Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

פרוטוקולים עבור C- לבנים DNA הרכבה רגילה באמצעות Cpf1

Published: June 15, 2017 doi: 10.3791/55775
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute of Plant Physiology and Ecology, Shanghai Insititutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences

Summary

CRISPR הקשורים חלבון Cpf1 יכול להיות מונחה על ידי CRNA RNA (CRRNA) שתוכנן במיוחד כדי לדבוק DNA כפול תקועים באתרים הרצוי, יצירת הקצוות דביקים. בהתבסס על מאפיין זה, תקן DNA הרכבה (C-Brick) הוקמה, ופרוטוקול המפרט את השימוש שלה מתואר כאן.

Abstract

CRISPR הקשורים חלבון Cpf1 cleaves פעמיים תקועים DNA תחת הדרכת CRISPR רנ"א (crRNA), יצירת הקצוות דביקים. בגלל זה מאפיין, Cpf1 שימש להקמת תקן הרכבה דנ"א בשם C-Brick, אשר יש את היתרון של אתרי הכרה ארוכה צלקות קצרות. על וקטור C- לבנים רגיל, ישנם ארבעה אתרי זיהוי Cpf1 - קידומת (T1 ו T2 אתרים) ואת הסיומת (T3 ו T4 אתרים) - צף חלקים DNA ביולוגי. המחשוף של אתרי T2 ו- T3 מייצר קצוות דביקים משלימים, המאפשרים הרכבה של חלקי DNA עם אתרי T2 ו- T3. בינתיים, צלקת קצרה "GGATCC" נוצר בין חלקים לאחר הרכבה. כמו פלסמיד החדש שנוצר שוב מכיל את ארבעת אתרי Cpf1 מחשוף, השיטה מאפשרת הרכבה איטרטיבי של חלקי ה- DNA, אשר דומה לאלה של תקנים BioBrick ו BglBrick. הליך המתאר את השימוש בתקן C-Brick להרכבת חלקי DNAמתואר כאן. תקן C-Brick יכול להיות בשימוש נרחב על ידי מדענים, בוגר סטודנטים לתואר ראשון, ואפילו חובבים.

Introduction

סטנדרטיזציה של חלקים ביולוגיים DNA חשוב לפיתוח של ביולוגיה סינתטית 1 . פיתוח של תהליך הרכבה דנ"א יכול להחליף עיצובים ניסיוניים אד הוק ולהסיר רבים של תוצאות בלתי צפויות המתעוררות במהלך הרכבה של רכיבים גנטיים לתוך מערכות גדולות. תקן ה- BioBrick (BBF RFC 10) היה אחד התקני ה- DNA הראשונים שהוצעו. הוא משתמש ברצף קידומת (המכיל EcoRI ו XBAI חיתוך אתרים) ואת רצף הסיומת (המכיל Spei ו PSTI חיתוך אתרים) 2 , 3 . כי XbaI ו SpeI יש משלים מלוכדת משלימים, BioBrick חלקים DNA שנחתכים עם XbaI ו SpeI ניתן לחבר יחד, יצירת BioBrick חדש להרכבה איטרטיבי נוסף.

פגמים מסוימים זוהו עם השימוש של תקן BioBrick 4 . לדוגמה, הוא מייצר צלקת 8-bpבין חלקי ה- DNA, אשר אינו מאפשר בניית חלבונים בתוך היתוך. חוץ מזה, ארבעה סוגי הנ"ל של אתרים 6-bp הגבלה יש להסיר את החלקים DNA, וזה מאוד לא נוח. תקן BglBrick הוקמה כדי לפתור את הבעיה הראשונה 5 . זה יוצר 6 "BP" GGATCT "צלקת, לייצר Gly-Ser ומאפשר היתוך של חלבונים מרובים או תחומים חלבון. IBrick פותחה כדי להתמודד עם הבעיה השנייה 6 . היא משתמשת endonucleases ביתית (HE) כי לזהות רצפים דנ"א ארוך. כמו אתרי זיהוי HE לעתים רחוקות קיימים רצפי DNA טבעי, תקן iBrick ניתן להשתמש לבנייה ישירה של חלקים iBrick ללא שינוי רצפי DNA שלהם. עם זאת, תקן iBrick משאיר צלקת bp 21 בין חלקי ה- DNA, אשר עשוי להיות הסיבה הפופולריות שלה.

בשנים האחרונות, מקובצים באופן קבוע חוזרים interinded קצר palindromic (CRISיחסי ציבור) מערכת פיתחה במהירות 7 , 8 . בין CRISPR הקשורים (חלבונים) Cas, CAS9 endonuclease מ streptococcus pyogenes כיום בשימוש נרחב. זה בעיקר מציג הפסקות דנ"א כפול תקועים (DSBs) עם הקצוות קהה 9 .

בשנת 2015, ג 'אנג ו coworkers מאופיינים Cpf1 (CRISPR מ Prevotella ו Francisella 1) בפעם הראשונה. זה שייך בכיתה 2 סוג CRISPR-Cas המערכת היא CRNARNA CRNA (CRRNA) מונחה endonuclease 10 . שלא כמו Cas9, Cpf1 מציג DSB עם 4 או 5 nt 5 'overhang 10 . בהתבסס על מאפיין זה, Cpf1 שימש לפיתוח תקן הרכבה דנ"א, C-Brick 4 . על וקטור סטנדרטי בריק C, ארבעה Cpf1 אתרי היעד של T1 / T2 קידומת ו סיומות T3 / T4 צדי החלקים הביולוגיים; זה דומה תקן BioBrick. כמו מחשוף של T2 ו T3 אתרים עמ 'מייצרת קצוות דביקים משלימים, ניתן לבצע את הרכבה האיטרטיבית של חלקי ה- DNA תוך יצירת צלקת "GGATCC" בין החלקים. יש לציין, תקן C-Brick יש שני יתרונות עיקריים: זיהוי רצפים יעד ארוך לעזוב צלקות קצרות. 6 "BP" צלקת "GGATCC" שנוצר על ידי C- לבנים מקודד Gly-Ser, אשר מאפשר את בניית חלבונים היתוך. יתר על כן, תקן C- לבנים הוא גם תואם חלקית עם BglBrick ו BioBrick סטנדרטים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת קרנה

  1. הכנת תבניות CRRNA
    1. Re-להשעות oligonucleotides הפרט ( טבלה 1 ) במים RNase חינם לריכוז של 10 מיקרומטר.
    2. הוסף 22.5 μL של oligonucleotide העליון גדיל (T7-F בטבלה 1 ), 22.5 μL של oligonucleotide גדיל התחתונה ( טבלה 1 ), ו 5 μL של חיץ 10x annealing כדי צינור 0.2 מ"ל PCR. ודא כי הנפח הכולל הוא 50 μL.
      הערה: שישה שונים oligonucleotides התחתונה התחתונה מוצגים בטבלה 1 , שכל אחד מהם יש לזווג בנפרד עם גדיל העליון T7-F. אותיות קטנות בטבלה 1 מייצגים את רצף להיות transcribed לתוך רצף המדריך של crRNA. חיץ 10x Taq PCR ניתן להשתמש במקום חיץ 10x annealing.
    3. מניחים את צינור PCR לתוך thermocycler.
    4. הפעל את תוכנית חישול: denaturation הראשונית ב 95 מעלות צלזיוס עבור5 דקות ולאחר מכן cooldown מ 95-20 מעלות צלזיוס, עם ירידה של 1 מעלות צלזיוס לדקה על thermocycler.
      הערה: מיד להשתמש דגימות עבור שלב 1.2.1.
  2. תמלול וטיהור של CRRNA
    1. הוסף 38 μL של מים ללא RNase, 8 μL של התבנית משלב 1.1.4, 20 μL של חיץ תמליל 5x T7, 20 μL של תערובת NTP (10 מיקרומטר), 4 μL של מעכב RNase רקומביננטי (RRI), ו 10 ΜL של פולימרז T7 RNA לצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל. ודא כי נפח הכולל הוא 100 μL.
    2. שים את הצינור microcentrifuge ב 37 מעלות צלזיוס מים במשך הלילה (כ 16 שעות).
    3. השתמש ניקוי RNA ואת ערכת ריכוז לטהר את RNA transcript; בצע את הפרוטוקול של היצרן.
    4. לכמת את RNAs עם ספקטרופוטומטרים UV- ויזול לדלל את RNA לריכוז של 10 מיקרומטר. השתמש בדגימות מיד או לאחסן אותם ב -80 מעלות צלזיוס.
      הערה: רצף CRRNAS המפורטים בטבלה 2 .

2. בנייה של חלקי לבנים C ( כלומר, את ההוספה של חלקים ביולוגיים לתוך C- לבנים רגיל וקטור)

הערה: שלב זה כולל שלושה שלבי משנה. עבור חלקים ביולוגיים קצרים ( למשל, מקדמי וטרמינלים), עדיף להשתמש בשיטת PCR ישיר להכניס את החלקים הביולוגיים לתוך וקטור רגיל C- לבנים 4 . רצף וקטור כולו מוצג נתונים משלימים, ואת הקידומת ואת רצף הסיומת מוצג באיור 1 (שלב 2.1, להלן). עבור חלקים ביולוגיים אשר ניתן להשיג בקלות באמצעות PCR ( למשל, עם תבניות של DNA גנומי, פלסמידים, או דה novo מסונתז רצפי DNA), עדיף להשתמש בשיטת הרכבה חלקה להכניס את החלקים הביולוגיים לתוך וקטור רגיל C- לבנים (שלב 2.2 להלן). עבור חלקים אלה המתקבלים BioBrick ו BglBrick סטנדרטים, הגבלהעיכול בתיווך אנזים T4 דנ"א ligase בתיווך קשירת ניתן להשתמש כדי להכניס את החלקים הביולוגיים לתוך וקטור סטנדרטי לבנים C (שלב 2.3, להלן).

  1. בנייה באמצעות הגברה ישירה PCR
    1. עיצוב וסדר oligonucleotides עבור הגברה PCR.
      הערה: סוף 5'oligonucleotide מכיל את רצף של חלק ה- DNA, ו -3 'סוף של oligonucleotide מכיל רצף וקטור ( כלומר, "GGATCCACTAGTCTCTAGCTCG" ב -3' סוף של גדיל קדימה "GGATCCTTTCTCCTCTTTTTTG" בגדר הפוכה). או לא overhang או ~ 20-BP overhang יכול להיות מתוכנן בסוף 5'5'של oligonucleotide. דוגמאות ספציפיות ניתן למצוא במחקר קודם 4 .
    2. Re-להשעות oligonucleotides הפרט במים אולטרה טהור לריכוז של 10 מיקרומטר.
    3. הגדרת תגובות PCR על הקרח בצינור 0.2 מ"ל PCR: להוסיף 18 μL של מים אולטרה טהור, 25 μL של 2x Pחיץ CR, 1 μL של dNTPs (10 מיקרומטר), 2.5 μL כל אחד primers קדימה והופך (10 מיקרומטר) משלב 2.1.2, 0.5 μL של C- לבנים וקטור סטנדרטי (50 ng) כתבנית, ו 0.5 μL של פולימראז DNA גבוהה נאמנות. ודא כי הנפח הכולל הוא 50 μL.
    4. מניחים את הצינור ישירות thermocycler ולהתחיל את תוכנית thermocycler. השתמש דגימות מיד או להקפיא ולאחסן אותם ב -20 מעלות צלזיוס.
    5. תוכנית Thermocycler: מחזור אחד עבור 3 דקות ב 98 מעלות צלזיוס; שלושים מחזורים עבור 10 s ב 98 מעלות צלזיוס, 20 s ב 55 מעלות צלזיוס, ו 2 דקות ב 72 מעלות צלזיוס; ו מחזור אחד עבור 10 דקות ב 72 מעלות צלזיוס. שמור את המדגם ב 16 ° C.
    6. הוסף 9 μL של התערובת משלב 2.1.4 לצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל.
    7. הוסף 1 μL של DpnI ו דגירה במשך שעה 1 באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
      הערה: אם פריימרים אין רצף חופפים, להוסיף 0.5 μL של t4 polynucleotide קינאז (PNK) ו 0.5 μL של ליגז DNA T4 ו דגירה באמבט מים 22 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות. אחרת, אם פריימרים מכילים רצף 20 ~ n חופפים חופפים, ישירות להפוך את המוצרים שטופלו DpnI לתוך E. coli (DH10B) תאים מתאימים (שלב 2.4). המוצר PCR לינארי יהיה מעגלי על ידי מערכת רקומבינציה המארח.
    8. השתמש דגימות מיד או לאחסן אותם ב -20 מעלות צלזיוס.
  2. בנייה באמצעות הרכבה חלקה
    1. עיצוב וסדר oligonucleotides עבור הגברה PCR.
      הערה: 3-end של oligonucleotide מכיל את רצף המסוף של חלק ה- DNA, ואת 5'-end של oligonucleotide מכיל את הטרמינל של רצף וקטור ליניארי סטנדרטי ליניארי ( כלומר, "CTAGAAAGAGGAGAAAGGATCC" עבור 5 ' -הגדיל קדימה ו "CGAGCTAGAGACTAGTGGATCC" עבור 5'-end של גדיל הפוך). דוגמאות ספציפיות ניתן למצוא במחקר קודם 4 .
    2. להשעות מחדש את הפרטOligonucleotides Ual במים אולטרה טהור לריכוז של 10 מיקרומטר.
    3. הגדרת תגובות PCR על הקרח בצינור 0.2 מ"ל PCR: להוסיף 18 μL של מים אולטרה טהור, 25 μL של חיץ PCR 2x, 1 μL של dNTPs (10 מיקרומטר), 2.5 μL כל אחד primers קדימה לאחור (10 מיקרומטר ) משלב 2.2.2, 0.5 μL של תבנית (20-500 ng), ו 0.5 μL של פולימרז DNA גבוהה נאמנות. ודא כי הנפח הכולל הוא 50 μL.
    4. מניחים את הצינור ישירות thermocycler ולהפעיל את תוכנית thermocycler. השתמש דגימות מיד או להקפיא ולאחסן אותם ב -20 מעלות צלזיוס.
      הערה: הגדרת תוכנית thermocycler ל: מחזור אחד במשך 3 דקות ב 98 מעלות צלזיוס; 30 מחזורים עבור 10 s ב 98 מעלות צלזיוס, 20 s ב 55 מעלות צלזיוס (על פי הטמפרטורה חישול של פריימר), ו 1 דקות (על פי אורך של חלקים ביולוגיים) ב 72 מעלות צלזיוס; ו מחזור אחד עבור 10 דקות ב 72 מעלות צלזיוס. שמור את המדגם ב 16 ° C.
    5. לטהר את המוצר PCR באמצעות סינון PCRערכת טאם; בצע את הפרוטוקול של היצרן.
    6. לעכל את C- לבנים וקטור רגיל עם BamHI: להוסיף 34 μL של מים טהור במיוחד, 10 μL של פלסמיד (1 מיקרוגרם), 5 μL של חיץ 10x, ו 1 μL של BamHI לצינור microcentrifuge. דגירה של עד 2 שעות על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
    7. לטהר את המוצר לעיל באמצעות ערכת ג 'ל ניקוי המערכת; בצע את הפרוטוקול של היצרן.
    8. הוספת 2 μL של וקטור לינארית (50 ng) משלב 2.2.7, 5 μL של שבר (200 ng) משלב 2.2.4, 2 μL של חיץ 5x חלקה חלקה, ו 1 μL של אנזים חלקה חלקה מן ערכת הרכבה חלקה כדי 1.5 מ"ל microcentrifuge tube.Ensure כי נפח כולל הוא 10 μL.
    9. מניחים את זה אמבטיה 37 מעלות צלזיוס מים למשך 30 דקות. השתמש דגימות מיד או להקפיא ולאחסן אותם ב -20 מעלות צלזיוס.
  3. בנייה באמצעות עיכול באנזים בתיווך עיכול ו T4 דנ"א ligase בתיווך קשירת.
    הערה: עבור חלקים אלה שהתקבלו מן BioBrick (שלב 2.3.4-2.3.7) ו BglBrick (שלב 2.3.1-2.3.3) סטנדרטים, הגבלת אנזים בתיווך עיכול T4 דנ"א ligase בתיווך קשירת ניתן להשתמש כדי להכניס את חלקים ביולוגיים לתוך וקטור סטנדרטי לבנים C.
    1. לעכל את חלקים BglBrick רגיל עם BamHI ו BglII: להוסיף 34 μL של מים טהור במיוחד, 10 μL של פלסמיד (2 מיקרוגרם), 5 μL של חיץ 10x 3, 0.5 μL של BamHI, ו 0.5 μL של BglII לצינור microcentrifuge. לדגור על 2 שעות אמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
    2. הפעל 1% agarose ג'ל אלקטרופורזה לטהר את השבר באמצעות ערכת ג 'ל ניקוי המערכת.
    3. לקשר את השבר ואת וקטור רגיל לבנים C: להוסיף 2 μL של וקטור לינארית (50 ng) משלב 2.1.12 ו 6 μL של שבר (200 ng) משלב 2.3.3 ל 1.5 צינור microcentrifuge מ"ל. הוסף 1 μL של 10 x T4 DNA חיץ ligase ו 1 μL של ליגז DNA T4. לדגור על 2 שעות ב 22 ° C. השתמש דגימות מיד או freezדואר ולאחסן אותם ב -20 מעלות צלזיוס.
    4. לעכל את החלקים תקן BioBrick עם XbaI ו SpeI: להוסיף 34 μL של מים טהור במיוחד, 10 μL של פלסמיד (2 מיקרוגרם), 5 μL של חיץ 10x, 0.5 μL של XbaI, ו 0.5 μL של SpeI לצינור microcentrifuge. לדגור על 2 שעות אמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
    5. לעכל את C- לבנים וקטור רגיל עם XBAI ו SpeI: להוסיף 34 μL של מים טהור במיוחד, 10 μL של פלסמיד (1 מיקרוגרם), 5 μL של חיץ 10x, 0.5 μL של XbaI, ו 0.5 μL של SpeI לצינור microcentrifuge . לדגור על 2 שעות אמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
    6. הפעל 1% agarose ג'ל אלקטרופורזה לטהר את השבר משלב 2.3.4 ואת וקטור לינארי משלב 2.3.5 עם ערכת ג 'ל ניקוי המערכת; בעקבות פרוטוקול היצרן.
    7. לקשר את השבר ואת וקטור בריק C: להוסיף 2 μL של וקטור לינארית (50 ng) משלב 2.3.5 ו 6 μL של שבר (200 ng) משלב 2.3.4 ל 1.5 צינור microcentrifuge מ"ל. מוֹדָעָהD 1 μL של חיץ T4 DNA T4 D4 ו 1 μL של ליגז DNA T4. לדגור על 2 שעות ב 22 ° C. השתמש דגימות מיד או להקפיא ולאחסן אותם ב -20 מעלות צלזיוס.
  4. הוסף 10 μL של מוצרים משלב 2.1.8, 2.2.9, 2.3.3, או 2.3.7 עבור שינוי כימי לתוך התאים המוסמכים של E. coli (DH10B).
  5. איסוף מספר שיבוטים צינור 5 ל"ל Luria-Bertani נוזלי (LB) ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס על שייקר (220 סל"ד) בן לילה.
  6. חלץ את הפלסמיד באמצעות ערכת הכנה פלסמיד; בצע את הפרוטוקול של היצרן.
  7. לזהות את שיבוטים הנכון על ידי סנגר רצף 11 .

3. C- לבנה האסיפה ( איור 2 )

  1. עיכול של וקטור C- לבנים עם Cpf1
    1. הוסף 22.5 μL של מים ללא RNase, 4 μL של חיץ 10x Cpf1, 10 μL של פלסמיד מ שלב 2.6 (1 מיקרוגרם), 0.5 μL של RRI, ו 1 &# 181; L של Cpf1 (5 מיקרומטר) לצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל.
      הערה: Cpf1 ניתן לרכוש מסחרית או מטוהרים בעקבות הפרוטוקול במחקר קודם 4 .
    2. כדי להכניס קטע DNA זרים לתוך T1 ו T2 אתרים, להוסיף 1 μL של CRRNA-T2 (10 מיקרומטר) ו דגירה באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. D 1 μL של CRRNA-T1 (10 מיקרומטר) ו Cpf1 (5 מיקרומטר) במשך 30 דקות נוספות.
      הערה: לחלופין, כדי להכניס קטע דנ"א זר לתוך T3 ו T4 אתרים, להוסיף 1 μL של CRRNA-T3 (10 מיקרומטר) ו דגירה באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. הוסף 1 μL של CRRNA-T4 (10 מיקרומטר) במשך 30 דקות נוספות.
    3. הוסף 1 μL של phosphatase אלקליין thermosensitive ו דגירה הצינור באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך עוד 1 ח.
    4. הפעל ג'ל אלקטרופורזה agarose ולטהר את וקטור באמצעות ערכת ג 'ל ניקוי המערכת. השתמש דגימות מיד או להקפיא ולאחסן אותם ב -20 מעלות צלזיוס.
    עיכול של קטע ה- DNA עם Cpf1
    1. הוסף 21.5 μL של מים ללא RNase, 4 μL של חיץ 10x Cpf1, 10 μL של פלסמיד משלב 2.6 (2 מיקרוגרם), 0.5 μL של RRI, ו 2 μL של Cpf1 (5 מיקרומטר) לצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל.
    2. כדי להכניס קטע דנ"א זר לתוך T1 ו T2 אתרים, להוסיף 1 μL של CRRNA-T1 (10 מיקרומטר) ו 1 μL של CRRNA-T3 (10 מיקרומטר) ו דגירה באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
      הערה: לחלופין, להוסיף 1 μL של CRRNA-T2 (10 מיקרומטר) ו 1 μL של CRRNA-T4 (10 מיקרומטר) ו דגירה באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
    3. הפעל ג'ל אלקטרופורזה agarose ולטהר את השבר באמצעות ערכת ג 'ל ניקוי המערכת. השתמש דגימות מיד או להקפיא ולאחסן אותם ב -20 מעלות צלזיוס.
  2. הרכבה C- לבנים אימות נוסף
    1. לקשר את קטע ה- DNA זר C- לבנים וקטור: להוסיף 2 μL של וקטור linearized (50 ng) משלב 3.1.4 ו 6 μL של קטע ה- DNA (200 ng) משלב 3.2.3 ל 1.5 מ"ל microcentrifuge צינור. הוסף 1 μL של חיץ T4 דנ"א ליגז T4 ו 1 μL של ליגז DNA T4. לדגור על 2 שעות ב 22 ° C. השתמש דגימות מיד או להקפיא ולאחסן אותם ב -20 מעלות צלזיוס.
    2. הוסף 10 μL של מוצרי קשירת (שלב 3.3.1) עבור שינוי כימי לתוך E. קולי (DH10B) תאים מתאימים.
    3. הוסף מספר שיבוטים צינור 5 LL נוזלי LL ו דגירה לילה על שייקר ב 220 סל"ד ו 37 מעלות צלזיוס.
    4. חלץ את הפלסמיד באמצעות ערכת הכנה פלסמיד; בצע את הפרוטוקול של היצרן.
    5. זיהוי שיבוטים נכונים על ידי סנגר רצף 11 .
  3. בצע סיבוב חדש של הרכבה C- לבנים. נכון שיבוטים מ 3.3.4 שלב יכול לשמש חדש C- לבנה וקטור או חלק DNA עבור עוד איטרטיבי C- בריק הרכבה, בעקבות אותו פרוטוקול מ 3.1-3.3.
    הערה: T2 'ו- T3' sItes מתוכננים כמו גיבוי של T2 ו T3 אתרים ( איור 1 א ). עבור פלסמידים המתקבל משלב 2.3.7, רק T2 'ו T3' ניתן להשתמש עבור הרכבה C- לבנים רגיל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרוטוקול זה הוכיח את הרכבה של שלוש קלטות chromoprotein (cjBlue (BBa_K592011), eforRed (BBa_K592012), ו amilGFP (BBa_K592010)). ראשית, רצפי ההקלדה של שלושת הגנים והטרמינלים הנ"ל הושככו בנפרד לתוך וקטור סטנדרטי של C-Brick. חלקים דנ"א קצר, האמרגן ואת הטרמינטור, הוכנסו לתוך וקטור C- לבנים באמצעות הגברה PCR באמצעות primers המכילים את חלקי ה- DNA קצר על מסוף 5 '. זה היה ואחריו שיטת קשירת עצמי. שלושה רצפים chromoprotein קידוד היו הראשונים דה נובו מסונתז ולאחר מכן משובטים לתוך וקטור סטנדרטי בריק באמצעות הרכבה חלקה. פריימרס תוארו במחקר קודם 4 .

לאחר מכן, cjBlue, eforRed, ו amilGFP רצפים היו ligated עם sequator ו sequences מקדם באותו הליך המוצג ב"Xfig"> איור 2. מבנים נכונים הפכו E. קולי , להפגין צבעים יפים ( איור 3 א ). לאחר מכן, שני קלטות ביטוי צבע הורכבו עוד עם תקן C לבנים כדי ליצור צבעים נוספים ( כלומר, צבע אדום מ amilGFP בתוספת eforRed, צבע ירוק מ amilGFP בתוספת cjBlue, ואת צבע סגול בהיר מ eforRed פלוס cjBlue; 3b ).

איור 1
איור 1: C- לבנים רגיל ממשק רצף DNA ו- C לבנים לבנים וקטור. ( א ) רצף של C- הלבנה תקן ממשק- T1, T2, T3, T4, T2 ', T3'- יכול להיות מוכר על ידי CRRNA המקביל שלה ולאחר מכן הציג לתוך 5' overhang באמצעות Cpf1. המחשוף של אתרי T2 ו- T3 (או T2 ו- T3) מייצר יותר משליםנתקע. עם שמונה אתרי הגבלה שתוכננו, תקן C לבנים הוא תואם חלקית עם BioBrick ו BglBrick. ( ב ) פלסמיד המפה עבור C- לבנים רגיל וקטור עם אתרי עיכול הגבלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: זרימת עבודה עבור הרכבה DNA בתקן C לבנים. אתרי היעד T2 ו- T3 מתעכלים מייצרים מסגרות מלוכדות משלימות של "GGATC" ו- "GATCC", בהתאמה, אשר ניתן לייגד כדי ליצור צלקת קצרה "GGATCC". נהלים מפורטים ניתן למצוא בשלב 3 בטקסט ("הרכבה C- לבנים"). אנא לחץ כאן להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: פיגמנטים צבעוניים בקטריאלי הופק על ידי א coli הארבור בונה מורכבים תקן C לבנים. ( א ) שלושה chromoproteins התבטאו ב coli גדל על צלחת. על גבי הצלחת הרביעית מוצגים חיידקים ללא כרומופרוטאינים (שליטה שלילית). ( ב ) שלושה chromoproteins ושלושה כרומופרוטינים כפול התאספו הביעו ב E. coli גדל בינוני LB נוזלי. מ 1 עד 6, מבנים הביע eforRed (1), amilGFP (2), cjBlue (3), amilGFP בתוספת eforRed (4), amilGFP בתוספת cjBlue (5), ו eforRed פלוס cjBlue (6). החיידקים הצבעוניים על צלחת אחת או בצינור microcentrifuge יחיד היו מתורבת משכפל אחד מאומת רצף. Les / ftp_upload / 55775 / 55775fig3large.jpg "target =" _ blank "> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

שֵׁם סדר פעולות
T7-F GAATATTAACACACTCACTAGAGG
T7-T1-R GaattcagtagaaagttgcgataaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC
T7-T2'-R CtagagtaaagcttgaattcagtaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC
T7-T2-R GgatcctttctcctctttctagagATATCTACACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC
T7-T3-R GgatccactagtctctagctcgaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC
T7-T3'-R CtctagctcgagaaattcaaggaATCTACAACAGTAGAATTCCCTATAGTAGTTCGTATTAATTTC
T7-T4-R TtcaagggactactgcagctagctATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC

טבלה 1: אוליגוס להכנת תבניות תעתיק CRRNA בשימוש במחקר זה. T7-F היה אוליגנוקליאוטיד עליון, והאחרות היו אוליגוטליאוטידים. בסיסים בסיסיים את רצף יהיה transcribed לתוך רצף המדריך crRNA.

שמות RNA רצפים (5'-3 ')
CRRNA-T1 GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUUAUCGCAACUUUCUACUGAAUUC
CRRNA-T2 GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUCUCUAGAGAAGAGAAGAGUCUCC
CRRNA-T3 GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUCGAGCUAGAGACAGAGUGUGUCC
CRRNA-T4 GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUAGCUAGCUGCAGUUUCUCCUUGAA
CRRNA-T2 ' GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUACUGAAUUCAAGCUUUUCUCUAG
CRRNA-T3 ' GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUCCUUUGAUUUCUCAGAGCAGAGAGAG

טבלה 2: רצפי CRRNA המשמשים במחקר זה. CRRNAs הופקו באמצעות שעתוק במבחנה בשלב 1 בטקסט ("הכנה של CRRNA").

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר הליך עבור תקן ה- DNA הרכבה C-Brick. השלב החשוב ביותר בפרוטוקול זה הוא לינאריזציה של וקטור סטנדרטי לבנים; מחסור שלם של וקטור יכול להשפיע על שיעור ההצלחה. בנוסף, למרות Cpf1 בעיקר cleaves היעד רצפי DNA דפוס "18-23" מחשוף, מחשוף מדויק ליד שני בסיסים התגלה גם 4 , אשר יכול לגרום למספר קטן של מוטציות לאחר הרכבה דנ"א. לכן, רצף סנגר יש צורך לאמת את המבנה התאספו.

היעילות של הרכבה C- לבנים הוא נמוך יותר מאשר הגבלה מסורתית אנזים שיטות קשירת כי תוארו במחקר הקודם 4 . הסיבה העיקרית המשפיעה על יעילות ההרכבה עשויה להיות מאפייני מחשוף מדויק של Cpf1. בעתיד, שיפורים הדיוק מחשוף יכול להיות מאוד שימושי עבור תקן אNd כרגע נבדקים.

C-Brick הוא גם תואם חלקית עם BglBrick ו BioBrick סטנדרטים. לדוגמה, חלקים BglBrick ניתן לחתוך עם BglII ו BamHI ולאחר מכן מוכנס לתוך האתר BamHI של C- לבנים רגיל וקטור, יצירת חלק C- לבנים. עם זאת, הכיוון ההכנסה של החלק BglBrick צריך להיות מאומת, ויהיה צלקת "GGATCT" לאחר ההרכבה. כאשר חלק C-Brick DNA מתקבל מחלק BioBrick ( כלומר, עם עיכול XbaI ו- SpeI), שני אתרי T2 ו- T3 יושמדו, וניתן להשתמש בשני רצפי Cpf1 של יעד גיבוי (T2 ו- T3).

כמו מחשוף Cpf1 דורש sgRNA, שהוא רגיש מאוד RNase, כל החומרים צריכים להיות RNase חינם. נכון לעכשיו, כל C-Brick ווקטורים סטנדרטיים, RNase ללא cpf1 nucleases, ו crRNAs ניתן להזמין מסחרית 12 . לכן, הנהלים של C-Brick הם פשוטים כמו אלה של ביותקן לבנים.

בשנים האחרונות, כמה שימושי DNA הרכבה שיטות פותחו והם נמצאים בשימוש נרחב, כולל גולדן שער האסיפה 13 , Gibson האסיפה 14 , ואחרים 15 . עם זאת, כמו תקני הרכבה דנ"א יש פוטנציאל לספק חסכונית, אמין, תפוקה גבוהה, ותגובות הרכבה אוטומטית 5 , תקנים עשויים להקל על בנייה ובדיקה של גנים חדשים תוכנן או מחדש, מעגלים גנטיים, ושבילים 15 , 16 , 17 , במיוחד בתחום הביולוגיה הסינתטית. בין התקנים שפורסמו כעת דנה הרכבה, תקן C לבנים יש יתרונות ברורים וחסרונות 4 ( כלומר, יעילות קשירת). אם יעילות קשירת הוא השתפר, תקן ניתן לאמץ באופן נרחב בעתיד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים שנחאי טולו ביוטק על סיוע טכני שלהם במהלך הפיתוח של תקן C לבנים. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי תוכנית עדיפות אסטרטגית מחקר של האקדמיה הסינית למדעים (מענק מס 'XDB19040200).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Comercial Oligonucleotide Sangon Biotech
10x Taq PCR Buffer Transgen #J40928
Ultra Pure Distilled Water Invitrogen 10977-015
5x RNA Transcription Buffer Thermo Scientific K0441
T7 RNA polymerase Thermo Scientific #EP0111
NTP mixture Sangon #ND0056
RRI (Recombinant RNase Inhibitor) Takara 2313A
RNA Clean & Concentrator-5 Zymo Research R1015
UV-Vis Spectrometer Thermo Scientific Nano-Drop 2000c
2x Phanta Max Buffer Vazyme PB505 PCR buffer
dNTPs Transgen AD101
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase Vazyme P505-d1
Ezmax for One-step Cloning Tolobio 24303-1 seamless assembly kit
5x Buffer for Ezmax One-step Cloning Tolobio 32006
BamHI NEB #R0136L
BamHI-HF NEB #R3136L
BglII  NEB #R0144L
XbaI NEB #R0145L
SpeI NEB #R3133L
10x Buffer 3 NEB #B7003S
10x CutSmart Buffer NEB B7204S
10x T4 DNA ligase Buffer Tolobio 32002
T4 PNK Tolobio 32206
T4 DNA ligase Tolobio 32210
DpnI NEB #R01762
SV Gel and PCR clean-up system Promega A9282
Plasmid Mini Kit I Omega D6943-02 plasmid preparation kit
thermosensitive alkaline phosphatase  Thermo Scientific #EF0651 FastAP
10x Cpf1 buffer Tolobio 32008
Cpf1 Tolobio 32105 FnCpf1
thermocycler Applied Biosystems veriti 96 well
C-Brick standard vector Tolobio 98101
E. coli [DH10B] Invitrogen 18297010
Luria-Bertani media (tryptone) Oxoid LP0042
Luria-Bertani media (yeast extract) Oxoid LP0021
Luria-Bertani media (NaCl) Sangon Biotech B126BA0007

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Canton, B., Labno, A., Endy, D. Refinement and standardization of synthetic biological parts and devices. Nat Biotechnol. 26 (7), 787-793 (2008).
  2. Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. J Biol Eng. 2, (2008).
  3. Knight, T. Idempotent Vector Design for Standard Assembly of Biobricks. , MIT Artificial Intelligence Laboratory; MIT Synthetic Biology Working Group. 1-11 (2003).
  4. Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J. C-Brick: A New Standard for Assembly of Biological Parts Using Cpf1. ACS Synth Biol. 5 (12), 1383-1388 (2016).
  5. Anderson, J. C., et al. BglBricks: A flexible standard for biological part assembly. J Biol Eng. 4 (1), (2010).
  6. Liu, J. K., Chen, W. H., Ren, S. X., Zhao, G. P., Wang, J. iBrick: a new standard for iterative assembly of biological parts with homing endonucleases. PLoS One. 9 (10), e110852 (2014).
  7. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  8. Wright, A. V., Nunez, J. K., Doudna, J. A. Biology and Applications of CRISPR Systems: Harnessing Nature's Toolbox for Genome Engineering. Cell. 164 (1-2), 29-44 (2016).
  9. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  10. Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
  11. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  12. Shanghai Tolo Biotechnology Company Limited. , Shanghai 200233, China. Available from: http://www.tolobio.com/ (2017).
  13. Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method. PLoS One. 3 (11), e3647 (2008).
  14. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  15. Casini, A., Storch, M., Baldwin, G. S., Ellis, T. Bricks and blueprints: methods and standards for DNA assembly. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (9), 568-576 (2015).
  16. Cameron, D. E., Bashor, C. J., Collins, J. J. A brief history of synthetic biology. Nat Rev Microbiol. 12 (5), 381-390 (2014).
  17. Keasling, J. D. Synthetic biology for synthetic chemistry. ACS Chem Biol. 3 (1), 64-76 (2008).

Tags

גנטיקה גיליון 124 ביולוגיה סינתטית CRISPR Cpf1 C-Brick קצוות דביקים הרכבה DNA, תקן הרכבה
פרוטוקולים עבור C- לבנים DNA הרכבה רגילה באמצעות Cpf1
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J.… More

Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J. Protocols for C-Brick DNA Standard Assembly Using Cpf1. J. Vis. Exp. (124), e55775, doi:10.3791/55775 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter