Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Protokoller til C-Brick DNA Standard Assembly ved anvendelse af Cpf1

Published: June 15, 2017 doi: 10.3791/55775
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute of Plant Physiology and Ecology, Shanghai Insititutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences

Summary

CRISPR-associeret protein Cpf1 kan styres af et specielt designet CRISPR-RNA (crRNA) til spaltning af dobbeltstrenget DNA på ønskede steder, der genererer klæbrige ender. Baseret på denne egenskab blev en DNA-samlingsstandard (C-Brick) etableret, og en protokol, der beskriver dens anvendelse, er beskrevet her.

Abstract

CRISPR-associeret protein Cpf1 spalter dobbeltstrenget DNA under vejledning af CRISPR RNA (crRNA), der genererer klæbrige ender. På grund af denne egenskab er Cpf1 blevet anvendt til etablering af en DNA-samlingsstandard kaldet C-Brick, som har fordelen ved lange genkendelsessteder og korte ar. På en standard C-Brick-vektor er der fire Cpf1-genkendelsessteder - præfiks (T1 og T2-steder) og suffikset (T3 og T4-steder) - flankerende biologiske DNA-dele. Klyvningen af ​​T2- og T3-steder producerer komplementære klæbrige ender, hvilket muliggør samling af DNA-dele med T2- og T3-steder. I mellemtiden genereres et kort "GGATCC" ar mellem dele efter samling. Da det nydannede plasmid igen indeholder de fire Cpfl-spaltningssteder, muliggør fremgangsmåden den iterative samling af DNA-dele, hvilket svarer til de af BioBrick og BglBrick-standarder. En procedure, der beskriver brugen af ​​C-Brick-standarden for at samle DNA-deleEr beskrevet her. C-Brick-standarden kan i vid udstrækning anvendes af forskere, kandidater og bachelorstuderende, og endda amatører.

Introduction

Standardiseringen af ​​DNA-biologiske dele er vigtig for udviklingen af ​​syntetisk biologi 1 . Udviklingen af ​​en DNA-samlingsprocedure kan erstatte ad hoc- eksperimentelle designs og fjerne mange af de uventede resultater, der opstår under samlingen af ​​genetiske komponenter i større systemer. BioBrick-standarden (BBF RFC 10) var en af ​​de tidligste foreslåede DNA-monteringsstandarder. Den anvender præfiksekvensen (indeholdende EcoRI- og XbaI-skæresites) og suffiksekvensen (indeholdende SpeI- og PstI-skæresites) 2 , 3 . Fordi XbaI og SpeI har komplementære sammenhængende ender, kan BioBrick DNA-dele, der er skåret med XbaI og SpeI, sammenføjes og generere en ny BioBrick til yderligere iterativ samling.

Nogle defekter er blevet identificeret ved brug af BioBrick standard 4 . For eksempel producerer den en 8-bp arMellem DNA-delene, hvilket ikke tillader konstruktion af in-fusionsproteiner. Desuden skal de fire ovennævnte typer af 6-bp restriktionssteder fjernes fra DNA-delene, hvilket er meget ubelejligt. BglBrick-standarden blev oprettet for at løse det første problem 5 . Det skaber en 6-bp "GGATCT" ar, der producerer Gly-Ser og giver mulighed for fusion af flere proteiner eller protein domæner. IBrick blev udviklet til at håndtere det andet problem 6 . Det bruger homing endonucleases (HEs), som genkender lange DNA-sekvenser. Da HE-genkendelsesstederne sjældent findes i naturlige DNA-sekvenser, kan iBrick-standarden anvendes til direkte konstruktion af iBrick-dele uden at ændre deres DNA-sekvenser. Imidlertid forlader iBrick-standarden en 21 bp ar mellem DNA-delene, hvilket kan være årsagen til dens upopularitet.

I de senere år har de klyngede regelmæssigt adskilt korte palindromiske gentagelser (CRISPR) system har udviklet sig hurtigt 7 , 8 . Blandt de CRISPR-associerede (Cas) proteiner anvendes Cas9 endonuklease fra Streptococcus pyogenes i vid udstrækning . Det introducerer for det meste dobbeltstrengede DNA-pauser (DSB'er) med stumpe ender 9 .

I 2015 karakteriserede Zhang og kollegaer Cpf1 (CRISPR fra Prevotella og Francisella 1) for første gang. Det tilhører klasse 2 type V CRISPR-Cas-systemet og er en CRISRP RNA (crRNA) -guided endonuclease 10 . I modsætning til Cas9 introducerer Cpf1 en DSB med et 4 eller 5 nt 5 'overhæng 10 . Baseret på denne karakteristik blev Cpf1 brugt til at udvikle en DNA-samlingsstandard, C-Brick 4 . På en C-Brick-standardvektor flankerer fire Cpf1-målsteder af præfikset T1 / T2 og suffixet T3 / T4 de biologiske dele; Dette ligner BioBrick-standarden. Som spaltningen af ​​T2 og T3 sites pRoduces komplementære klæbrige ender, er det muligt at udføre den iterative samling af DNA-dele under dannelse af et "GGATCC" ar mellem delene. C-Brick-standarden har især to hovedfordele: At genkende lange målsekvenser og forlade korte ar. Den 6 bp "GGATCC" ar, der er genereret af C-Brick, koder for Gly-Ser, som muliggør konstruktion af fusionsproteiner. Desuden er C-Brick-standarden også delvist kompatibel med BglBrick og BioBrick standarderne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling af crRNA

  1. Fremstilling af crRNA-skabeloner
    1. Re-suspendere individuelle oligonukleotider ( tabel 1 ) i RNase-frit vand til en koncentration på 10 μM.
    2. Tilsæt 22,5 μL topstrengoligonukleotid (T7-F i tabel 1 ), 22,5 μl bundstrengoligonukleotid ( tabel 1 ) og 5 μl 10x glødemiddelbuffer til et 0,2 ml PCR-rør. Sørg for, at det totale volumen er 50 μL.
      BEMÆRK: Seks forskellige bundstreng-oligonukleotider er vist i tabel 1 , som hver især skal parres individuelt med topstrengen T7-F. De små bogstaver i tabel 1 repræsenterer den sekvens, der skal transkriberes i styresekvensen af ​​crRNA. 10x Taq PCR buffer kan anvendes i stedet for 10x annealing buffer.
    3. Anbring PCR-røret i en termocykler.
    4. Kør glødningsprogrammet: initial denaturering ved 95 ° C for5 min og derefter en nedkøling fra 95-20 ° C, med et 1 ° C fald pr. Min på termocykleren.
      BEMÆRK: Brug straks prøverne til trin 1.2.1.
  2. Transkription og oprensning af crRNA
    1. Tilsæt 38 μL RNase-frit vand, 8 μl af skabelonen fra trin 1.1.4, 20 μl 5x T7 transkriptionsbuffer, 20 μl NTP-blanding (10 μM), 4 μl rekombinant RNase-inhibitor (RRI) og 10 μl Μl T7 RNA-polymerase til et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Sørg for, at det totale volumen er 100 μL.
    2. Sæt mikrocentrifugerøret i et 37 ° C vandbad natten over (i ca. 16 timer).
    3. Brug et RNA oprensnings- og koncentrationssæt til at rense det transkriberede RNA; Følg producentens protokol.
    4. Kvantificere RNA'erne med UV-Vis-spektrofotometre og fortynd RNA'et til en koncentration på 10 μM. Brug prøverne øjeblikkeligt eller opbevar dem ved -80 ° C.
      BEMÆRK: CrRNA-sekvensenS er angivet i tabel 2 .

2. Konstruktion af C-Brick Dele ( dvs. indsættelse af biologiske dele i en C-Brick Standard Vector)

BEMÆRK: Dette trin har tre undertrin. For korte biologiske dele ( f.eks. Promotorer og terminatorer) er det bedst at anvende den direkte PCR-metode til at indsætte de biologiske dele i en C-Brick standard vektor 4 . Hele vektorsekvensen er vist i supplerende data, og præfiks- og suffiksekvensen er vist i figur 1 (trin 2.1 nedenfor). For biologiske dele, der let kan opnås via PCR ( f.eks. Med skabeloner af genomisk DNA, plasmider eller de novo syntetiserede DNA-sekvenser), er det bedst at anvende den sømløse samlefremgangsmåde til at indsætte de biologiske dele i en C-Brick standard vektor (Trin 2.2 nedenfor). For de dele opnået fra BioBrick og BglBrick standarder, begrænsningEnzymmedieret fordøjelse og T4-DNA-ligasemedieret ligering kan anvendes til at indsætte de biologiske dele i en C-Brick-standardvektor (trin 2.3 nedenfor).

  1. Konstruktion via direkte PCR-amplifikation
    1. Design og orden oligonukleotider til PCR amplifikation.
      BEMÆRK: 5'-enden af ​​oligonukleotidet indeholder sekvensen af ​​DNA-delen, og 3'-enden af ​​oligonukleotidet indeholder vektorsekvensen ( dvs. "GGATCCACTAGTCTCTAGCTCG" ved 3'-enden af ​​fremadgående streng og "GGATCCTTTCTCCTCTTTCTAG" I den omvendte streng). Hverken overhæng eller overløb på over 20 bp kan udformes ved 5'-enden af ​​oligonukleotidet. Specifikke eksempler kan findes i en tidligere undersøgelse 4 .
    2. Re-suspendere individuelle oligonukleotider i ultra rent vand til en koncentration på 10 μM.
    3. Opsæt PCR-reaktioner på is i et 0,2 ml PCR-rør: Tilsæt 18 μL ultrahert vand, 25 μl 2 x PCR-buffer, 1 μl dNTP'er (10 μM), 2,5 μl hver af de fremadrettede og reversere primere (10 μM) fra trin 2.1.2, 0,5 μl C-Brick standardvektor (50 ng) som en skabelon og 0,5 μl Af højfidelitets DNA-polymerase. Sørg for, at det totale volumen er 50 μL.
    4. Placer røret direkte i en termocykler og start termocyklerprogrammet. Brug prøverne øjeblikkeligt eller fryse og opbevar dem ved -20 ° C.
    5. Thermocycler program: en cyklus i 3 minutter ved 98 ° C; Tredive cyklusser i 10 s ved 98 ° C, 20 s ved 55 ° C og 2 minutter ved 72 ° C; Og en cyklus i 10 minutter ved 72 ° C. Opbevar prøven ved 16 ° C.
    6. Tilsæt 9 μl af blandingen fra trin 2.1.4 til et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
    7. Tilsæt 1 μl Dpnl og inkuber i 1 time i et 37 ° C vandbad.
      BEMÆRK: Hvis primrene ikke har nogen overlappende sekvenser, tilsættes 0,5 μl T4-polynukleotidkinase (PNK) og 0,5 μl T4-DNA-ligase og inkuberes iEt 22 ° C vandbad i 1 time. Hvis primrene indeholder en ~ 20 nt overlappende sekvens, transformerer de ellers DpnI-behandlede produkter direkte til E. coli (DH10B) -competente celler (trin 2.4). Det lineariserede PCR-produkt cirkuleres ved hjælp af rekombinationssystemet i værten.
    8. Brug prøverne øjeblikkeligt eller opbevar dem ved -20 ° C.
  2. Konstruktion via sømløs samling
    1. Design og orden oligonukleotider til PCR amplifikation.
      BEMÆRK: 3'-enden af ​​oligonukleotidet indeholder den terminale sekvens af DNA-delen, og 5'-enden af ​​oligonukleotidet indeholder terminalen af ​​den lineariserede C-Brick-standardvektor-sekvens ( dvs. "CTAGAAAGAGGAGAAAGGATCC" for 5'- -enden af ​​den fremadgående streng og "CGAGCTAGAGACTAGTGGATCC" for 5'-enden af ​​den omvendte streng). Specifikke eksempler kan findes i en tidligere undersøgelse 4 .
    2. Tilbagestill individetUal oligonukleotider i ultra rent vand til en koncentration på 10 μM.
    3. Opsætning af PCR-reaktioner på is i et 0,2 ml PCR-rør: Tilsæt 18 μL ultrahert vand, 25 μl 2x PCR-buffer, 1 μL dNTP'er (10 μM), 2,5 μl hver af de fremadrettede og reversere primere (10 μM ) Fra trin 2.2.2, 0,5 μl skabelon (20-500 ng) og 0,5 μl højfidelitets DNA-polymerase. Sørg for, at det totale volumen er 50 μL.
    4. Placer røret direkte i termocykleren og kør termocyklerprogrammet. Brug prøverne øjeblikkeligt eller fryse og opbevar dem ved -20 ° C.
      BEMÆRK: Indstil termocyklerprogrammet til: en cyklus i 3 minutter ved 98 ° C; 30 cyklusser i 10 s ved 98 ° C, 20 s ved 55 ° C (ifølge primerens glødningstemperatur) og 1 min (ifølge længden af ​​de biologiske dele) ved 72 ° C; Og en cyklus i 10 minutter ved 72 ° C. Opbevar prøven ved 16 ° C.
    5. Rens PCR-produktet ved hjælp af en PCR-oprydningssystemTem kit; Følg producentens protokol.
    6. Fordel C-Brick standardvektoren med BamHI: Tilsæt 34 μL ultrahert vand, 10 μl plasmid (1 μg), 5 μl 10x buffer og 1 μl BamHI til mikrocentrifugerøret. Inkubér i op til 2 timer ved 37 ° C i et vandbad.
    7. Rens det ovennævnte produkt ved hjælp af et geloprensningssystem kit; Følg producentens protokol.
    8. Tilsæt 2 μL lineariseret vektor (50 ng) fra trin 2.2.7, 5 μl fragment (200 ng) fra trin 2.2.4, 2 μl 5x sømløs samlingsbuffer og 1 μl sømløs samlingsenzym fra et sømløs samlingssæt Til en 1,5 ml mikrocentrifugerør. Sørg for, at det totale volumen er 10 μl.
    9. Anbring dette i et 37 ° C vandbad i 30 minutter. Brug prøverne øjeblikkeligt eller fryse og opbevar dem ved -20 ° C.
  3. Konstruktion via restriktionsenzym-medieret fordøjelse og T4 DNA ligase-medieret ligering.
    BEMÆRK: For de dele, der er opnået fra BioBrick (trin 2.3.4-2.3.7) og BglBrick (trin 2.3.1-2.3.3) standarder, kan restriktionsenzym-medieret fordøjelse og T4 DNA ligase-medieret ligering anvendes til at indsætte Biologiske dele i en C-Brick standard vektor.
    1. Fordel BglBrick standarddelene med BamHI og BglII: Tilsæt 34 μL ultrahurt vand, 10 μl plasmid (2 μg), 5 μl 10x buffer 3, 0,5 μl BamHI og 0,5 μl BglII til mikrocentrifugerøret. Inkubér i 2 timer i et 37 ° C vandbad.
    2. Kør en 1% agaroselelektroforese og rens fragmentet under anvendelse af et geloprensningssystem.
    3. Ligér fragmentet og C-Brick standardvektoren: Tilsæt 2 μL lineariseret vektor (50 ng) fra trin 2.1.12 og 6 μl fragment (200 ng) fra trin 2.3.3 til et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Tilsæt 1 μl 10 x T4 DNA ligase buffer og 1 μl T4 DNA ligase. Inkubér i 2 timer ved 22 ° C. Brug prøverne straks eller freezE og opbevar dem ved -20 ° C.
    4. Fordel BioBrick standarddelene med XbaI og SpeI: Tilsæt 34 μL ultrahert vand, 10 μl plasmid (2 μg), 5 μl 10x buffer, 0,5 μl Xbal og 0,5 μl SpeI til mikrocentrifugerøret. Inkubér i 2 timer i et 37 ° C vandbad.
    5. Fordel C-Brick-standardvektoren med XbaI og SpeI: Tilsæt 34 μL ultrahert vand, 10 μl plasmid (1 μg), 5 μl 10x buffer, 0,5 μl Xbal og 0,5 μl SpeI til mikrocentrifugerøret . Inkubér i 2 timer i et 37 ° C vandbad.
    6. Kør en 1% agarosegelelektroforese og rens fragmentet fra trin 2.3.4 og den lineariserede vektor fra trin 2.3.5 med et geloprensningssystem kit; Efter producentens protokol.
    7. Ligér fragmentet og C-Brick-vektoren: Tilsæt 2 μL lineariseret vektor (50 ng) fra trin 2.3.5 og 6 μl fragment (200 ng) fra trin 2.3.4 til et 1,5 ml mikrocentrifugerør. AdD 1 μl 10x T4 DNA ligase buffer og 1 μl T4 DNA ligase. Inkubér i 2 timer ved 22 ° C. Brug prøverne øjeblikkeligt eller fryse og opbevar dem ved -20 ° C.
  4. Tilsæt 10 μL af produkterne fra trin 2.1.8, 2.2.9, 2.3.3 eller 2.3.7 til kemisk omdannelse til de kompetente celler i E. coli (DH10B).
  5. Pick-up flere kloner til et 5 ml flydende Luria-Bertani (LB) rør og inkuber ved 37 ° C på en shaker (220 rpm) natten over.
  6. Ekstraher plasmidet ved anvendelse af et plasmidforberedelseskit; Følg producentens protokol.
  7. Identificer de korrekte kloner ved Sanger-sekventering 11 .

3. C-Brick Assembly ( Figur 2 )

  1. Fordøjelse af C-Brick-vektoren med Cpf1
    1. Tilsæt 22,5 μL RNase-frit vand, 4 μl 10x Cpf1-buffer, 10 μl af plasmidet fra trin 2,6 (1 μg), 0,5 μl RRI og 1# 181; L af Cpf1 (5 μM) til et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
      BEMÆRK: Cpf1 kan købes kommercielt eller renses efter protokollen i en tidligere undersøgelse 4 .
    2. For at indsætte et fremmed DNA-fragment i T1- og T2-stederne tilsættes 1 μl crRNA-T2 (10 μM) og inkuberes i et vandbad ved 37 ° C i 30 minutter. A dd 1 μl crRNA-T1 (10 μM) og Cpf1 (5 μM) i yderligere 30 minutter.
      BEMÆRK: For at indsætte et fremmed DNA-fragment i T3- og T4-stederne, tilføjes 1 μl crRNA-T3 (10 μM) og inkuberes i et vandbad ved 37 ° C i 30 minutter. Tilsæt 1 μl crRNA-T4 (10 μM) i yderligere 30 min.
    3. Tilsæt 1 μl termosensitiv alkalisk phosphatase og inkubér røret i et 37 ° C vandbad i yderligere 1 time.
    4. Kør en agarosegelelektroforese og rens vektoren ved hjælp af et geloprensningssystem. Brug prøverne øjeblikkeligt eller fryse og opbevar dem ved -20 ° C.
    Fordøjelse af DNA-fragmentet med Cpf1
    1. Tilsæt 21,5 μL RNase-frit vand, 4 μl 10x Cpf1-buffer, 10 μl plasmid fra trin 2,6 (2 μg), 0,5 μl RRI og 2 μl Cpf1 (5 μM) til et 1,5 ml mikrotentrifugerør.
    2. For at indsætte et fremmed DNA-fragment i T1- og T2-stederne, tilsættes 1 μl crRNA-T1 (10 μM) og 1 μl crRNA-T3 (10 μM) og inkuberes i et vandbad ved 37 ° C i 2 timer.
      BEMÆRK: Tilsæt 1 μL crRNA-T2 (10 μM) og 1 μl crRNA-T4 (10 μM) og inkuber i et vandbad ved 37 ° C i 2 timer.
    3. Kør en agarosegelelektroforese og rens fragmentet under anvendelse af et geloprensningssystem. Brug prøverne øjeblikkeligt eller fryse og opbevar dem ved -20 ° C.
  2. C-Brick samling og yderligere verifikation
    1. Ligér det fremmede DNA-fragment og C-Brick-vektoren: Tilsæt 2 μL af den lineariserede vektor (50 ng) fra trin 3.1.4 og 6 μl af DNA-fragmentet (200 ng) fra trin 3.2.3 til et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Tilsæt 1 μl 10x T4 DNA ligase buffer og 1 μl T4 DNA ligase. Inkubér i 2 timer ved 22 ° C. Brug prøverne øjeblikkeligt eller fryse og opbevar dem ved -20 ° C.
    2. Tilsæt 10 μl af ligeringsprodukterne (trin 3.3.1) til kemisk transformation i E. coli (DH10B) -kompetente celler.
    3. Tilsæt flere kloner til et 5 ml flydende LB-rør og inkuber natten over på en ryster ved 220 omdrejninger pr. Minut og 37 ° C.
    4. Ekstraher plasmidet ved anvendelse af et plasmidforberedelseskit; Følg producentens protokol.
    5. Identificer korrekte kloner ved Sanger-sekventering 11 .
  3. Udfør en ny runde C-Brick samling. Korrekte kloner fra trin 3.3.4 kan anvendes som en ny C-Brick-vektor eller DNA-del til yderligere iterativ C-Brick-samling efter samme protokol fra trin 3.1-3.3.
    BEMÆRK: T2 'og T3' sItes er designet som backup af T2 og T3 sites ( Figur 1a ). For plasmider opnået fra trin 2.3.7 kan kun T2 'og T3' anvendes til C-Brick-standardmontagen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokol demonstrerede samlingen af ​​tre kromoproteinkassetter (cjBlue (BBa_K592011), eforRed (BBa_K592012) og amilGFP (BBa_K592010)). For det første klones de kodende sekvenser af de tre ovennævnte gener og terminatorer individuelt i en C-Brick-standardvektor. Korte DNA-dele, promotor og terminator blev introduceret i C-Brick-vektoren gennem PCR-amplifikation under anvendelse af primere indeholdende de korte DNA-dele på 5'-terminalen. Dette blev efterfulgt af selv-ligeringsmetoden. Tre chromoprotein-kodende sekvenser blev først de novo syntetiseret og derefter klonet i C-Brick standardvektoren gennem sømløs samling. Primerne blev beskrevet i en tidligere undersøgelse 4 .

Derefter blev cjBlue-, eforRed- og amilGFP-sekvenser ligeret med terminator- og promotorsekvenser i samme procedure vist i"Xfig"> Figur 2. Korrekt konstruktioner blev transformeret til E. coli , hvilket demonstrerede smukke farver ( figur 3a ). Derefter blev to farveekspressionskassetter yderligere samlet med C-Brick-standarden for at skabe flere farver ( dvs. den røde farve fra amilGFP plus eforRed, den grønne farve fra amilGFP plus cjBlue og den lyserøde farve fra eforRed plus cjBlue; Figur 3b ).

figur 1
Figur 1: C-Brick Standard Interface DNA Sequence og C-Brick Standard Vector. ( A ) Sekvensen af ​​C-mursten standard grænsefladen-T1, T2, T3, T4, T2 ', T3'-kan genkendes af dens tilsvarende crRNA og indføres derefter i et 5'-overhang under anvendelse af Cpf1. Klyvningen af ​​T2 og T3 (eller T2 'og T3') sites producerer komplementære overhænger. Med de otte begrænsningssteder designet, er C-Brick-standarden delvist kompatibel med BioBrick og BglBrick. ( B ) Plasmidkort for C-Brick-standardvektoren med restriktionsfordøjelsessteder. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2
Figur 2: Arbejdsstrømmen til DNA-montering i C-Brick Standard. Cpf1-fordøjede T2- og T3-målsteder frembringer komplementære kohæsive ender af henholdsvis "GGATC" og "GATCC", som kan ligeres til dannelse af et kort "GGATCC" ar. Detaljerede procedurer findes i trin 3 i teksten ("C-Brick assembly"). Venligst klik her til Se en større version af denne figur.

Figur 3
Figur 3: Farverige bakteriepigmenter Fremstillet af E. coli Haring Constructs samlet i C-Brick Standard. ( A ) Tre chromoproteiner blev udtrykt i E. coli dyrket på en plade. Bakterier uden kromoproteiner (negativ kontrol) er vist på den 4. plade. ( B ) Tre chromoproteiner og tre samlede dobbeltchromoproteiner blev udtrykt i E. coli dyrket i flydende LB-medium. Fra 1 til 6 udtrykte konstruktionerne eforRed (1), amilGFP (2), cjBlue (3), amilGFP plus eforRed (4), amilGFP plus cjBlue (5) og eforRed plus cjBlue (6). De farverige bakterier på en enkelt plade eller i et enkelt mikrocentrifugerør blev dyrket fra en enkelt sekvens-verificeret klon. Les / ftp_upload / 55775 / 55775fig3large.jpg "target =" _ blank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.

navn sekvens
T7-F GAAATTAATACGACTCACTATAGGG
T7-T1-R gaattcagtagaaagttgcgataaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC
T7-T2'-R ctagagtaaagcttgaattcagtaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC
T7-T2-R ggatcctttctcctctttctagagATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC
T7-T3-R ggatccactagtctctagctcgaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC
T7-T3'-R ctctagctcgagaaattcaaggaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC
T7-T4-R ttcaagggaaactgcagctagctATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC

Tabel 1: Oligos til fremstilling af crRNA-transkriptionsskabeloner anvendt i denne undersøgelse. T7-F var topstreng-oligonukleotidet, og de andre var bundstreng-oligonukleotiderne. De små bogstaver i sekvensen transkriberes i styresekvensen i crRNA.

navne RNA-sekvenser (5'-3 ')
crRNA-T1 GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUUAUCGCAACUUUCUACUGAAUUC
crRNA-T2 GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUCUCUAGAAAGAGGAGAAAGGAUCC
crRNA-T3 GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUCGAGCUAGAGACUAGUGGAUCC
crRNA-T4 GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUAGCUAGCUGCAGUUUCUCCUUGAA
crRNA-T2' GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUACUGAAUUCAAGCUUUACUCUAG
crRNA-T3' GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUCCUUGAAUUUCUCGAGCUAGAG

Tabel 2: CrRNA-sekvenserne anvendt i denne undersøgelse. CrRNA'erne blev fremstillet ved in vitro transkriptionen i trin 1 i teksten ("Fremstilling af crRNA").

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol beskriver en procedure for DNA-samlingsstandarden C-Brick. Det vigtigste trin i denne protokol er lineariseringen af ​​C-Brick standardvektoren; Ufuldstændig spaltning af vektoren kunne alvorligt påvirke succeshastigheden. Selvom Cpf1 primært spalter mål-DNA-sekvenser i "18-23" spaltningsmønsteret, blev der også detekteret unøjagtig spaltning nær de to baser 4 , hvilket kan forårsage et lille antal mutationer efter DNA-samling. Derfor er Sanger-sekventering nødvendig for at verificere den samlede konstruktion.

Effektiviteten af ​​C-Brick-samlingen er lavere end traditionelle restriktionsenzym- og ligeringsmetoder, som er blevet beskrevet i et tidligere studie 4 . Den væsentligste årsag, der påvirker samleffektiviteten, kan være de unøjagtige spaltningsegenskaber for Cpf1. I fremtiden kan forbedringer af spaltningsnøjagtigheden være yderst nyttige for standarden aNd udforskes i øjeblikket.

C-Brick er også delvist kompatibel med BglBrick og BioBrick standarderne. For eksempel kan BglBrick dele skæres med Bglll og BamHI og indsættes derefter i BamHI-stedet af en C-Brick-standardvektor, der genererer en C-Brick-del. Indsatsretningen af ​​BglBrick-delen bør imidlertid verificeres, og der ville være et "GGATCT" ar efter samling. Når en C-Brick DNA-del opnås fra en BioBrick-del ( dvs. med XbaI og SpeI-fordøjelse), vil begge T2- og T3-steder blive ødelagt, og to backup-Cpf1-målsekvenser (T2 'og T3') kan anvendes.

Da Cpf1-spaltningen kræver sgRNA, som er yderst følsom overfor RNase, skal alle materialer være RNase-fri. I øjeblikket kan alle C-Brick standardvektorer, RNase-fri Cpf1 nucleaser og crRNA'er bestilles kommercielt 12 . Derfor er procedurerne for C-Brick faktisk lige så enkle som i BioBrick standard.

I de seneste år er der blevet udviklet flere nyttige DNA-samlingsmetoder, og de er meget udbredt, herunder Golden Gate Assembly 13 , Gibson Assembly 14 og andre 15 . Da DNA-samlingsstandarder har potentiale til at tilvejebringe omkostningseffektiv, pålidelig, høj gennemstrømning og automatiske samlingsreaktioner 5 , kan standarder imidlertid lette opbygningen og testningen af ​​nyudformede eller genudformede gener, genetiske kredsløb og veje 15 , 16 , 17 , især inden for syntetisk biologi. Blandt de aktuelt offentliggjorte DNA-monteringsstandarder har C-Brick-standarden både indlysende fordele og ulemper 4 ( dvs. ligeringseffektiviteten). Hvis ligeringseffektiviteten er forbedret, kan standarden i vid udstrækning vedtages i fremtiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker Shanghai Tolo Biotech for deres tekniske assistance under udviklingen af ​​C-Brick-standarden. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra det kinesiske videnskabelige videnskabs videnskabelige prioritetsprogram (stipendium nr. XDB19040200).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Comercial Oligonucleotide Sangon Biotech
10x Taq PCR Buffer Transgen #J40928
Ultra Pure Distilled Water Invitrogen 10977-015
5x RNA Transcription Buffer Thermo Scientific K0441
T7 RNA polymerase Thermo Scientific #EP0111
NTP mixture Sangon #ND0056
RRI (Recombinant RNase Inhibitor) Takara 2313A
RNA Clean & Concentrator-5 Zymo Research R1015
UV-Vis Spectrometer Thermo Scientific Nano-Drop 2000c
2x Phanta Max Buffer Vazyme PB505 PCR buffer
dNTPs Transgen AD101
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase Vazyme P505-d1
Ezmax for One-step Cloning Tolobio 24303-1 seamless assembly kit
5x Buffer for Ezmax One-step Cloning Tolobio 32006
BamHI NEB #R0136L
BamHI-HF NEB #R3136L
BglII  NEB #R0144L
XbaI NEB #R0145L
SpeI NEB #R3133L
10x Buffer 3 NEB #B7003S
10x CutSmart Buffer NEB B7204S
10x T4 DNA ligase Buffer Tolobio 32002
T4 PNK Tolobio 32206
T4 DNA ligase Tolobio 32210
DpnI NEB #R01762
SV Gel and PCR clean-up system Promega A9282
Plasmid Mini Kit I Omega D6943-02 plasmid preparation kit
thermosensitive alkaline phosphatase  Thermo Scientific #EF0651 FastAP
10x Cpf1 buffer Tolobio 32008
Cpf1 Tolobio 32105 FnCpf1
thermocycler Applied Biosystems veriti 96 well
C-Brick standard vector Tolobio 98101
E. coli [DH10B] Invitrogen 18297010
Luria-Bertani media (tryptone) Oxoid LP0042
Luria-Bertani media (yeast extract) Oxoid LP0021
Luria-Bertani media (NaCl) Sangon Biotech B126BA0007

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Canton, B., Labno, A., Endy, D. Refinement and standardization of synthetic biological parts and devices. Nat Biotechnol. 26 (7), 787-793 (2008).
  2. Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. J Biol Eng. 2, (2008).
  3. Knight, T. Idempotent Vector Design for Standard Assembly of Biobricks. , MIT Artificial Intelligence Laboratory; MIT Synthetic Biology Working Group. 1-11 (2003).
  4. Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J. C-Brick: A New Standard for Assembly of Biological Parts Using Cpf1. ACS Synth Biol. 5 (12), 1383-1388 (2016).
  5. Anderson, J. C., et al. BglBricks: A flexible standard for biological part assembly. J Biol Eng. 4 (1), (2010).
  6. Liu, J. K., Chen, W. H., Ren, S. X., Zhao, G. P., Wang, J. iBrick: a new standard for iterative assembly of biological parts with homing endonucleases. PLoS One. 9 (10), e110852 (2014).
  7. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  8. Wright, A. V., Nunez, J. K., Doudna, J. A. Biology and Applications of CRISPR Systems: Harnessing Nature's Toolbox for Genome Engineering. Cell. 164 (1-2), 29-44 (2016).
  9. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  10. Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
  11. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  12. Shanghai Tolo Biotechnology Company Limited. , Shanghai 200233, China. Available from: http://www.tolobio.com/ (2017).
  13. Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method. PLoS One. 3 (11), e3647 (2008).
  14. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  15. Casini, A., Storch, M., Baldwin, G. S., Ellis, T. Bricks and blueprints: methods and standards for DNA assembly. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (9), 568-576 (2015).
  16. Cameron, D. E., Bashor, C. J., Collins, J. J. A brief history of synthetic biology. Nat Rev Microbiol. 12 (5), 381-390 (2014).
  17. Keasling, J. D. Synthetic biology for synthetic chemistry. ACS Chem Biol. 3 (1), 64-76 (2008).

Tags

Genetik udgave 124 syntetisk biologi CRISPR Cpf1 C-Brick klæbrige ender DNA-samling, Monteringsstandard
Protokoller til C-Brick DNA Standard Assembly ved anvendelse af Cpf1
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J.… More

Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J. Protocols for C-Brick DNA Standard Assembly Using Cpf1. J. Vis. Exp. (124), e55775, doi:10.3791/55775 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter