Quantificando a densidade de ramificação em glândulas mamárias de ratos montadas inteiras usando o método de análise Sholl

Summary

O desenvolvimento da glândula mamária no roedor tipicamente foi avaliado usando avaliações descritivas ou medindo atributos físicos básicos. A densidade de ramificação é um indicador de desenvolvimento mamário que é difícil de quantificar objetivamente. Este protocolo descreve um método confiável para a avaliação quantitativa das características de ramificação da glândula mamária.

Abstract

Um número crescente de estudos está utilizando a glândula mamária do roedor como um ponto final para avaliar a toxicidade do desenvolvimento de uma exposição química. Os efeitos dessas exposições no desenvolvimento da glândula mamária são tipicamente avaliados usando medidas dimensionais básicas ou marcando características morfológicas. No entanto, a ampla gama de métodos para interpretar mudanças de desenvolvimento pode levar a traduções inconsistentes em todos os laboratórios. É necessário um método comum de avaliação para que as interpretações apropriadas possam ser formadas a partir de dados comparados em todos os estudos. O presente estudo descreve a aplicação do método de análise Sholl para quantificar as características de ramificação da glândula mamária. O método Sholl foi originalmente desenvolvido para uso na quantificação de padrões dendríticos neuronais. Usando o ImageJ, um pacote de software de análise de imagens de código aberto e um plugin desenvolvido para esta análise, a densidade de ramificação da glândula mamária e a complexidade de amA glândula amariária de uma fêmea feminina peripúbera foi determinada. Os métodos aqui descritos permitirão o uso da análise Sholl como uma ferramenta eficaz para quantificar uma característica importante do desenvolvimento da glândula mamária.

Introduction

A ramificação das glândulas mamárias é uma característica comumente avaliada como um indicador do desenvolvimento das glândulas, mas é difícil quantificar objetivamente. Em 1953, Sholl ¹ descreveu um método para medir a arborização dendrítica neuronal nos cortis visual e motor do gato, e um complemento para esta técnica foi desenvolvido por Ferriera et al . ² . Uma vez que tanto os neurônios como as glândulas mamárias exibem uma estrutura semelhantes a uma árvore similar, o complemento foi empregado para quantificar as densidades de ramificação epitelial mamária em imagens 2D da glândula mamária do rato peripúbero. O estágio peripúbero foi escolhido para análise porque o desmame é um estágio de vida que é freqüentemente avaliado em laboratórios acadêmicos e estudos de orientação de teste. A análise Sholl é um plugin distribuído com FIJI, que é o pacote de processamento de imagens de código aberto ImageJ, com plugins adicionais incluídos. O plugin cria uma série de anéis concêntricos que envolvem um predefCentro interno (tipicamente o soma de um neurônio ou a origem do ducto primário de uma glândula mamária) e estendendo-se para a parte mais distal do objeto (o raio de encerramento). Em seguida, conta o número de interseções (N) que ocorrem em cada um dos anéis. O plugin também retorna um coeficiente de regressão de Sholl ( k ), que é uma medida da taxa de decaimento da ramificação epitelial.

Usando ImageJ, é criada uma imagem esqueletizada de um conjunto completo de glândula mamária e mede-se a área epitelial mamária (MEA). A imagem é analisada usando o plugin de análise Sholl, e os valores para N e k , entre outros valores não utilizados aqui, são retornados. A densidade de ramificação epitelial mamária é determinada pelo cálculo de N / MEA. A extensão em que a ramificação continua nas regiões externas do epitélio glandular é a complexidade de ramificação e é um indicador de crescimento epitelial distal uniforme. Como k é uma medida da diminuição distal em EpithElial ramificação, é uma medida efetiva da complexidade de ramificação e um indicador confiável do desenvolvimento mamário.

Este protocolo descreve um método assistido por computador para criar imagens esqueletizadas de montagens inteiras de glândulas mamárias e avaliar quantitativamente características de ramificação mamária em ratos machos e fêmeas peripúberas. Este método é relativamente rápido e não requer o uso de equipamentos de microscopia especializados. O desenvolvimento e a validação deste método estão descritos em Stanko et al. (2015) ³ . Este relatório também descreve a preparação da glândula mamária de rato inteiro = montagens. Procedimentos semelhantes de mamaria total foram descritos em Assis et al. (2010) ⁴ e Plante et al. (2011) ⁵ .

Protocol

Todos os animais utilizados e procedimentos para este estudo foram aprovados pelo NIEHS Laboratory Animal Care and Use Committee e conduzido em uma Associação para Avaliação e Credenciamento de Laboratório Animal Care-acreditada facilidade. 1. Glândulas mamárias de consumo excessivo Pre-rotular todos os slides usando um método à prova de xileno (o lápis funciona melhor). Cubra-os com solução de montagem no final para preservar o rótulo. Eutanizar o animal po…

Representative Results

Os valores para o raio fechado medido, MEA, N, k e densidade de ramificação calculada para a glândula mamária analisada neste protocolo são relatados na Tabela 1 . A análise Sholl gera parcelas lineares e semi-logs do número de interseções em cada raio ( Figura 9 ) e, se selecionado, um mapa de calor das interseções ( Figura 10 ). As glândulas menos desenvolvidas exibem menos intersecções …

Discussion

Do nascimento até a puberdade, o crescimento da glândula mamária é alométrico. Após a puberdade, a glândula mamária se desenvolve através de extensas derivações ductais e alongamento, que continuam até o epitélio mamário ocupar toda a almofada de gordura. As características de ramificação são um aspecto importante do desenvolvimento da glândula mamária e a capacidade de quantificar objetivamente essas características pode ser altamente útil para avaliar o desenvolvimento mamário normal e para iden…

Materials

Dissecting board	NA	NA	A piece of styrofoam roughly 10"x12" is suitable.
Dissecting T-Pins	Daigger	EF7419A
Spray bottle with ethanol	NA	NA	70% ethanol is suitable.
Curved dissecting scissors	Fine Science Tools	14569-09
Straight dissecing scissors	Fine Science Tools	14568-09
Curved forceps	Fine Science Tools	11003-12
Superfrost Plus 24x75x1 mm microscope slides	ThermoFisher Scientific	4951PLUS-001	Thermo Scientific Superfrost Plus & Colorfrost Plus slides hold tissue sections on permanently without the need for expensive coatings in IHC and Anatomical Pathology applications. This treatment reduces tissue loss during staining as well as hours of slide preparation. Slides electro-statically attract frozen tissue sections and cytology preparations and feature a chemistry similar to silane, although optimized to improve application performance. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4951PLUS4.
Fisherfinest Premium Cover Glass 24x60x1 mm	Fisher scientific	12-548-5P
Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film	Fisher scientific	13-374-12
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432
Glacial acetic acid	Sigma-Aldrich	A9967
Ethanol absolute, ≥99.8% (GC)	Sigma-Aldrich	24102
Xylene	Sigma-Aldrich	214736
Carmine alum	Sigma-Aldrich	C1022
Aluminum potassium sulfate	Sigma-Aldrich	A6435
Permount mounting media	Fisher Scientific	SP15
Macroscope	Leica	Z16 APO	This is the image capturing hardware and software used in this laboratory.  As there are many different options, the methods and applications may vary between laboratories.
Digital camera	Leica	DFC295
Camera software	Leica	Leica Application Suite v3.1
ImageJ software	Open source	http://imagej.net/Welcome
Sholl analysis	Open source	http://imagej.net/Sholl_Analysis