Summary
En selektiv och känslig vätskekromatografi-tandemmasspektrometri (LC-MS / MS) -metod kopplad till en effektiv fastfas-extraktion på en mikroplat med 96 m brunnsmedelsplattform (mixed-mode cation-exchange) (MCX) utvecklades för mätning av fri 3-nitrotyrosin ( 3-NT) i human urin med hög genomströmning, vilket är lämpligt för kliniska tillämpningar.
Abstract
Fri 3-nitrotyrosin (3-NT) har i stor utsträckning använts som en möjlig biomarkör för oxidativ stress. Ökad nivå av 3-NT har rapporterats i en mängd olika patologiska tillstånd. Existerande metoder saknar emellertid tillräcklig känslighet och / eller specificitet som är nödvändig för att på ett tillförlitligt sätt mäta den låga endogena nivån på 3-NT och är för tunga för kliniska tillämpningar. Därför krävs analytisk förbättring för att noggrant kvantifiera nivåerna av 3-NT och verifiera rollen av 3-NT vid patologiska tillstånd. Detta protokoll presenterar utvecklingen av en ny vätskekromatografi-tandemmasspektrometri (LC-MS / MS) -detektering kombinerad med en miniatyriserad fastfasutvinning (SPE) för snabb och noggrann mätning av 3-NT i human urin som en icke-invasiv biomarkör För oxidativ stress. SPE med en 96-brunnsplatta förenklade processen genom att kombinera provrening och analysberikning utan tråkiga derivatiserings- och evaporationssteg, Minskning av lösningsmedelsförbrukning, avfallshantering, risk för kontaminering och total bearbetningstid. Anställning av 25 mM ammoniumacetat (NH4OAC) vid pH 9 som SPE elueringslösningen förbättras väsentligen selektiviteten. Masspektrometrisignalresponsen förbättrades genom justering av multipelreaktionsövervakning (MRM) -övergångarna. Användning av 0,01% HCOOH som additiv på en pentafluorfenyl (PFP) -kolonn (150 mm x 2,1 mm, 3 um) förbättrade signalresponsen ytterligare 2,5 gånger och förkortat den totala körtiden till 7 min. En lägre kvantifieringsgräns (LLOQ) på 10 pg / ml (0,044 nM) uppnåddes, vilket representerade en signifikant förbättring av känsligheten för de rapporterade analyserna. Denna förenklade, snabba, selektiva och känsliga metod medger att två plåtar ur urinprover (n = 192) behandlas under en 24 h tidsperiod. Med tanke på den markant förbättrade analysprestandan och icke-invasiv och billig urinprovtagning är den föreslagna analysen fördelaktig för preklinisk och kliniskstudier.
Introduction
Effekterna av oxidativ stress på klinisk presentation har dragits fram i framkant de senaste åren 1 . En av de biomarkörer som undersöks är 3-nitrotyrosin (3-NT), en slutstabil produkt som bildas när reaktiva kvävearter (RNS) interagerar med tyrosin, en katecholamin-neurotransmittorprekursor. Medan 3-NT kan ha kliniskt värde som biomarkör för RNS in vivo, kan de väsentliga förändringar av egenskaperna och funktionerna hos tyrosin negativt påverkar motsvarande proteiner och cellulära funktioner 1, 2. Ny forskning har föreslagit att 3-NT kan spela en viktig roll vid inflammatoriska tillstånd 3 , neurodegenerativa sjukdomar 4 , 5 , kardiovaskulär sjukdom 6 och diabetes 7 samt villkor relaterade till oxidativ stress. Men dessa obseRvationer baseras på resultat från metoder som saknar känslighet och / eller selektivitet 8 , 9 , 10 , 11 . De enorma 3-NT-koncentrationsområdena för de biologiska prover som tidigare rapporterats i litteraturen visar att allvarliga analytiska problem är associerade med dessa analyser och teknisk förbättring är nödvändig för att exakt kvantifiera nivåerna av 3-NT och verifiera dess roll i patologin för dessa betingelser .
Kvantitering av fri 3-NT i biologiska matriser presenterar en speciell utmaning för man och instrument 8 , 9 , 10 , 11 . För det första kräver spårningsnivån för endogen 3-NT en ultrakänslig detektering; För det andra finns förekomsten av många strukturellt liknande analoger, särskilt tyrosin, som är närvarande iStort överskott, kräver en hög grad av selektivitet För det tredje kräver artefaktuell bildning av 3-NT genom tyrosinitrering med allestädes närvarande nitrat och nitrit särskild hänsyn vid provberedning för att undvika falskt överskattning av 3-NT.
Bland många olika metoder som används för att mäta 3-NT har MS / MS betraktats som guldstandardmetoden på grund av sin överlägsen känslighet och selektivitet 11 , 12 , 13 , 14 . Gaskromatografi (GC) kopplad MS / MS ger den bästa känsligheten, men de nödvändiga provderivatiseringsstegen är alltför tråkiga och tidskrävande för att vara effektiva för klinisk nytta 15 , 16 . LC-MS / MS kräver inte komplicerad provderivatisering, vilket gör det mer lovande alternativet. Ändå finns det flera hinder att övervinna, såsom seNsitivity av LC-MS / MS-metoder som rapporteras i litteraturen måste förbättras för mätning av lågt rikligt 3-NT 7 , 17 , 18 och den relativt långa omställningstiden måste förkortas för applikationer med hög genomströmning 12 , 13 , 17 , 19 .
Vidare spelar den biologiska matrisen en betydande roll när man överväger kliniska tillämpningar. Det ska vara enkelt och billigt att få och inte invasiv om möjligt 20 , 21 , 22 . Plasma, det traditionellt använda provet i litteraturen, är inte en kliniskt önskvärd matris, så en metod som utnyttjar urin som är icke-invasiv och kostnadseffektiv sökes.
Flera försök att utveckla relAnvändbara och specifika LC-MS / MS-metoder har gjorts med användning av urin 9 , 10 , 11 . De har emellertid alla fallit brist på att vara selektiva, tillförlitliga eller effektiva nog för klinisk användning. Effektiviteten hos den övervägande SPE med användning av traditionell reversfaspatron (C18-typ) som provuppsättning för 3-NT-analysen har ifrågasatts och en sekventiell SPE med stark katjonbyte (SCX) och omvänd fas C18-OH har föreslagits 6 , 7 , 19 . En nyligen utvecklad LC-MS / MS-metod utnyttjade en rening med flera steg med manuell C18 SPE, preparativ högtrycksvätskekromatografi (HPLC) och online SPE för analys av 3-NT 23 . Fastän denna metod var känslig nog för kliniska ändamål, med en LLOQ på 0,041 nM, var uppreningsprocessen intensiv och tråkig och krävdesRöd 3 ml urin, vilket begränsar dess genomförbarhet för hög genomströmning. En molekylärtryckad polymer användes som SPE-sorptionsmedlet för att förbättra effektiviteten hos upprensningsprocessen 14 , men den resulterande LLOQ (0,7 ug / ml) var inte tillräckligt låg för kliniska prov. En annan metod krävde tvådimensionell (2D) LC-MS / MS och immunaffinitetskromatografi för provuppretting för att uppnå en detektionsgräns (LOD) på 0,022 nM 24 . Medan alla dessa metoder har gjort framsteg i bedömningen av 3-NT har ingen uppnått känsligheten, tillförlitligheten och effektiviteten som krävs för kliniska tillämpningar.
För att undersöka patologin för fri 3-NT och dess roll som biomarkör av oxidativ stress i kliniska miljöer har vi utvecklat en metod som är enkel, effektiv, exakt och exakt, vilket möjliggör kliniska applikationer med hög genomströmning 25 . En miniatyriserad blandad-mode katjon exc(MCX) 96-brunns extraktionsmikroplatta genomfördes för att uppnå enkel och effektiv provrening och berikning av 3-NT i en enda extraktion som omger de nackdelar som ses i de befintliga metoderna som kräver derivatisering, avdunstning och 2D-LC. Vätskekromatografi med 0,01% HCOOH som additiv i mobilfas erbjöd ett förbättrat signalrespons med en snabb cykeltid. Selektivitet förbättrades ytterligare genom applicering av en mild NH4OAC elueringslösning för selektiv eluering av 3-NT, och användning av MRM övergång för både 3-NT och den interna standarden (IS). Matriseffekten kompenserades genom användning av en reducerad mängd av en föredragen 13 C-märkt isotopisk IS för kvantifiering. Med tillkomsten av denna metodik kommer forskare och kliniker att kunna verifiera rollen som 3-NT i kliniska tillstånd och vidare utforska effekterna av oxidativ stress.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla studier som involverade urinprover av mänskliga personer utfördes i enlighet med förfarandet godkänt av Pharmasan / Neuroscience Institutional Review Board (IRB).
1. Urinprovsamling och kreatinin (Cr) bestämning
- Samla 5 ml av nästa morgon urinprover efter ca. 10 h över natten fastande i ett 5 ml transportrör A innehållande 250 | xl 3 N HCl som konserveringsmedel och förvaras vid -20 ° C tills användning.
- Tina och virvel 5 ml transporturin Ett rör och centrifug i en centrifug ( t.ex. Sorvall) (2297 xg, 10 min).
- Aliquot 1 ml urin två gånger från 5 ml transportrör A.
- Bestäm Cr genom en kreatininmetod 26 .
2. Framställning av standard, IS och kvalitetskontroll (QC)
- Förbered en stamlösning av 3-NT vid 100 μg / mL i vatten med 0,01% HCOOH mobil fas A (MA) och förvara vid -20 ° C.
- GöraEn 3-NT-arbetsstandardlösning vid koncentration av 100 ng / ml genom att späda 100 μg / mL 3-NT stamlösning med MA.
- Generera standarder som sträcker sig från 5 till 2500 pg / ml genom utspädning av 100 ng / ml arbetsstandard med 0,15 M HCl surgjort blank urin fri från 3-NT tillsammans med tomma och dubbelblinda prover.
- Förbered en stamlösning av IS 13 C 9 -3-NT vid 100 μg / ml i vatten med MA och förvara vid -20 ° C.
- Gör en IS-arbetslösning vid 500 pg / ml genom utspädning av 100 μg / ml 13 C 9 -3-NT IS stamlösning med MA.
- Upprätta fem nivåer av QC-prover som täcker LLOQ, låg, medelstora och höga nivåer ( dvs 10, 25, 100, 500 och 1 250 pg / ml), genom utspädning av 3-NT-arbetsstandard i den surgjorda tomma urinen.
3. Fast fas extraktionsprocedur
- Tina och virvel urinprover, standarder och QC-prover.
- Lägg till urinprover, standarder och QC sampLes (250 μl vardera) till 32 brunnar i en ren 2 ml 96-brunns uppsamlingsplatta.
- Introducera 500 pg / ml IS-arbetslösningen (50 μl) till varje brunn, med undantag av dubbelfyllprovbrunn. Tillsätt 0,01% HCOOH (50 μl) till dubbelpappprovbrunnen.
- Tillsätt LC-MS / MS vatten med 0,1% HCOOH (250 | il).
- Blanda ovanstående blandning med en 8-kanals pipett tre gånger.
- Täck plattan tills SPE laddas.
- Placera en MCX 96-brunns extraktionsplatta och en uppsamlingsbehållare på en positivtrycksprocessor.
- Konditionera extraktionsplattan med flytande MeOH (200 μl) genom sorbenten.
- Ekvilibrera genom att flöda vatten med 2% HCOOH (200 μl) genom sorbenten.
- Ladda hela volymen av varje förblandad prov på den förkylade extraktionsplattan försiktigt med en 8-kanalig pipett.
- Ställ lågt positivt tryck (t ex 3 psi) på den positiva tryckprocessorn för att tillåta blandningen att strömma triggOugh sorbenten långsamt, justera trycket om det behövs.
- Tvätta brunnarna genom att flöda vatten med 2% HCOOH (200 μl) genom sorbenten.
- Tvätta brunnarna genom att flyta metanol (200 μl) genom sorbenten.
- Tvätta brunnarna genom att flöda vatten (200 μl) genom sorbenten.
- Torka brunnarna helt med hög positiv tryckinställning ( t.ex. 40 psi) på positivtrycksprocessorn.
- Byt behållaren med en ren 2 ml 96-brunns insamlingsplatta.
- Applicera 25 mM NH4OAC vid pH 9 (50 ^ il) för att eluera den kvarhållna analyten och IS från utvinning plattan.
- Pipett LC-MS vatten med 5% HCOOH (50 | il) för att neutralisera eluatet.
- Blanda med 8-kanalspipetten tre gånger och skicka till LC-MS / MS-stationen för analys.
4. LC-MS / MS-analys
- Mät noggrant 2,000 ml LC-MS vatten med en graderad cylinder och överför den till en 2 liter flaska.
- P200 ml ren HCOOH i den ovanstående flaskan innehållande LC-MS vatten.
- Blanda noggrant och märka som mobil fas A (MA). Inkludera initialer, förberedelsedatum och utgångsdatum.
- Ta en 2 L flaska LC-MS metanol och etikett som mobil fas B (MB) med startdatum och utgångsdatum.
- Ställ in autoproverarens temperatur till 4 ° C.
- Placera uppsamlingsplattan med färdiga prover i autosamplaren.
- Placera en PFP-kolonn (150 mm x 2.1 mm ID, 3 μm) och skydda kolonnen i ugnen.
- Ställ ugns temperaturen till 30 ° C.
- Ekvilibrera 10 minuter med användning av förvärvsmetoden med LC-gradientelueringen såsom visas i tabell 1 .
| Tid (min) | Modul | evenemang | Parameter |
| 0 | Pumps | Pump B Conc. | 5 |
| 0,5 | Pumps | Pump B Conc. | 20 |
| 1 | Pumps | Pump B Conc. | 50 |
| 3 | Pumps | Pump B Conc. | 80 |
| 4 | Pumps | Pump B Conc. | 90 |
| 4,01 | Pumps | Pump B Conc. | 95 |
| 5,5 | Pumps | Pump B Conc. | 95 |
| 5,6 | Pumps | Pump B Conc. | 5 |
| 7 | Kontroller | Sluta |
Tabell 1: Vätskekromatografi Gradientelueringsbetingelser
- Skapa en grupplista inklusiveStandarder, QC och urinprover.
- Starta sats genom injektion av de beredda proven (12 μl).
5. Toppidentifiering, integration och dataprocess
- Kontrollera datainsamling och bearbetning med hjälp av programvaran.
- Identifiera och integrera 3-NT och IS-toppar för alla prover.
- Upprätta en standardkurva med intervallet 10-2.500 pg / ml för 3-NT kvantifiering genom linjär regression av toppområdesförhållandet 3-NT och IS jämfört med den nominella 3-NT-koncentrationen med en viktningsfaktor av 1 / x.
- Kvantifiera alla prover med hjälp av standardkurvan.
- Bestäm om QC-proverna faller inom det etablerade intervallet.
- Konvertera de detekterade koncentrationerna av urinprover till slutresultat i enheten av nM eller nmol / mmol Cr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 illustrerar att 3-NT separeras fullständigt kromatografiskt från andra strukturellt liknande tyrosinanaloger under det optimerade LC-tillståndet, vilket eliminerar de ko-eluerande störningarna på grund av dessa mycket överdrivna föreningar och följaktligen ökar graden av analysselektivitet. Dessutom möjliggör gradientelueringen med 0,01% HCOOH som additiv i MA och metanol vid en flödeshastighet av 0,45 ml / min snabb eluering av 3-NT ( dvs 3 min med en vridningstid på 7 min).
Figur 1: Baslinje LC-kromatografisk separation av 3-NT från andra tyrosinanaloger i en standardlösning. ( A ) p- Tyrosin; ( B ) m- Tyrosin; ( C ) o -tyrosin; ( D ) Cl-tyrosin; ( E ) 3-NT. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2 visar att ingen 3-NT-signal observeras i dubbelämnesprovet, vilket indikerar ingen bildning av artefaktuell 3-NT under hela processen. Figur 3 illustrerar representativa MRM kromatogram av 3-NT och IS för en frisk individ. Som framgår observeras inga störande signaler vid retentionstiderna av 3-NT och IS. Vidare observerades mindre än ± 6% skillnad i 3-NT mellan de icke-spikade och spikade sammansatta urinproverna med nitrit (50 μM), nitrat (50 | im) och tyrosin (50 mg / liter) 25 , vilket ytterligare ger stöd Till analysens specificitet.
Figur 2: MRM-kromatogram av 3-NT och IS i en representativ dubbel blankprov. ( A ) 3-NT MRM-kvantifierare 227,0> 90,0; ( B ) ÄR MRM-kvantifierare 236,0> 189,0. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: MRM-kromatogram av 3-NT och IS i en representativ urinprov av friska människor. ( A ) 3-NT MRM-kvantifierare 227,0> 90,0; ( B ) ÄR MRM-kvantifierare 236,0> 189,0. Vänligen klicka på hanÅter att se en större version av denna figur.
Standardkurvan fastställdes genom extraktion av surgjord blank urin spikad med 3-NT i intervallet 10-2.500 pg / ml genom att plotta toppareansförhållandet 3-NT och IS mot den nominella koncentrationen av 3-NT med en linjär montering Av 1 / x viktning. En representativ standardkurva visas i figur 4 . LOD, definierad som den lägsta koncentrationen med ett signal-brus-förhållande större än tre, bestämdes att vara 2 pg / ml (0,0088 nM). LLOQ bestämdes att vara 10 pg / mL (0,044 nM) per definition som den lägsta koncentrationen som skulle mätas inom ± 20% av o precision och noggrannhet med signal-brusförhållandet större än tio.
Figur 4: En representativ 3-NT-standardkurva iOmråde av 10-2 500 pg / ml. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Väsentliga variationer i koncentrationer som tidigare rapporterats i litteraturen för det endogena fria 3-NT i humana urinprover avslöjar metodiska problem associerade med tillgängliga analyser 8 , 9 , 10 , 11 . Noggrann bestämning av den låga basala nivån på 3-NT i human urin är fortfarande en utmanande uppgift som kräver speciella försiktighetsåtgärder för provberedning och LC-MS / MS-analys. Detta protokoll beskriver ett nytt SPE-förfarande kombinerat med en selektiv LC-MS / MS-detektering som tillåter den specifika och känsliga bestämningen av urin 3-NT med hög genomströmning.
Noggrant urval av MRM-parametrar förbättrade selektiviteten för detektering av 3-NT. MRM-övergången m / z 236,0> 96,0 av IS för 3-NT i plasma 27 orsakade allvarlig kontaminering för urinprover. En renare 9-faldig signalökningRespons uppnåddes med MRM-övergång m / z 236,0> 189,0. MRM-övergång m / z 227,0> 90,0 valdes för 3-NT-kvantifiering på grund av svår interferens med användning av den mest intensiva övergången m / z 227,0> 181,0. De detaljerade MRM-övergångarna och sammansatta parametrar sammanfattas i tabell 2 .
| analyt | MRM-övergång (m / z) | DP (V) | EP (V) | CE (eV) | CXP (V) |
| 3-NT (kvantifierare) | 227,0> 90,0 | 50 | 10 | 38 | 13 |
| 3-NT (kvalifierare) | 227,0> 103,9 | 50 | 10 | 45 | 16 |
| 13 C 9 -NT (IS) | 236,0> 189,0 | 50 | 10 | 21 | 14 |
| En jonspridningsspänning: 2200 V; Temperatur: 600 ° C; Gardingas: 35; CAD-gas: 9; Nebulisatorgas (GSl): 50; Värmegas (GS2): 55. | |||||
Tabell 2: Optimerade MRM-förhållanden.
Den traditionella kolonn C18-typen som vanligen användes för LC-kromatografisk separation av 3-NT i litteraturen 12 , 13 , 17 , 19 krävde typiskt en lång vändningstid för att reducera störningar, vilket gjorde det otillräckligt för hög genomströmning. I detta protokoll användes en PFP-kolonn för optimering av LC-kromatografisk separation av 3-NT baserat på dess förbättrade retention av polära föreningar 22 ,> 27 , 28 . Koncentrationen av mobilfasadditiver har ett viktigt inflytande på signalintensiteten 25 , 28 . HCOOH vid 0,01% befanns vara det optimala additivet i MA eftersom det resulterade i en 2,5-faldig signalförstärkning över 0,1% koncentration och ytterligare minskningar i koncentrationsminskalt signalrespons. En gradientelueringsprofil med användning av 0,01% HCOOH i vatten (MA) och metanol (MB) etablerades med en flödeshastighet av 0,45 ml / min, vilket gav en optimal separation och snabb eluering av 3-NT inom 3 min med en total körtid av Bara 7 min, vilket möjliggör en signifikant snabbare analys av 3-NT i komplicerade biologiska matriser än rapporterat i litteraturen 12 , 13 , 17 , 19 .
För att ta itu med ineffektiviteten hos den traditionella reversfaspatronen (C18-typ) sSom används övervägande för SPE av biologiska prover 6 , 7 , har vi nyligen utvecklat en LC-MS / MS-metod för att bestämma 3-NT i human plasma av SPE på en enda dubbelfunktionell 96-brunns MCX-platta 27 , vilket resulterade i förbättringar i SPE Effektivitet och selektivitet. En tydlig nackdel med alla SPE-tillvägagångssätt i litteraturen är dock arbetskrävande och riskrelaterade förångnings- och rekonstitutionssteg. Dessutom krävde plasmametoden en extra förtvätt av extraktionsplattan för att eliminera förorening från sorbenten. I detta protokoll har dessa nackdelar eliminerats av en skräddarsydd SPE med användning av en miniatyriserad 96-brunns mikroplatta. Valet av elueringslösning befanns vara avgörande för extraktionseffektiviteten. Betydande störningar observerades i urinprover genom att tillämpa den gemensamma NH4OH elueringslösning med varierad sammansättning MeOH. Det var hypotes som störing substanser sam-eluerades med analyten på grund av den starka elueringen kraften i metanolisk NH4OH elueringslösning, följaktligen resulterar i den låga selektiviteten. För att förbättra selektiviteten var det nödvändigt att identifiera en lösning som skulle vara tillräckligt stark för att eluera 3-NT och svag nog att inte orsaka eluering av störande föreningar. Efter detaljerad undersökning av mindre basiskt NH4OAC vid olika pH och koncentrationer, tillsattes en 25 mM NH4OAC-lösning med pH 9 befanns vara optimalt som elueringslösning. Med den optimerade elueringslösning, var frågan om störande föreningar lösas och en 40% vinst i känslighet uppnåddes jämfört med den reguljära metanolisk NH4OH elueringslösningen.
Tabell 3 ger en detaljerad sammanfattning av det analytiska resultatet av detta protokoll 25 jämfört med andra tillgängliga metoder för bestämning av det fria 3-NT i biologiska matriser. Detta protokoll från Ger flera olika fördelar jämfört med tidigare rapporterade analyser. Först uppnåddes genom att använda 96-brunns-extraktionsmikroplattan ett enda steg för provrening och analysberikning, varvid man undviker 1 - 5 cyklerna av avdunstning och rekonstituering som vanligtvis krävs i 3-NT-metoderna som involverar SPE. För det andra reducerades lösningsmedelsanvändningen per prov för SPE drastiskt, från 5,5-118 ml till endast 1,1 ml, vilket representerar en 5-107 gånger reduktion i lösningsmedel och avfallshantering. För det tredje minskade LC-vändningstiden per prov 2-7 gånger jämfört med andra analyser och var 30% snabbare än vår tidigare plasmametod. För det fjärde krävdes en 10-3 000 faldig lägre mängd av den föredragna 13 C-märkta IS för kompensation av matriseffekten. Slutligen representerar denna analys en signifikant förbättring av känsligheten jämfört med andra konventionella SPE-baserade LC-MS / MS-metoder för kvantifiering av urin-3-NT.
sätt ">metod
+ filtrering
(MCX-plattan)
+ Online SPE
Tabell 3: CompariSon för det analytiska resultatet av detta protokoll med befintliga analyser för detektion av 3-NT i biologiska matriser
Den analyserade och kliniska validiteten för den föreslagna analysen utvärderades ytterligare genom bestämning av referensintervallet för 3-NT urin som fastställdes från de autentiska urinproverna av 82 friska människor 25 . Den förbättrade enkelheten och genomströmningsmetoden möjliggör att två plåtar ur urinprover (n = 192) behandlas och analyseras under en 24 h tidsperiod. Den utvecklade metoden som använder den icke-invasiva urinprovtagningen, är enkel, snabb, känslig och selektiv, förväntas vara ett kraftfullt verktyg för att verifiera rollen av 3-NT i kliniska tillstånd och ytterligare undersöka effekterna av oxidativ stress. De kritiska stegen i protokollet innefattar SPE på en MCX-mikroplatta med användning av en mild NH4OAc som elueringsbuffert, LC-separation på en PFP-kolonn med 0,01% HCOOH som ett tillsats- och MRM-val för 3-NT quantification. Framtida tillämpning av metoden är att kvantifiera 3-NT-koncentrationer hos patienter med patologiska tillstånd, såsom inflammatoriska och neurodegenerativa störningar etc. Potentiella fallgropar i det föreslagna protokollet för kliniska tillämpningar kvarstår att behandlas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har någon intressekonflikt.
Acknowledgments
Författarna skulle erkänna Scott Howard och Abigail Marinack för allmänt stöd och samordning av detta arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Nitro-L-tyrosine | Sigma | N7389-5g | |
| 3-Nitro-L-tyrosine-13C9 | Sigma | 652296-5.0mg | |
| Mass Spec Gold Urine | Golden West Biologicals | MSG 5000-1L | |
| Oasis MCX 96-well µElution plate | Waters | 186001830BA | |
| 2 mL 96 well collection plate | Phenomenex | AH0-7194 | |
| 96 positive processor | Waters | 186005521 | |
| LC-MS Ultra CHROMASOLV methanol | Sigma | 14262-2L | |
| LC-MS Ultra CHROMASOLV water | Sigma | 14263-2L | |
| Formic acid for mass spectrometry | Sigma | 94318-50ML-F | |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma | 338818-1L | |
| Ultra PFP propyl columns | Restek | 9179362 | |
| 5500 Triple quad | AB Sciex | / | Contact manufacture for more detail |
| UFLC-XR | Shimadzu | / | Contact manufacture for more detail |
| Integra 400 Plus | Roche | / | Urinary Creatinine Jaffé Gen 2 method |
| LCMS certified 12 x 32 mm screw neck vial | Waters | 600000751CV | |
| LCGC certified 12 x 32 mm screw neck total recovery vial | Waters | 186000384C | |
| 5 mL transport tube | Phenix | TT-3205 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Crystalgen | 23-2263 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Crystalgen | 23-2266 | |
| eLine electronic pipette | Sartorius | 730391 | |
| Microfuge centrifuge | Beckman Coulter | A46474 | |
| OHAUS balance | Kennedy Scales, inc. | 735 | |
| Vortex mixer | Bernstead Thermolyne | M16715 |
References
- Dalle-Donne, I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., Milzani, A. Biomarkers of oxidative damage in human disease. Clin. Chem. 52 (4), 601-623 (2006).
- Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease. Physiol. Rev. 87 (1), 315-424 (2007).
- Baraldi, E., et al. 3-Nitrotyrosine, a marker of nitrosative stress, is increased in breath condensate of allergic asthmatic children. Allergy. 61 (1), 90-96 (2006).
- Ischiropoulos, H., Beckman, J. S. Oxidative stress and nitration in neurodegeneration: Cause, effect, or association? J. Clin. Invest. 111 (2), 163-169 (2003).
- Butterfield, D. A., et al. Elevated levels of 3-nitrotyrosine in brain from subjects with amnestic mild cognitive impairment: implications for the role of nitration in the progression of Alzheimer's disease. Brain Res. 1148, 243-248 (2007).
- Hui, Y., et al. A simple and robust LC-MS/MS method for quantification of free 3-nitrotyrosine in human plasma from patients receiving on-pump CABG surgery. Electrophoresis. 33 (4), 697-704 (2012).
- Kato, Y., et al. Quantification of modified tyrosines in healthy and diabetic human urine using liquid chromatography/tandem mass spectrometry. J. Clin. Biochem. Nutr. 44 (1), 67-78 (2009).
- Duncan, M. W. A review of approaches to the analysis of 3-nitrotyrosine. Amino acids. 25 (3-4), 351-361 (2003).
- Ryberg, H., Caidahl, K. Chromatographic and mass spectrometric methods for quantitative determination of 3-nitrotyrosine in biological samples and their application to human samples. J. Chromatogr. B. 851 (1-2), 160-171 (2007).
- Tsikas, D. Analytical methods for 3-nitrotyrosine quantification in biological samples: the unique role of tandem mass spectrometry. Amino acids. 42 (1), 45-63 (2012).
- Tsikas, D., Duncan, M. W. Mass spectrometry and 3-nitrotyrosine: strategies, controversies, and our current perspective. Mass Spectrom. Rev. 33 (4), 237-276 (2014).
- Iwasaki, Y., et al. Comparison of fluorescence reagents for simultaneous determination of hydroxylated phenylalanine and nitrated tyrosine by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection. Biomed. Chromatogr. 26 (1), 41-50 (2012).
- Saravanabhavan, G., Blais, E., Vincent, R., Kumarathasan, P. A high performance liquid chromatography-electrochemical array method for the measurement of oxidative/nitrative changes in human urine. J. Chromatogr. A. 1217 (19), 3269-3274 (2010).
- Mergola, L., Scorrano, S., Del Sole,, Lazzoi, R., R, M., Vasapollo, G. Developments in the synthesis of a water compatible molecularly imprinted polymer as artificial receptor for detection of 3-nitro-L-tyrosine in neurological diseases. Biosens. Bioelectron. 40 (1), 336-341 (2013).
- Schwedhelm, E., Tsikas, D., Gutzki, F. M., Frolich, J. C. Gas chromatographic-tandem mass spectrometric quantification of free 3-nitrotyrosine in human plasma at the basal state. Anal. Biochem. 276 (2), 195-203 (1999).
- Tsikas, D., Mitschke, A., Suchy, M. T., Gutzki, F. M., Stichtenoth, D. O. Determination of 3-nitrotyrosine in human urine at the basal state by gas chromatography-tandem mass spectrometry and evaluation of the excretion after oral intake. J. Chromatogr. B. 827 (1), 146-156 (2005).
- Marvin, L. F., et al. Quantification of o,o'-dityrosine, o-nitrotyrosine, and o-tyrosine in cat urine samples by LC/electrospray ionization-MS/MS using isotope dilution. Anal. Chem. 75 (2), 261-267 (2003).
- Orhan, H., Vermeulen, N. P., Tump, C., Zappey, H., Meerman, J. H. Simultaneous determination of tyrosine, phenylalanine and deoxyguanosine oxidation products by liquid chromatography-tandem mass spectrometry as non-invasive biomarkers for oxidative damage. J. Chromatogr. B. 799 (2), 245-254 (2004).
- Chen, H. J. C., Chiu, W. L. Simultaneous detection and quantification of 3-nitrotyrosine and 3-bromotyrosine in human urine by stable isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry. Toxicol. Lett. 181 (1), 31-39 (2008).
- Marc, D. T., Ailts, J. W., Campeau, D. C. A., Bull, M. J., Olson, K. L. Neurotransmitters excreted in the urine as biomarkers of nervous system activity: validity and clinical applicability. Neurosci. Biobehav. Rev. 35 (3), 635-644 (2011).
- Li, X. G., Li, S., Wynveen, P., Mork, K., Kellermann, G. Development and validation of a specific and sensitive LC-MS/MS method for quantification of urinary catecholamines and application in biological variation studies. Anal. Bioanal. Chem. 406 (28), 7287-7297 (2014).
- Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. Pre-analytical and analytical validations and clinical applications of a miniaturized, simple and cost-effective solid phase extraction combined with LC-MS/MS for the simultaneous determination of catecholamines and metanephrines in spot urine samples. Talanta. 159, 238-247 (2016).
- Chao, M. R., et al. Simultaneous detection of 3-nitrotyrosine and 3-nitro-4-hydroxyphenylacetic acid in human urine by online SPE LC-MS/MS and their association with oxidative and methylated DNA lesions. Chem. Res. Toxicol. 28 (5), 997-1006 (2015).
- Radabaugh, M. R., Nemirovskiy, O. V., Misko, T. P., Aggarwal, P., Mathews, W. R. Immunoaffinity liquid chromatography-tandem mass spectrometry detection of nitrotyrosine in biological fluids development of a clinically translatable biomarker. Anal. Biochem. 380 (1), 68-76 (2008).
- Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. Tailored 96-well µElution solid-phase extraction combined with UFLC-MS/MS: a significantly improved approach for determination of free 3-nitrotyrosine in human urine. Anal. Bioanal. Chem. 407 (25), 7703-7712 (2015).
- Roche Diagnostics. Roche Creatinine Jaffé Gen.2, package insert 2011-11, V7. , Mannheim. Available from: https://usdiagnostics.roche.com/products/06407137190/PARAM2083/overlay.html 2011-2011 (2011).
- Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. A novel mixed-mode solid phase extraction coupled with LC-MS/MS for the re-evaluation of free 3-nitrotyrosine in human plasma as an oxidative stress biomarker. Talanta. 140, 45-51 (2015).
- Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. An integrated liquid chromatography-tandem mass spectrometry approach for the ultra-sensitive determination of catecholamines in human peripheral blood mononuclear cells to assess neural-immune communication. J. Chromatogr. A. 1449, 54-61 (2016).
