL SpeI til mikrocentrifugerøret. Inkuber i 2 timer i et 37 ° C vannbad.
- Fordel C-Brick-standardvektoren med XbaI og SpeI: Tilsett 34 μL ultra rent vann, 10 μl plasmid (1 μg), 5 μl 10x buffer, 0,5 μl Xbal og 0,5 μL SpeI til mikrocentrifugerøret . Inkuber i 2 timer i et 37 ° C vannbad.
- Kjør en 1% agaroselelektroforese og rens fragmentet fra trinn 2.3.4 og den lineære vektoren fra trinn 2.3.5 med et gelopprydningssystemsett; Følger produsentens protokoll.
- Ligat fragmentet og C-Brick vektoren: Tilsett 2 μL linearisert vektor (50 ng) fra trinn 2.3.5 og 6 μl fragment (200 ng) fra trinn 2.3.4 til et 1,5 ml mikrocentrifugerør. annonseD 1 μl 10x T4 DNA ligase buffer og 1 μl T4 DNA ligase. Inkuber i 2 timer ved 22 ° C. Bruk prøvene umiddelbart eller frys og lagre dem ved -20 ° C.
- Tilsett 10 μL av produktene fra trinn 2.1.8, 2.2.9, 2.3.3 eller 2.3.7 for kjemisk transformasjon i de kompetente cellene i E. coli (DH10B).
- Pick-up flere kloner til et 5 ml flytende Luria-Bertani (LB) rør og inkuber ved 37 ° C på en shaker (220 rpm) over natten.
- Ekstraher plasmidet ved bruk av et plasmidpreparasjonssett; Følg produsentens protokoll.
- Identifiser de riktige klonene ved Sanger-sekvensering 11 .
3. C-Brick Assembly ( Figur 2 )
- Fordøyelse av C-Brick-vektoren med Cpf1
- Tilsett 22,5 μL RNase-fri vann, 4 μl 10x Cpf1 buffer, 10 μl av plasmidet fra trinn 2.6 (1 μg), 0,5 μl RRI og 1# 181; L av Cpf1 (5 uM) til et 1,5 ml mikrosentrifugerør.
MERK: Cpf1 kan kjøpes kommersielt eller renses etter protokollen i en tidligere studie 4 . - For å sette inn et fremmed DNA-fragment i T1- og T2-stedene, tilsett 1 μl crRNA-T2 (10 μM) og inkuber i et vannbad ved 37 ° C i 30 minutter. A dd 1 μl crRNA-T1 (10 μM) og Cpf1 (5 μM) i ytterligere 30 min.
MERK: Alternativt, for å sette inn et fremmed DNA-fragment i T3- og T4-stedene, tilsett 1 μl crRNA-T3 (10 μM) og inkuber i et vannbad ved 37 ° C i 30 minutter. Tilsett 1 μl crRNA-T4 (10 μM) i ytterligere 30 minutter. - Tilsett 1 μl av termosensitiv alkalisk fosfatase og inkuber røret i et 37 ° C vannbad i ytterligere 1 time.
- Kjør en agarosegelelektroforese og rens vektoren ved hjelp av et system for rensing av gel. Bruk prøvene umiddelbart eller frys og lagre dem ved -20 ° C.
Spaltning av DNA-fragmentet med Cpf1 - Tilsett 22,5 μL RNase-fri vann, 4 μl 10x Cpf1 buffer, 10 μl av plasmidet fra trinn 2.6 (1 μg), 0,5 μl RRI og 1# 181; L av Cpf1 (5 uM) til et 1,5 ml mikrosentrifugerør.
- Tilsett 21,5 μL RNase-fri vann, 4 μl 10x Cpf1 buffer, 10 μl plasmid fra trinn 2.6 (2 μg), 0,5 μl RRI og 2 μl Cpf1 (5 μM) til et 1,5 ml mikrosentrifugerør.
- For å sette inn et fremmed DNA-fragment i T1- og T2-stedene, tilsett 1 μl crRNA-T1 (10 μM) og 1 μl crRNA-T3 (10 μM) og inkuber i et vannbad ved 37 ° C i 2 timer.
MERK: Tilsett 1 μl crRNA-T2 (10 μM) og 1 μl crRNA-T4 (10 μM) og inkuber i et vannbad ved 37 ° C i 2 timer. - Kjør en agarosegelelektroforese og rens fragmentet ved hjelp av et system for rensing av gel. Bruk prøvene umiddelbart eller frys og lagre dem ved -20 ° C.
- C-Brick-montering og videre verifisering
- Ligere det fremmede DNA-fragmentet og C-Brick-vektoren: Tilsett 2 μL av den lineariserte vektoren (50 ng) fra trinn 3.1.4 og 6 μl av DNA-fragmentet (200 ng) fra trinn 3.2.3 til et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Tilsett 1 μl 10x T4 DNA ligase buffer og 1 μl T4 DNA ligase. Inkuber i 2 timer ved 22 ° C. Bruk prøvene umiddelbart eller frys og lagre dem ved -20 ° C.
- Tilsett 10 μl av ligasjonsproduktene (trinn 3.3.1) for kjemisk transformasjon i E. coli (DH10B) -kompetente celler.
- Tilsett flere kloner til et 5 ml flytende LB-rør og inkuber natten over på en rister ved 220 rpm og 37 ° C.
- Ekstraher plasmidet ved bruk av et plasmidpreparasjonssett; Følg produsentens protokoll.
- Identifiser korrekte kloner ved Sanger-sekvensering 11 .
- Utfør en ny runde med C-Brick-montering. Korrekte kloner fra trinn 3.3.4 kan brukes som en ny C-Brick-vektor eller DNA-del for videre iterativ C-Brick-montering, etter samme protokoll fra trinn 3.1-3.3.
MERK: T2 'og T3' sItes er utformet som backup av T2 og T3 nettsteder ( figur 1a ). For plasmider oppnådd fra trinn 2.3.7, kan bare T2 'og T3' brukes til C-Brick-standardmonteringen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen demonstrerte montering av tre kromoproteinkassetter (cjBlue (BBa_K592011), eforRed (BBa_K592012) og amilGFP (BBa_K592010)). Først klones de kodende sekvensene av de tre ovennevnte gener og terminatorer individuelt i en C-Brick-standardvektor. Korte DNA-deler, promotor og terminator ble introdusert i C-Brick-vektoren gjennom PCR-amplifisering ved anvendelse av primere som inneholdt de korte DNA-delene på 5'-terminalen. Dette ble fulgt av selv-ligeringsmetoden. Tre kromoprotein-kodende sekvenser ble først de novo syntetisert og deretter klonet inn i C-Brick standardvektoren gjennom sømløs samling. Primrene ble beskrevet i en tidligere studie 4 .
Etter det ble cjBlue, eforRed og amilGFP-sekvenser ligert med terminator- og promotorsekvenser i samme prosedyre som vist i"Xfig"> Figur 2. Korrekte konstruksjoner ble transformert til E. coli , og demonstrerte vakre farger ( figur 3a ). Deretter ble to fargeuttrykkskassetter samlet sammen med C-Brick-standarden for å skape flere farger ( dvs. den røde fargen fra amilGFP pluss eforRed, den grønne fargen fra amilGFP pluss cjBlue og den lyse lilla fargen fra eforRed pluss cjBlue; Figur 3b ).
Figur 1: C-Brick Standard Interface DNA Sequence og C-Brick Standard Vector. ( A ) Sekvensen av C-murstein standardgrensesnittet-T1, T2, T3, T4, T2 ', T3'-kan gjenkjennes av dets tilsvarende crRNA og deretter innføres i et 5'-overheng ved bruk av Cpf1. Spaltningen av T2 og T3 (eller T2 'og T3') -steder produserer komplementær overhenger. Med de åtte restriksjonene utformet, er C-Brick-standarden delvis kompatibel med BioBrick og BglBrick. ( B ) Plasmidkart for C-Brick-standardvektoren med restriksjonsfordøyelsessteder. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Arbeidsflyten for DNA-montering i C-Brick Standard. Cpf1-fordøyede T2- og T3-målsteder frembringer komplementære kohesive ender av henholdsvis "GGATC" og "GATCC", som kan ligeres for å generere et kort "GGATCC" arr. Detaljert prosedyrer finnes i trinn 3 i teksten ("C-Brick assembly"). Vennligst klikk her til Se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Fargerike bakteriepigmenter Produsert av E. coli Harbour Constructs Montert i C-Brick Standard. ( A ) Tre kromoproteiner ble uttrykt i E. coli vokst på en plate. Bakterier uten kromoproteiner (negativ kontroll) er vist på den 4. plate. ( B ) Tre kromoproteiner og tre sammenstillede doble kromoproteiner ble uttrykt i E. coli dyrket i flytende LB-medium. Fra 1 til 6 uttrykte konstruksjonene eforRed (1), amilGFP (2), cjBlue (3), amilGFP pluss eforRed (4), amilGFP pluss cjBlue (5) og eforRed pluss cjBlue (6). De fargerike bakteriene på en enkelt plate eller i et enkelt mikrocentrifugerør ble dyrket fra en enkelt sekvens-verifisert klon. Les / ftp_upload / 55775 / 55775fig3large.jpg "target =" _ blank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Navn | sekvens | ||
T7-F | GAAATTAATACGACTCACTATAGGG | ||
T7-T1-R | gaattcagtagaaagttgcgataaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC | ||
T7-T2'-R | ctagagtaaagcttgaattcagtaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC | ||
T7-T2-R | ggatcctttctcctctttctagagATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC | ||
T7-T3-R | ggatccactagtctctagctcgaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC | ||
T7-T3'-R | ctctagctcgagaaattcaaggaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC | ||
T7-T4-R | ttcaagggaaactgcagctagctATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC |
Tabell 1: Oligos for fremstilling av crRNA transkripsjonsmaler benyttet i denne studien. T7-F var toppstrengoligonukleotidet, og de andre var bunnstreng-oligonukleotidene. De små bokstaver i sekvensen blir transkribert i styresekvensen i crRNA.
navnene | RNA-sekvenser (5'-3 ') | ||
crRNA-T1 | GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUUAUCGCAACUUUCUACUGAAUUC | ||
crRNA-T2 | GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUCUCUAGAAAGAGGAGAAAGGAUCC | ||
crRNA-T3 | GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUCGAGCUAGAGACUAGUGGAUCC | ||
crRNA-T4 | GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUAGCUAGCUGCAGUUUCUCCUUGAA | ||
crRNA-T2' | GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUACUGAAUUCAAGCUUUACUCUAG | ||
crRNA-T3' | GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUCCUUGAAUUUCUCGAGCUAGAG |
Tabell 2: CrRNA-sekvensene som brukes i denne studien. CrRNAene ble fremstilt gjennom in vitro transkripsjonen i trinn 1 i teksten ("Fremstilling av crRNA").
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver en prosedyre for DNA-monteringsstandarden C-Brick. Det viktigste trinnet i denne protokollen er linearisering av C-Brick-standardvektoren; Ufullstendig spalting av vektoren kan på alvor påvirke suksessraten. I tillegg, selv om Cpf1 hovedsakelig spalter mål-DNA-sekvenser i "18-23" spaltningsmønsteret, ble også unøyaktig spaltning nær de to basene detektert 4 , noe som kan forårsake et lite antall mutasjoner etter DNA-montering. Derfor er Sanger-sekvensering nødvendig for å verifisere den samlede konstruksjonen.
Effektiviteten til C-Brick-samlingen er lavere enn tradisjonelle restriksjonsenzym- og ligeringsmetoder som er blitt beskrevet i en tidligere studie 4 . Den viktigste årsaken som påvirker samleeffektiviteten, kan være de unøyaktige spaltningsegenskapene til Cpf1. I fremtiden kan forbedringer av spaltningsnøyaktigheten være ekstremt nyttig for standarden aNd blir for tiden undersøkt.
C-Brick er også delvis kompatibel med BglBrick og BioBrick standarder. For eksempel kan BglBrick-deler kuttes med Bglll og BamHI og deretter settes inn i BamHI-stedet av en C-Brick-standardvektor, som genererer en C-Brick-del. Imidlertid bør innsetningsretningen til BglBrick-delen verifiseres, og det ville være et "GGATCT" arr etter montering. Når en C-Brick-DNA-del oppnås fra en BioBrick-del ( dvs. med XbaI og SpeI-fordøyelse), vil begge T2- og T3-stedene bli ødelagt, og to backup Cpf1-målsekvenser (T2 'og T3') kan brukes.
Siden Cpf1-spaltningen krever sgRNA, som er ekstremt følsom for RNase, bør alle materialer være RNase-fri. For tiden kan alle C-Brick standardvektorer, RNase-fri Cpf1-nukleaser og crRNAer bestilles kommersielt 12 . Derfor er prosedyrene for C-Brick faktisk like enkle som for BioBrick standard.
I de siste årene har flere nyttige DNA-samlingsmetoder blitt utviklet og brukt mye, inkludert Golden Gate Assembly 13 , Gibson Assembly 14 og andre 15 . Men da DNA-monteringsstandarder har potensial til å gi kostnadseffektiv, pålitelig, høy gjennomstrømning og automatiske samlingsreaksjoner 5 , kan standarder forenkle konstruksjon og testing av nyutviklede eller omformede gener, genetiske kretser og baner 15 , 16 , 17 , spesielt innen syntetisk biologi. Blant de nåværende publiserte DNA-monteringsstandardene har C-Brick-standarden både åpenbare fordeler og ulemper 4 ( dvs. ligeringseffektiviteten). Hvis ligasjonseffektiviteten er forbedret, kan standarden bli allment vedtatt i fremtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Shanghai Tolo Biotech for deres tekniske assistanse under utviklingen av C-Brick-standarden. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Det kinesiske vitenskapsakademiets strategiske prioritetsforskningsprogram (Grant No. XDB19040200).
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Comercial Oligonucleotide | Sangon Biotech | ||
10x Taq PCR Buffer | Transgen | #J40928 | |
Ultra Pure Distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | |
5x RNA Transcription Buffer | Thermo Scientific | K0441 | |
T7 RNA polymerase | Thermo Scientific | #EP0111 | |
NTP mixture | Sangon | #ND0056 | |
RRI (Recombinant RNase Inhibitor) | Takara | 2313A | |
RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | R1015 | |
UV-Vis Spectrometer | Thermo Scientific | Nano-Drop 2000c | |
2x Phanta Max Buffer | Vazyme | PB505 | PCR buffer |
dNTPs | Transgen | AD101 | |
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase | Vazyme | P505-d1 | |
Ezmax for One-step Cloning | Tolobio | 24303-1 | seamless assembly kit |
5x Buffer for Ezmax One-step Cloning | Tolobio | 32006 | |
BamHI | NEB | #R0136L | |
BamHI-HF | NEB | #R3136L | |
BglII | NEB | #R0144L | |
XbaI | NEB | #R0145L | |
SpeI | NEB | #R3133L | |
10x Buffer 3 | NEB | #B7003S | |
10x CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
10x T4 DNA ligase Buffer | Tolobio | 32002 | |
T4 PNK | Tolobio | 32206 | |
T4 DNA ligase | Tolobio | 32210 | |
DpnI | NEB | #R01762 | |
SV Gel and PCR clean-up system | Promega | A9282 | |
Plasmid Mini Kit I | Omega | D6943-02 | plasmid preparation kit |
thermosensitive alkaline phosphatase | Thermo Scientific | #EF0651 | FastAP |
10x Cpf1 buffer | Tolobio | 32008 | |
Cpf1 | Tolobio | 32105 | FnCpf1 |
thermocycler | Applied Biosystems | veriti 96 well | |
C-Brick standard vector | Tolobio | 98101 | |
E. coli [DH10B] | Invitrogen | 18297010 | |
Luria-Bertani media (tryptone) | Oxoid | LP0042 | |
Luria-Bertani media (yeast extract) | Oxoid | LP0021 | |
Luria-Bertani media (NaCl) | Sangon Biotech | B126BA0007 |
References
- Canton, B., Labno, A., Endy, D. Refinement and standardization of synthetic biological parts and devices. Nat Biotechnol. 26 (7), 787-793 (2008).
- Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. J Biol Eng. 2, (2008).
- Knight, T. Idempotent Vector Design for Standard Assembly of Biobricks. , MIT Artificial Intelligence Laboratory; MIT Synthetic Biology Working Group. 1-11 (2003).
- Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J. C-Brick: A New Standard for Assembly of Biological Parts Using Cpf1. ACS Synth Biol. 5 (12), 1383-1388 (2016).
- Anderson, J. C., et al. BglBricks: A flexible standard for biological part assembly. J Biol Eng. 4 (1), (2010).
- Liu, J. K., Chen, W. H., Ren, S. X., Zhao, G. P., Wang, J. iBrick: a new standard for iterative assembly of biological parts with homing endonucleases. PLoS One. 9 (10), e110852 (2014).
- Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
- Wright, A. V., Nunez, J. K., Doudna, J. A. Biology and Applications of CRISPR Systems: Harnessing Nature's Toolbox for Genome Engineering. Cell. 164 (1-2), 29-44 (2016).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Shanghai Tolo Biotechnology Company Limited. , Shanghai 200233, China. Available from: http://www.tolobio.com/ (2017).
- Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method. PLoS One. 3 (11), e3647 (2008).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Casini, A., Storch, M., Baldwin, G. S., Ellis, T. Bricks and blueprints: methods and standards for DNA assembly. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (9), 568-576 (2015).
- Cameron, D. E., Bashor, C. J., Collins, J. J. A brief history of synthetic biology. Nat Rev Microbiol. 12 (5), 381-390 (2014).
- Keasling, J. D. Synthetic biology for synthetic chemistry. ACS Chem Biol. 3 (1), 64-76 (2008).