Summary
Для измерения свободного 3-нитротирозина был разработан метод селективной и чувствительной жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (LC-MS / MS), связанный с эффективной твердофазной экстракцией на 96-луночном микропланшетном катионообменном (MCX) смешанном режиме (MCX) 3-NT) в моче человека с высокой пропускной способностью, которая подходит для клинических применений.
Abstract
Свободный 3-нитротирозин (3-NT) широко использовался в качестве возможного биомаркера для окислительного стресса. Сообщалось о повышении уровня 3-NT в самых разнообразных патологических состояниях. Однако существующие методы не обладают достаточной чувствительностью и / или специфичностью, необходимой для надежного измерения уровня эндогенного уровня 3-NT и слишком громоздки для клинических применений. Следовательно, срочно необходимо аналитическое улучшение для точного количественного определения уровней 3-NT и проверки роли 3-NT в патологических условиях. Этот протокол представляет собой разработку новой спектроскопии тандемной масс-спектрометрии (LC-MS / MS) в жидкой хроматографии в сочетании с миниатюризированной твердофазной экстракцией (SPE) для быстрого и точного измерения 3-NT в человеческой моче как неинвазивный биомаркер Для окислительного стресса. SPE с использованием 96-луночного планшета заметно упрощает процесс путем объединения очистки образца и обогащения аналита без утомительной дериватизации и стадии испарения, Снижение потребления растворителя, удаление отходов, риск загрязнения и общее время обработки. Применение 25 мМ ацетата аммония (NH 4 OAc) при рН 9 в качестве раствора элюирования SPE существенно повысило селективность. Реакция сигнала масс-спектрометрии была улучшена путем регулирования переходов с множественным контролем реакции (MRM). Использование 0,01% HCOOH в качестве добавки на колонке пентафторфенила (PFP) (150 мм x 2,1 мм, 3 мкм) улучшало реакцию сигнала еще в 2,5 раза и сокращало общее время работы до 7 мин. Был достигнут нижний предел количественного определения (LLOQ) 10 пг / мл (0,044 нМ), что представляет собой значительное улучшение чувствительности по сравнению с указанными анализами. Этот упрощенный, быстрый, выборочный и чувствительный метод позволяет обрабатывать две пластины мочи (n = 192) в течение 24-часового периода времени. Учитывая значительно улучшенные аналитические характеристики и неинвазивный и недорогой выборки мочи, предлагаемый анализ полезен для доклинических и клиническихисследования.
Introduction
В последние годы воздействие окислительного стресса на клиническое проявление было выдвинуто на первый план 1 . Один из исследованных биомаркеров представляет собой 3-нитротирозин (3-NT), конечный стабильный продукт, образующийся при взаимодействии реакционноспособных видов азота (RNS) с тирозином, предшественником нейротрансмиттера катехоламина. Хотя 3-NT может иметь клиническое значение в качестве биомаркера для RNS in vivo, существенные изменения свойств и функций тирозина могут неблагоприятно влиять на соответствующие белки и клеточные функции 1 , 2 . Новые исследования показали, что 3-NT может играть важную роль в воспалительных заболеваниях 3 , нейродегенеративных расстройствах 4 , 5 , сердечно-сосудистых заболеваниях 6 и диабете 7, а также в условиях, связанных с окислительным стрессом. Однако эти обманкиОснованные на результатах методологий, не обладающих чувствительностью и / или селективностью 8 , 9 , 10 , 11 . Огромные диапазоны концентраций 3-НТ для биологических образцов, о которых сообщалось ранее в литературе, показывают, что с этими анализами связаны серьезные аналитические проблемы, и требуется техническое усовершенствование для точного количественного определения уровней 3-НТ и проверки его роли в патологии этих условий ,
Количественное определение свободных 3-NT в биологических матрицах представляет особый вызов человеку и инструменту 8 , 9 , 10 , 11 . Во-первых, уровень следа эндогенного 3-NT требует ультрачувствительного обнаружения; Во-вторых, существование многочисленных структурно подобных аналогов, особенно тирозина, которое присутствует вОгромный избыток, требует высокой степени избирательности; В-третьих, артефактное образование 3-NT тирозиновым нитрованием с вездесущим нитратом и нитритом требует особого рассмотрения при подготовке образца, чтобы избежать ложной переоценки 3-NT.
Среди широкого спектра методологий, используемых для измерения 3-NT, MS / MS считается золотым стандартным методом из-за его превосходной чувствительности и селективности 11 , 12 , 13 , 14 . Газовая хроматография (ГХ), связанная с MS / MS, обеспечивает лучшую чувствительность, однако незаменимые этапы дериватизации образцов слишком утомительны и требуют много времени, чтобы быть эффективными для клинической полезности 15 , 16 . LC-MS / MS не требует сложной дериватизации образцов, что делает его более перспективным. Тем не менее, есть несколько препятствий для преодоления, таких какВ литературе необходимо повысить чувствительность методов LC-MS / MS, которые необходимо улучшить для измерения низких концентраций 3-NT 7 , 17 , 18, и относительно длительное время поворота должно быть сокращено для высокопроизводительных приложений 12 , 13 , 17 , 19 ,
Кроме того, при рассмотрении клинических применений важную роль играет используемая биологическая матрица. Это должно быть легко и недорого для получения и неинвазивного, если это возможно, 20 , 21 , 22 . Плазма, традиционно используемая в литературе, не является клинически желательной матрицей, поэтому была запрошена методология использования неинвазивной и рентабельной мочи.
Несколько попыток разработать relМетоды LC-MS / MS были разработаны с использованием мочи 9 , 10 , 11 . Тем не менее, они все еще не были избирательными, надежными или эффективными для клинического использования. Эффективность преобладающего SPE с использованием традиционного картриджа с обращенной фазой (тип C18) в качестве очистки образца для анализа 3-NT была поставлена под сомнение и предложена последовательная SPE сильного катионного обмена (SCX) и обратная фаза C18-OH 6 , 7 , 19 . В недавно разработанном методе LC-MS / MS использовался многоступенчатый процесс очистки ручного C18 SPE, препаративной жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC) и онлайн-SPE для анализа 3-NT 23 . Хотя этот метод был достаточно чувствительным для клинических целей, с LLOQ 0,041 нМ, процесс очистки был интенсивным и утомительным и требовалКрасный 3 мл мочи, что ограничивает его возможность высокой пропускной способности. В качестве сорбента SPE использовали молекулярно-импринтированный полимер для повышения эффективности процесса очистки 14 , но полученный LLOQ (0,7 мкг / мл) был недостаточно низким для клинических образцов. Другой метод требовал двумерной (2D) LC-MS / MS и иммуноаффинной хроматографии для очистки образца для достижения предела обнаружения (LOD) 0,022 нМ 24 . Хотя все эти методы сделали успехи в оценке 3-NT, ни один из них не достиг чувствительности, надежности и эффективности, необходимых для клинических применений.
Чтобы исследовать патологию свободного 3-NT и его роль биомаркера окислительного стресса в клинических условиях, мы разработали простую, эффективную, точную и точную методологию, позволяющую применять высокопроизводительные клинические применения 25 . Миниатюрный катион смешанного режима(MCX) была выполнена 96-луночная микропланшетная микропланшетная установка для обеспечения простой и эффективной очистки образца и обогащения 3-NT в одной экстракции, минуя недостатки, существующие в существующих методах, которые требуют дериватизации, испарения и 2D-LC. Жидкая хроматография с 0,01% HCOOH в качестве добавки в подвижной фазе обеспечивала повышенный сигнал с быстрым временем цикла. Селективность была дополнительно улучшена за счет применения мягкого раствора элюирования NH 4 OAc для селективного элюирования 3-NT и использования перехода MRM как для 3-NT, так и для внутреннего стандарта (IS). Матричный эффект был компенсирован за счет использования уменьшенного количества предпочтительной 13 С-меченой изотопной ИС для количественной оценки. С появлением этой методологии исследователи и клиницисты смогут проверить роль 3-НТ в клинических условиях и дополнительно изучить влияние окислительного стресса.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все исследования с использованием образцов мочи человека проводились в соответствии с процедурой, утвержденной Советом по институциональному обзору Pharmasan / Neuroscience (IRB).
1. Сбор образцов мочи и определение креатинина (Cr)
- Соберите 5 мл образцов мочи следующего дня после ок. 10 ч на ночь в транспортной трубке объемом 5 мл А, содержащей 250 мкл 3 н. HCl в качестве консерванта и хранить при -20 ° С до использования.
- Оттепель и вихрь 5 мл транспортной мочи. Пробирку и центрифугу в центрифуге ( например, Сорваль) (2297 × 10 мин).
- Аликвоту 1 мл мочи дважды из 5 мл транспортной трубки А.
- Определить Cr с помощью метода креатинина в моче 26 .
2. Подготовка образцов стандартного, ИС и контроля качества (КК)
- Подготовьте исходный раствор 3-NT при 100 мкг / мл в воде с 0,01% HCOOH подвижной фазой A (MA) и храните при -20 ° C.
- Делать3-NT рабочий стандартный раствор при концентрации 100 нг / мл путем разбавления исходного раствора 100 мкг / мл 3-NT с помощью МА.
- Генерировать стандарты в пределах от 5 до 2500 пг / мл путем разбавления рабочего раствора 100 нг / мл с 0,15 М HCl подкисленной чистой мочой без 3-NT вместе с пустыми и двойными пустыми образцами.
- Подготовьте исходный раствор IS 13 C 9 -3-NT при 100 мкг / мл в воде с МА и храните при -20 ° C.
- Сделайте рабочий раствор IS при 500 пг / мл путем разбавления исходного раствора 100 мкг / мл 13 C 9 -3-NT IS с помощью МА.
- Создайте пять уровней образцов КК, покрывающих LLOQ, низкий, средний и высокий уровни ( то есть 10, 25, 100, 500 и 1,250 пг / мл), путем разбавления рабочего стандарта 3 NT в подкисленной пустой моче.
3. Процедура твердофазной экстракции
- Образцы оттаивания и вихревой мочи, стандарты и образцы КК.
- Добавить образцы мочи, стандарты и QC samp(По 250 мкл каждый) до 32 лунок чистой 2 мл 96-луночного планшета.
- Ввести рабочий раствор 500 мкг / мл IS (50 мкл) в каждую лунку, за исключением двойной чистой пробы. Добавить 0,01% HCOOH (50 мкл) в лунку с двойной пустой пробкой.
- Добавляют воду LC-MS / MS с 0,1% HCOOH (250 мкл).
- Смешайте вышеуказанную смесь с 8-канальной пипеткой три раза.
- Накройте пластину до загрузки SPE.
- Поместите пластину для экстракции MCX 96 и коллекционный резервуар на процессоре с положительным давлением.
- Заполните экстракционную пластину проточным MeOH (200 мкл) через сорбент.
- Уравновешивают проточной водой 2% HCOOH (200 мкл) через сорбент.
- Загрузите весь объем каждого из предварительно смешанных образцов на предварительно подготовленную экстракционную пластину осторожно с помощью 8-канальной пипетки.
- Установите низкое положительное давление ( например , 3 фунта на квадратный дюйм) на процессор с положительным давлением, чтобы смесь могла течьМедленно, при необходимости отрегулируйте давление.
- Промыть лунки проточной водой 2% HCOOH (200 мкл) через сорбент.
- Промыть лунки проточным метанолом (200 мкл) через сорбент.
- Промыть лунки проточной водой (200 мкл) через сорбент.
- Полностью высушите колодцы с высокой установкой положительного давления ( например , 40 psi) на процессоре с положительным давлением.
- Замените резервуар чистой 2 мл 96-луночным планшетом.
- Применяют 25 мМ NH 4 OAc при рН 9 (50 мкл) для элюирования удерживаемого аналита и IS из экстракционной пластины.
- Пипетируют воду LC-MS с 5% HCOOH (50 мкл) для нейтрализации элюата.
- Три раза смешивайте с 8-канальной пипеткой и отправляйте на станцию LC-MS / MS для анализа.
4. Анализ LC-MS / MS
- Точно измерьте 2000 мл воды LC-MS с градуированным цилиндром и перенесите его в 2-литровый флакон.
- пIpet 200 мкл чистого HCOOH в вышеуказанную бутылку, содержащую воду LC-MS.
- Тщательно перемешать и маркировать как подвижную фазу A (MA). Включите инициалы, дату подготовки и срок действия.
- Возьмите 2 л бутылки метанола LC-MS и наклейте в качестве подвижной фазы B (МБ) с датой начала и датой истечения срока годности.
- Установите температуру автосэмплера на 4 ° C.
- Поместите сборную пластину с подготовленными образцами в автосамплер.
- Поместите колонку PFP (150 мм x 2,1 мм id, 3 мкм) и защитную колонну в духовке.
- Установите температуру в духовке до 30 ° C.
- Равновелибить 10 минут, используя метод получения с элюированием градиента LC, как показано в таблице 1 .
Время (мин) | модуль | Мероприятия | параметр |
0 | Насосы | Насос B Conc. | 5 |
0,5 | Насосы | Насос B Conc. | 20 |
1 | Насосы | Насос B Conc. | 50 |
3 | Насосы | Насос B Conc. | 80 |
4 | Насосы | Насос B Conc. | 90 |
4,01 | Насосы | Насос B Conc. | 95 |
5,5 | Насосы | Насос B Conc. | 95 |
5,6 | Насосы | Насос B Conc. | 5 |
7 | контроллер | Стоп |
Таблица 1: Условия элюирования градиентом жидкой хроматографии
- Создайте список партий, включаяСтандартов, образцов КК и мочи.
- Начните партию путем инъекции готовых образцов (12 мкл).
5. Идентификация пика, интеграция и процесс обработки данных
- Сбор и обработка данных управления с помощью программного обеспечения.
- Определите и интегрируйте 3-NT и IS пики для всех образцов.
- Установите стандартную кривую с диапазоном 10-2 500 пг / мл для количественного определения 3 NT с помощью линейной регрессии отношения площади пиков 3-NT и IS к номинальной концентрации 3 NT с весовым коэффициентом 1 / x.
- Количественное определение всех образцов с использованием стандартной кривой.
- Определите, попадают ли образцы контроля качества в установленный диапазон.
- Преобразовать обнаруженные концентрации образцов мочи в конечные результаты в единицах нМ или нмоль / ммоль Cr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1 показано, что 3-NT полностью хроматографически отделена от других аналогично аналогичных аналогов тирозина при оптимизированном состоянии ЖК, что устраняет сопутствующие помехи из-за этих значительно избыточных соединений и, следовательно, повышает степень селективности анализа. Кроме того, градиентное элюирование 0,01% HCOOH в качестве добавки в МА и метаноле при скорости потока 0,45 мл / мин позволяет быстро элюировать 3-НТ ( т. Е. 3 мин с временем поворота 7 мин).
Рисунок 1: Исходное LC-хроматографическое разделение 3-NT от других тирозиновых аналогов в стандартном растворе. ( А ) р- тирозин; ( B ) m- тирозин; ( C ) o -тирозин; ( D ) Cl-тирозин; ( E ) 3-NT. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2 показывает, что в двойном пустом образце не наблюдается сигнала 3-NT, что указывает на отсутствие образования артефактного 3-NT во время всего процесса. Рисунок 3 иллюстрирует типичные хроматограммы MRM 3-NT и IS для здорового человека. Как можно видеть, не наблюдается мешающих сигналов во время удерживания 3-NT и IS. Кроме того, наблюдалось менее ± 6% разницы в 3-НТ между образцами нешипованной и шипованной пули с нитритом (50 мкМ), нитратом (50 мкМ) и тирозином (50 мг / л) 25 , что также оказывает поддержку К специфичности анализа.
Рисунок 2: МРМ-хроматограммы 3-NT и IS в типичном образце с двойной пробой. ( A ) квантор квантования 3-NT MR7 227,0> 90,0; ( B ) IS MRM-квантификатор 236,0> 189,0. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Хроматограммы MRM 3-NT и IS в типичном образце мочи здоровых людей. ( A ) квантор квантования 3-NT MR7 227,0> 90,0; ( B ) IS MRM-квантификатор 236,0> 189,0. Пожалуйста, нажмитеЧтобы просмотреть большую версию этого рисунка.
Стандартная кривая была установлена путем экстракции подкисленной заготовки мочи, расшитой 3-NT в диапазоне 10-2,500 пг / мл, путем расчета отношения площади пика 3-NT и IS к номинальной концентрации 3-NT с линейным фитингом Взвешивания 1 / х. Репрезентативная стандартная кривая показана на рисунке 4 . Было определено, что LOD, определяемый как самая низкая концентрация с отношением сигнал-шум больше трех, составляет 2 пг / мл (0,0088 нМ). Было определено, что LLOQ составляет 10 пг / мл (0,044 нМ) по определению как самая низкая концентрация, которая должна быть измерена в пределах ± 20% от неточности и точности с отношением сигнал / шум больше десяти.
Рисунок 4: Типичная стандартная кривая 3-NT вДиапазон 10-2,500 пг / мл. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Существенные изменения концентраций, ранее описанные в литературе для эндогенного свободного 3-НТ в образцах мочи человека, выявили методологические проблемы, связанные с доступными анализами 8 , 9 , 10 , 11 . Точное определение низкого базального уровня 3-NT в моче человека остается сложной задачей, требующей специальных мер предосторожности для подготовки проб и анализа LC-MS / MS. Этот протокол описывает новую процедуру SPE в сочетании с выборочным обнаружением LC-MS / MS, которое позволяет специфическое и чувствительное определение мочевого 3-NT с высокой пропускной способностью.
Тщательный выбор параметров MRM улучшил селективность для обнаружения 3-NT. Переход MRM m / z 236.0> 96.0 IS для 3-NT в плазме 27 вызвал сильное загрязнение образцов мочи. Более чистое, 9-кратное увеличение сигналаРеакция была достигнута при переходе MRM m / z 236,0> 189,0. Переход MRM m / z 227,0> 90,0 был выбран для количественной оценки 3-NT из-за сильных помех с использованием наиболее интенсивного перехода m / z 227,0> 181,0. Подробные MRM-переходы и составные параметры приведены в таблице 2 .
Аналит | Переход MRM (m / z) | DP (V) | EP (V) | CE (эВ) | CXP (V) |
3-NT (квантификатор) | 227,0> 90,0 | 50 | 10 | 38 | 13 |
3-NT (квалификатор) | 227,0> 103,9 | 50 | 10 | 45 | 16 |
13 C 9 -NT (IS) | 236,0> 189,0 | 50 | 10 | 21 | 14 |
напряжение ионного распыления: 2200 В; Температура: 600 ° C; Занавес газа: 35; CAD-газ: 9; Небулайзерный газ (GS1): 50; Газообразный газ (GS2): 55. |
Таблица 2: Оптимизированные условия MRM.
Традиционная колонка типа C18, обычно используемая для жидкостного хроматографического разделения 3-NT в литературе 12 , 13 , 17 , 19, как правило, требовала длительного времени поворота для уменьшения помех, что делало его невосприимчивым к высокой пропускной способности. В этом протоколе использовалась колонка PFP для оптимизации хроматографического разделения LC 3-NT на основе его усиленного удержания полярных соединений 22 ,> 27 , 28 . Концентрация подвижных фазовых добавок оказывает важное влияние на интенсивность сигнала 25 , 28 . Было обнаружено, что HCOOH при 0,01% является оптимальной добавкой в МА, так как это приводит к увеличению сигнала в 2,5 раза более чем на 0,1%, а также к уменьшению концентрации сигнала. Был разработан профиль градиентного элюирования с использованием 0,01% HCOOH в воде (MA) и метаноле (МБ) со скоростью потока 0,45 мл / мин, обеспечивая оптимальное разделение и быстрое элюирование 3-NT в течение 3 мин с общим временем работы Всего 7 мин, что позволяет значительно ускорить анализ 3-НТ в сложных биологических матрицах, чем описано в литературе 12 , 13 , 17 , 19 .
Чтобы устранить неэффективность традиционного картриджа с обращенной фазой (тип C18) pНедавно использовавшийся для SPE биологических образцов 6 , 7 , мы недавно разработали метод LC-MS / MS для определения 3-NT в плазме человека SPE на одной двухфункциональной 96-луночной пластине MCX 27 , что привело к улучшению SPE Эффективности и селективности. Тем не менее, особый недостаток всех подходов SPE в литературе - трудоемкие и связанные с риском шаги по испарению и восстановлению. Кроме того, для плазменного метода потребовалась дополнительная предварительная промывка экстракционной пластины для устранения загрязнения из сорбента. В этом протоколе эти недостатки были устранены с помощью специализированного SPE с использованием миниатюрной 96-луночной микропланшет. Было обнаружено, что выбор раствора для элюирования имеет решающее значение для эффективности извлечения. Существенные помехи наблюдались в образцах мочи, применяя общий раствор элюирования NH 4 OH с различным составом MeOH. Высказывалось предположение, что интерференцияВещества были элюированы с помощью аналита из-за сильной элюирующей способности метанольного раствора элюирования NH 4 OH, что в результате привело к низкой селективности. Чтобы улучшить селективность, необходимо было определить решение, которое было бы достаточно сильным, чтобы элюировать 3-NT и достаточно слабым, чтобы не вызывать элюирование мешающих соединений. После детального исследования менее основного NH 4 OAc при разных значениях рН и концентраций было установлено, что раствор 25 мМ NH 4 OAc с рН 9 является оптимальным в качестве раствора для элюирования. С оптимизированным элюирующим раствором проблема интерферирующих соединений была решена, и чувствительность достигала 40% по сравнению с обычным метанольным раствором элюирования NH 4 OH.
В таблице 3 представлено подробное резюме аналитических характеристик этого протокола 25 по сравнению с другими доступными методами определения свободного 3-NT в биологических матрицах. Этот протокол Дает несколько отличных преимуществ по сравнению с ранее описанными анализами. Во-первых, с использованием 96-луночного экстракционного микропланшета была достигнута одна стадия для очистки образца и обогащения аналита, избегая 1-5 циклов испарения и восстановления, как правило, требуемых в методах 3-NT с участием SPE. Во-вторых, использование растворителя на образец для SPE было резко уменьшено - от 5,5 до 118 мл до всего 1,1 мл, что в 5-10 раз уменьшило растворимость и удаление отходов. В-третьих, время обработки LC на образец уменьшалось в 2-7 раз по сравнению с другими анализами и было на 30% быстрее, чем наш предыдущий метод плазмы. В-четвертых, для компенсации матричного эффекта требовалось на 10-3000 раз меньшее количество предпочтительного 13 С-меченного ИС. Наконец, этот анализ представляет собой значительное улучшение чувствительности по сравнению с другими традиционными методами LC-MS / MS на основе SPE для количественного определения мочевого 3-NT.
пути ">метод
+ фильтрация
(Пластина MCX)
+ Онлайн SPE
Таблица 3: CompariСын аналитического исполнения этого протокола с существующими анализами для обнаружения 3-NT в биологических матрицах
Аналитическая и клиническая обоснованность предлагаемого анализа дополнительно оценивалась путем определения контрольного интервала для 3-NT для мочеиспускания, установленного на основе аутентичных образцов мочи у 82 здоровых людей 25 . Усовершенствованный метод простоты и пропускной способности позволяет обрабатывать и анализировать две пластины мочи (n = 192) в течение 24-часового периода времени. Ожидается, что разработанный метод с использованием неинвазивной выборки мочи, простой, быстрой, чувствительной и селективной, станет мощным инструментом для проверки роли 3-НТ в клинических условиях и дальнейшего изучения влияния окислительного стресса. Критические этапы протокола включают SPE на микропланшет MCX с использованием мягкого NH4OAc в качестве элюирующего буфера, отделение LC на колонке PFP с 0,01% HCOOH в качестве добавки и выбор MRM для количественной оценки 3-NTТион. Дальнейшее применение метода заключается в количественном определении концентраций 3-NT у пациентов с такими патологическими состояниями, как воспалительные и нейродегенеративные расстройства и т. Д. По-прежнему необходимо устранить потенциальные ловушки предлагаемого протокола для клинических применений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Авторы признали Скотта Говарда и Абигайль Маринак за общую поддержку и координацию этой работы.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
3-Nitro-L-tyrosine | Sigma | N7389-5g | |
3-Nitro-L-tyrosine-13C9 | Sigma | 652296-5.0mg | |
Mass Spec Gold Urine | Golden West Biologicals | MSG 5000-1L | |
Oasis MCX 96-well µElution plate | Waters | 186001830BA | |
2 mL 96 well collection plate | Phenomenex | AH0-7194 | |
96 positive processor | Waters | 186005521 | |
LC-MS Ultra CHROMASOLV methanol | Sigma | 14262-2L | |
LC-MS Ultra CHROMASOLV water | Sigma | 14263-2L | |
Formic acid for mass spectrometry | Sigma | 94318-50ML-F | |
Ammonium hydroxide solution | Sigma | 338818-1L | |
Ultra PFP propyl columns | Restek | 9179362 | |
5500 Triple quad | AB Sciex | / | Contact manufacture for more detail |
UFLC-XR | Shimadzu | / | Contact manufacture for more detail |
Integra 400 Plus | Roche | / | Urinary Creatinine Jaffé Gen 2 method |
LCMS certified 12 x 32 mm screw neck vial | Waters | 600000751CV | |
LCGC certified 12 x 32 mm screw neck total recovery vial | Waters | 186000384C | |
5 mL transport tube | Phenix | TT-3205 | |
50 mL Centrifuge tube | Crystalgen | 23-2263 | |
15 mL Centrifuge tube | Crystalgen | 23-2266 | |
eLine electronic pipette | Sartorius | 730391 | |
Microfuge centrifuge | Beckman Coulter | A46474 | |
OHAUS balance | Kennedy Scales, inc. | 735 | |
Vortex mixer | Bernstead Thermolyne | M16715 |
References
- Dalle-Donne, I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., Milzani, A. Biomarkers of oxidative damage in human disease. Clin. Chem. 52 (4), 601-623 (2006).
- Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease. Physiol. Rev. 87 (1), 315-424 (2007).
- Baraldi, E., et al. 3-Nitrotyrosine, a marker of nitrosative stress, is increased in breath condensate of allergic asthmatic children. Allergy. 61 (1), 90-96 (2006).
- Ischiropoulos, H., Beckman, J. S. Oxidative stress and nitration in neurodegeneration: Cause, effect, or association? J. Clin. Invest. 111 (2), 163-169 (2003).
- Butterfield, D. A., et al. Elevated levels of 3-nitrotyrosine in brain from subjects with amnestic mild cognitive impairment: implications for the role of nitration in the progression of Alzheimer's disease. Brain Res. 1148, 243-248 (2007).
- Hui, Y., et al. A simple and robust LC-MS/MS method for quantification of free 3-nitrotyrosine in human plasma from patients receiving on-pump CABG surgery. Electrophoresis. 33 (4), 697-704 (2012).
- Kato, Y., et al. Quantification of modified tyrosines in healthy and diabetic human urine using liquid chromatography/tandem mass spectrometry. J. Clin. Biochem. Nutr. 44 (1), 67-78 (2009).
- Duncan, M. W. A review of approaches to the analysis of 3-nitrotyrosine. Amino acids. 25 (3-4), 351-361 (2003).
- Ryberg, H., Caidahl, K. Chromatographic and mass spectrometric methods for quantitative determination of 3-nitrotyrosine in biological samples and their application to human samples. J. Chromatogr. B. 851 (1-2), 160-171 (2007).
- Tsikas, D. Analytical methods for 3-nitrotyrosine quantification in biological samples: the unique role of tandem mass spectrometry. Amino acids. 42 (1), 45-63 (2012).
- Tsikas, D., Duncan, M. W. Mass spectrometry and 3-nitrotyrosine: strategies, controversies, and our current perspective. Mass Spectrom. Rev. 33 (4), 237-276 (2014).
- Iwasaki, Y., et al. Comparison of fluorescence reagents for simultaneous determination of hydroxylated phenylalanine and nitrated tyrosine by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection. Biomed. Chromatogr. 26 (1), 41-50 (2012).
- Saravanabhavan, G., Blais, E., Vincent, R., Kumarathasan, P. A high performance liquid chromatography-electrochemical array method for the measurement of oxidative/nitrative changes in human urine. J. Chromatogr. A. 1217 (19), 3269-3274 (2010).
- Mergola, L., Scorrano, S., Del Sole,, Lazzoi, R., R, M., Vasapollo, G. Developments in the synthesis of a water compatible molecularly imprinted polymer as artificial receptor for detection of 3-nitro-L-tyrosine in neurological diseases. Biosens. Bioelectron. 40 (1), 336-341 (2013).
- Schwedhelm, E., Tsikas, D., Gutzki, F. M., Frolich, J. C. Gas chromatographic-tandem mass spectrometric quantification of free 3-nitrotyrosine in human plasma at the basal state. Anal. Biochem. 276 (2), 195-203 (1999).
- Tsikas, D., Mitschke, A., Suchy, M. T., Gutzki, F. M., Stichtenoth, D. O. Determination of 3-nitrotyrosine in human urine at the basal state by gas chromatography-tandem mass spectrometry and evaluation of the excretion after oral intake. J. Chromatogr. B. 827 (1), 146-156 (2005).
- Marvin, L. F., et al. Quantification of o,o'-dityrosine, o-nitrotyrosine, and o-tyrosine in cat urine samples by LC/electrospray ionization-MS/MS using isotope dilution. Anal. Chem. 75 (2), 261-267 (2003).
- Orhan, H., Vermeulen, N. P., Tump, C., Zappey, H., Meerman, J. H. Simultaneous determination of tyrosine, phenylalanine and deoxyguanosine oxidation products by liquid chromatography-tandem mass spectrometry as non-invasive biomarkers for oxidative damage. J. Chromatogr. B. 799 (2), 245-254 (2004).
- Chen, H. J. C., Chiu, W. L. Simultaneous detection and quantification of 3-nitrotyrosine and 3-bromotyrosine in human urine by stable isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry. Toxicol. Lett. 181 (1), 31-39 (2008).
- Marc, D. T., Ailts, J. W., Campeau, D. C. A., Bull, M. J., Olson, K. L. Neurotransmitters excreted in the urine as biomarkers of nervous system activity: validity and clinical applicability. Neurosci. Biobehav. Rev. 35 (3), 635-644 (2011).
- Li, X. G., Li, S., Wynveen, P., Mork, K., Kellermann, G. Development and validation of a specific and sensitive LC-MS/MS method for quantification of urinary catecholamines and application in biological variation studies. Anal. Bioanal. Chem. 406 (28), 7287-7297 (2014).
- Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. Pre-analytical and analytical validations and clinical applications of a miniaturized, simple and cost-effective solid phase extraction combined with LC-MS/MS for the simultaneous determination of catecholamines and metanephrines in spot urine samples. Talanta. 159, 238-247 (2016).
- Chao, M. R., et al. Simultaneous detection of 3-nitrotyrosine and 3-nitro-4-hydroxyphenylacetic acid in human urine by online SPE LC-MS/MS and their association with oxidative and methylated DNA lesions. Chem. Res. Toxicol. 28 (5), 997-1006 (2015).
- Radabaugh, M. R., Nemirovskiy, O. V., Misko, T. P., Aggarwal, P., Mathews, W. R. Immunoaffinity liquid chromatography-tandem mass spectrometry detection of nitrotyrosine in biological fluids development of a clinically translatable biomarker. Anal. Biochem. 380 (1), 68-76 (2008).
- Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. Tailored 96-well µElution solid-phase extraction combined with UFLC-MS/MS: a significantly improved approach for determination of free 3-nitrotyrosine in human urine. Anal. Bioanal. Chem. 407 (25), 7703-7712 (2015).
- Roche Diagnostics. Roche Creatinine Jaffé Gen.2, package insert 2011-11, V7. , Mannheim. Available from: https://usdiagnostics.roche.com/products/06407137190/PARAM2083/overlay.html 2011-2011 (2011).
- Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. A novel mixed-mode solid phase extraction coupled with LC-MS/MS for the re-evaluation of free 3-nitrotyrosine in human plasma as an oxidative stress biomarker. Talanta. 140, 45-51 (2015).
- Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. An integrated liquid chromatography-tandem mass spectrometry approach for the ultra-sensitive determination of catecholamines in human peripheral blood mononuclear cells to assess neural-immune communication. J. Chromatogr. A. 1449, 54-61 (2016).