Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Kwantificerende vertakkingsdichtheid in Rat Mammary Gland Whole-mounts Met behulp van de Sholl Analyse Methode

doi: 10.3791/55789 Published: July 12, 2017

Summary

Ontwikkeling van de mammageklier in het knaagdier is typisch geëvalueerd met behulp van beschrijvende beoordelingen of door het meten van basis fysieke attributen. Vertakingsdichtheid is een indicator van de ontwikkeling van de moeders die moeilijk is om objectief te kwantificeren. Dit protocol beschrijft een betrouwbare methode voor de kwantitatieve beoordeling van de vertakkingseigenschappen van de borstklier.

Abstract

Een toenemend aantal studies maakt gebruik van de knaagdier-klier als een eindpunt voor de beoordeling van de ontwikkelingstoxiciteit van een chemische blootstelling. De effecten die deze blootstellingen hebben op de ontwikkeling van de borstklier worden typisch geëvalueerd met behulp van basisdimensionale metingen of door morfologische kenmerken te scoren. Het brede scala van methoden voor het interpreteren van ontwikkelingsveranderingen kan echter leiden tot inconsistente vertalingen in laboratoria. Een gemeenschappelijke beoordelingsmethode is nodig, zodat er goede interpretaties kunnen worden gevormd uit gegevens die in vergelijking met studies worden vergeleken. De onderhavige studie beschrijft de toepassing van de Sholl analysemethode om de vertakkingseigenschappen van de borstklier te kwantificeren. De Sholl-methode werd oorspronkelijk ontwikkeld voor gebruik bij het kwantificeren van neuronale dendritische patronen. Door gebruik te maken van ImageJ, is een softwarepakket voor open-source beeldanalyse en een plugin ontwikkeld voor deze analyse, de vertakkingsdichtheid van de borstkanker en de complexiteit van amAmmerklier van een peripubertal vrouwelijke rat werden bepaald. De hier beschreven methoden maken het gebruik van de Sholl-analyse mogelijk als een effectief hulpmiddel om een ​​belangrijk kenmerk van de ontwikkeling van de borstklier te kwantificeren.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mammary gland branching is een kenmerk dat algemeen wordt beschouwd als een indicator van de ontwikkeling van de klier, maar het is moeilijk om objectief te kwantificeren. In 1953 beschreef Sholl 1 een methode voor het meten van neuronale dendritische arborisatie in de visuele en motorische cortices van de kat en een plugin voor deze techniek werd ontwikkeld door Ferriera et al. 2 . Omdat beide neuronen en mammeklieren een soortgelijke boomachtige structuur vertonen, werd de plugin gebruikt om de epitheliale vertakkingsdichtheden van de mammografische epitheel te kwantificeren in 2D beelden van de peripubertal-ratmembraan. De peripubertalfase werd gekozen voor analyse omdat het spenen is een levensfase die vaak wordt beoordeeld in academische laboratoria en testrichtlijnen. De Sholl analyse is een plugin verdeeld met FIJI, dat is het open source image processing pakket ImageJ, met extra plugins opgenomen. De plugin creëert een reeks concentrische ringen die een predef omringenIn het centrum (typisch de soma van een neuron of de oorsprong van het primaire kanaal van een borstkanker) en strekt zich uit naar het meest distale deel van het voorwerp (de omhullende radius). Het telt dan het aantal kruispunten (N) dat op elk van de ringen voorkomt. De plugin geeft ook een Sholl regressiecoëfficiënt ( k ), die een afmeting van de verval van epitheliale vertakkingen is.

Met behulp van ImageJ wordt een geraamd beeld van een volledige membraan gecreëerd en wordt het mammale epitheliale gebied (MEA) gemeten. De afbeelding wordt geanalyseerd met behulp van de Sholl analyse plugin, en de waarden voor N en k , onder andere waarden die hier niet worden gebruikt, worden teruggestuurd. Mammary epithelial branching density wordt bepaald door N / MEA te berekenen. De mate waarin vertakking in de buitenste gebieden van het klierpithelium doorloopt, is de vertakkingscomplexiteit en is een indicator voor uniforme distale epitheliale groei. Omdat k een maat is van de distale afname in epithElial branching, het is een effectieve maatstaf voor de vertakkingscomplexiteit en een betrouwbare indicator voor de ontwikkeling van de borst.

Dit protocol beschrijft een computer-geassisteerde methode voor het creëren van geraamiseerde beelden van volledige muizen van de membraan en kwantitatieve evaluatie van de vertakkingseigenschappen van de mammier in peripubertal mannelijke en vrouwelijke ratten. Deze methode is relatief snel en vereist geen gebruik van gespecialiseerde microscopie-apparatuur. Ontwikkeling en validatie van deze werkwijze zijn beschreven in Stanko et al. (2015) 3 . Dit rapport beschrijft ook de bereiding van ratmurgheelkunde hele = mounts. Soortgelijke procedures voor volledige monstering van de mammografie zijn beschreven in de Assis et al. (2010) 4 en Plante et al. (2011) 5 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle dierengebruik en procedures voor deze studie werden goedgekeurd door het NIEHS Laboratory Animal Care and Use Committee en uitgevoerd in een Vereniging voor beoordeling en accreditatie van laboratorium dierenwelzijn geaccrediteerde faciliteit.

1. Accijnzen Mammary Glands

  1. Zet alle glijbanen op met een xyleenvrije methode (het potlood werkt het beste). Bedek ze met een montageoplossing aan het einde om het etiket te bewaren.
  2. Euthanize het dier door een goedgekeurde methode van de Institusionele Dierverzorging en -gebruik.
  3. Na euthanasie, plaats het dier op zijn rug op een dissectatieplank ( Figuur 1 ). Strek en pin al vier de ledematen vast, waarbij de achterste ledematen een omgekeerde V vormen (vastpennen of kleine gaugenaalden werken goed).
  4. Spuit de buik liberaal met 70% ethanol om haar uit het mammariummonster te houden.
  5. Trek de buikhuid op de middellijn met een pincet en maak een kleine snedeSchaar dissecteren, wees voorzichtig om het peritoneum niet te punkteren.
    1. Begin bij de incisie, snijd de huid tot aan de nek en dan distaal aan de voorste ledemaat. Knip naar het inguinale gebied en dan distaal naar de eerste gewricht van de achterste ledematen aan dezelfde kant; Deze incisie scheidt meestal de dikke klieren 5 en 6. Vermijd het peritoneum snijden.
    2. Trek de huid terug met het bijgevoegde vetpasta met behulp van pincet, voorzichtig scheiden van het peritoneum met behulp van het stompe uiteinde van het dissecteren van een schaar. Onafhankelijke dorsaal zoveel mogelijk de 4de en 5de inguinale melkklieren volledig bloot aan de onderkant van de huid; Knijp de huid aan op het dissectorbord ( figuur 2 ).
    3. Pak voorzichtig het borstweefsel van het 5e klier met de bolle kant van gebogen pincet en trimmen langzaam de klier van de huid, dat evenwel niet tot nick de klier of de huid.
    4. Ga verder met trimmen,bewegende dorsaal tot de 4 e en 5 e klieren zijn volledig uit de huid opgeheven. Zorg ervoor dat het tepelgebied met de rest van de klier verwijderd wordt, aangezien dit dient als uitgangspunt voor de Sholl-analyse. Knip het mammary tissue weg van het lichaam waar het bij de klier is vastgemaakt 4.
  6. Zodra de klier uit het dier is verwijderd, verspreid het gelijkmatig op een elektrostatisch geladen, 25 mm x 75 mm x 1 mm microscopie glijbaan, met de kant die naast de huid naar beneden gericht was.
    OPMERKING: Voor kieren van oudere of lakterende dieren kan een 51 x 75 x 1 mm glijbaan nodig zijn.
  7. Terwijl u handschoenen draagt, duw er voorzichtig luchtbellen uit. Bedek de klier met een plastic paraffine film en een andere microscoopglijbaan en druk de klier om het vast te houden aan de glijbaan.
    OPMERKING: een 50 ml conische buis gevuld met water dient als een geschikt gewicht. De hoeveelheid tijd die nodig is om aan de dia te houden, hangt af van de dikte van de klier. Dun, postnaTal dag (PND) 4 klieren moeten gedurende minimaal 30 minuten gecomprimeerd worden, terwijl dikker, volwassen klieren mogelijk zo veel als 2-5 uur nodig hebben.

2. Bereid Mammary Whole-Mounts

  1. Bereid de carmine aluin oplossing minstens 24 uur van tevoren, omdat het kookt en koelt.
    1. Los 1 g carminealuminium op en 2,5 g aluminiumkaliumsulfaat (AlK (SO 4 ) 2 · 12H 2 O) in 500 ml gedestilleerd water en kook 20 minuten in een 1-liter fles. Breng het uiteindelijke volume tot 500 ml met gedestilleerd water.
    2. Filter de oplossing door middel van filterpapier onder een vacuüm en koel voor opslag.
      OPMERKING: Carmine alum oplossing kan hergebruikt worden maar moet weggegooid worden als de kleur begint te vervagen.
  2. Vóór de fixatie, schil de paraffinefilm van de klier af, wees voorzichtig om de klier niet uit de glijbaan te trekken. Plaats de glijbaan (s) in een glazen glijmiddel en dompel in fixatief (100% ethaanOl, chloroform en ijsazijn in een verhouding van 6: 3: 1) gedurende 12-48 uur, afhankelijk van de dikte van de klieren.
  3. Giet de fixatie af en laat de klieren in 70% ethanol gedurende 15 minuten zacht worden. Rehydrate de klieren geleidelijk door 1/3 van de ethanoloplossing uit te gieten en met gedestilleerd water te vervangen. Week voor 5 minuten. Herhaal dit proces drie keer.
  4. Na de laatste spoeling giet dan alle ethanol / wateroplossing af en vervang deze met 100% gedestilleerd water. Week de klieren gedurende 5 minuten.
  5. Giet het gedistilleerde water af en doei de klieren in de carmine-aluinoplossing. Vlek de klieren gedurende 12-24 uur, afhankelijk van de dikte.
    OPMERKING: De klieren kunnen niet oververfd worden, maar de kleurtijd voor meerdere batches moet hetzelfde zijn, zodat de kleurintensiteit hetzelfde is.
  6. Giet de carminealuminiumoplossing af en spoel de klieren in 100% gedestilleerd water gedurende 30 s. Geleidelijk dehydraten uitdrogen door ze gedurende 15 minuten, 70% ethanol gedurende 15 minuten, 95% ethanol gedurende 15 minuten te laten doven, a100% ethanol gedurende 20 minuten.
  7. Verwijder de klieren van vet door ze gedurende 12-72 uur in xyleen te slikken, afhankelijk van de dikte.
    OPMERKING: De klieren moeten doorschijnend zijn (duidelijk). Als er ondoorzichtige (whitish) gebieden blijven, blijf doordrenken in xyleen tot doorschijnend. Als lachende of anderszins dikke klieren worden gekleurd en verwijderd, moet het xyleen eens vervangen worden om de klieren volledig te verwijderen.
  8. Monteer de dia's met een xyleen-opbouwmedium door voldoende medium te pipetteren om de klier enkel te bedekken. Voeg een deklip toe, zodat er geen luchtbellen ontstaan.
  9. Laat de dia's drogen. Naarmate het montagemedium droogt, komt het onder de deklap aan, en het kan nodig zijn om extra montagemedium toe te voegen. Zodra er geen extra medium nodig is, laat de dia's volledig drogen; Dit kan 2-3 weken duren.
  10. Zodra de glijbanen helemaal droog zijn, kan elk restmonteringsmiddel verwijderd worden met een katoenen pootje en een kleine hoeveelheid xyleen. Wees voorzichtig om niet te gebruikenTe veel xyleen, omdat dit het montagemedium kan oplossen en de deksel losmaken. Als dit gebeurt en luchtbellen verzamelen onder de deklaag, moet de deklaag in xyleen worden verwijderd en moet het montageproces worden herhaald.

3. Bereid volledige foto's voor analyse

  1. Vang afbeeldingen van full-mounts ( afbeelding 3 ) met behulp van een macroscope of dissecteer microscoop en een digitale camera met de juiste software.
    OPMERKING: Terwijl een vergroting die het hele glandulaire epithel vastlegt, kan worden geselecteerd, is het absoluut noodzakelijk om alle full-mount afbeeldingen vast te leggen die met dezelfde vergroting met elkaar worden vergeleken.
  2. Download ImageJ software (of FIJI software) 6 .
  3. Open de volledige foto van de mammografie in ImageJ door op "Bestand" → "Openen" te klikken. Selecteer het Freehand-gereedschap en traceer rond het klierpithium. Selecteer 'Bewerken' en #8594; 'Clear Outside'.
    1. Verwijder de lymfeklieren door het knooppunt te traceren en gebruikmaken van het Freehand-gereedschap en "Bewerken" → "Snijden".
  4. Scheid de kleurkanalen door "Beeld" → "Kleur" → "Split-kanalen te selecteren." Selecteer het kanaal met het beste contrast, meestal het blauwe kanaal.
    OPMERKING: een RGB-afbeelding bestaat uit een stapel van de rode, groene en blauwe componenten van die afbeelding. Deze actie scheidt deze componenten in drie 8-bits grijstinten afbeeldingen.
  5. Trek de achtergrond af door "Proces" → "Achtergrond trekken" te selecteren. Kies de gewenste parameters en klik vervolgens op 'Voorbeeld' om de wijzigingen te bekijken.
    OPMERKING: "Subtract Background" verwijdert gladde, continue achtergronden. Bovendien kan "Process" → "Filters" → "Unsharp Mask" worden gebruikt om contrast te maken.
  6. Kies een van de th E volgende methoden voor het automatisch verwijderen van geluid: despeckle of remove outliers.
    OPMERKING: ImageJ biedt een derde methode voor automatische geluidsverwijdering: verwijder NaNs. Het verwijderde NaNs commando is echter niet van toepassing, aangezien het 32-bits beelden gebruikt, en de huidige methode maakt gebruik van 8-bits beelden.
    1. Verwijder geluid met behulp van het despeckle commando door "Process" → "Noise" → "Despeckle" te selecteren.
      OPMERKING: Dit komt overeen met het toevoegen van een median filter, dat elke pixel vervangt met de gemiddelde waarde in de 3 × 3 buurt.
    2. Verwijder geluid met behulp van het commando Remove Outliers door "Process" → "Noise" → "Remove Outliers" te selecteren.
      OPMERKING: dit proces vervangt een pixel met de mediaan van de pixels in de directe omgeving als het afwijkt van de mediaan met meer dan een bepaalde waarde (de drempelwaarde).
  7. Verwijder eventueel nog resterende geluiden (Lass = "xfig"> Afbeelding 4).
    1. Open een kopie van het originele beeld en gebruik dit als een gids voor wat is en wat is geen geluid. Klik op de dubbele rode pijlknop rechts van de werkbalk. Selecteer de tekeninstrumenten; De tekenbewerkingsknoppen worden nu in de werkbalk weergegeven.
    2. Klik op het gereedschap Eraser. Stel de diameter van de gumdier in met de rechtermuisknop op de knop Eraser. Houd de linkermuisknop ingedrukt om geluid te wissen.
      OPMERKING: slechts één sessie van wissen kan ongedaan gemaakt worden. Zodra de linker muisknop is vrijgegeven en opnieuw geklikt, kan de vorige verwijdering niet ongedaan gemaakt worden.
  8. Stel de drempel aan door "Beeld" → "Aanpassen" → "Drempel" te selecteren. Verplaats de schuifregelaars om de minimale (bovenste schuifregelaar) en de maximale (onderste schuifregelaar) drempelwaarden aan te passen tot een adequate afbeelding van de klier is bereikt.
    OPMERKING: Stel de drempelwaarde-segmenten in grijstinten in eigenschappen van belang en achtergrond.
    1. Klik op Toepassen. Verwijder eventueel extra geluid op dit punt door de stappen 3.6.1 en 3.6.2 te volgen.
  9. Reconstructeer de delen van het klierpitheel dat verwijderd werden door drempel en geluidsverwijdering ( Figuur 5 ).
    1. Doe de beeldherstructurering zorgvuldig en minimaal om de integriteit van het originele beeld te behouden. Raadpleeg de originele afbeelding voor een verwijzing naar wat is en wat is geen epithelium.
    2. Klik op het gereedschap Spray Can (op de werkbalk met de tekeninstrumenten). Stel de spuitdiameter en de snelheid aan door met de rechtermuisknop op de knop Spray Can te drukken. Vul de ontbrekende delen van de klier voorzichtig in door op de linkermuisknop te klikken of te houden.
  10. Maak een geraamd beeld van de klier voor het uitvoeren van de Sholl Analyse. Zorg ervoor dat het gedeprimeerde beeld binair is door "Proces" → "Binair" → "B te selecteren inary."
    1. Als de afbeelding op een zwarte achtergrond wit is, selecteer u 'Process' → 'Binair' → 'Opties' en verwijder de optie 'Zwarte achtergrond'. Skeletoniseer het beeld door "Process" → "Binary" → "Skeletonize" te selecteren.
      OPMERKING: dit herhaaldelijk verwijdert pixels van de randen van het binaire beeld totdat deze wordt verlaagd tot een enkele pixel-brede vorm.
    2. Verf één keer de afbeelding door "Process" → "Binary" → "Dilate" te selecteren.
      OPMERKING: dit vult de leemten op die door de drempel en het skelet worden gemaakt door pixels aan de randen van het binaire beeld toe te voegen.
  11. Sla de afbeelding op door "File" → "Save As" te selecteren. Selecteer een afbeeldingstype (typisch jpeg), voer de bestandsnaam in en klik op 'OK'.
  12. Controleer de nauwkeurigheid van het skeletvormige beeld door het skeletonformeerde beeld over te leggen op het originele beeld (Ass = "xfig"> afbeelding 6).
    1. Maak een overlay aan door zowel de originele afbeelding als de geraamde afbeelding te openen. Selecteer "Afbeelding" → "Overlay" → "Afbeelding toevoegen". Selecteer in het dialoogvenster Afbeelding toevoegen de afbeeldingen van het skelet in het vervolgkeuzemenu 'Afbeelding aan toevoegen' en stel de opaciteit op 30%.
    2. Bewaar de afbeelding van het skeletbeeld dat op het origineel is overgelegd door "File" → "Save As" te selecteren. Selecteer een afbeeldingstype, voer de bestandsnaam in en klik op 'OK'.

4. Voer de Sholl Analyse uit

  1. Open een skeletbeeld en maak de afbeelding binair door "Proces" → "Binair" → "Binair maken" te selecteren.
    1. Voordat u de vergrotingsschaal instelt, meet u het aantal pixels / mm met behulp van een micrometer voor de vergroting waarbij de beelden werden vastgelegd.
    2. Stel de gemeten vergroting s inCale door "Analyse" → "Scale instellen" te selecteren. Voer het aantal pixels / mm in. Stel de 'Bekende afstand' en de 'Pixel Aspect Ratio' in. Ga als volgt te werk: 1. Typ "mm" voor de "Lengte eenheid" en controleer "Global" (behoud dezelfde schaal voor elke afbeelding).
  2. Bepaal de eindradius (omhulling van de straal) voor de Sholl-analyse door een lijn te tekenen vanaf het begin van het primaire kanaal (centrum van de analyse) naar het meest distale punt van het klierpitheel ( Figuur 7 ).
    1. Gebruik het lijntekeningsgereedschap in de werkbalk om een ​​lijn tussen de bezienswaardigheden te trekken. Druk op de "M" toets om een ​​meting te maken en let op dat een resultaatvenster wordt geopend.
      OPMERKING: De waarde in de kolom "Lengte" is de lengte van de regel in mm. Deze waarde wordt automatisch ingevoerd als het eindradius bij het instellen van de Sholl-parameters. De Sholl plugin zal het startpunt gebruikenVan de lijn als het midden van de centrische ringen.
  3. De Sholl Analyse uitvoeren.
    1. Doe de analyse door "Plugins" te selecteren "Advanced Sholl Analysis;" Er verschijnt een parametervenster.
    2. Stel de startradius in "I. Definitie van schelpen" in op 0,00 mm; De lengte van de lijn gemeten in stap 4.2 wordt automatisch ingevoerd als de "eindradius".
    3. Stel de "Radius Step Size" in op 0,1 mm.
      OPMERKING: De straalstrookgrootte bepaalt het aantal ringen (effectief het aantal iteraties); Een kleinere stapgrootte verhoogt het aantal ringen, terwijl een grotere stapgrootte het aantal ringen zal verlagen. De straal kan niet te klein worden ingesteld, hoewel een te kleine radius tot een onnodig groot aantal ringen zal leiden. Het kan echter te groot worden ingesteld, wat minder ringen zal veroorzaken en vervolgens het echte aantal kruispunten onderschatten. Zie Stanko et al.(2015) voor meer informatie over het bepalen van de stapgrootte.
    4. Stel de "# Monsters" op 1 en de "Integratie" in "Mean" in "II. Meerdere monsters per straal."
    5. Stel de "Afsluiting van de afsluiter" in op 1 en controleer "Afleiden van de startradius" voor de "# Primaire takken" in "III. Descriptors and Curve Fitting."
      OPMERKING: "Fit profiel en bereken descriptors" en "Show fit details" kunnen worden gecontroleerd naar wens.
    6. Controleer "Lineair" en selecteer "Best passende graad" in "Profielen zonder normalisatie;" Kijk 'meest informatief'. Selecteer 'Gebied voor genormaliseerde profielen' in 'IV. Sholl-methoden'.
    7. Controleer "Maskers maken in" in "V. Output-opties" om een ​​hittekaart van de kruispunten te maken (optioneel).
    8. Klik op "Zie segmentatie" om een ​​voorbeeldvenster van de afbeelding te genereren met ringen om het gebied te bevestigenVan analyse.
  4. Klik op "OK" om de analyse uit te voeren.

5. Meten van het MEA

  1. Meet het MEA door de kortste afstand rond de epitheliale boom te vinden ( Figuur 8 ).
    1. In ImageJ met het skeletbeeld van de klier open, klik op het Polygon tool. Klik op een punt op de omtrek van de epitheliale boom om de veelhoek te beginnen, rond de omtrek van de klier te bewegen en klik om een ​​lijnsegment toe te voegen.
    2. Wanneer het gehele epitheliale gebied is omzeild, dubbelklik om de polygoon te sluiten. Druk op de "M" toets om een ​​resultatenvenster te openen; De waarde in de kolom "Gebied" is de MEA.
  2. In gevallen waarin het klierpitel zich buiten het lymfeknoop heeft verlengd, trekt u het lymfekliergebied (LNA) van het MEA af bij het berekenen van de vertakkingsdichtheid.
    1. Meet de LNA door het lymfeknoop in dezelfde man op te sporenEr als de epitheliale boom en druk op "M."
      OPMERKING: De LNA moet in deze gevallen van de MEA worden afgetrokken omdat het lymfeknoop de analyse voorkomt door kruisingen in het LNA te tellen. Wanneer het epitheel niet het lymfeknoop heeft bereikt, is het LNA nul.

6. Rapportering van gegevens

  1. Meld waarden voor de omsloten radius, MEA, N, k en vertakkingsdichtheid.
    OPMERKING: De omgevingsstraal wordt bepaald in stap 4.2 en het MEA wordt bepaald in stap 5.1.
    1. Voer de analyse uit om een ​​Sholl-resultatenvenster te genereren.
      OPMERKING: De gerapporteerde N is de waarde voor de som inters. De gerapporteerde k is de waarde voor de Sholl regressiecoëfficiënt (semi-log). De Sholl analyse zal een waarde voor k over elk gemeten gebied van het klierpitium terugkeren. Om een ​​nauwkeurige waarde voor k over het volledige epithel te verkrijgen, moeten de ductale uiteinden aanwezig zijn.
    2. Wijzigen thE Sholl analyse voor de borstkanker door gebruik te maken van de output waarde voor N om de vertakkingsdichtheid te berekenen (het fundamentele eindpunt van deze methode). Bereken de vertakkingsdichtheid met de formule N / (MEA-LNA) en meld de waarde als N / mm 2 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De waarden voor de gemeten afgesloten straal, MEA, N, k , en berekende vertakkingsdichtheid voor de borstkanker die in dit protocol worden geanalyseerd, worden vermeld in tabel 1 . De Sholl analyse genereert lineaire en semi-log plots van het aantal kruispunten bij elke straal ( Figuur 9 ) en, indien geselecteerd, een warmtekaart van de kruispunten ( Figuur 10 ). Minder ontwikkelde klieren vertoont minder kruispunten binnen hetzelfde MEA en hebben daarom een ​​lagere vertakkingsdichtheid. Een goed ontwikkelde klier blijft uniform door het gehele klierpitheel, vooral in de distale gebieden. De mate waarin vertakking in deze regio's doorgaat, kan worden beschouwd als vertakkingskomplexiteit en afnemingen in complexiteit worden overgedragen als vervalsnelheid (of Sholl regressiecoëfficiënt, k ). De vervalsnelheid weerspiegelt de verandering in distale epitheliale behaNach en wordt gemeten als de helling van de lijn van het aantal kruispunten die tegen de omhullende radius zijn getekend ( dwz de longitudinale groei van het epithelium). Zo wordt de Sholl regressiecoëfficiënt berekend door de helling van de lijn van de plot van log (N / S) tegen de radiale afstand (r) te nemen, waarbij log (N / S) = - k r + m, waarbij N is Het aantal kruisingen voor elke ring van straal r en gebied S (πr 2 ) en m de onderschepping zijn. Omdat de helling - k beschrijft het verval van de snijpunten, de waarde - zou k = 0 nul verval en gelijkmatige vertakking van het centrum van de analyse naar de rand van het epitheel te geven. In dun ontwikkelde klieren is het verankeren van vertakking toegenomen; Er zijn minder kruispunten in het distale gebied van de epitheliale boom; En de helling, k , wordt verhoogd. Daarom zijn de waarden van k naderend 0 indicatief voor grotere distale vertakkingen ( dwz vertakkingscomplexiteit) en een put-ontwikkelde borstklier.

Figuur 1
Figuur 1: Ventrale weergave. Afbeelding van het ventrale gedeelte van een volwassen vrouwelijke Sprague Dawley rat, die illustreert hoe de rat op het dissecterende oppervlak en de plaats van de 12 borstklippen vastzitten, met de tepels omcirkeld. * De tepels van klieren 6 en 7 zijn niet zichtbaar. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2: Vrouwelijke Rat Mammary Gland. Illustratie van blootgestelde borstklippen 4 (MG4) en 5 (MG5), met de huid vastgelegd aan het dissecterende oppervlak boven MG4 en net onder MG5. De klieren moeten van de sk worden verwijderd In het begin met MG5 en verder en dorsaal tot MG5 en 4 volledig zijn verwijderd. De tepel ligt in het distale gebied van de klier 4, en zorg moet worden uitgeoefend om dit gebied te verzamelen. Het lymfeklieren is aangegeven als referentie. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3: Mammary Gland Whole Mount. Een heleboelbeeld van een borstklier verzameld uit een postnatale dag 25 Sprague Dawley rat. Schaalbalk = 1 mm. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

.jpg "/>
Figuur 4: Verwijdering van geluid. Het blauwe kleurkanaal van een mammary full-mount afbeelding, met de achtergrond afgetrokken. ( A ) toont voorbeelden van geluid. De pijlen wijzen op geluiden die door bloedvaten worden gecreëerd, en de zwaardere schaduwrijke omgeving rondom de ductale uiteinden is een voorbeeld van geluid dat wordt gecreëerd door de achtergrond af te trekken. ( B ) illustreert het beeld nadat het geluid is verwijderd. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5
Figuur 5: Beeldherstructurering. Reconstructie van de gesleutelde gedeelten van de gedrempelde afbeelding. ( A ) De rode pijlen geven gebieden aan waar delen van de afbeelding verloren gaan door drempels. Beeld reconstIn deze regio's moet een ruil worden uitgevoerd. ( B ) Moederbeeld na reconstructie van de verwijderde gebieden. Image reconstructie moet zorgvuldig en minimaal uitgevoerd worden om de integriteit van het originele beeld te behouden . Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 6
Figuur 6: Overlay van een Skeletonized Image. Overlay afbeelding met een geraamde afbeelding die op de originele full-mount afbeelding staat. Deze afbeelding toont aan dat de geraamte klier de vertakking van de werkelijke klier met een hoge mate van nauwkeurigheid weerspiegelt. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.


Figuur 7: Omsluiter Radius. Skeletonized afbeelding van een mammary full-mount waaruit de omhullende radius wordt gemeten (geel). De lijn moet beginnen aan de basis van de epitheliale boom (centrum van de analyse) en uitstrekken tot het meest distale punt van het epithelium. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8
Figuur 8: Mammary Epithelial Area. Skeletonized afbeelding met een polygoon die rond de epitheliale boom wordt opgespoord om het MEA te bepalen. Klik hier om een ​​grotere vertoning te bekijkenSion van deze figuur.

Figuur 9
Figuur 9: Sholl Plot Output. Sholl-uitvoer van lineaire ( A ) en semi-log ( B ) plots van het aantal kruispunten bij elke radiale increment. De rode stip in het paneel (A) is de abscisse van het centroid (geometrisch centrum). In paneel (B), de blauwe lijn is de lineaire regressie over de volledige gegevens, terwijl de rode lijn is de lineaire regressie via -90 10e percentiel. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 10
Figuur 10: Intersectiemask. Wanneer de 'Create InterSectie Masker "optie is geselecteerd (stap 4.3.7), zal de analyse een warmtekaart van het aantal kruispunten over de omhullende radius van het beeld uitvoeren. Deze warmtekaart weerspiegelt de dichtheid van vertakkingsdoorsnedes door het epithelium (rood = heet = Hoge dichtheid, blauw = koud = lage dichtheid). Het gehele epithelium zou dezelfde kleur hebben in een hittekaart van een afbeelding waar k = 0. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te zien.

</ Table>

Tabel 1: Sholl Analyse Parameters. De waarden zijn de gerapporteerde gegevens voor de Sholl analyse. De sluitingsradius (stap 4.2) en MEA (stap 5.1) zijn gemeten waarden, N en k zijn de resultaten van Sholl-analyses en worden teruggestuurd in het venster Sholl analyseresultaten (stap 6.1.) En de afgreningsdichtheid wordt berekend aan de hand van de formule N / MEA-LNA) (stap 6.1.2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Van de geboorte tot de puberteit is de groei van de borstklier allometrisch. Na de puberteit ontwikkelt de borstkanker door middel van uitgebreide ductale vertakking en verlenging, die doorgaan tot het epitheel van het mammarium de hele vetpoot opneemt. Vertakkingseigenschappen zijn een belangrijk aspect van de ontwikkeling van de borstklier, en het vermogen om deze kenmerken objectief te kwantificeren kan zeer nuttig zijn voor het beoordelen van de normale ontwikkeling van de borst en voor het identificeren van abnormale ontwikkeling na vroege levens blootstelling aan toxische toxische stoffen.

Het scoren van morfologische kenmerken, het kwantificeren van basisdimensionale metingen en het tellen van borststructuren zijn typische methoden voor het evalueren van de ontwikkeling van de borstklier. Deze methoden zijn echter niet bijzonder gevoelig vanwege de grote variatie in de grootte en vorm van knaagdierkliere en ontwikkelingsinterpretatie kan moeilijk zijn voor een onervaren beoordelaar. Bovendien, het potentieel voorVooroordeel bestaat in studies die niet goed verblind zijn. De Sholl analyse methode biedt een efficiënt protocol voor nauwkeurige kwantificering van de vertakkingsdichtheid van de epitheliale epitheel en vertakkingscomplexiteit, discrete morfologische kenmerken van de ontwikkeling van de borstklier, die gemakkelijk kan worden vergeleken in studies en laboratoria.

Er zijn kritieke stappen in meerdere secties van dit protocol. De eerste en belangrijkste heeft betrekking op de conditie van de volledige klierhaarklier. De nauwkeurigheid van deze methode berust op een borstkanker die volledig intact is, gemonteerd zonder gebreken, correct gefixeerd en gekleurd, en toont geen oxidatie van de klier of significante verkleuring van het montagemedium. Als de klier gescheurd of gevouwen is, kan een nauwkeurige afmeting van de vertakkingsdichtheid niet worden verkregen. Als de ductale uiteinden niet aanwezig zijn, zal de waarde voor k niet representatief zijn voor de hele klier. Drempelwaarde zal moeilijk zijn in de klierenDie niet volledig zijn vastgesteld door een gebrek aan vlekkencontrast in het ductale epithelium. En tenslotte, als er oxidatie of verkleuring aanwezig is, kunnen deze vlekken voorkomen dat de analyse kruispunten in het getroffen gebied meet.

Bij het voorbereiden van passende full-mounts, is de volgende kritische stap de beelden op dezelfde vergroting vastgelegd. Het is gebruikelijk om digitale beelden op de hoogste resolutie mogelijk te maken. Voor de Sholl analyse is het echter belangrijk dat alle beelden op dezelfde vergroting worden vastgelegd. Zoals beschreven in Stanko et al. (2015) 3 werd een caveat ontdekt waar beelden van kleinere klieren die bij hoge vergroting werden vastgelegd, grotere vertakkingsdichtheden vertoonden dan beelden van grotere klieren die bij een lagere vergroting werden gevangen, hoewel ze visueel minder ontwikkeld bleken te zijn. Wij veronderstelden dat de hogere vergroting resulteerde in meer detail, die overgedragen in tHij skeletteerde het beeld en resulteerde in een hogere N, die de vertakkingsdichtheid van de kleinere klieren oververtegenwoordigde. Dit probleem wordt verholpen door alle afbeeldingen op dezelfde vergroting vast te leggen.

Terwijl de basis van een nauwkeurige analyse binnen de gehele berg ligt, ligt het grootste potentieel voor door gebruikers beïnvloedde wijzigingen in kruisingsgegevens binnen de stappen voor geluidsverwijdering. Alle afbeeldingen bevatten geluid, tot op zekere hoogte, door kleurintensiteit, niet-relevante fysiologische entiteiten ( bijv. Bloedvaten) en artefacten van drempelwaarden. Elke afbeelding moet onafhankelijk worden aangepakt door variaties in de hoeveelheid geluid tussen beelden. Er moet voor worden gezorgd om te weinig of te veel geluid te verwijderen, omdat dit het snijpunt en daarmee de vertakkingsdichtheid kan scheiden. De mate waarin geluid invloed heeft op de interpretatie is echter niet onderzocht. De gebruiker moet beslissen hoe nauwgezet het is met geluidsverwijdering en moet ook oefenenTency om de integriteit van de beelden te behouden. Het wordt ten zeerste aan te bevelen dat de gebruiker verblind wordt voor behandeling bij het uitvoeren van geluidsverwijdering, omdat dit het potentieel voor vooroordeel vermindert. Ruisverwijdering is gedetailleerd beschreven in de ImageJ Gebruikershandleiding 7 . In deze procedure wordt het geluid voornamelijk verwijderd uit de achtergrondafgetrokken afbeelding. Bovendien kan het drempelproces zelf segmenten van de klier verwijderen. Gedeelten van de klier waar slechts een paar pixels verwijderd zijn, worden automatisch gereconstrueerd wanneer het geraamde beeld wordt verwijd. Uitgebreide gaten kunnen echter handmatige reconstructie vereisen. De gebruiker moet beslissen of en in hoeverre deze segmenten kunnen worden gereconstrueerd, opnieuw de integriteit van de originele beelden behouden.

Hoewel dit niet kritisch is, is het belangrijk om software-updates te handhaven, aangezien ImageJ-software vaak wordt bijgewerkt. De hier beschreven methoden zijn gebaseerd op versie 1.48v. FIJI en de Sholl aNalysis plugin worden ook regelmatig bijgewerkt, en het hier beschreven protocol is gebaseerd op v3.4.1. Wijzigingen in latere versies van zowel ImageJ als de plugin Sholl Analyse kunnen deze methoden beïnvloeden. ImageJ controleert automatisch updates, maar updates voor FIJI moeten regelmatig worden uitgevoerd, en de wijzigingen tussen de huidige versies en de hier gebruikte toepassingen moeten zo nodig worden aangepakt. Alle parameters worden gedefinieerd in de subrubrieken op de Sholl Analysis webpagina 6 . Parameterinstellingen binnen deze procedure zijn gebaseerd op beelden die zijn vastgelegd uit de volledige membraan van de borstkanker in ons laboratorium en zijn niet absoluut. De volledige voorbereiding varieert van lab naar lab, en deze parameters kunnen dienovereenkomstig worden aangepast om beelden en uitvoer te optimaliseren.

De gehele bergmembraan die in deze studie werd gebruikt, was van een vrouwelijke Sprague Dawley-rat bij PND 25, en de methode werd adequaat en zonder beperkingen toegepast. Bij ratten wordt de epitheliale dichtheid van de mammier incReageert met leeftijd tot een punt waar het verhindert dat het beeld met een hoge genoeg resolutie wordt gedrempeld om een ​​nauwkeurig geraamd beeld van de klier te genereren. Daarom adviseren wij momenteel niet deze methode te gebruiken op klieren van ratten ouder dan PND40. Hoewel hier de ratriem is aangegeven, is het irrelevant, omdat de auteurs momenteel niet op de hoogte zijn van stamspecifieke borstkenmerken die het gebruik van deze methode zouden verhinderen. Bovendien kan, terwijl de in het beschreven voorbeeld beschreven werkwijze werd uitgevoerd met behulp van een vrouwelijke rat, ook op de borstklieren van mannelijke ratten worden toegepast. Deze applicatie is ook effectief gebruikt bij gehele muizen (Deirdre Tucker, persoonlijke communicatie) en zou geschikt zijn voor muizen van elke leeftijd, aangezien de borstklippen bij muizen niet zo dicht zijn als die bij ratten. Er zijn echter twee beperkingen bij het gebruik van deze applicatie bij muizen: 1) er kunnen te weinig vertakkingsdoorsnedes in jongere muizen zijn om significante verschillen te detecteren en 2) deze methode kan nietT worden toegepast op mannelijke muizen, aangezien zij geen epitheel van het mammarium vertonen. Ongeacht, deze geautomatiseerde methode is sneller, onbevooroordeeld en veel minder arbeidsintensief dan het handmatig kruisen van vertakkingen kruipt.

Het is mogelijk dat onderzoekers de mammoklier kunnen gebruiken voor andere experimentele technieken, zoals afschaffing van abnormale structuren of immunohistochemie (IHC). Hoewel Tucker et al. (2016) hebben een methode beschreven voor het bereiden van een hematoxyline-eosine-gekleurde sectie van een muis-membraan-full-mount, 8 overwegen we meestal het creëren van een gehele berg om een ​​eindproces te zijn en niet te weten over methoden voor het gebruik van een heel- Gemonteerde borstkanker voor aanvullende gevoelige analyses, zoals IHC of TUNEL assays. Waar gevoelige analyses met behulp van borstkanker weefsel nodig zijn in combinatie met full-mounts, wordt aanbevolen de contralaterale borstklippen te gebruiken.

De borstklier blijft tO zijn het focuspunt in steeds meer studies, maar verschillen tussen laboratoria bestaan ​​zowel in volledige voorbereiding 9 , 10 , 11 , 12 als bij ontwikkelingsbeoordelingen 13 , 14 , 15 . De modificatie van de hier beschreven Sholl analyse verschaft een gestandaardiseerde methode voor de objectieve kwantificering van vertakkingsdichtheid, een belangrijk kenmerk van de ontwikkeling van de borstklier, in de knaagdierklierkanker. Deze methode kan worden toegepast op mammary full-mounts van mannelijke of vrouwelijke knaagdieren, en hoewel deze momenteel wordt aanbevolen voor gebruik in alleen vroege postnatale tot peripubertalklippen van ratten, kan deze worden toegepast op membraan van muizen van alle leeftijden. De applicatie is bijzonder geschikt voor borstklippen die worden verzameld uit peripubertal knaagdieren, aangezien deze periode een aanbeveling isEindpunt voor de volledige voorbereiding van de mammografie in testrichtlijnstudies. Optimalisatie van deze methode voor gebruik in de dichtere borstklippen van volwassen ratten wordt momenteel overwogen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs willen graag Dr. Michael Easterling (Social and Scientific Systems, Inc., Durham, NC) erkennen voor zijn assistentie bij de validatie van deze methode en voor zijn voortdurende dr. Tiago Ferreira (McGill University, Montreal, Quebec, Canada). Hulp bij de Sholl-applicatie.

Materials

Behuizing Radius (mm) MEA (mm2) N k Vertakingsdichtheid (N / mm2)
7.4 71.7 2381 0.73 33.2
Name Company Catalog Number Comments
Dissecting board NA NA A piece of styrofoam roughly 10"x12" is suitable.
Dissecting T-Pins Daigger EF7419A
Spray bottle with ethanol NA NA 70% ethanol is suitable.
Curved dissecting scissors Fine Science Tools 14569-09
Straight dissecing scissors Fine Science Tools 14568-09
Curved forceps Fine Science Tools 11003-12
Superfrost Plus 24 x 75 x 1 mm microscope slides ThermoFisher Scientific 4951PLUS-001 Thermo Scientific Superfrost Plus & Colorfrost Plus slides hold tissue sections on permanently without the need for expensive coatings in IHC and Anatomical Pathology applications. This treatment reduces tissue loss during staining as well as hours of slide preparation. Slides electro-statically attract frozen tissue sections and cytology preparations and feature a chemistry similar to silane, although optimized to improve application performance.
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4951PLUS4. 
Fisherfinest Premium Cover Glass 24 x 60 x 1 mm Fisher scientific 12-548-5P
Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film Fisher scientific 13-374-12
Chloroform Sigma-Aldrich C2432
Glacial acetic acid Sigma-Aldrich A9967
Ethanol absolute, ≥99.8% (GC)  Sigma-Aldrich 24102
Xylene Sigma-Aldrich 214736
Carmine alum  Sigma-Aldrich C1022
Aluminum potassium sulfate  Sigma-Aldrich A6435
Permount mounting media Fisher Scientific SP15
Macroscope Leica Z16 APO  This is the image capturing hardware and software used in this laboratory.  As there are many different options, the methods and applications may vary between laboratories.
Digital camera Leica DFC295
Camera software Leica Leica Application Suite v3.1 
ImageJ software Open source http://imagej.net/Welcome
Sholl analysis  Open source http://imagej.net/Sholl_Analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sholl, D. A. Dendritic organization of the neurons in the visual and motor cortices of the cat. J Anat. 87, (4), 387-406 (1953).
  2. Ferreira, T. A., Iacono, L. L., Gross, C. T. Serotonin receptor 1A modulates actin dynamics and restricts dendritic growth in hippocampal neurons. Eur J Neurosci. 32, (1), 18-26 (2010).
  3. Stanko, J. P., Easterling, M. R., Fenton, S. E. Application of Sholl analysis to quantify changes in growth and development in rat mammary gland whole mounts. Reprod Toxicol. 54, 129-135 (2015).
  4. Assis, S., Warri, A., Cruz, M. I., Hilakivi-Clarke, L. Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats. J. Vis. Exp. (44), e2260 (2010).
  5. Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models. J. Vis. Exp. (53), e2828 (2011).
  6. Ferreira, T. Sholl Analysis. ImageJ. Available from: http://imagej.net/Sholl_Analysis (2012).
  7. Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide. IJ 1.46r. ImageJ. Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html (2012).
  8. Tucker, D. K., Foley, J. F., Hayes-Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Preparation of High-quality Hematoxylin and Eosin-stained Sections from Rodent Mammary Gland Whole Mounts for Histopathologic Review. Toxicol Pathol. 44, (7), 1059-1064 (2016).
  9. Fenton, S. E., Hamm, J. T., Birnbaum, L. S., Youngblood, G. L. Persistent abnormalities in the rat mammary gland following gestational and lactational exposure to 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD). Toxicol Sci. 67, (1), 63-74 (2002).
  10. Murray, T. J., Maffini, M. V., Ucci, A. A., Sonnenschein, C., Soto, A. M. Induction of mammary gland ductal hyperplasias and carcinoma in situ following fetal bisphenol A exposure. Reprod Toxicol. 23, (3), 383-390 (2007).
  11. Moral, R., Santucci-Pereira, J., Wang, R., Russo, I. H., Lamartiniere, C. A., Russo, J. In utero exposure to butyl benzyl phthalate induces modifications in the morphology and the gene expression profile of the mammary gland: an experimental study in rats. Environ Health. 10, (1), 5 (2011).
  12. Johnson, M. D., Mueller, S. C. Three dimensional multiphoton imaging of fresh and whole mount developing mouse mammary glands. BMC Cancer. 13, 373 (2013).
  13. Enoch, R. R., Stanko, J. P., Greiner, S. N., Youngblood, G. L., Rayner, J. L., Fenton, S. E. Mammary gland development as a sensitive end point after acute prenatal exposure to an atrazine metabolite mixture in female Long-Evans rats. Environ Health Persp. 115, (4), 541-547 (2007).
  14. Hovey, R. C., Coder, P. S., Wolf, J. C., Sielken, R. L., Tisdel, M. O., Breckenridge, C. B. Quantitative assessment of mammary gland development in female Long Evans rats following in utero exposure to atrazine. Toxicol Sci. 119, (2), 380-390 (2011).
  15. Mandrup, K. R., Hass, U., Christiansen, S., Boberg, J. Perinatal ethinyl oestradiol alters mammary gland development in male and female Wistar rats. Inter J of Androl. 35, (3), 385-396 (2012).
Kwantificerende vertakkingsdichtheid in Rat Mammary Gland Whole-mounts Met behulp van de Sholl Analyse Methode
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stanko, J. P., Fenton, S. E. Quantifying Branching Density in Rat Mammary Gland Whole-mounts Using the Sholl Analysis Method. J. Vis. Exp. (125), e55789, doi:10.3791/55789 (2017).More

Stanko, J. P., Fenton, S. E. Quantifying Branching Density in Rat Mammary Gland Whole-mounts Using the Sholl Analysis Method. J. Vis. Exp. (125), e55789, doi:10.3791/55789 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter