Summary

Kvantifiering av förgreningsdensitet i råtta Mammary Gland Whole-mounts med hjälp av Sholl analysmetoden

Published: July 12, 2017
doi:

Summary

Utveckling av mamma-körteln i gnagaren har typiskt utvärderats med hjälp av beskrivande bedömningar eller genom mätning av grundläggande fysiska egenskaper. Förgreningstäthet är en indikator på bröstutveckling som är svår att kvantifiera objektivt. Detta protokoll beskriver en tillförlitlig metod för kvantitativ bedömning av förgreningsegenskaper hos bröstkörteln.

Abstract

Ett ökande antal studier använder sig av gnagarkörteln som en slutpunkt för att bedöma utvecklingstoxiciteten hos en kemisk exponering. Effekterna av dessa exponeringar har på utvecklingen av bröstkörteln utvärderas typiskt med antingen grundläggande dimensionella mätningar eller genom att poängtera morfologiska egenskaper. Det breda utbudet av metoder för tolkning av utvecklingsförändringar kan emellertid leda till inkonsekventa översättningar över laboratorier. En gemensam bedömningsmetod är nödvändig så att rätt tolkningar kan bildas av data som jämförs mellan studier. Den föreliggande studien beskriver tillämpningen av Sholl analysmetoden för att kvantifiera bröstkörtelförgreningsegenskaper. Sholl-metoden var ursprungligen utvecklad för användning vid kvantifiering av neuronala dendritiska mönster. Genom att använda ImageJ, ett mjukvarupaket med öppen källkodsanalys och ett plugin utvecklat för denna analys, bröstkörtelns förgreningstäthet och komplexiteten hosAmmary körtel från en peripubertal kvinnlig råtta bestämdes. Metoderna som beskrivs här gör det möjligt att använda Sholl-analysen som ett effektivt verktyg för att kvantifiera en viktig egenskap hos utvecklingen av bröstkörteln.

Introduction

Mammarförgrening är en egenskap som vanligtvis bedöms som en indikator på körtelutveckling, men det är svårt att objektivt kvantifiera. 1953 beskrev Sholl 1 en metod för att mäta neuronal dendritisk arborisering i kattens visuella och motoriska cortices och en plugin för denna teknik utvecklades av Ferriera et al. 2 . Eftersom båda neuronerna och bröstkörtlarna uppvisar en liknande trädliknande struktur användes plugin för att kvantifiera bröst-epithelialförgreningsdensiteter i 2D-bilder av peripubertal-råtta-bröstkörteln. Peripubertalstadiet valdes för analys, eftersom avvänjning är ett livsstadium som ofta utvärderas i akademiska laboratorier och provrincipstudier. Sholl-analysen är ett plugin som distribueras med FIJI, vilket är bildkällan ImageJ med öppen källkod, med ytterligare plugins inkluderade. Pluggen skapar en serie koncentriska ringar som omger en predefInent-centret (typiskt soma av en neuron eller ursprunget till den primära kanalen hos en muggkörtel) och sträcker sig ut till den distala delen av föremålet (den inneslutande radien). Det räknar sedan antalet korsningar (N) som uppstår på var och en av ringarna. Pluggen returnerar också en Sholl-regressionskoefficient ( k ), som är en mätning av graden av förfall av epithelialförgrening.

Med hjälp av ImageJ skapas en skelettiserad bild av ett bröstkörtel helmonterat och mageepitelområdet (MEA) mäts. Bilden analyseras med hjälp av Sholl analys plugin, och värden för N och k , bland andra värden som inte används här, returneras. Mammary epithelial branching density bestäms genom att beräkna N / MEA. I vilken utsträckning förgrening fortsätter i de yttre områdena av klyftepitelet är förgreningskomplexiteten och är en indikator på enhetlig distal epithelialväxt. Eftersom k är ett mått på den distala minskningen i epitElial branching, det är ett effektivt mått på förgreningskomplexiteten och en pålitlig indikator på bröstutveckling.

Detta protokoll beskriver en datorassisterad metod för att skapa skelettbildade bilder av bröstkorgs helmounts och kvantitativt utvärderande bröstförgreningsegenskaper hos peripubertal han- och honrotter. Denna metod är relativt snabb och kräver inte användning av specialiserad mikroskopiutrustning. Utveckling och validering av denna metod beskrivs i Stanko et al. (2015) 3 . I denna rapport beskrivs också beredning av råttkörtelkirtlet hela = fästen. Liknande förfaranden för fullständig montering av bröst har beskrivits i de Assis et al. (2010) 4 och Plante et al. (2011) 5 .

Protocol

All djuranvändning och förfaranden för denna studie godkändes av NIEHS Laboratory Animal Care and Use Committee och genomfördes i en Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care-ackrediterade anläggningar. 1. Excise Mammary Glands Förmarkera alla diabilder med hjälp av en xylentäker metod (penna fungerar bäst). Täck dem med monteringslösning i slutet för att bevara etiketten. Euthanize djuret genom en godkänd metod för institution…

Representative Results

Värdena för den uppmätta slutna radien, MEA, N, k och beräknad förgreningstäthet för bröstkörteln analyserad i detta protokoll rapporteras i Tabell 1 . Sholl-analysen genererar linjära och semi-loggbilder av antalet korsningar vid varje radie ( Figur 9 ) och, om vald, en värmekarta över korsningarna ( Figur 10 ). Mindre utvecklade körtlar uppvisar färre korsningar inom samma MEA och har d?…

Discussion

Från födsel till puberteten är bröstkörtel tillväxt allometrisk. Efter puberteten utvecklas bröstkörteln genom omfattande duktalförgrening och förlängning, som fortsätter tills bröstpiteln upptar hela fettkudden. Förgreningsegenskaper är en viktig aspekt av utvecklingen av bröstkörteln, och förmågan att objektivt kvantifiera dessa egenskaper kan vara mycket användbar för att bedöma normal bröstutveckling och för att identifiera onormal utveckling efter tidiga livsutsikter för toxiska toxicanter….

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Författarna skulle vilja bekräfta Dr. Michael Easterling (Social and Scientific Systems, Inc., Durham, NC) för hans hjälp med valideringen av denna metod och Dr. Tiago Ferreira (McGill University, Montreal, Quebec, Kanada) för hans kontinuerliga Hjälp med Sholl-ansökan.

Materials

Dissecting board NA NA A piece of styrofoam roughly 10"x12" is suitable.
Dissecting T-Pins Daigger EF7419A
Spray bottle with ethanol NA NA 70% ethanol is suitable.
Curved dissecting scissors Fine Science Tools 14569-09
Straight dissecing scissors Fine Science Tools 14568-09
Curved forceps Fine Science Tools 11003-12
Superfrost Plus 24x75x1 mm microscope slides ThermoFisher Scientific 4951PLUS-001 Thermo Scientific Superfrost Plus & Colorfrost Plus slides hold tissue sections on permanently without the need for expensive coatings in IHC and Anatomical Pathology applications. This treatment reduces tissue loss during staining as well as hours of slide preparation. Slides electro-statically attract frozen tissue sections and cytology preparations and feature a chemistry similar to silane, although optimized to improve application performance.
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4951PLUS4. 
Fisherfinest Premium Cover Glass 24x60x1 mm Fisher scientific 12-548-5P
Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film Fisher scientific 13-374-12
Chloroform Sigma-Aldrich C2432
Glacial acetic acid Sigma-Aldrich A9967
Ethanol absolute, ≥99.8% (GC)  Sigma-Aldrich 24102
Xylene Sigma-Aldrich 214736
Carmine alum  Sigma-Aldrich C1022
Aluminum potassium sulfate  Sigma-Aldrich A6435
Permount mounting media Fisher Scientific SP15
Macroscope Leica Z16 APO  This is the image capturing hardware and software used in this laboratory.  As there are many different options, the methods and applications may vary between laboratories.
Digital camera Leica DFC295
Camera software Leica Leica Application Suite v3.1 
ImageJ software Open source http://imagej.net/Welcome
Sholl analysis  Open source http://imagej.net/Sholl_Analysis

References

  1. Sholl, D. A. Dendritic organization of the neurons in the visual and motor cortices of the cat. J Anat. 87 (4), 387-406 (1953).
  2. Ferreira, T. A., Iacono, L. L., Gross, C. T. Serotonin receptor 1A modulates actin dynamics and restricts dendritic growth in hippocampal neurons. Eur J Neurosci. 32 (1), 18-26 (2010).
  3. Stanko, J. P., Easterling, M. R., Fenton, S. E. Application of Sholl analysis to quantify changes in growth and development in rat mammary gland whole mounts. Reprod Toxicol. 54, 129-135 (2015).
  4. Assis, S., Warri, A., Cruz, M. I., Hilakivi-Clarke, L. Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats. J. Vis. Exp. (44), e2260 (2010).
  5. Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models. J. Vis. Exp. (53), e2828 (2011).
  6. ImageJ User Guide. IJ 1.46r. ImageJ Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html (2012)
  7. Tucker, D. K., Foley, J. F., Hayes-Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Preparation of High-quality Hematoxylin and Eosin-stained Sections from Rodent Mammary Gland Whole Mounts for Histopathologic Review. Toxicol Pathol. 44 (7), 1059-1064 (2016).
  8. Fenton, S. E., Hamm, J. T., Birnbaum, L. S., Youngblood, G. L. Persistent abnormalities in the rat mammary gland following gestational and lactational exposure to 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD). Toxicol Sci. 67 (1), 63-74 (2002).
  9. Murray, T. J., Maffini, M. V., Ucci, A. A., Sonnenschein, C., Soto, A. M. Induction of mammary gland ductal hyperplasias and carcinoma in situ following fetal bisphenol A exposure. Reprod Toxicol. 23 (3), 383-390 (2007).
  10. Moral, R., Santucci-Pereira, J., Wang, R., Russo, I. H., Lamartiniere, C. A., Russo, J. In utero exposure to butyl benzyl phthalate induces modifications in the morphology and the gene expression profile of the mammary gland: an experimental study in rats. Environ Health. 10 (1), 5 (2011).
  11. Johnson, M. D., Mueller, S. C. Three dimensional multiphoton imaging of fresh and whole mount developing mouse mammary glands. BMC Cancer. 13, 373 (2013).
  12. Enoch, R. R., Stanko, J. P., Greiner, S. N., Youngblood, G. L., Rayner, J. L., Fenton, S. E. Mammary gland development as a sensitive end point after acute prenatal exposure to an atrazine metabolite mixture in female Long-Evans rats. Environ Health Persp. 115 (4), 541-547 (2007).
  13. Hovey, R. C., Coder, P. S., Wolf, J. C., Sielken, R. L., Tisdel, M. O., Breckenridge, C. B. Quantitative assessment of mammary gland development in female Long Evans rats following in utero exposure to atrazine. Toxicol Sci. 119 (2), 380-390 (2011).
  14. Mandrup, K. R., Hass, U., Christiansen, S., Boberg, J. Perinatal ethinyl oestradiol alters mammary gland development in male and female Wistar rats. Inter J of Androl. 35 (3), 385-396 (2012).

Play Video

Cite This Article
Stanko, J. P., Fenton, S. E. Quantifying Branching Density in Rat Mammary Gland Whole-mounts Using the Sholl Analysis Method. J. Vis. Exp. (125), e55789, doi:10.3791/55789 (2017).

View Video