Kvantifiserende forgreningstetthet i rotte Mammary Gland Whole-mounts ved hjelp av Sholl analysemetoden
Summary
Utvikling av mamma kjertel i gnageren er typisk blitt evaluert ved hjelp av beskrivende vurderinger eller ved å måle grunnleggende fysiske egenskaper. Forgreningsdensitet er en indikator på brystutvikling som er vanskelig å kvantifisere objektivt. Denne protokollen beskriver en pålitelig metode for den kvantitative vurderingen av forgreningsegenskaper for brystkjertelen.
Abstract
Et økende antall studier benytter gnagekjertelen som et sluttpunkt for å vurdere utviklingsmessig toksisitet av en kjemisk eksponering. Effektene disse eksponeringene har på utvikling av brystkjertelen, blir typisk vurdert ved hjelp av enten grunnleggende dimensjonale målinger eller ved å score morfologiske egenskaper. Det brede spekteret av metoder for tolking av utviklingsendringer kan imidlertid føre til inkonsekvente oversettelser på tvers av laboratorier. En felles metode for vurdering er nødvendig, slik at det kan dannes skikkelige tolkninger fra data som sammenlignes på tvers av studier. Den foreliggende studien beskriver anvendelsen av Sholl analysemetoden for å kvantifisere brystkjertelen forgreningsegenskaper. Sholl-metoden ble opprinnelig utviklet for bruk i kvantifisering av neuronale dendritiske mønstre. Ved hjelp av ImageJ, en programvarepakke med åpen kildekodeanalyse, og et plugin utviklet for denne analysen, er kjernekjertelen forgreningstettheten og kompleksiteten avAmmerkjertelen fra en peripubertal kvinnelig rotte ble bestemt. Metodene beskrevet her vil muliggjøre bruk av Sholl-analysen som et effektivt verktøy for å kvantifisere et viktig kjennetegn ved utvikling av brystkirtler.
Introduction
Mammekjertyrforgrening er en egenskap som vanligvis vurderes som en indikator på kjertelutvikling, men det er vanskelig å objektivt kvantifisere. I 1953 beskrev Sholl 1 en metode for å måle nevronisk dendritisk arborisering i kattens visuelle og motoriske cortices, og en plugin for denne teknikken ble utviklet av Ferriera et al. 2 . Fordi både nevroner og brystkjertler utviser en lignende trelignende struktur, ble pluggen benyttet for å kvantifisere bryst epithelial forgreningsdensiteter i 2D-bilder av peripubertal-rotte-brystkjertelen. Peripubertal-scenen ble valgt for analyse fordi avvenning er et livsstadium som ofte blir vurdert i akademiske laboratorier og testretningslinjer. Sholl-analysen er et plugin distribuert med FIJI, som er åpen kildekodebehandlingspakke ImageJ, med flere plugins inkludert. Pluggen skaper en serie konsentriske ringer som omkranser en predefMidtpunkt (vanligvis soma av en nevron eller opprinnelsen til den primære kanalen i en brystkjertel) og strekker seg ut til den fjerneste delen av objektet (den innelukkende radius). Det teller deretter antall kryssinger (N) som forekommer på hver av ringene. Pluggen returnerer også en Sholl-regresjonskoeffisient ( k ), som er en måling av graden av forfall av epithelialforgrening.
Ved hjelp av ImageJ, opprettes et skjelettbildet av en brystkjertel-helfest, og mageepitelområdet (MEA) måles. Bildet analyseres ved hjelp av Sholl analyse plugin, og verdier for N og k , blant andre verdier som ikke benyttes her, returneres. Mammary epithelial branching density bestemmes ved å beregne N / MEA. Omfanget av forgrening fortsetter i de ytre områdene av kjertelepitelet er forgrenings-kompleksiteten og er en indikator for uniform distal epitel vekst. Som k er et mål for den distale nedgangen i epithElial branching, er det et effektivt mål for forgreningskompleksiteten og en pålitelig indikator for brystutvikling.
Denne protokollen beskriver en datamaskinassistert metode for å lage skeletoniserte bilder av brystkjertel-helmounts og kvantitativt evaluerende brystforgreningsegenskaper hos peripubertal han- og hunrotter. Denne metoden er relativt rask og krever ikke bruk av spesialisert mikroskopi utstyr. Utvikling og validering av denne metoden er beskrevet i Stanko et al. (2015) 3 . Denne rapporten beskriver også fremstilling av rotte brystkjertel hele = mounts. Lignende helbrede prosedyrer for mamma er beskrevet i de Assis et al. (2010) 4 og Plante et al. (2011) 5 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Fra fødsel til puberteten er brystkjertelveksten allometrisk. Etter pubertet utvikler brystkjertelen gjennom omfattende duktal forgrening og forlengelse, som fortsetter til brystepitelet opptar hele fettputen. Forgreningsegenskaper er et viktig aspekt ved brystkjertelutvikling, og evnen til objektivt å kvantifisere disse egenskapene kan være svært nyttig for å vurdere normal brystutvikling og for å identifisere unormal utvikling etter tidlig livseksponering til brystgiftige stoffer.
Sc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gjerne anerkjenne Dr. Michael Easterling (Social and Scientific Systems, Inc., Durham, NC) for hans hjelp med validering av denne metoden og Dr. Tiago Ferreira (McGill University, Montreal, Quebec, Canada) for hans kontinuerlige Hjelp med Sholl-søknaden.
Materials
| Dissecting board | NA | NA | A piece of styrofoam roughly 10"x12" is suitable. |
| Dissecting T-Pins | Daigger | EF7419A | |
| Spray bottle with ethanol | NA | NA | 70% ethanol is suitable. |
| Curved dissecting scissors | Fine Science Tools | 14569-09 | |
| Straight dissecing scissors | Fine Science Tools | 14568-09 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11003-12 | |
| Superfrost Plus 24x75x1 mm microscope slides | ThermoFisher Scientific | 4951PLUS-001 | Thermo Scientific Superfrost Plus & Colorfrost Plus slides hold tissue sections on permanently without the need for expensive coatings in IHC and Anatomical Pathology applications. This treatment reduces tissue loss during staining as well as hours of slide preparation. Slides electro-statically attract frozen tissue sections and cytology preparations and feature a chemistry similar to silane, although optimized to improve application performance. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4951PLUS4. |
| Fisherfinest Premium Cover Glass 24x60x1 mm | Fisher scientific | 12-548-5P | |
| Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film | Fisher scientific | 13-374-12 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | A9967 | |
| Ethanol absolute, ≥99.8% (GC) | Sigma-Aldrich | 24102 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Carmine alum | Sigma-Aldrich | C1022 | |
| Aluminum potassium sulfate | Sigma-Aldrich | A6435 | |
| Permount mounting media | Fisher Scientific | SP15 | |
| Macroscope | Leica | Z16 APO | This is the image capturing hardware and software used in this laboratory. As there are many different options, the methods and applications may vary between laboratories. |
| Digital camera | Leica | DFC295 | |
| Camera software | Leica | Leica Application Suite v3.1 | |
| ImageJ software | Open source | http://imagej.net/Welcome | |
| Sholl analysis | Open source | http://imagej.net/Sholl_Analysis |
References
- Sholl, D. A. Dendritic organization of the neurons in the visual and motor cortices of the cat. J Anat. 87 (4), 387-406 (1953).
- Ferreira, T. A., Iacono, L. L., Gross, C. T. Serotonin receptor 1A modulates actin dynamics and restricts dendritic growth in hippocampal neurons. Eur J Neurosci. 32 (1), 18-26 (2010).
- Stanko, J. P., Easterling, M. R., Fenton, S. E. Application of Sholl analysis to quantify changes in growth and development in rat mammary gland whole mounts. Reprod Toxicol. 54, 129-135 (2015).
- Assis, S., Warri, A., Cruz, M. I., Hilakivi-Clarke, L. Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats. J. Vis. Exp. (44), e2260 (2010).
- Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models. J. Vis. Exp. (53), e2828 (2011).
- ImageJ User Guide. IJ 1.46r. ImageJ Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html (2012)
- Tucker, D. K., Foley, J. F., Hayes-Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Preparation of High-quality Hematoxylin and Eosin-stained Sections from Rodent Mammary Gland Whole Mounts for Histopathologic Review. Toxicol Pathol. 44 (7), 1059-1064 (2016).
- Fenton, S. E., Hamm, J. T., Birnbaum, L. S., Youngblood, G. L. Persistent abnormalities in the rat mammary gland following gestational and lactational exposure to 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD). Toxicol Sci. 67 (1), 63-74 (2002).
- Murray, T. J., Maffini, M. V., Ucci, A. A., Sonnenschein, C., Soto, A. M. Induction of mammary gland ductal hyperplasias and carcinoma in situ following fetal bisphenol A exposure. Reprod Toxicol. 23 (3), 383-390 (2007).
- Moral, R., Santucci-Pereira, J., Wang, R., Russo, I. H., Lamartiniere, C. A., Russo, J. In utero exposure to butyl benzyl phthalate induces modifications in the morphology and the gene expression profile of the mammary gland: an experimental study in rats. Environ Health. 10 (1), 5 (2011).
- Johnson, M. D., Mueller, S. C. Three dimensional multiphoton imaging of fresh and whole mount developing mouse mammary glands. BMC Cancer. 13, 373 (2013).
- Enoch, R. R., Stanko, J. P., Greiner, S. N., Youngblood, G. L., Rayner, J. L., Fenton, S. E. Mammary gland development as a sensitive end point after acute prenatal exposure to an atrazine metabolite mixture in female Long-Evans rats. Environ Health Persp. 115 (4), 541-547 (2007).
- Hovey, R. C., Coder, P. S., Wolf, J. C., Sielken, R. L., Tisdel, M. O., Breckenridge, C. B. Quantitative assessment of mammary gland development in female Long Evans rats following in utero exposure to atrazine. Toxicol Sci. 119 (2), 380-390 (2011).
- Mandrup, K. R., Hass, U., Christiansen, S., Boberg, J. Perinatal ethinyl oestradiol alters mammary gland development in male and female Wistar rats. Inter J of Androl. 35 (3), 385-396 (2012).
