Summary

Cuantificación de la densidad de ramificación en las monturas enteras de la glándula mamaria de rata usando el método de análisis Sholl

Published: July 12, 2017
doi:

Summary

El desarrollo de la glándula mamaria en el roedor se ha evaluado típicamente mediante evaluaciones descriptivas o mediante la medición de atributos físicos básicos. La densidad de ramificación es un indicador del desarrollo mamario que es difícil de cuantificar objetivamente. Este protocolo describe un método fiable para la evaluación cuantitativa de las características de ramificación de las glándulas mamarias.

Abstract

Un número creciente de estudios están utilizando la glándula mamaria de roedor como punto final para evaluar la toxicidad de desarrollo de una exposición química. Los efectos que estas exposiciones tienen en el desarrollo de la glándula mamaria se evalúan típicamente usando mediciones dimensionales básicas o marcando características morfológicas. Sin embargo, la amplia gama de métodos para interpretar los cambios en el desarrollo podría llevar a traducciones inconsistentes entre los laboratorios. Se necesita un método común de evaluación para que las interpretaciones adecuadas puedan formarse a partir de los datos que se comparan entre los estudios. El presente estudio describe la aplicación del método de análisis Sholl para cuantificar las características de ramificación de las glándulas mamarias. El método de Sholl se desarrolló originalmente para su uso en la cuantificación de patrones dendríticos neuronales. Mediante el uso de ImageJ, un paquete de software de análisis de imágenes de código abierto, y un complemento desarrollado para este análisis, la densidad de ramificación de la glándula mamaria y la complejidad de la amSe determinó la glándula mamaria de una rata hembra peripubertal. Los métodos descritos aquí permitirán el uso del análisis de Sholl como una herramienta eficaz para cuantificar una característica importante del desarrollo de la glándula mamaria.

Introduction

La ramificación de las glándulas mamarias es una característica que comúnmente se evalúa como un indicador del desarrollo de las glándulas, pero es difícil de cuantificar objetivamente. En 1953, Sholl 1 describe un método para medir arborización dendrítica neuronal en las cortezas visuales y motoras del gato, y un plugin para esta técnica fue desarrollada por Ferriera et al 2. Debido a que las neuronas y las glándulas mamarias exhiben una estructura parecida a un árbol similar, el plugin se empleó para cuantificar las densidades de ramificación epitelial mamaria en imágenes 2D de la glándula mamaria peripubertal de rata. La etapa peripuberal fue elegida para el análisis porque el destete es una etapa de la vida que se evalúa a menudo en los laboratorios académicos y los estudios de la guía de la prueba. El análisis de Sholl es un plugin distribuido con FIJI, que es el paquete de procesamiento de imágenes de código abierto ImageJ, con complementos adicionales incluidos. El complemento crea una serie de anillos concéntricos que rodean un prefijo(Típicamente el soma de una neurona o el origen del conducto primario de una glándula mamaria) y extendiéndose hacia fuera hasta la porción más distal del objeto (el radio envolvente). A continuación, cuenta el número de intersecciones (N) que se producen en cada uno de los anillos. El complemento también devuelve un coeficiente de regresión de Sholl ( k ), que es una medida de la tasa de decaimiento de la ramificación epitelial.

Utilizando ImageJ, se crea una imagen esqueletizada de una glándula mamaria de montaje completo y se mide el área epitelial mamaria (MEA). La imagen se analiza utilizando el plugin de análisis de Sholl, y se devuelven valores para N yk , entre otros valores no utilizados aquí. La densidad de ramificación epitelial mamaria se determina mediante el cálculo de N / MEA. La extensión a la cual la ramificación continúa en las regiones externas del epitelio glandular es la complejidad de la ramificación y es un indicador del crecimiento epitelial distal uniforme. Como k es una medida de la disminución distal en epítetoEs una medida eficaz de la complejidad ramificada y un indicador fiable del desarrollo mamario.

Este protocolo describe un método asistido por ordenador para crear imágenes esqueletizadas de glándulas mamarias globales y evaluar cuantitativamente las características de ramificación mamaria en ratas peripuberales macho y hembra. Este método es relativamente rápido y no requiere el uso de equipos de microscopía especializados. El desarrollo y la validación de este método se describen en Stanko et al. (2015) 3 . Este informe también describe la preparación de glándulas mamarias de rata enteras = monturas. Se han descrito procedimientos mamarios de montaje completo similares en de Assis et al. (2010) 4 y Plante et al. (2011) 5 .

Protocol

Todos los usos y procedimientos de los animales para este estudio fueron aprobados por el Comité de Uso y Cuidado de Animales del Laboratorio del NIEHS y llevados a cabo en una instalación acreditada por la Asociación de Evaluación y Acreditación de Laboratorios de Cuidado de Animales. 1. Glándulas mamarias de los impuestos especiales Pre-etiquete todas las diapositivas con un método a prueba de xileno (el lápiz funciona mejor). Cubrirlos con una solución de montaje al fi…

Representative Results

Los valores para el radio cerrado medido, MEA, N, k , y densidad de ramificación calculada para la glándula mamaria analizada en este protocolo se presentan en la Tabla 1 . El análisis de Sholl genera diagramas lineales y semi-log del número de intersecciones en cada radio ( Figura 9 ) y, si se selecciona, un mapa de calor de las intersecciones ( Figura 10 ). Las glándulas menos desarrolladas exhib…

Discussion

Desde el nacimiento hasta la pubertad, el crecimiento de la glándula mamaria es alométrico. Después de la pubertad, la glándula mamaria se desarrolla a través de ramificaciones ductales extensas y elongación, que continúan hasta que el epitelio mamario ocupa la almohadilla de grasa entera. Las características de ramificación son un aspecto importante del desarrollo de la glándula mamaria y la capacidad de cuantificar objetivamente estas características puede ser muy útil para evaluar el desarrollo mamario no…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores desean agradecer al Dr. Michael Easterling (Sistemas Social y Científico, Inc., Durham, NC) por su ayuda con la validación de este método y el Dr. Tiago Ferreira (McGill University, Montreal, Quebec, Canadá) Asistencia con la aplicación Sholl.

Materials

Dissecting board NA NA A piece of styrofoam roughly 10"x12" is suitable.
Dissecting T-Pins Daigger EF7419A
Spray bottle with ethanol NA NA 70% ethanol is suitable.
Curved dissecting scissors Fine Science Tools 14569-09
Straight dissecing scissors Fine Science Tools 14568-09
Curved forceps Fine Science Tools 11003-12
Superfrost Plus 24x75x1 mm microscope slides ThermoFisher Scientific 4951PLUS-001 Thermo Scientific Superfrost Plus & Colorfrost Plus slides hold tissue sections on permanently without the need for expensive coatings in IHC and Anatomical Pathology applications. This treatment reduces tissue loss during staining as well as hours of slide preparation. Slides electro-statically attract frozen tissue sections and cytology preparations and feature a chemistry similar to silane, although optimized to improve application performance.
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4951PLUS4. 
Fisherfinest Premium Cover Glass 24x60x1 mm Fisher scientific 12-548-5P
Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film Fisher scientific 13-374-12
Chloroform Sigma-Aldrich C2432
Glacial acetic acid Sigma-Aldrich A9967
Ethanol absolute, ≥99.8% (GC)  Sigma-Aldrich 24102
Xylene Sigma-Aldrich 214736
Carmine alum  Sigma-Aldrich C1022
Aluminum potassium sulfate  Sigma-Aldrich A6435
Permount mounting media Fisher Scientific SP15
Macroscope Leica Z16 APO  This is the image capturing hardware and software used in this laboratory.  As there are many different options, the methods and applications may vary between laboratories.
Digital camera Leica DFC295
Camera software Leica Leica Application Suite v3.1 
ImageJ software Open source http://imagej.net/Welcome
Sholl analysis  Open source http://imagej.net/Sholl_Analysis

References

  1. Sholl, D. A. Dendritic organization of the neurons in the visual and motor cortices of the cat. J Anat. 87 (4), 387-406 (1953).
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Cite This Article
Stanko, J. P., Fenton, S. E. Quantifying Branching Density in Rat Mammary Gland Whole-mounts Using the Sholl Analysis Method. J. Vis. Exp. (125), e55789, doi:10.3791/55789 (2017).

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