Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Protokoller for C-Brick DNA Standard Assembly Bruke Cpf1

Published: June 15, 2017 doi: 10.3791/55775
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute of Plant Physiology and Ecology, Shanghai Insititutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences

Summary

CRISPR-assosiert protein Cpf1 kan styres av et spesialdesignet CRISPR-RNA (crRNA) for å spalte dobbeltstrenget DNA på ønskede steder, og genererer klissete ender. Basert på denne egenskapen ble en DNA-monteringsstandard (C-Brick) etablert, og en protokoll som beskriver bruken av denne er beskrevet her.

Abstract

CRISPR-assosiert protein Cpf1 spalter dobbeltstrenget DNA under veiledning av CRISPR RNA (crRNA), hvilket gir klebrig endene. På grunn av denne egenskapen har Cpf1 blitt brukt til etablering av en DNA-monteringsstandard kalt C-Brick, som har fordelen av lange anerkjennelsessteder og korte arr. På en standard C-Brick-vektor er det fire Cpf1-anerkjennelsessteder - prefikset (T1 og T2-områder) og suffikset (T3 og T4-områder) - flankerende biologiske DNA-deler. Spaltningen av T2- og T3-områder produserer komplementære klistrede ender, noe som tillater montering av DNA-deler med T2- og T3-steder. Samtidig genereres en kort "GGATCC" arr mellom deler etter montering. Siden det nylig dannede plasmidet igjen inneholder de fire Cpfl-spaltningssteder, tillater metoden den iterative samling av DNA-deler, som ligner de av BioBrick og BglBrick-standarder. En prosedyre som beskriver bruk av C-Brick-standarden for å montere DNA-delerEr beskrevet her. C-Brick-standarden kan brukes mye av forskere, kandidater og studenter, og til og med amatører.

Introduction

Standardiseringen av DNA-biologiske deler er viktig for utviklingen av syntetisk biologi 1 . Utviklingen av en DNA-forsamlingsprosedyre kan erstatte ad hoc- eksperimentelle design og fjerne mange av de uventede utfallene som oppstår under samlingen av genetiske komponenter i større systemer. BioBrick-standarden (BBF RFC 10) var en av de tidligste foreslåtte DNA-monteringsstandardene. Den bruker prefikssekvensen (inneholder EcoRI- og XbaI-kuttsteder) og suffiksekvensen (inneholdende SpeI- og PstI-kuttsteder) 2 , 3 . Fordi XbaI og SpeI har komplementære kohesive ender, kan BioBrick DNA-deler som er kuttet med XbaI og SpeI, slås sammen, og genererer en ny BioBrick for videre iterativ montering.

Noen feil har blitt identifisert ved bruk av BioBrick standard 4 . For eksempel produserer den en 8-bp arrMellom DNA-delene, som ikke tillater konstruksjon av in-fusjonsproteiner. Dessuten må de fire ovennevnte typene av 6-bp restriksjonsseter fjernes fra DNA-delene, hvilket er svært ubeleilig. BglBrick-standarden ble etablert for å løse det første problemet 5 . Det skaper en 6-bp "GGATCT" arr, som produserer Gly-Ser og tillater sammensmelting av flere proteiner eller protein domener. IBrick ble utviklet for å håndtere det andre problemet 6 . Den bruker homing endonucleases (HEs) som gjenkjenner lange DNA-sekvenser. Siden HE-anerkjennelsessidene sjelden eksisterer i naturlige DNA-sekvenser, kan iBrick-standarden brukes til direkte konstruksjon av iBrick-deler uten å modifisere deres DNA-sekvenser. Imidlertid etterlater iBrick-standarden en 21 bp arr mellom DNA-delene, noe som kan være årsaken til dens upopularitet.

I de siste årene har de klyngede regelmessig interspaced korte palindromiske gjentakelser (CRISPR) systemet har utviklet seg raskt 7 , 8 . Blant de CRISPR-assosierte (Cas) -proteinene, er Cas9 endonuklease fra Streptococcus pyogenes nå mye brukt. Det introduserer for det meste dobbeltstrengede DNA-pauser (DSB) med stumpe ender 9 .

I 2015 preget Zhang og kollegaer Cpf1 (CRISPR fra Prevotella og Francisella 1) for første gang. Det tilhører klasse 2 type V CRISPR-Cas-systemet og er en CRISRP RNA (crRNA) -guided endonuclease 10 . I motsetning til Cas9 introduserer Cpf1 en DSB med en 4 eller 5 nt 5 'overheng 10 . Basert på denne egenskapen ble Cpf1 brukt til å utvikle en DNA-monteringsstandard, C-Brick 4 . På en C-Brick-standardvektor flipper fire Cpf1-målsteder av prefikset T1 / T2 og suffiks T3 / T4 de biologiske delene; Dette ligner BioBrick-standarden. Som spaltning av T2 og T3 sider pDanner komplementære klissete ender, er det mulig å utføre den iterative samlingen av DNA-deler samtidig som det oppnås et "GGATCC" arr mellom delene. Spesielt har C-Brick-standarden to hovedfordeler: å gjenkjenne lange målsekvenser og forlate korte arr. Den 6 bp "GGATCC" arr utviklet av C-Brick koder for Gly-Ser, som muliggjør bygging av fusjonsproteiner. Videre er C-Brick-standarden også delvis kompatibel med BglBrick og BioBrick-standardene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling av crRNA

  1. Fremstilling av crRNA-maler
    1. Resuspender individuelle oligonukleotider ( Tabell 1 ) i RNase-fri vann til en konsentrasjon på 10 uM.
    2. Tilsett 22,5 μL toppstrengoligonukleotid (T7-F i tabell 1 ), 22,5 μl bunnstrengoligonukleotid ( Tabell 1 ) og 5 μl 10x annealeringsbuffer til et 0,2 ml PCR-rør. Kontroller at totalvolumet er 50 μL.
      MERK: Seks forskjellige bunnstreng-oligonukleotider er vist i tabell 1 , som hver av dem skal være individuelt parret med toppstrengen T7-F. De små bokstaver i tabell 1 representerer sekvensen som skal transkriberes i styresekvensen av crRNA. 10x Taq PCR buffer kan brukes i stedet for 10x annealing buffer.
    3. Sett PCR-røret inn i en termocykler.
    4. Kjør annealing programmet: initial denaturering ved 95 ° C for5 min og deretter en nedkjøling fra 95-20 ° C, med en 1 ° C reduksjon per minutt på termocykleren.
      MERK: Bruk øyeblikkelig prøvene for trinn 1.2.1.
  2. Transkripsjon og rensing av crRNA
    1. Tilsett 38 μL RNase-fri vann, 8 μl av malen fra trinn 1.1.4, 20 μl 5x T7 transkripsjonsbuffer, 20 μl NTP-blanding (10 μM), 4 μl rekombinant RNase-inhibitor (RRI) og 10 Μl T7 RNA-polymerase til et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Kontroller at totalvolumet er 100 μL.
    2. Sett mikrocentrifugerøret i et 37 ° C vannbad over natten (i ca. 16 timer).
    3. Bruk et RNA opprydding og konsentrasjonssett for å rense det transkriberte RNA; Følg produsentens protokoll.
    4. Kvantifiser RNAene med UV-Vis-spektrofotometre og fortynn RNA til en konsentrasjon på 10 μM. Bruk prøvene umiddelbart eller lagre dem ved -80 ° C.
      MERK: CrRNA-sekvensenS er oppført i tabell 2 .

2. Bygging av C-Brick Parts ( dvs. innsetting av biologiske deler i en C-Brick Standard Vector)

MERK: Dette trinnet har tre delstrinn. For korte biologiske deler ( f.eks. Promotorer og terminatorer), er det best å bruke den direkte PCR-metoden for å sette de biologiske delene inn i en C-Brick standardvektor 4 . Hele vektorsekvensen er vist i tilleggsdata, og prefiks- og suffiksekvensen er vist i figur 1 (trinn 2.1 nedenfor). For biologiske deler som lett kan oppnås via PCR ( f.eks. Med templates av genomisk DNA, plasmider eller de novo syntetiserte DNA-sekvenser), er det best å bruke den sømløse samlefremgangsmåten for å sette de biologiske delene inn i en C-Brick standardvektor (Trinn 2.2 nedenfor). For de delene som er oppnådd fra BioBrick og BglBrick standarder, begrensningEnzymmediert fordøyelse og T4 DNA ligase-mediert ligering kan brukes til å sette de biologiske delene inn i en C-Brick standardvektor (trinn 2.3 nedenfor).

  1. Konstruksjon via direkte PCR-amplifikasjon
    1. Design og orden oligonukleotider for PCR amplifisering.
      MERK: 5'-enden av oligonukleotidet inneholder sekvensen av DNA-delen og 3'-enden av oligonukleotidet inneholder vektorsekvensen ( dvs. "GGATCCACTAGTCTCTAGCTCG" ved 3'-enden av fremoverstrengen og "GGATCCTTTCTCCTCTTTCTAG" I omvendt streng). Ingen avhengighet eller en overgang på 20-bp kan utformes ved 5'-enden av oligonukleotidet. Spesifikke eksempler finnes i en tidligere studie 4 .
    2. Resuspender individuelle oligonukleotider i ultra rent vann til en konsentrasjon på 10 μM.
    3. Sett opp PCR-reaksjoner på is i et 0,2 mL PCR-rør: Tilsett 18 μL ultra-rent vann, 25 μl 2 x PCR-buffer, 1 μl dNTPs (10 μM), 2,5 μl hver av de fremre og bakre primere (10 μM) fra trinn 2.1.2, 0,5 μl C-Brick standardvektor (50 ng) som en mal og 0,5 μl Av høyfidelitets DNA-polymerase. Kontroller at totalvolumet er 50 μL.
    4. Plasser røret direkte i en termocykler og start termocyklerprogrammet. Bruk prøvene umiddelbart eller frys og lagre dem ved -20 ° C.
    5. Thermocycler program: en syklus i 3 minutter ved 98 ° C; Tretti sykluser i 10 s ved 98 ° C, 20 s ved 55 ° C og 2 minutter ved 72 ° C; Og en syklus i 10 minutter ved 72 ° C. Hold prøven ved 16 ° C.
    6. Tilsett 9 μl av blandingen fra trinn 2.1.4 til et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
    7. Tilsett 1 μl Dpnl og inkuber i 1 time i et 37 ° C vannbad.
      MERK: Hvis primrene ikke har noen overlappende sekvenser, tilsatt 0,5 μl T4 polynukleotidkinase (PNK) og 0,5 μl T4 DNA ligase og inkuber iEt 22 ° C vannbad i 1 time. Ellers, hvis primrene inneholder en ~ 20 nt overlappende sekvens, transformerer de DpnI-behandlede produktene direkte til E. coli (DH10B) -kompetente celler (trinn 2.4). Det lineære PCR-produktet vil bli sirkulærisert av rekombinationssystemet i verten.
    8. Bruk prøvene umiddelbart eller oppbevar dem ved -20 ° C.
  2. Konstruksjon via sømløs montering
    1. Design og orden oligonukleotider for PCR amplifisering.
      MERK: 3'-enden av oligonukleotidet inneholder den terminale sekvensen av DNA-delen, og 5'-enden av oligonukleotidet inneholder terminalen av den lineariserte C-Brick-standardvektor-sekvensen ( dvs. "CTAGAAAGAGGAGAAAGGATCC" for 5'- -end av fremoverstrengen og "CGAGCTAGAGACTAGTGGATCC" for 5'-enden av reversstrengen). Spesifikke eksempler finnes i en tidligere studie 4 .
    2. Tilbakestill individetUal oligonukleotider i ultra rent vann til en konsentrasjon på 10 uM.
    3. Sett opp PCR-reaksjoner på is i et 0,2 mL PCR-rør: Tilsett 18 μL ultra rent vann, 25 μl 2 x PCR buffer, 1 μL dNTPs (10 μM), 2,5 μl hver av de fremre og bakre primere (10 μM ) Fra trinn 2.2.2, 0,5 μl mal (20-500 ng) og 0,5 μl høyfidelitets DNA-polymerase. Kontroller at totalvolumet er 50 μL.
    4. Plasser røret direkte i termocykleren og kjør termocyklerprogrammet. Bruk prøvene umiddelbart eller frys og lagre dem ved -20 ° C.
      MERK: Still termocyklerprogrammet til: en syklus i 3 minutter ved 98 ° C; 30 sykluser i 10 s ved 98 ° C, 20 s ved 55 ° C (i henhold til primerens annealingstemperatur) og 1 min (i henhold til lengden av de biologiske delene) ved 72 ° C; Og en syklus i 10 minutter ved 72 ° C. Hold prøven ved 16 ° C.
    5. Rens PCR-produktet ved hjelp av en PCR-oppryddingTem kit; Følg produsentens protokoll.
    6. Fordel C-Brick-standardvektoren med BamHI: Tilsett 34 μL ultrahelt vann, 10 μl plasmid (1 μg), 5 μl 10x buffer og 1 μl BamHI til mikrocentrifugerøret. Inkuber i opptil 2 timer ved 37 ° C i et vannbad.
    7. Rens det ovennevnte produktet ved hjelp av et system for opprydding av gel Følg produsentens protokoll.
    8. Tilsett 2 μL lineærisert vektor (50 ng) fra trinn 2.2.7, 5 μl fragment (200 ng) fra trinn 2.2.4, 2 μl 5x sømløs monteringsbuffer og 1 μl sømløs monteringsenzym fra et sømløst forsamlingssett Til en 1,5 ml mikrocentrifugerør. Kontroller at totalvolumet er 10 μl.
    9. Plasser dette i et 37 ° C vannbad i 30 minutter. Bruk prøvene umiddelbart eller frys og lagre dem ved -20 ° C.
  3. Konstruksjon via restriksjonsenzym-mediert fordøyelse og T4 DNA ligase-mediert ligering.
    MERK: For de delene som er oppnådd fra BioBrick (trinn 2.3.4-2.3.7) og BglBrick (trinn 2.3.1-2.3.3), kan restriksjonsenzym-mediert fordøyelse og T4 DNA ligase-mediert ligering brukes til å sette inn Biologiske deler i en C-Brick standardvektor.
    1. Fordel BglBrick-standarddelene med BamHI og BglII: Tilsett 34 μL ultra rent vann, 10 μl plasmid (2 μg), 5 μl 10x buffer 3, 0,5 μl BamHI og 0,5 μl Bglll til mikrocentrifugerøret. Inkuber i 2 timer i et 37 ° C vannbad.
    2. Kjør en 1% agaroselelektroforese og rens fragmentet ved hjelp av et system for rensing av gel.
    3. Liger fragmentet og C-Brick standardvektoren: Tilsett 2 μL linearisert vektor (50 ng) fra trinn 2.1.12 og 6 μl fragment (200 ng) fra trinn 2.3.3 til et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Tilsett 1 μl 10 x T4 DNA ligase buffer og 1 μl T4 DNA ligase. Inkuber i 2 timer ved 22 ° C. Bruk prøvene umiddelbart eller frittE og lagre dem ved -20 ° C.
    4. Fordel BioBrick-standarddelene med XbaI og SpeI: Tilsett 34 μL ultra-rent vann, 10 μl plasmid (2 μg), 5 μl 10x buffer, 0,5 μl Xbal og 0,5 μL SpeI til mikrocentrifugerøret. Inkuber i 2 timer i et 37 ° C vannbad.
    5. Fordel C-Brick-standardvektoren med XbaI og SpeI: Tilsett 34 μL ultra rent vann, 10 μl plasmid (1 μg), 5 μl 10x buffer, 0,5 μl Xbal og 0,5 μL SpeI til mikrocentrifugerøret . Inkuber i 2 timer i et 37 ° C vannbad.
    6. Kjør en 1% agaroselelektroforese og rens fragmentet fra trinn 2.3.4 og den lineære vektoren fra trinn 2.3.5 med et gelopprydningssystemsett; Følger produsentens protokoll.
    7. Ligat fragmentet og C-Brick vektoren: Tilsett 2 μL linearisert vektor (50 ng) fra trinn 2.3.5 og 6 μl fragment (200 ng) fra trinn 2.3.4 til et 1,5 ml mikrocentrifugerør. annonseD 1 μl 10x T4 DNA ligase buffer og 1 μl T4 DNA ligase. Inkuber i 2 timer ved 22 ° C. Bruk prøvene umiddelbart eller frys og lagre dem ved -20 ° C.
  4. Tilsett 10 μL av produktene fra trinn 2.1.8, 2.2.9, 2.3.3 eller 2.3.7 for kjemisk transformasjon i de kompetente cellene i E. coli (DH10B).
  5. Pick-up flere kloner til et 5 ml flytende Luria-Bertani (LB) rør og inkuber ved 37 ° C på en shaker (220 rpm) over natten.
  6. Ekstraher plasmidet ved bruk av et plasmidpreparasjonssett; Følg produsentens protokoll.
  7. Identifiser de riktige klonene ved Sanger-sekvensering 11 .

3. C-Brick Assembly ( Figur 2 )

  1. Fordøyelse av C-Brick-vektoren med Cpf1
    1. Tilsett 22,5 μL RNase-fri vann, 4 μl 10x Cpf1 buffer, 10 μl av plasmidet fra trinn 2.6 (1 μg), 0,5 μl RRI og 1# 181; L av Cpf1 (5 uM) til et 1,5 ml mikrosentrifugerør.
      MERK: Cpf1 kan kjøpes kommersielt eller renses etter protokollen i en tidligere studie 4 .
    2. For å sette inn et fremmed DNA-fragment i T1- og T2-stedene, tilsett 1 μl crRNA-T2 (10 μM) og inkuber i et vannbad ved 37 ° C i 30 minutter. A dd 1 μl crRNA-T1 (10 μM) og Cpf1 (5 μM) i ytterligere 30 min.
      MERK: Alternativt, for å sette inn et fremmed DNA-fragment i T3- og T4-stedene, tilsett 1 μl crRNA-T3 (10 μM) og inkuber i et vannbad ved 37 ° C i 30 minutter. Tilsett 1 μl crRNA-T4 (10 μM) i ytterligere 30 minutter.
    3. Tilsett 1 μl av termosensitiv alkalisk fosfatase og inkuber røret i et 37 ° C vannbad i ytterligere 1 time.
    4. Kjør en agarosegelelektroforese og rens vektoren ved hjelp av et system for rensing av gel. Bruk prøvene umiddelbart eller frys og lagre dem ved -20 ° C.
    Spaltning av DNA-fragmentet med Cpf1
    1. Tilsett 21,5 μL RNase-fri vann, 4 μl 10x Cpf1 buffer, 10 μl plasmid fra trinn 2.6 (2 μg), 0,5 μl RRI og 2 μl Cpf1 (5 μM) til et 1,5 ml mikrosentrifugerør.
    2. For å sette inn et fremmed DNA-fragment i T1- og T2-stedene, tilsett 1 μl crRNA-T1 (10 μM) og 1 μl crRNA-T3 (10 μM) og inkuber i et vannbad ved 37 ° C i 2 timer.
      MERK: Tilsett 1 μl crRNA-T2 (10 μM) og 1 μl crRNA-T4 (10 μM) og inkuber i et vannbad ved 37 ° C i 2 timer.
    3. Kjør en agarosegelelektroforese og rens fragmentet ved hjelp av et system for rensing av gel. Bruk prøvene umiddelbart eller frys og lagre dem ved -20 ° C.
  2. C-Brick-montering og videre verifisering
    1. Ligere det fremmede DNA-fragmentet og C-Brick-vektoren: Tilsett 2 μL av den lineariserte vektoren (50 ng) fra trinn 3.1.4 og 6 μl av DNA-fragmentet (200 ng) fra trinn 3.2.3 til et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Tilsett 1 μl 10x T4 DNA ligase buffer og 1 μl T4 DNA ligase. Inkuber i 2 timer ved 22 ° C. Bruk prøvene umiddelbart eller frys og lagre dem ved -20 ° C.
    2. Tilsett 10 μl av ligasjonsproduktene (trinn 3.3.1) for kjemisk transformasjon i E. coli (DH10B) -kompetente celler.
    3. Tilsett flere kloner til et 5 ml flytende LB-rør og inkuber natten over på en rister ved 220 rpm og 37 ° C.
    4. Ekstraher plasmidet ved bruk av et plasmidpreparasjonssett; Følg produsentens protokoll.
    5. Identifiser korrekte kloner ved Sanger-sekvensering 11 .
  3. Utfør en ny runde med C-Brick-montering. Korrekte kloner fra trinn 3.3.4 kan brukes som en ny C-Brick-vektor eller DNA-del for videre iterativ C-Brick-montering, etter samme protokoll fra trinn 3.1-3.3.
    MERK: T2 'og T3' sItes er utformet som backup av T2 og T3 nettsteder ( figur 1a ). For plasmider oppnådd fra trinn 2.3.7, kan bare T2 'og T3' brukes til C-Brick-standardmonteringen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokollen demonstrerte montering av tre kromoproteinkassetter (cjBlue (BBa_K592011), eforRed (BBa_K592012) og amilGFP (BBa_K592010)). Først klones de kodende sekvensene av de tre ovennevnte gener og terminatorer individuelt i en C-Brick-standardvektor. Korte DNA-deler, promotor og terminator ble introdusert i C-Brick-vektoren gjennom PCR-amplifisering ved anvendelse av primere som inneholdt de korte DNA-delene på 5'-terminalen. Dette ble fulgt av selv-ligeringsmetoden. Tre kromoprotein-kodende sekvenser ble først de novo syntetisert og deretter klonet inn i C-Brick standardvektoren gjennom sømløs samling. Primrene ble beskrevet i en tidligere studie 4 .

Etter det ble cjBlue, eforRed og amilGFP-sekvenser ligert med terminator- og promotorsekvenser i samme prosedyre som vist i"Xfig"> Figur 2. Korrekte konstruksjoner ble transformert til E. coli , og demonstrerte vakre farger ( figur 3a ). Deretter ble to fargeuttrykkskassetter samlet sammen med C-Brick-standarden for å skape flere farger ( dvs. den røde fargen fra amilGFP pluss eforRed, den grønne fargen fra amilGFP pluss cjBlue og den lyse lilla fargen fra eforRed pluss cjBlue; Figur 3b ).

Figur 1
Figur 1: C-Brick Standard Interface DNA Sequence og C-Brick Standard Vector. ( A ) Sekvensen av C-murstein standardgrensesnittet-T1, T2, T3, T4, T2 ', T3'-kan gjenkjennes av dets tilsvarende crRNA og deretter innføres i et 5'-overheng ved bruk av Cpf1. Spaltningen av T2 og T3 (eller T2 'og T3') -steder produserer komplementær overhenger. Med de åtte restriksjonene utformet, er C-Brick-standarden delvis kompatibel med BioBrick og BglBrick. ( B ) Plasmidkart for C-Brick-standardvektoren med restriksjonsfordøyelsessteder. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2
Figur 2: Arbeidsflyten for DNA-montering i C-Brick Standard. Cpf1-fordøyede T2- og T3-målsteder frembringer komplementære kohesive ender av henholdsvis "GGATC" og "GATCC", som kan ligeres for å generere et kort "GGATCC" arr. Detaljert prosedyrer finnes i trinn 3 i teksten ("C-Brick assembly"). Vennligst klikk her til Se en større versjon av denne figuren.

Figur 3
Figur 3: Fargerike bakteriepigmenter Produsert av E. coli Harbour Constructs Montert i C-Brick Standard. ( A ) Tre kromoproteiner ble uttrykt i E. coli vokst på en plate. Bakterier uten kromoproteiner (negativ kontroll) er vist på den 4. plate. ( B ) Tre kromoproteiner og tre sammenstillede doble kromoproteiner ble uttrykt i E. coli dyrket i flytende LB-medium. Fra 1 til 6 uttrykte konstruksjonene eforRed (1), amilGFP (2), cjBlue (3), amilGFP pluss eforRed (4), amilGFP pluss cjBlue (5) og eforRed pluss cjBlue (6). De fargerike bakteriene på en enkelt plate eller i et enkelt mikrocentrifugerør ble dyrket fra en enkelt sekvens-verifisert klon. Les / ftp_upload / 55775 / 55775fig3large.jpg "target =" _ blank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Navn sekvens
T7-F GAAATTAATACGACTCACTATAGGG
T7-T1-R gaattcagtagaaagttgcgataaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC
T7-T2'-R ctagagtaaagcttgaattcagtaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC
T7-T2-R ggatcctttctcctctttctagagATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC
T7-T3-R ggatccactagtctctagctcgaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC
T7-T3'-R ctctagctcgagaaattcaaggaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC
T7-T4-R ttcaagggaaactgcagctagctATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC

Tabell 1: Oligos for fremstilling av crRNA transkripsjonsmaler benyttet i denne studien. T7-F var toppstrengoligonukleotidet, og de andre var bunnstreng-oligonukleotidene. De små bokstaver i sekvensen blir transkribert i styresekvensen i crRNA.

navnene RNA-sekvenser (5'-3 ')
crRNA-T1 GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUUAUCGCAACUUUCUACUGAAUUC
crRNA-T2 GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUCUCUAGAAAGAGGAGAAAGGAUCC
crRNA-T3 GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUCGAGCUAGAGACUAGUGGAUCC
crRNA-T4 GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUAGCUAGCUGCAGUUUCUCCUUGAA
crRNA-T2' GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUACUGAAUUCAAGCUUUACUCUAG
crRNA-T3' GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUCCUUGAAUUUCUCGAGCUAGAG

Tabell 2: CrRNA-sekvensene som brukes i denne studien. CrRNAene ble fremstilt gjennom in vitro transkripsjonen i trinn 1 i teksten ("Fremstilling av crRNA").

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen beskriver en prosedyre for DNA-monteringsstandarden C-Brick. Det viktigste trinnet i denne protokollen er linearisering av C-Brick-standardvektoren; Ufullstendig spalting av vektoren kan på alvor påvirke suksessraten. I tillegg, selv om Cpf1 hovedsakelig spalter mål-DNA-sekvenser i "18-23" spaltningsmønsteret, ble også unøyaktig spaltning nær de to basene detektert 4 , noe som kan forårsake et lite antall mutasjoner etter DNA-montering. Derfor er Sanger-sekvensering nødvendig for å verifisere den samlede konstruksjonen.

Effektiviteten til C-Brick-samlingen er lavere enn tradisjonelle restriksjonsenzym- og ligeringsmetoder som er blitt beskrevet i en tidligere studie 4 . Den viktigste årsaken som påvirker samleeffektiviteten, kan være de unøyaktige spaltningsegenskapene til Cpf1. I fremtiden kan forbedringer av spaltningsnøyaktigheten være ekstremt nyttig for standarden aNd blir for tiden undersøkt.

C-Brick er også delvis kompatibel med BglBrick og BioBrick standarder. For eksempel kan BglBrick-deler kuttes med Bglll og BamHI og deretter settes inn i BamHI-stedet av en C-Brick-standardvektor, som genererer en C-Brick-del. Imidlertid bør innsetningsretningen til BglBrick-delen verifiseres, og det ville være et "GGATCT" arr etter montering. Når en C-Brick-DNA-del oppnås fra en BioBrick-del ( dvs. med XbaI og SpeI-fordøyelse), vil begge T2- og T3-stedene bli ødelagt, og to backup Cpf1-målsekvenser (T2 'og T3') kan brukes.

Siden Cpf1-spaltningen krever sgRNA, som er ekstremt følsom for RNase, bør alle materialer være RNase-fri. For tiden kan alle C-Brick standardvektorer, RNase-fri Cpf1-nukleaser og crRNAer bestilles kommersielt 12 . Derfor er prosedyrene for C-Brick faktisk like enkle som for BioBrick standard.

I de siste årene har flere nyttige DNA-samlingsmetoder blitt utviklet og brukt mye, inkludert Golden Gate Assembly 13 , Gibson Assembly 14 og andre 15 . Men da DNA-monteringsstandarder har potensial til å gi kostnadseffektiv, pålitelig, høy gjennomstrømning og automatiske samlingsreaksjoner 5 , kan standarder forenkle konstruksjon og testing av nyutviklede eller omformede gener, genetiske kretser og baner 15 , 16 , 17 , spesielt innen syntetisk biologi. Blant de nåværende publiserte DNA-monteringsstandardene har C-Brick-standarden både åpenbare fordeler og ulemper 4 ( dvs. ligeringseffektiviteten). Hvis ligasjonseffektiviteten er forbedret, kan standarden bli allment vedtatt i fremtiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Shanghai Tolo Biotech for deres tekniske assistanse under utviklingen av C-Brick-standarden. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Det kinesiske vitenskapsakademiets strategiske prioritetsforskningsprogram (Grant No. XDB19040200).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Comercial Oligonucleotide Sangon Biotech
10x Taq PCR Buffer Transgen #J40928
Ultra Pure Distilled Water Invitrogen 10977-015
5x RNA Transcription Buffer Thermo Scientific K0441
T7 RNA polymerase Thermo Scientific #EP0111
NTP mixture Sangon #ND0056
RRI (Recombinant RNase Inhibitor) Takara 2313A
RNA Clean & Concentrator-5 Zymo Research R1015
UV-Vis Spectrometer Thermo Scientific Nano-Drop 2000c
2x Phanta Max Buffer Vazyme PB505 PCR buffer
dNTPs Transgen AD101
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase Vazyme P505-d1
Ezmax for One-step Cloning Tolobio 24303-1 seamless assembly kit
5x Buffer for Ezmax One-step Cloning Tolobio 32006
BamHI NEB #R0136L
BamHI-HF NEB #R3136L
BglII  NEB #R0144L
XbaI NEB #R0145L
SpeI NEB #R3133L
10x Buffer 3 NEB #B7003S
10x CutSmart Buffer NEB B7204S
10x T4 DNA ligase Buffer Tolobio 32002
T4 PNK Tolobio 32206
T4 DNA ligase Tolobio 32210
DpnI NEB #R01762
SV Gel and PCR clean-up system Promega A9282
Plasmid Mini Kit I Omega D6943-02 plasmid preparation kit
thermosensitive alkaline phosphatase  Thermo Scientific #EF0651 FastAP
10x Cpf1 buffer Tolobio 32008
Cpf1 Tolobio 32105 FnCpf1
thermocycler Applied Biosystems veriti 96 well
C-Brick standard vector Tolobio 98101
E. coli [DH10B] Invitrogen 18297010
Luria-Bertani media (tryptone) Oxoid LP0042
Luria-Bertani media (yeast extract) Oxoid LP0021
Luria-Bertani media (NaCl) Sangon Biotech B126BA0007

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Canton, B., Labno, A., Endy, D. Refinement and standardization of synthetic biological parts and devices. Nat Biotechnol. 26 (7), 787-793 (2008).
  2. Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. J Biol Eng. 2, (2008).
  3. Knight, T. Idempotent Vector Design for Standard Assembly of Biobricks. , MIT Artificial Intelligence Laboratory; MIT Synthetic Biology Working Group. 1-11 (2003).
  4. Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J. C-Brick: A New Standard for Assembly of Biological Parts Using Cpf1. ACS Synth Biol. 5 (12), 1383-1388 (2016).
  5. Anderson, J. C., et al. BglBricks: A flexible standard for biological part assembly. J Biol Eng. 4 (1), (2010).
  6. Liu, J. K., Chen, W. H., Ren, S. X., Zhao, G. P., Wang, J. iBrick: a new standard for iterative assembly of biological parts with homing endonucleases. PLoS One. 9 (10), e110852 (2014).
  7. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  8. Wright, A. V., Nunez, J. K., Doudna, J. A. Biology and Applications of CRISPR Systems: Harnessing Nature's Toolbox for Genome Engineering. Cell. 164 (1-2), 29-44 (2016).
  9. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  10. Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
  11. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  12. Shanghai Tolo Biotechnology Company Limited. , Shanghai 200233, China. Available from: http://www.tolobio.com/ (2017).
  13. Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method. PLoS One. 3 (11), e3647 (2008).
  14. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  15. Casini, A., Storch, M., Baldwin, G. S., Ellis, T. Bricks and blueprints: methods and standards for DNA assembly. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (9), 568-576 (2015).
  16. Cameron, D. E., Bashor, C. J., Collins, J. J. A brief history of synthetic biology. Nat Rev Microbiol. 12 (5), 381-390 (2014).
  17. Keasling, J. D. Synthetic biology for synthetic chemistry. ACS Chem Biol. 3 (1), 64-76 (2008).

Tags

Genetikk utgave 124 syntetisk biologi CRISPR Cpf1 C-Brick klebrig endene DNA-montering, Monteringsstandard
Protokoller for C-Brick DNA Standard Assembly Bruke Cpf1
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J.… More

Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J. Protocols for C-Brick DNA Standard Assembly Using Cpf1. J. Vis. Exp. (124), e55775, doi:10.3791/55775 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter