Utveckling av mamma-körteln i gnagaren har typiskt utvärderats med hjälp av beskrivande bedömningar eller genom mätning av grundläggande fysiska egenskaper. Förgreningstäthet är en indikator på bröstutveckling som är svår att kvantifiera objektivt. Detta protokoll beskriver en tillförlitlig metod för kvantitativ bedömning av förgreningsegenskaper hos bröstkörteln.
Ett ökande antal studier använder sig av gnagarkörteln som en slutpunkt för att bedöma utvecklingstoxiciteten hos en kemisk exponering. Effekterna av dessa exponeringar har på utvecklingen av bröstkörteln utvärderas typiskt med antingen grundläggande dimensionella mätningar eller genom att poängtera morfologiska egenskaper. Det breda utbudet av metoder för tolkning av utvecklingsförändringar kan emellertid leda till inkonsekventa översättningar över laboratorier. En gemensam bedömningsmetod är nödvändig så att rätt tolkningar kan bildas av data som jämförs mellan studier. Den föreliggande studien beskriver tillämpningen av Sholl analysmetoden för att kvantifiera bröstkörtelförgreningsegenskaper. Sholl-metoden var ursprungligen utvecklad för användning vid kvantifiering av neuronala dendritiska mönster. Genom att använda ImageJ, ett mjukvarupaket med öppen källkodsanalys och ett plugin utvecklat för denna analys, bröstkörtelns förgreningstäthet och komplexiteten hosAmmary körtel från en peripubertal kvinnlig råtta bestämdes. Metoderna som beskrivs här gör det möjligt att använda Sholl-analysen som ett effektivt verktyg för att kvantifiera en viktig egenskap hos utvecklingen av bröstkörteln.
Mammarförgrening är en egenskap som vanligtvis bedöms som en indikator på körtelutveckling, men det är svårt att objektivt kvantifiera. 1953 beskrev Sholl 1 en metod för att mäta neuronal dendritisk arborisering i kattens visuella och motoriska cortices och en plugin för denna teknik utvecklades av Ferriera et al. 2 . Eftersom båda neuronerna och bröstkörtlarna uppvisar en liknande trädliknande struktur användes plugin för att kvantifiera bröst-epithelialförgreningsdensiteter i 2D-bilder av peripubertal-råtta-bröstkörteln. Peripubertalstadiet valdes för analys, eftersom avvänjning är ett livsstadium som ofta utvärderas i akademiska laboratorier och provrincipstudier. Sholl-analysen är ett plugin som distribueras med FIJI, vilket är bildkällan ImageJ med öppen källkod, med ytterligare plugins inkluderade. Pluggen skapar en serie koncentriska ringar som omger en predefInent-centret (typiskt soma av en neuron eller ursprunget till den primära kanalen hos en muggkörtel) och sträcker sig ut till den distala delen av föremålet (den inneslutande radien). Det räknar sedan antalet korsningar (N) som uppstår på var och en av ringarna. Pluggen returnerar också en Sholl-regressionskoefficient ( k ), som är en mätning av graden av förfall av epithelialförgrening.
Med hjälp av ImageJ skapas en skelettiserad bild av ett bröstkörtel helmonterat och mageepitelområdet (MEA) mäts. Bilden analyseras med hjälp av Sholl analys plugin, och värden för N och k , bland andra värden som inte används här, returneras. Mammary epithelial branching density bestäms genom att beräkna N / MEA. I vilken utsträckning förgrening fortsätter i de yttre områdena av klyftepitelet är förgreningskomplexiteten och är en indikator på enhetlig distal epithelialväxt. Eftersom k är ett mått på den distala minskningen i epitElial branching, det är ett effektivt mått på förgreningskomplexiteten och en pålitlig indikator på bröstutveckling.
Detta protokoll beskriver en datorassisterad metod för att skapa skelettbildade bilder av bröstkorgs helmounts och kvantitativt utvärderande bröstförgreningsegenskaper hos peripubertal han- och honrotter. Denna metod är relativt snabb och kräver inte användning av specialiserad mikroskopiutrustning. Utveckling och validering av denna metod beskrivs i Stanko et al. (2015) 3 . I denna rapport beskrivs också beredning av råttkörtelkirtlet hela = fästen. Liknande förfaranden för fullständig montering av bröst har beskrivits i de Assis et al. (2010) 4 och Plante et al. (2011) 5 .
Från födsel till puberteten är bröstkörtel tillväxt allometrisk. Efter puberteten utvecklas bröstkörteln genom omfattande duktalförgrening och förlängning, som fortsätter tills bröstpiteln upptar hela fettkudden. Förgreningsegenskaper är en viktig aspekt av utvecklingen av bröstkörteln, och förmågan att objektivt kvantifiera dessa egenskaper kan vara mycket användbar för att bedöma normal bröstutveckling och för att identifiera onormal utveckling efter tidiga livsutsikter för toxiska toxicanter….
The authors have nothing to disclose.
Författarna skulle vilja bekräfta Dr. Michael Easterling (Social and Scientific Systems, Inc., Durham, NC) för hans hjälp med valideringen av denna metod och Dr. Tiago Ferreira (McGill University, Montreal, Quebec, Kanada) för hans kontinuerliga Hjälp med Sholl-ansökan.
Dissecting board | NA | NA | A piece of styrofoam roughly 10"x12" is suitable. |
Dissecting T-Pins | Daigger | EF7419A | |
Spray bottle with ethanol | NA | NA | 70% ethanol is suitable. |
Curved dissecting scissors | Fine Science Tools | 14569-09 | |
Straight dissecing scissors | Fine Science Tools | 14568-09 | |
Curved forceps | Fine Science Tools | 11003-12 | |
Superfrost Plus 24x75x1 mm microscope slides | ThermoFisher Scientific | 4951PLUS-001 | Thermo Scientific Superfrost Plus & Colorfrost Plus slides hold tissue sections on permanently without the need for expensive coatings in IHC and Anatomical Pathology applications. This treatment reduces tissue loss during staining as well as hours of slide preparation. Slides electro-statically attract frozen tissue sections and cytology preparations and feature a chemistry similar to silane, although optimized to improve application performance. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4951PLUS4. |
Fisherfinest Premium Cover Glass 24x60x1 mm | Fisher scientific | 12-548-5P | |
Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film | Fisher scientific | 13-374-12 | |
Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | A9967 | |
Ethanol absolute, ≥99.8% (GC) | Sigma-Aldrich | 24102 | |
Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
Carmine alum | Sigma-Aldrich | C1022 | |
Aluminum potassium sulfate | Sigma-Aldrich | A6435 | |
Permount mounting media | Fisher Scientific | SP15 | |
Macroscope | Leica | Z16 APO | This is the image capturing hardware and software used in this laboratory. As there are many different options, the methods and applications may vary between laboratories. |
Digital camera | Leica | DFC295 | |
Camera software | Leica | Leica Application Suite v3.1 | |
ImageJ software | Open source | http://imagej.net/Welcome | |
Sholl analysis | Open source | http://imagej.net/Sholl_Analysis |