Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Количественная оценка плотности ветвлений в клетках грудной железы крысы с полным ходом с использованием метода анализа Sholl

Published: July 12, 2017 doi: 10.3791/55789
Automatic Translation
1, 1
1National Toxicology Program Laboratory, Division of the National Toxicology Program, National Institute of Environmental Health Sciences

Summary

Развитие молочной железы у грызунов обычно оценивалось с использованием описательных оценок или путем измерения основных физических характеристик. Плотность ветвления является показателем развития молочной железы, который трудно объективно оценить количественно. Этот протокол описывает надежный метод количественной оценки характеристик ветвления молочной железы.

Abstract

Все большее число исследований использует молочную железу грызунов в качестве конечной точки для оценки токсичности развития химического воздействия. Эффекты, которые эти воздействия оказывают на развитие молочной железы, обычно оцениваются с использованием либо основных измерений размеров, либо путем оценки морфологических характеристик. Однако широкий спектр методов интерпретации изменений в области развития может привести к несовместимым переводам в лабораториях. Необходим общий метод оценки, чтобы можно было интерпретировать правильные интерпретации из сопоставимых данных по исследованиям. В настоящем исследовании описывается применение метода анализа Шолла для количественной оценки характеристик ветвления молочной железы. Метод Sholl был первоначально разработан для использования при количественном определении нейронных дендритных структур. Используя ImageJ, пакет программного обеспечения для анализа изображений с открытым исходным кодом и плагин, разработанный для этого анализа, плотность разветвления молочной железы и сложность amОпределяли аммиачную железу от перипубертальной женской крысы. Описанные здесь методы позволят использовать анализ Sholl как эффективный инструмент для количественной оценки важной характеристики развития молочной железы.

Introduction

Разветвление молочной железы является характеристикой, которая обычно оценивается как индикатор развития железы, но ее объективно объективно оценить невозможно. В 1953 году Шолл 1 описал метод измерения нейронной дендритной арборизации в зрительной и моторной коре кошки, а плагин для этой техники был разработан Ферриере и др. 2 . Поскольку и нейроны, и молочные железы имеют сходную древовидную структуру, плагин использовался для количественного определения плотности размножения эпителиальных млекопитающих в двумерных изображениях молочной железы перибубертальной крысы. Перипубертальный этап был выбран для анализа, потому что отлучение - это жизненный этап, который часто оценивается в академических лабораториях и исследованиях по тестированию. Анализ Sholl представляет собой плагин, распространяемый с помощью FIJI, который представляет собой пакет обработки изображений ImageJ с открытым исходным кодом, включая дополнительные плагины. Плагин создает ряд концентрических колец, окружающих predef(Как правило, сома нейрона или происхождение первичного канала молочной железы) и простирается до самой дистальной части объекта (радиус окружения). Затем он подсчитывает количество пересечений (N), которые встречаются на каждом из колец. Плагин также возвращает коэффициент регрессии Sholl ( k ), который является измерением скорости распада эпителиального ветвления.

Используя ImageJ, создается скелетонизированное изображение цельной смолы молочной железы и измеряется площадь эпителия молочной железы (MEA). Изображение анализируется с использованием плагина анализа Sholl, а значения для N и k , среди других значений, не используемых здесь, возвращаются. Плотность разветвления эпителия молочной железы определяется путем расчета N / MEA. Степень, в которой ветвление продолжается во внешних областях железистого эпителия, является сложностью ветвления и является показателем равномерного роста дистального эпителия. Поскольку k является мерой дистального уменьшения в эпитетеВетвь элиты, это эффективная мера сложности ветвления и надежный показатель развития молочной железы.

В этом протоколе описывается компьютерный метод для создания скелетонизированных изображений цельных гормонов молочной железы и количественной оценки характеристик ветвления молочной железы у перипубертальных самцов и самцов крыс. Этот метод является относительно быстрым и не требует использования специализированного оборудования для микроскопии. Разработка и валидация этого метода описаны в Stanko et al. (2015 год) 3 . В этом отчете также описывается подготовка крысиной молочной железы all = mounts. Подобные процедуры полного восстанавления молочной железы описаны в работе Assis et al. (2010) 4 и Plante et al. (2011 год) 5 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все виды использования животного и процедуры для этого исследования были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных NIEHS в Лаборатории животных и проведены в Ассоциации по оценке и аккредитации аккредитованного лабораторией по уходу за животными.

1. Акцизные молочные железы

  1. Предварительно маркируйте все слайды с использованием метода ксилола (лучше всего работает карандаш). Накройте их монтажным раствором в конце, чтобы сохранить этикетку.
  2. Усыплять животное по методике, утвержденной Институтом по уходу и использованию животных.
  3. После эвтаназии положите животное на спину на рассекающую доску ( рис. 1 ). Протяните и сожмите все четыре конечности, при этом задние конечности образуют перевернутый V (удерживающие штифты или иглы малого калибра хорошо работают).
  4. Разбрызгивайте живот либерально 70% этанолом, чтобы держать волосы вне образца молочной железы.
  5. Используя щипцы, подтяните брюшную кожу на средней линии и сделайте небольшой разрез сРассекающие ножницы, стараясь не прокалывать брюшину.
    1. Начиная с надреза, разрезать кожу до области шеи, а затем дистально до передней конечности. Вырезать до паховой области, а затем дистально к первому суставу задней конечности на той же стороне; Этот разрез обычно разделяет молочные железы 5 и 6. Избегайте срезания брюшины.
    2. Вытяните кожу с прикрепленной грудной клеткой с помощью щипцов, аккуратно отделив ее от брюшины, используя тупой конец ножниц для рассечения. Отделите как можно дальше дорсально, чтобы полностью открыть 4- ю и 5- ю паховые молочные железы на нижней стороне кожи; Прикрепите кожу к рассекающей доске ( рис. 2 ).
    3. Аккуратно возьмитесь за молочную ткань 5- й железы с закругленной стороной изогнутых щипцов и медленно очертите сальник от кожи, стараясь не наклеить железу или кожу.
    4. Продолжайте обрезать,Двигаясь дорзально до тех пор, пока 4- я и 5- я железы не будут полностью сняты с кожи. Убедитесь, что область сосков удалена остальной частью сальника, поскольку это служит отправной точкой для анализа Шолла. Вырежьте молочную ткань вдали от тела, где она прикреплена к железу 4.
  6. После удаления железы с животного равномерно распределите его на электростатически заряженном слайде с микроскопом размером 25 мм х 75 мм х 1 мм со стороной, прилегающей к коже вниз.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Для желез у пожилых или кормящих животных может потребоваться 51 x 75 x 1 мм слайд.
  7. Надев перчатки, аккуратно выжмите пузырьки воздуха. Накройте железом пластиковую парафиновую пленку и другой слайд микроскопа и сжимайте сальник, чтобы прикрепить его к предмету слайда.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Коническую трубку объемом 50 мл, наполненную водой, служит подходящим весом. Количество времени, необходимое для прикрепления к слайду, зависит от толщины сальника. Тонкая, постна(PND) 4 железы должны быть сжаты в течение минимум 30 минут, тогда как более толстые взрослые железы могут потребовать 2-5 часов.

2. Подготовьте все мазки для грудных детей

  1. Предварительно подготовьте раствор карминового квасца по крайней мере за 24 часа, так как это требует кипения и охлаждения.
    1. Растворить 1 г карминового квасца и 2,5 г сульфата алюминия (AlK (SO 4 ) 2 · 12H 2 O) в 500 мл дистиллированной воды и кипятить в течение 20 минут в 1-литровой колбе. Довести конечный объем до 500 мл с использованием дистиллированной воды.
    2. Фильтрация раствора через фильтровальную бумагу под вакуумом и охлаждение для хранения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: раствор карминового квасца можно повторно использовать, но его следует отбрасывать, когда цвет начинает исчезать.
  2. Перед фиксацией очистите парафиновую пленку от железы, стараясь не вытащить сальник с ползуна. Поместите слайд (ы) в стеклянную баню с пятнами и погрузите в фиксатор (100% этанОл, хлороформ и ледяная уксусная кислота в соотношении 6: 3: 1) в течение 12-48 ч, в зависимости от толщины желез.
  3. Налейте фиксатор и впитайте железы в 70% этаноле в течение 15 минут. Постепенно регидратируйте железы, выливая 1/3 раствора этанола и заменяя его дистиллированной водой. Замочить в течение 5 мин. Повторите этот процесс три раза.
  4. После окончательного полоскания вылейте весь раствор этанол / вода и замените его 100% дистиллированной водой. Замочите железы в течение 5 мин.
  5. Вылейте дистиллированную воду и погрузите железы в раствор карминового квасца. Окрашивайте железы в течение 12-24 часов, в зависимости от толщины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: железы не могут быть перекрашены, но время окрашивания для нескольких партий должно быть одинаковым, чтобы интенсивность окрашивания была одинаковой.
  6. Вылейте раствор карминового квасца и промойте железы в 100% дистиллированной воде в течение 30 с. Постепенно обезвоживают железы, впитывая их в 70% этаноле в течение 15 мин, 95% этанола в течение 15 мин,100% этанола в течение 20 мин.
  7. Очистите железы жиров, впитав их в ксилол в течение 12-72 часов, в зависимости от толщины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: железы должны быть полупрозрачными (прозрачными). Если остаются непрозрачные (беловатые) области, продолжайте вымачивать в ксилоле до полупрозрачного. Если лактирующие или иначе очень толстые железы окрашиваются и очищаются, ксилол может потребоваться заменить один раз, чтобы полностью очистить железы.
  8. Установите слайды с помощью монтажной среды на основе ксилола, пипетируя достаточное количество среды, чтобы просто покрыть сальник. Добавьте покровное, чтобы не образовывались пузырьки воздуха.
  9. Дайте слайдам высохнуть. По мере того, как монтажная среда высыхает, она сжимается под покровным слоем, и может потребоваться добавить дополнительную монтажную среду. Если не требуется дополнительная среда, дайте слайдам полностью высохнуть; Это может занять 2-3 недели.
  10. Как только слайды полностью высохнут, любая остаточная монтажная среда может быть удалена ватным тампоном и небольшим количеством ксилола. Будьте осторожны, чтобы не использоватьСлишком много ксилола, так как это может растворить установочную среду и ослабить покровное. Если это происходит, и пузырьки воздуха собираются под покровным покровом, покровное стекло следует удалить в ксилоле, и процесс монтажа следует повторить.

3. Подготовьте изображения целиком для анализа

  1. Захват изображений целых монстров ( рисунок 3 ) с помощью макроскопа или рассекающего микроскопа и цифровой камеры с соответствующим программным обеспечением.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Несмотря на то, что любое увеличение, которое захватывает весь железистый эпителий, может быть выбрано, необходимо зафиксировать все изображения с полным креплением, которые будут сравниваться друг с другом при одинаковом увеличении.
  2. Загрузите программное обеспечение ImageJ (или программное обеспечение FIJI). 6 .
  3. Откройте изображение целиком в молочной железе в ImageJ, нажав «Файл» → «Открыть». Выберите инструмент Freehand и проследите вокруг железистого эпителия. Выберите «Изменить» & #8594; «Очистить снаружи».
    1. Удалите лимфатические узлы, проследив вокруг узла и используя инструмент Freehand и «Edit» → «Cut».
  4. Отделите цветные каналы, выбрав «Изображение» → «Цвет» → «Разделить каналы». Выберите канал с наилучшим контрастом, обычно синий.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Изображение RGB состоит из стопки красных, зеленых и синих компонентов этого изображения. Это действие разделяет эти компоненты на три 8-битных изображения в оттенках серого.
  5. Вычеркните фон, выбрав «Процесс» → «Вычесть фон». Выберите нужные параметры и нажмите «Предварительный просмотр», чтобы просмотреть изменения.
    ПРИМЕЧАНИЕ. «Вычесть фон» удаляет гладкие непрерывные фоны. Кроме того, для создания контраста можно использовать «Процесс» → «Фильтры» → «Маска нерезкости».
  6. Выберите один из E следующие методы автоматического удаления шума: despeckle или удалить выбросы.
    ПРИМЕЧАНИЕ. ImageJ предлагает третий метод автоматического удаления шума: удалите NaNs. Однако команда удаления NaNs неприменима, поскольку она использует 32-битные изображения, а текущий метод использует 8-битные изображения.
    1. Удалите шум с помощью команды despeckle, выбрав «Process» → «Noise» → «Despeckle».
      ПРИМЕЧАНИЕ. Это эквивалентно добавлению медианного фильтра, который заменяет каждый пиксель на медианное значение в его окрестности 3 × 3.
    2. Удалите шум, используя команду удаления выбросов, выбрав «Процесс» → «Шум» → «Удалить выбросы».
      ПРИМЕЧАНИЕ. Этот процесс заменяет пиксель средой пикселей в ближайшем окружении, если он отклоняется от медианы более чем на определенное значение (порог).
  7. Удалите все оставшиеся шумы вручную (Lass = "xfig"> Рисунок 4).
    1. Откройте копию исходного изображения и используйте это как руководство для того, что есть и что не является шумом. Нажмите кнопку двойной красной стрелки в крайнем правом углу панели инструментов. Выберите Инструменты рисования; Теперь на панели инструментов появятся кнопки Drawing Tool.
    2. Нажмите инструмент «Ластик». Отрегулируйте диаметр ластика, щелкнув правой кнопкой мыши на кнопке Eraser. Удерживайте левую кнопку мыши, чтобы стереть шум.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Только один сеанс стирания может быть отменен. После того, как левая кнопка мыши будет отпущена и снова будет нажата, предыдущее удаление не может быть отменено.
  8. Отрегулируйте порог, выбрав «Изображение» → «Настроить» → «Порог». Переместите ползунки, чтобы настроить минимальные (верхний ползунок) и максимальные (нижний ползунки) пороговые значения, пока не будет достигнуто адекватное изображение сальника.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Установка пороговых значений сегментирует изображения в оттенках серого в интересующие объекты и фон.
    1. Нажмите «Применить». При необходимости удалите дополнительный шум в этот момент, выполнив шаги 3.6.1 и 3.6.2.
  9. Восстановить части железистого эпителия, которые были удалены с помощью порога и удаления шума ( рис. 5 ).
    1. Проведите реконструкцию изображения тщательно и на минимальной основе, чтобы сохранить целостность исходного изображения. Обратитесь к исходному изображению за ссылкой о том, что есть и что не является эпителием.
    2. Нажмите инструмент Spray Can (на панели инструментов с помощью инструментов рисования). Отрегулируйте диаметр и скорость распыления, щелкнув правой кнопкой мыши на кнопке инструмента Spray Can. Аккуратно заполните отсутствующие участки железы, нажав или удерживая левую кнопку мыши.
  10. Создайте скелетный образ железы для проведения анализа Sholl. Убедитесь, что пороговое изображение является двоичным, выбрав «Процесс» → «Двоичный» → «Сделать B Инары «.
    1. Если изображение белого цвета на черном фоне, выберите «Процесс» → «Двоичный» → «Параметры» и снимите флажок «Черный фон». Скелетонируйте изображение, выбрав «Процесс» → «Двоичный» → «Скелезонировать».
      ПРИМЕЧАНИЕ. Это неоднократно удаляет пиксели с краев двоичного изображения, пока оно не будет уменьшено до одной пиксельной формы.
    2. Разбавьте изображение один раз, выбрав «Процесс» → «Двоичный» → «Разбавить».
      ПРИМЕЧАНИЕ. Это заполняет пробелы, созданные порогом и скелетонированием, добавляя пиксели к краям двоичного изображения.
  11. Сохраните изображение, выбрав «Файл» → «Сохранить как». Выберите тип изображения (обычно jpeg), введите имя файла и нажмите «ОК».
  12. Проверьте точность скелетонированного изображения путем наложения скелетонированного изображения на исходное изображение (Рис. 6).
    1. Создайте наложение, открыв как исходное изображение, так и скелетонированное изображение. Выберите «Изображение» → «Наложение» → «Добавить изображение». В диалоговом окне «Добавить изображение» выберите изображение скелета из раскрывающегося меню «Изображение для добавления» и установите непрозрачность на 30%.
    2. Сохраните изображение скелета, наложенного на оригинал, выбрав «Файл» → «Сохранить как». Выберите тип изображения, введите имя файла и нажмите «ОК».

4. Проведите анализ Sholl

  1. Откройте изображение скелета и сделайте двоичный файл изображения, выбрав «Процесс» → «Двоичный» → «Сделать двоичный файл».
    1. Перед установкой шкалы увеличения измерьте количество пикселей / мм с помощью микрометра для увеличения, при котором изображения были захвачены.
    2. Установите измеренное увеличение sCale, выбрав «Анализ» → «Установить масштаб». Введите количество пикселей / мм. Установите «Известное расстояние» и «Соотношение пикселей пикселей», равное 1. Введите «мм» для «Единицы измерения длины» и отметьте «Глобальный» (поддерживает одинаковый масштаб для каждого изображения).
  2. Определите радиус окончания (охватывающий радиус) для анализа Шолла, вычерчивая линию от начала первичного протока (центр анализа) до самой дистальной точки железистого эпителия ( рис. 7 ).
    1. Используйте инструмент рисования линии на панели инструментов, чтобы нарисовать линию между представляющими интерес точками. Нажмите клавишу «M», чтобы выполнить измерение, и обратите внимание, что откроется окно результатов.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Значение в столбце «Длина» - это длина строки в мм. Это значение будет автоматически вводиться как конечный радиус при настройке параметров Sholl. Плагин Sholl будет использовать начальную точкуЛинии как центра центрических колец.
  3. Выполнение анализа Sholl.
    1. Запустите анализ, выбрав «Плагины» «Расширенный анализ Sholl»; Появится окно параметров.
    2. Установите начальный радиус в «I. Определение оболочек» на 0,00 мм; Длина линии, измеренная на шаге 4.2, автоматически вводится как «Конечный радиус».
    3. Установите «Шаг шага радиуса» на 0,1 мм.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Размер шага радиуса определяет количество колец (фактически количество итераций); Меньший размер шага увеличит количество колец, в то время как больший размер шага уменьшит количество колец. Радиус не может быть установлен слишком малым, хотя чрезмерно малый радиус приведет к излишне большому числу колец. Однако он может быть установлен слишком большим, что создаст меньше колец и впоследствии недооценивает истинное количество пересечений. См. Stanko et al.(2015) для получения дополнительной информации об определении размера шага.
    4. Установите «# Образцы» на 1 и «Интеграция» на «Среднее» в «II. Несколько образцов на радиус».
    5. Установите «Обрезание радиуса закрытия» на 1 и проверьте «вывести из радиуса начала» для «# Первичные ветви» в «III. Дескрипторы и фитинг кривой».
      ПРИМЕЧАНИЕ: «Скомпоновать профиль и дескрипторы вычислений» и «Показать детали фитинга» можно проверить по желанию.
    6. Проверьте «Линейный» и выберите «Наилучшая степень соответствия» в разделе «Профили без нормализации»; Проверьте «Наиболее информативный». Выберите «Область для нормализованных профилей» в «IV. Методы Sholl».
    7. Установите флажок «Создать маску пересечений» в «V. Параметры вывода», чтобы создать тепловую карту пересечений (необязательно).
    8. Нажмите «Cf.segmentation», чтобы создать окно предварительного просмотра изображения с кольцами для подтверждения областиАнализа.
  4. Нажмите «ОК», чтобы запустить анализ.

5. Измерение MEA

  1. Измерьте MEA, проследив кратчайшее расстояние вокруг эпителиального дерева ( рис. 8 ).
    1. В ImageJ с изображением скелета сальника откройте инструмент Polygon. Нажмите на точку по периметру эпителиального дерева, чтобы начать многоугольник, передвиньтесь по периметру железы и нажмите, чтобы добавить сегмент линии.
    2. Когда вся эпителиальная область была обойдена, дважды щелкните, чтобы закрыть многоугольник. Нажмите клавишу «M», чтобы открыть окно результатов; Значение в столбце «Площадь» - это MEA.
  2. В случаях, когда железистый эпителий выходил за пределы лимфатического узла, вычитайте площадь лимфатических узлов (МШУ) из МЭА при расчете плотности ветвления.
    1. Измерьте МШУ, проследив лимфатический узел в той же маннеEr как эпителиальное дерево и нажатие «M.»
      ПРИМЕЧАНИЕ. В этих случаях МШУ следует вычесть из МЭА, поскольку лимфатический узел не позволяет анализировать подсчет пересечений в МШУ. Когда эпителий не достиг лимфатического узла, МШУ равен нулю.

6. Отчетные данные

  1. Сообщите значения радиуса окружения, MEA, N, k и плотности ветвления.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Радиус окружения определяется на этапе 4.2, а МЭА определяется на этапе 5.1.
    1. Запустите анализ, чтобы создать окно результатов Sholl.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Сообщенный N является значением для суммы. Сообщаемое значение k является значением коэффициента регрессии Sholl (полулогарифмический). Анализ Sholl вернет значение для k по любой измеренной области железистого эпителия. Чтобы получить точное значение для k над полным эпителием, должны присутствовать протонные концы.
    2. ИзменитьE Sholl-анализ для молочной железы с использованием выходного значения для N для вычисления плотности ветвления (основной конечной точки этого метода). Вычислите плотность разветвления с использованием формулы N / (MEA-LNA) и сообщите значение как N / мм 2 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Значения измеренного замкнутого радиуса, MEA, N, k и расчетной плотности ветвления для молочной железы, проанализированные в этом протоколе, представлены в таблице 1 . Анализ Sholl генерирует линейные и полу-логовые графики числа пересечений в каждом радиусе ( рис. 9 ) и, если выбрано, тепловую карту пересечений ( рис. 10 ). Менее развитые железы имеют меньше пересечений в одном и том же MEA и поэтому имеют более низкую плотность разветвления. Хорошо развитая железа будет продолжать равномерно распределяться по всему железистому эпителию, особенно в дистальных областях. Степень продолжения ветвления в этих регионах может быть описана как сложность ветвления, а уменьшение сложности передается как скорость распада (или коэффициент регрессии Sholl, k ). Скорость распада отражает изменение в дистальном эпителиальном бюстгальтереnching и измеряется как наклон линии числа пересечений на график против радиуса заключающей (то есть, продольный рост эпителия). Таким образом, коэффициент регрессии Шолла рассчитывается путем наклона линии графика log (N / S) по сравнению с радиальным расстоянием (r), где log (N / S) = - k r + m, причем N является Число пересечений для каждого кольца радиуса r и площади S (πr 2 ), а m - перехват. Поскольку наклон - k описывает распад пересечений, значение - k = 0 указывает на нулевой спад и равномерное разветвление от центра анализа до края эпителия. В малоразвитых железах разветвляется разветвление; В дистальной области эпителиального дерева меньше пересечений; И наклон k увеличивается. Поэтому значения k, приближающиеся к 0, указывают на большее дистальное ветвление ( т. Е. Сложность разветвления) и скважину- развитая молочная железа.

Рисунок 1
Рисунок 1: Вентральный вид. Изображение вентральной части взрослой самки крысы Sprague Dawley, иллюстрирующей, как закрепить крысу на рассекающей поверхности и расположение 12 молочных желез, при этом соски окружены. * Соски желез 6 и 7 не видны. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

фигура 2
Рисунок 2: Женская крысиная молочная железа. Иллюстрация открытых молочных желез 4 (MG4) и 5 ​​(MG5), при этом кожа прикреплена к рассекающей поверхности выше MG4 и чуть ниже MG5. Железы должны быть удалены с экрана Начиная с MG5 и продолжая вверх и дорзально до тех пор, пока MG5 и 4 не будут полностью удалены. Ниппель находится в дистальной области железы 4, и следует заботиться о том, чтобы собрать эту область. Лимфатический узел указан для справки. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3
Рисунок 3: Полная гора молочной железы. Образ цельной смолы молочной железы, собранный из послеродового дня 25 самки крысы Sprague Dawley. Шкала шкалы = 1 мм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

.jpg "/>
Рисунок 4: Удаление шума. Голубой цветной канал изображения целиком, с фоном вычитается. ( A ) демонстрирует примеры с шумом. Стрелки указывают шум, создаваемый кровеносными сосудами, а более сильно заштрихованная область, окружающая концы протоков, является примером шума, создаваемого вычитанием фона. ( B ) иллюстрирует изображение после удаления шума. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5
Рисунок 5: Реконструкция изображения. Реконструкция стертых участков порогового изображения. ( A ) Красные стрелки указывают области, где части изображения были потеряны из-за порога. Изображение реконструкцияВ этих регионах следует проводить мероприятия. ( B ) Изображение молочной железы после восстановления удаленных областей. Реконструкция изображений должна проводиться тщательно и на минимальной основе, чтобы сохранить целостность исходного изображения. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6
Рисунок 6: Наложение скелетного изображения. Наложение изображения, изображающего скелетное изображение, накладывается на исходное изображение целиком. Это изображение демонстрирует, что скелетонированная железа отражает высокую степень точности ветвления фактической железы. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.


Рисунок 7: Радиус окружения. Скелетонированное изображение молочной железы, показывающее, где измеряется радиус окружения (желтый). Линия должна начинаться у основания эпителиального дерева (центр анализа) и простираться до самой дистальной точки эпителия. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 8
Рисунок 8: Эпителиальная область молочной железы. Скелетонированное изображение, показывающее многоугольник, прорисованный вокруг эпителиального дерева, чтобы определить MEA. Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версиюЭта цифра.

Рисунок 9
Рисунок 9: Вывод данных Sholl. Sholl выход линейных ( A ) и полулогарифмических ( B ) графиков числа пересечений при каждом радиальном приращении. Красной точкой на панели (A) является абсцисса центра тяжести (геометрический центр). В панели (B), синяя линия является линейной регрессии по всему диапазону данных, в то время как красная линия является линейной регрессии по 10 - й -90 - й процентиль. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 10
Рисунок 10: Маска пересечений. Когда «Создать Интер»(Шаг 4.3.7), в результате анализа будет отображено тепловое отображение числа пересечений на окружном радиусе изображения. Это тепловое отображение отражает плотность разветвляющихся пересечений по всему эпителию (красный = горячий = Высокая плотность, синий = холод = низкая плотность). Весь эпителий был бы одного цвета в тепловой карте изображения, где k = 0. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

</ Table>

Таблица 1: Параметры анализа Sholl. Значения представляют собой данные для анализа Sholl. Окружающий радиус (шаг 4.2) и MEA (шаг 5.1) представляют собой измеренные значения, N и k - результаты анализа Sholl и возвращаются в окне результатов анализа Sholl (этап 6.1.), А плотность ветвления рассчитывается по формуле N / ( MEA-LNA) (этап 6.1.2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

От рождения до полового созревания рост молочной железы является аллометричным. После полового созревания молочная железа развивается в результате обширного ветвления и удлинения протоков, которые продолжаются до тех пор, пока эпителий молочной железы не займет всю жировую подушку. Ветвящиеся характеристики являются важным аспектом развития молочной железы, и способность объективно количественно оценивать эти характеристики может быть очень полезна для оценки нормального развития молочной железы и выявления аномального развития после раннего облучения токсинов молочных желез.

Подсчет морфологических характеристик, количественное определение основных измерений размеров и подсчет молочных структур являются типичными методами оценки развития молочной железы. Однако эти методы не особенно чувствительны из-за значительного изменения размера и формы молочных желез грызунов, и интерпретация развития может быть трудной для неопытного оценщика. Кроме того, потенциалПредвзятость существует в исследованиях, которые не ослепляются должным образом. Метод анализа Sholl обеспечивает эффективный протокол для точного количественного определения плотности разветвления эпителия молочной железы и сложности разветвления, дискретных морфологических характеристик развития молочной железы, которые легко сравниваются между исследованиями и лабораториями.

В нескольких разделах этого протокола есть критические шаги. Первое и самое важное относится к состоянию всей молочной железы. Точность этого метода основана на молочной железе, которая полностью собрана, смонтирована без дефектов, правильно закреплена и окрашена, и не демонстрирует никакого окисления железы или значительного обесцвечивания монтажной среды. Если сальник разорван или сложен, то точная мера плотности разветвления не может быть получена. Если концов протоков нет, значение для k не будет представлять весь сальник. Пороговое значение будет затруднено в железахКоторые не были полностью устранены из-за отсутствия контраста окрашивания в проточном эпителии. И, наконец, если присутствует окисление или обесцвечивание, эти пятна могут помешать анализу измерить пересечения в пораженной области.

Когда подходящие цельные крепления были подготовлены, следующий критический шаг - захват изображений с одинаковым увеличением. Общепринятой практикой является захват цифровых изображений с максимально возможным разрешением. Однако для анализа Sholl важно, чтобы все изображения были захвачены с одинаковым увеличением. Как описано в Stanko et al. (2015) 3 , было обнаружено оговорку, в которой изображения меньших желез, захваченных при большом увеличении, демонстрировали большую плотность разветвления, чем изображения более крупных желез, захваченных при меньшем увеличении, хотя они визуально оказались менее развитыми. Мы выдвинули гипотезу о том, что более высокое увеличение приводило к более детальным данным, перенесенным в tОн скелетонизировал изображение и привел к более высокому N, что чрезмерно показало плотность разветвления меньших желез. Эта проблема устраняется путем захвата всех изображений с одинаковым увеличением.

В то время как основа точного анализа лежит в пределах всего монтирования, наибольший потенциал для изменения данных пересечения, влияющих на пользователя, лежит в пределах шагов для удаления шума. Все изображения содержат в некоторой степени шум из-за интенсивности окрашивания, несущественных физиологических объектов ( например, кровеносных сосудов) и артефактов порогового значения. Каждое изображение должно быть адресовано независимо из-за различий в количестве шума между изображениями. Необходимо проявлять осторожность, чтобы не удалять слишком мало или слишком много шума, поскольку это может исказить количество пересечений и, следовательно, плотность ветвления. Однако степень влияния шума на интерпретацию не изучалась. Пользователь должен решить, насколько тщательным является удаление шума, а также следует использовать consisЧтобы поддерживать целостность изображений. Настоятельно рекомендуется, чтобы пользователь был ослеплен при обработке при удалении шума, поскольку это минимизирует вероятность смещения. Удаление шума подробно описано в Руководстве пользователя ImageJ 7 . В этой процедуре шум удаляется в основном из фонового вычитаемого изображения. Кроме того, сам процесс порога может удалить сегменты железы. Части сальника, где удалены только несколько пикселей, будут автоматически восстановлены при расширении скелетного изображения. Тем не менее, экспансивные пробелы могут потребовать ручной реконструкции. Пользователь должен решить, следует ли и в какой степени восстановить эти сегменты, снова сохраняя целостность исходных изображений.

Хотя это не критично, важно поддерживать обновления программного обеспечения, так как программное обеспечение ImageJ часто обновляется. Описанные здесь методы основаны на версии 1.48v. FIJI и Sholl aПлагин nalysis также регулярно обновляется, и описанный здесь протокол основан на версии 3.3. Изменения, внесенные в более поздние версии как ImageJ, так и плагина Sholl Analysis, могут повлиять на эти методы. ImageJ автоматически проверяет наличие обновлений, но обновления для FIJI должны проводиться регулярно, а изменения между текущими версиями и используемыми здесь должны быть устранены по мере необходимости. Все параметры определены в подзаголовках на веб-странице Sholl Analysis 6 . Настройки параметров в этой процедуре основаны на изображениях, снятых с цельных монстров молочной железы, созданных в нашей лаборатории, и не являются абсолютными. Подготовка цельного монтирования варьируется от лаборатории к лаборатории, и эти параметры могут быть скорректированы соответственно для оптимизации изображений и вывода.

Общая масса молочной железы, используемая в этом исследовании, была получена от самки крысы Sprague Dawley в PND 25, и этот метод применялся надлежащим образом и без ограничений. У крыс плотность эпителия молочной железы инкС возрастом до такой степени, что он предотвращает пороговое изображение с достаточно высоким разрешением для создания точного скелетонированного изображения железы. Поэтому в настоящее время мы не рекомендуем использовать этот метод на железах у крыс старше PND40. Хотя штамм крысы был указан здесь, это не имеет значения, так как авторы в настоящее время не знают о каких-либо специфических штаммах молочных желез, которые препятствовали бы использованию этого метода. Кроме того, в то время как метод, описанный внутри, был проведен с использованием женской крысы, он также может быть применен к молочным железам самцов крыс. Это приложение также эффективно использовалось для целых мышей (Deirdre Tucker, личное общение) и должно быть пригодным для мышей любого возраста, поскольку молочные железы у мышей не растут столь же плотно, как у крыс. Тем не менее, существует два ограничения использования этого приложения у мышей: 1) для более молодых мышей может быть слишком мало разветвлений для выявления значительных различий и 2) этот метод cannoT применяют к самцам мышей, так как они не проявляют эпителий молочной железы. Независимо от того, этот автоматический метод быстрее, непредвзято и значительно менее трудоемкий, чем подсчет ветвящихся перекрестков вручную.

Возможно, исследователи могут захотеть использовать молочную железу для других экспериментальных методов, таких как вырезание аномальных структур или иммуногистохимия (IHC). Хотя Tucker et al. (2016) описал способ получения окрашенного гематоксилин-эозином участка из мышиного молочного железа целиком 8, как правило, мы рассматриваем создание цельного монтирования как терминального процесса и не знаем методов для использования цельнозерновой молочной железы, Смонтированных молочных желез для дополнительных чувствительных анализов, таких как анализы IHC или TUNEL. Там, где необходимы чувствительные анализы с использованием ткани молочной железы в сочетании с целыми креплениями, рекомендуется использовать контралатеральные молочные железы.

Молочная железа продолжается tO быть координационным центром во все большем числе исследований, однако различия между лабораториями существуют как в подготовке всего 9 , 10 , 11 , 12, так и в оценках развития 13 , 14 , 15 . Модификация описанного здесь анализа Шолла представляет собой стандартизированный метод объективного количественного определения плотности ветвления, важной характеристики развития молочной железы, в молочной железе грызунов. Этот метод может быть применен к молочным целям грызунов мужского или женского пола, и, хотя в настоящее время он рекомендуется для использования только у ранних послеродовых периптуральных желез у крыс, его можно применять к молочным железам у мышей всех возрастов. Применение особенно подходит для молочных желез, собранных у перипубертатных грызунов, поскольку этот период рекомендуетсяКонечной точки для подготовки всего гормонального препарата в экспериментальных исследованиях. В настоящее время рассматривается оптимизация этого метода для использования в более плотных молочных железах взрослых крыс.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Михаэля Истринга (Social and Scientific Systems, Inc., Durham, NC) за его помощь в проверке этого метода и доктора Тьяго Феррейры (Университет Макгилла, Монреаль, Квебек, Канада) за его постоянную Помощь с помощью приложения Sholl.

Materials

Радиус крепления (мм) MEA (мм2) N К Плотность ветвления (Н / мм2)
7,4 71,7 2381 0,73 33,2
Name Company Catalog Number Comments
Dissecting board NA NA A piece of styrofoam roughly 10"x12" is suitable.
Dissecting T-Pins Daigger EF7419A
Spray bottle with ethanol NA NA 70% ethanol is suitable.
Curved dissecting scissors Fine Science Tools 14569-09
Straight dissecing scissors Fine Science Tools 14568-09
Curved forceps Fine Science Tools 11003-12
Superfrost Plus 24 x 75 x 1 mm microscope slides ThermoFisher Scientific 4951PLUS-001 Thermo Scientific Superfrost Plus & Colorfrost Plus slides hold tissue sections on permanently without the need for expensive coatings in IHC and Anatomical Pathology applications. This treatment reduces tissue loss during staining as well as hours of slide preparation. Slides electro-statically attract frozen tissue sections and cytology preparations and feature a chemistry similar to silane, although optimized to improve application performance.
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4951PLUS4. 
Fisherfinest Premium Cover Glass 24 x 60 x 1 mm Fisher scientific 12-548-5P
Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film Fisher scientific 13-374-12
Chloroform Sigma-Aldrich C2432
Glacial acetic acid Sigma-Aldrich A9967
Ethanol absolute, ≥99.8% (GC)  Sigma-Aldrich 24102
Xylene Sigma-Aldrich 214736
Carmine alum  Sigma-Aldrich C1022
Aluminum potassium sulfate  Sigma-Aldrich A6435
Permount mounting media Fisher Scientific SP15
Macroscope Leica Z16 APO  This is the image capturing hardware and software used in this laboratory.  As there are many different options, the methods and applications may vary between laboratories.
Digital camera Leica DFC295
Camera software Leica Leica Application Suite v3.1 
ImageJ software Open source http://imagej.net/Welcome
Sholl analysis  Open source http://imagej.net/Sholl_Analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sholl, D. A. Dendritic organization of the neurons in the visual and motor cortices of the cat. J Anat. 87 (4), 387-406 (1953).
  2. Ferreira, T. A., Iacono, L. L., Gross, C. T. Serotonin receptor 1A modulates actin dynamics and restricts dendritic growth in hippocampal neurons. Eur J Neurosci. 32 (1), 18-26 (2010).
  3. Stanko, J. P., Easterling, M. R., Fenton, S. E. Application of Sholl analysis to quantify changes in growth and development in rat mammary gland whole mounts. Reprod Toxicol. 54, 129-135 (2015).
  4. Assis, S., Warri, A., Cruz, M. I., Hilakivi-Clarke, L. Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats. J. Vis. Exp. (44), e2260 (2010).
  5. Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models. J. Vis. Exp. (53), e2828 (2011).
  6. Ferreira, T. Sholl Analysis. ImageJ. , Available from: http://imagej.net/Sholl_Analysis (2012).
  7. Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide. IJ 1.46r. ImageJ. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html (2012).
  8. Tucker, D. K., Foley, J. F., Hayes-Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Preparation of High-quality Hematoxylin and Eosin-stained Sections from Rodent Mammary Gland Whole Mounts for Histopathologic Review. Toxicol Pathol. 44 (7), 1059-1064 (2016).
  9. Fenton, S. E., Hamm, J. T., Birnbaum, L. S., Youngblood, G. L. Persistent abnormalities in the rat mammary gland following gestational and lactational exposure to 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD). Toxicol Sci. 67 (1), 63-74 (2002).
  10. Murray, T. J., Maffini, M. V., Ucci, A. A., Sonnenschein, C., Soto, A. M. Induction of mammary gland ductal hyperplasias and carcinoma in situ following fetal bisphenol A exposure. Reprod Toxicol. 23 (3), 383-390 (2007).
  11. Moral, R., Santucci-Pereira, J., Wang, R., Russo, I. H., Lamartiniere, C. A., Russo, J. In utero exposure to butyl benzyl phthalate induces modifications in the morphology and the gene expression profile of the mammary gland: an experimental study in rats. Environ Health. 10 (1), 5 (2011).
  12. Johnson, M. D., Mueller, S. C. Three dimensional multiphoton imaging of fresh and whole mount developing mouse mammary glands. BMC Cancer. 13, 373 (2013).
  13. Enoch, R. R., Stanko, J. P., Greiner, S. N., Youngblood, G. L., Rayner, J. L., Fenton, S. E. Mammary gland development as a sensitive end point after acute prenatal exposure to an atrazine metabolite mixture in female Long-Evans rats. Environ Health Persp. 115 (4), 541-547 (2007).
  14. Hovey, R. C., Coder, P. S., Wolf, J. C., Sielken, R. L., Tisdel, M. O., Breckenridge, C. B. Quantitative assessment of mammary gland development in female Long Evans rats following in utero exposure to atrazine. Toxicol Sci. 119 (2), 380-390 (2011).
  15. Mandrup, K. R., Hass, U., Christiansen, S., Boberg, J. Perinatal ethinyl oestradiol alters mammary gland development in male and female Wistar rats. Inter J of Androl. 35 (3), 385-396 (2012).

Tags

Биология развития выпуск 125 молочная железа анализ Sholl репродуктивная цельная токсикология модель крысы
Количественная оценка плотности ветвлений в клетках грудной железы крысы с полным ходом с использованием метода анализа Sholl
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stanko, J. P., Fenton, S. E.… More

Stanko, J. P., Fenton, S. E. Quantifying Branching Density in Rat Mammary Gland Whole-mounts Using the Sholl Analysis Method. J. Vis. Exp. (125), e55789, doi:10.3791/55789 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter