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Biochemistry

Microcristallografia dei cristalli proteici e Published: July 21, 2017 doi: 10.3791/55793
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Infection and Immunity Program, Monash Biomedicine Discovery Institute, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Monash University
* These authors contributed equally

Summary

Viene presentato un protocollo per la cristallografia a raggi X utilizzando microcristalli di proteine. Sono stati confrontati due esempi che analizzano microcristalli in vivo dopo la purificazione o in cellulo .

Abstract

L'avvento di linee di microfocus di alta qualità in molti impianti di sincrotrone ha consentito l'analisi di routine di cristalli inferiori a 10 μm nella loro dimensione più grande, che rappresentavano una sfida. Presentiamo due flussi di lavoro alternativi per la determinazione della struttura di microcristalli proteici mediante cristallografia a raggi X con particolare attenzione ai cristalli in vivo . I microcristalli vengono estratti dalle cellule per ultrasuoni e purificati mediante centrifugazione differenziale o analizzati in cellulo dopo la selezione delle cellule mediante citometria a flusso di cellule contenenti cristalli. Opzionalmente, cristalli purificati o cellule contenenti cristalli vengono imbevuti in soluzioni di atomi pesanti per la fase di sperimentazione. Questi campioni vengono quindi preparati per esperimenti di diffrazione in modo analogo mediante applicazione su un supporto micromesh e raffreddamento a flash in azoto liquido. Breve descrizione e confronto di esperimenti di diffrazione seriale di microcristalli isolati e di cristallo-Contenenti le cellule utilizzando un beamline di sincrotrino microfocus per produrre set di dati adatti per la fase di fasi, la costruzione di modelli e la raffinatezza.

Questi flussi di lavoro sono esemplificati con i cristalli del polyhedrin Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) prodotto dall'infezione di cellule insettiche con un baculovirus ricombinante. In questo caso, l'analisi cellulare è più efficace dell'analisi dei cristalli purificati e produce una struttura in ~ 8 giorni dall'espressione al raffinamento.

Introduction

L'uso della cristallografia a raggi X per la determinazione di strutture ad alta risoluzione di macromolecole biologiche ha registrato una costante progressione negli ultimi due decenni. La crescente assunzione di cristallografia a raggi X da ricercatori non esperti esemplifica la democratizzazione di questo approccio in molti settori della scienza della vita 1 .

Storicamente, i cristalli con dimensioni inferiori a ~ 10 μm sono state considerate come impegnative, se non inutilizzabili, per la determinazione della struttura. La crescente disponibilità di microfocus dedicate a fonti di radiazione di sincrotrone in tutto il mondo e progressi tecnologici, come lo sviluppo di strumenti per la manipolazione dei microcristalli, hanno rimosso gran parte di queste barriere che hanno ostacolato l'ampio utilizzo della microcristallografia a raggi X. Avanzamenti nella microcristallografia a raggi X seriali 2 , 3 e diffrazione a micro elettronica 4 haVe ha mostrato che l'uso di micro- e nanocristalli per la determinazione della struttura non è solo possibile ma anche a volte preferibile all'uso di grandi cristalli 5 , 6 , 7 .

Questi progressi sono stati applicati per lo studio dei peptidi 8 e dei cristalli naturali prodotti dai virus degli insetti 9 , 10 . Sono ora utilizzati per una vasta gamma di macromolecole biologiche tra cui i sistemi più difficili come le proteine ​​a membrana e grandi complessi 11 . Per facilitare l'analisi di questi microcristalli, sono stati analizzati in meso, proteine di membrana 12 in particolare e in chips microfluidica 13.

La disponibilità di queste metodologie microcristallografia nuovi ha sollevato la possibilità di utilizzare inCristallizzazione vivo come un nuovo percorso per la biologia strutturale 14 , 15 , 16 che offre un'alternativa alla cristallogenesi classica in vitro . Purtroppo, anche quando si possono produrre cristalli in vivo , rimangono diversi ostacoli quali la degradazione o la perdita di ligandi durante la depurazione dalle cellule, la difficoltà nella manipolazione e la visualizzazione dei cristalli alla radiazione di sincrotrone e negli esperimenti di diffusione a raggi X. Come cristalli alternativi sono stati analizzati anche direttamente all'interno della cella senza alcuna fase di purificazione 17 , 18 , 19 . Un'analisi comparativa suggerisce che tali approcci cellulari possono essere più efficienti dell'analisi dei cristalli purificati e dei dati di resa di maggiore risoluzione 20 .

Questo protocollo è inTendeva ad aiutare i ricercatori alla microcristallografia delle proteine. Fornisce metodologie che si concentrano sulla preparazione e manipolazione del campione per gli esperimenti di diffrazione a raggi X in un beamline di sincrotrone. Si propongono due opzioni utilizzando cristalli isolati per microcristallografia classica o cellule contenenti cristalli ordinate per citometria a flusso per l'analisi cellulare ( Figura 1 ).

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Protocol

Nota: La cristallizzazione in vivo è stata segnalata in molti organismi, inclusi batteri, lieviti, piante, insetti e mammiferi (riveduti al punto 21 ). La cristallizzazione delle proteine ​​ricombinanti è stata inoltre ottenuta in laboratorio utilizzando transfection transitoria di cellule di mammiferi e infezione da baculovirus di cellule insettiche. Il seguente protocollo è stato sviluppato utilizzando il gene polyhedrin di Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) clonato in un baculovirus ricombinante sotto il promotore di polyhedrin baculovirus, generato secondo le istruzioni del riferimento 22 . Pertanto, anche se questo protocollo può essere adattato ad altri tipi di cellule ( ad es. Le cellule di mammiferi), descriviamo qui le procedure per le cellule degli insetti. Il protocollo presuppone che l'eccessiva espressione della proteina di interesse sia già stata raggiunta. I metodi per la produzione di un baculovirus ricombinante e il suo utilizzo per l'espressione della proteina di interesse sono avAilable nei riferimenti 23 , 24 , 25 , 26 , 27 .

1. Identificazione delle celle contenenti cristalli

  1. Se le cellule vengono coltivate in monostrato, controllarle direttamente nel pallone. Se le cellule vengono coltivate in coltura liquida, utilizzare il seguente protocollo.
    1. Usando una pipetta sterile sterile, trasferire 500 μL di cellule in un tubo di microcentrifuga. Fare attenzione a garantire che la sterilità della cultura principale sia mantenuta; Gestire le celle in un armadio di sicurezza di classe II e seguire le tecniche standard asettiche.
    2. Pipettare 5 μL di cellule dal tubo di microcentrifuga su una lastra di vetro.
    3. Posizionare con cura un coperchio di vetro sul liquido evitando la formazione di bolle d'aria. Se la diapositiva non può essere visualizzata entro 15 minuti, sigillare la copertura con grasso vuoto per evitare l'evaporazionezione.
  2. Inserire il pallone o scorrere con un microscopio invertito. Se disponibile, utilizzare il contrasto di fase e / o la microscopia a contrasto differenziale differenziale (DIC). Entrambe le tecniche ottimizzano il contrasto in campioni trasparenti e sottolineano linee e bordi, facilitando così l'identificazione dei cristalli in vivo .
  3. Esamini con cura le celle. Inizia con ingrandimento 200X e ingrandisci con l'ingrandimento massimo quando rileva un cristallo potenziale. La presenza di cristalli può essere suggerita indirettamente da cambiamenti nella morfologia delle cellule ( Figura 2 ). Cercare i bordi taglienti e le modifiche della refrattività (se si utilizza il contrasto o il DIC). I cristalli noti in vivo adottano forme diverse, tra cui aste, pile di aghi, cubi, piramidi e polihedra (per alcuni esempi vedere la Figura 2 e la Tabella 1 ).
    Nota: la percentuale di celle contenenti cristalli sarà diversa in ogni caso e può venire in festaN variano tra preparazioni ma in generale non si dovrebbe aspettare di trovare cristalli in tutte le cellule. Allo stesso modo, il numero di cristalli per cella è anche variabile (vedi tabella 1 ) e più di un cristallo può essere trovato in una sola cellula. Questi fattori devono essere ottimizzati, ove possibile, regolando la molteplicità dell'infezione, alterando la lunghezza dell'espressione e variando il costrutto della proteina. Da una parte, le condizioni di espressione di proteine ​​e di crescita cellulare che massimizzano il numero di cellule contenenti cristalli consentono di migliorare la produttività ( ad esempio maggiore multiplicità di infezione e tardiva raccolta della coltura cellulare). D'altra parte, le condizioni in cui le celle contengono un singolo cristallo facilitano la raccolta dei dati ( ad esempio una bassa molteplicità di infezione). Data l'arricchimento portato dalla classificazione del flusso descritto al punto 2.2, si consiglia di mirare a più grandi cristalli ( ad esempio un singolo cristallo per cella) anche se la percentuale di cellule contenenti cristalli è bassa.
  4. Se cristalloVengono individuati, registrare la loro posizione (quando si esegue l'imaging in monocomponente in un pallone) e stimare la percentuale di cellule contenenti cristalli. Se disponibile, utilizzare un microscopio dotato di una fotocamera in grado di monitorare le modifiche a un solo livello di cella.
  5. Per le cellule in sospensione, determinare il grado di vitalità cellulare seguendo il protocollo dettagliato nel riferimento 28 . Per le cellule colte in un monostrato, stimare per ispezione visiva il grado approssimativo della confluenza e la quantità di cellule staccate.
  6. Monitorare la crescita del cristallo, la crescita cellulare e la vitalità due volte al giorno.
  7. Raccogli le cellule appena la crescita cristallina sembra smettere. Per cristalli fortemente robusti come la poliedra virale, i tempi di incubazione estesi (> 4 giorni) aumentano il numero di grandi cristalli. Tuttavia, per i cristalli proteici tipici, si raccomanda di raccogliere le cellule quando la vitalità scende sotto l'80% per prevenire i danni causati dalla lisi cellulare.
  8. Rimuovere il pallone dall'incubatore e procederePunto 2.2 il più presto possibile. Tenere le celle sul ghiaccio durante le seguenti fasi, salvo diversa indicazione.

2. Purificazione del campione

Nota: Descriviamo due metodi di analisi dei cristalli in vivo da cristalli purificati e rispettivamente in cellulo .

  1. Purificazione di cristalli
    Nota: a meno che non vi siano prove che i cristalli di interesse sono sensibili a basse temperature, lavorare sul ghiaccio e usare buffere ghiacciate per evitare il degrado del cristallo.
    1. Pipettare 50 mL di cellule Sf9 infette in un tubo centrifugo conico da 50 mL. Questo rappresenta ~ 4 x 10 8 cellule in un esperimento tipico.
    2. Celle a pellet a 450 xg per 10 minuti a 4 ° C.
    3. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 40 ml di soluzione fredda di fosfato tamponato (PBS), pH 7,4.
      Nota: PBS viene proposto come punto di partenza per la purificazione come tampone isotonica standard con l'obiettivo di mimSconvolgendo l'ambiente cellulare in cui crescevano i cristalli in vivo. È stato utilizzato per la maggior parte dei cristalli in vivo coltivati ​​nella coltura cellulare fino ai 9 , 14 e 29 anni . In alternativa, il supporto DMEM è stato utilizzato con successo anche nella purificazione di cristalli in vivo da cellule di mammiferi 19 . Se i cristalli soffrono visibilmente del loro trasferimento in PBS o presentano scarsa diffrazione, questo parametro dovrebbe essere esaminato come potenziale fonte di degradazione.
    4. Sonicare il pellet resuspendato per 30 s a 10 mA utilizzando un sonicatore dotato di una sonda da 19 mm. Per evitare di riscaldare il campione, posizionarlo in un bicchiere pieno di ghiaccio mentre sonicating. Le alterazioni delle cellule chimiche o meccaniche possono essere utilizzate come alternative se i cristalli sembrano essere danneggiati dalla sonicazione, come valutato nella fase 2.1.7.
    5. Centrifugare a 450 xg per 10 min a 4 ° C. Dopo la centrifugazione, sono visibili 2 strati:Uno strato superiore di detriti cellulari, marrone pallido, e un pellet inferiore di cristalli polyhedrin, bianco e gesso.
    6. Scartare il surnatante e rimuovere lo strato superiore mediante pipettazione prudente. Riprendere il pellet inferiore in 40 ml di PBS refrigerato.
    7. Valutare la qualità dei campioni mediante l'imaging con un microscopio leggero.
      1. Pipettare 5 μL di cellule o cristalli purificati su una lastra di vetro. Ciò può essere fatto a temperatura ambiente.
      2. Posizionare con cura un coperchio di vetro sul liquido evitando la formazione di bolle d'aria.
      3. Immagine la diapositiva con un microscopio invertito a 200X ingrandimento. Immagine il campione entro 15 minuti dalla sua preparazione sulla diapositiva. Se la diapositiva non può essere visualizzata entro 15 minuti, sigillare la copertura con grasso vuoto per evitare l'evaporazione.
        NOTA: Nel caso di polihedra, i cristalli appaiono come cubetti rifrangenti di ~ 1 - 10 μm per lato. Controllare l'integrità dei cristalli in cerca di segni di perdita di nitidezza( Es. Bordi rotondi), crepe o dissoluzione. Inoltre controllare la presenza di detriti di cellule che appariranno come grumi e oggetti di dimensioni e forma irregolari.
    8. Ripetere i passaggi da 2.1.5 a 2.1.7, dimezzando il volume di PBS utilizzato per risospendere il pellet ad ogni ciclo finché i cristalli non appaiono privi di detriti. Riposizionare il pellet finale in 1 ml di PBS refrigerato e trasferire i cristalli in un tubo di microcentrifuga. Conservare i cristalli purificati a 4 ° C.
    9. Stima la concentrazione dei cristalli usando un emocitometro come descritto dal produttore. Contare i cristalli come se contano le celle.

Figura 3
Figura 3 : Microcristalli purificati in vivo . Purificazione rappresentativa di cristalli del poliedrino BmCPV1 dalle cellule insettuali Sf9 che mostrano ( a ) detriti di cellule pelletati e piangonoStali dopo la sonicazione, e ( b ) close-up sui detriti e sugli strati di cristallo. Lo strato di detriti può essere accuratamente risospeso nel surnatante e scartato per una purificazione più rapida del cristallo. C ) Immagine microscopica ottica di polihedra purificata. Barra di scala = 50 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Isolamento di cellule contenenti cristalli tramite citometria a flusso
    Nota: Per facilitare la definizione dei cancelli in citometria a flusso, si raccomanda di coltivare una cultura di controllo in parallelo a quella che esprime la proteina di interesse. Ciò può essere fatto infettando un pallone di cellule Sf9 con un baculovirus ricombinante non rilevante o preparando cellule infette. La classificazione e l'imaging dei campioni vengono effettuati solitamente a temperatura ambiente.
    ATTENZIONE: Propidium ioduro è un cancerogeno sospetto e deve essere manipolatocon cura.
    1. Pipettare 4 mL di cellule Sf9 infette - rappresentanti ~ 3 x 10 7 cellule - in un tubo adattato all'analisi di flusso-citometria. Inoltre, preparare un secondo tubo con un numero equivalente di Sf9 cellule infettate da un baculovirus non ricombinante.
    2. Aggiungere ioduri propidium (PI) a entrambi i campioni alla concentrazione finale di 1 μg / mL poco prima della valutazione citometrica a flusso. Questo passaggio è necessario per identificare le cellule morte, i cluster di cellule ei detriti che possono alterare o mascherare la distribuzione delle cellule sulla trama di spostamento avanti e laterale. Preparare le riserve PI di 1 mg / mL in acqua e conservare a 4 ° C protetto dalla luce.
    3. Applicare le cellule a un citometro di flusso standard in grado di ordinare le cellule in base all'FSC (forward- forwarding) e alla dispersione laterale (SSC). Analizzare almeno 20.000 eventi del campione di controllo ( cioè non-cristallino). Dopo aver scartato le cellule morte, i blocchi di cellule ei detriti dall'analisi, generano la trama FSC a SSC.
    4. Analizzate almeno 20.000Ts del campione contenente cristalli. Confronta la trama FSC con SSC con il mock one. Cercare l'aspetto di una popolazione distinta corrispondente a cellule contenenti cristalli. Tipicamente, le cellule con cristalli intracellulari avranno un SSC superiore a causa di una maggiore complessità morfologica. L'FSC può anche aumentare se la crescita del cristallo provoca un aumento del volume della cella. Definire le porte del distributore di flusso per isolare le popolazioni delle cellule corrispondenti alle aree del diagramma di dispersione che si differenziano dalla trama di mock. Immagini i campioni ordinati mediante microscopia leggera come descritto nel passaggio 1 per confermare la popolazione associata a cellule contenenti cristalli.
    5. Utilizzando le porte definite al punto 2.2.4, ordinate le cellule contenenti cristalli in PBS o in qualsiasi altro tampone isotonic. Registrare il numero di celle contenenti cristalli ordinate e il volume finale per facilitare i passaggi successivi. Conservare le celle ordinate sul ghiaccio oa 4 ° C.
      Nota: in un'ora,> 300.000 polihedra-conLe cellule sono ordinate su un separatore di celle con un ugello di 100 mm (138 kPa con una frequenza di 39 kHz). Questa quantità di cellule è sufficiente per preparare> 1.000 maglie.
    6. Seguendo il protocollo descritto nel punto 2.1.7, immagini le cellule con un microscopio leggero per confermare l'arricchimento in cellule contenenti cristalli. La preparazione del campione per la raccolta dei dati dovrebbe essere effettuata al più presto dopo la selezione delle cellule in quanto i cristalli possono degradarsi nel tempo o essere liberati a causa della lisi cellulare.

Figura 4
Figura 4 : Selezione delle cellule. Le cifre di flusso di rappresentazione dispersiscono da ( a ) le cellule non infette (mock), che non contengono cristalli, e ( b ) le cellule Sf9 infettate da un baculovirus ricombinante che si esprime troppo per il poliedrina BmCPV1. Differenze nel modello di dispersione tra le due popolazioni alGating della popolazione cellulare contenente il cristallo (cancello rosso, elevati valori SSC). Ogni trama rappresenta 20.000 eventi di ordinamento. SSC: dispersione della luce laterale; FSC: dispersione della luce in avanti. C ) Immagine microscopica ottica di una popolazione rappresentativa delle cellule ordinate, mostrando la presenza di cristalli intracellulari. Scala = 50 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Preparazione del campione per la raccolta dei dati

Nota: se le cellule oi cristalli devono essere derivatizzati per il protocollo sperimentale seguendo il protocollo dettagliato nella sezione 3.1. Altrimenti, andare direttamente alle sezioni 3.2 per i cristalli purificati o 3.3 per l'analisi cellulare .

  1. Derivazione di microcristalli purificati o in cellulo
    ATTENZIONE: Prima dell'uso consultare tutti i fogli di sicurezza relativi ai materiali di sicurezza (MSDS).La maggior parte delle sostanze chimiche utilizzate per la fasi sperimentale sono acutamente tossiche. Utilizzare tutte le pratiche di sicurezza appropriate, compresa l'uso di un cappuccio chimico e delle attrezzature di protezione individuale. Smaltire i rifiuti in conformità con la politica dell'istituzione.
    Nota: La natura degli atomi pesanti, la loro concentrazione e il loro tempo di incubazione sono dati in modo indicativo per i cristalli del polihedrin BmCPV1. Questi parametri devono essere determinati sperimentalmente per ogni nuovo target. La colorazione successiva con il blu trypanico nel punto 3.3.2 può essere omessa se le cellule sono facilmente colorate dal composto chimico usato per la fase di fasi.
    1. Preparare soluzioni saturate degli atomi pesanti desiderati (o soluzioni di altri prodotti chimici utilizzati per la fase di sperimentazione). In genere, saranno necessari volumi inferiori a 100 μL per ogni atomo pesante. Rimuovere sali e detriti non sciolti mediante centrifugazione a velocità massima in microcentrifuga per 5 minuti a temperatura ambiente.
    2. Preparare aliquote di ~ 50.000 cristalliO ordinate per un composto atomico pesante. Se il PBS non è compatibile con la sostanza chimica utilizzata per la derivatizzazione ( vale a dire le forme di precipitazione e la soluzione diventa nuvolosa), pettinare i cristalli a 4 000 xg per 3 minuti a temperatura ambiente in una microcentrifuga o le cellule a 150 xg per 3 minuti, rimuovere Supernatante e riposizionare delicatamente i cristalli o le cellule in 20 μl di un opportuno tampone. Ripetere la pelletizzazione e la resuspensione per assicurare che non rimangano tracce di PBS. Regolare il volume finale a 20 μL per tutte le aliquote.
    3. Aggiungere 20 μL di soluzione atomica pesante o di altri composti chimici di scelta ai cristalli o alle cellule. La concentrazione ottimale dell'atomo pesante dipenderà da una combinazione di parametri cellulari (permeabilità, proteine ​​fuori bersaglio ...) e la natura del cristallo della proteina di interesse. Come punto di partenza, prova 3 diverse concentrazioni: saturazione completa, 1 / 10e, 1 / 100e.
    4. Tenere i campioni a 4 ° C per un massimo di 3 giorni. Cristalli del polideEdrone sono molto resistenti e denso e necessitano di lunghi si addensano per incorporare gli atomi pesanti; Per altri tipi di cristalli il periodo di incubazione e la concentrazione di atomi pesanti dovrebbero essere determinati sperimentalmente. I tempi di incubazione troppo brevi non consentiranno l'incorporazione di quantità adeguate dell'atomo pesante, mentre i lunghi tempi di incubazione possono influenzare l'integrità dei cristalli, quindi abbassando la qualità di diffrazione o addirittura sciogliendoli. Come punto di partenza, provare 3 diversi tempi di incubazione per ogni soluzione di atomi pesanti ( es. 1 min, 1 h e overnight). La derivazione successiva viene valutata mediante l'analisi dei dati di diffrazione descritti brevemente nella sezione 5 e riferimenti in esso contenuti.
    5. Lavare via l'eccesso di soluzione atomica pesante per pelleting i cristalli a 4,000 xg per 3 minuti a temperatura ambiente in una microcentrifuga o alle cellule a 150 xg per 3 minuti, rimuovendo il surnatante e riposizionando delicatamente i cristalli o le cellule in 10 μL di tampone .
  2. ATTENZIONE: l'uso di azoto liquido è associato a pericoli quali asfissia, bruciature a freddo, incendi in atmosfera arricchita di ossigeno e esplosioni. Si prega di consultare la gestione dei rischi e le pratiche di lavoro sicure dell'istituzione.
    1. Sulla base della concentrazione di cristallo calcolata nel punto 2.1.9, regolare la concentrazione su 10 7 cristalli / mL diluendo il campione; O pellettando i cristalli a 4000 xg per 3 minuti a temperatura ambiente in una microcentrifuga, regolando il volume finale rimuovendo il surnatante e riposaldando delicatamente i cristalli.
    2. Se i campioni devono essere congelati in anticipo, raffreddare il caricatore o il dewar asciutto con azoto liquido. Preparare i flaconi oi pucchetti, se del caso, e raffreddarli con azoto liquido.
    3. Riposizionare il pellet di cristallo e applicare una pipetta da 0,5 μl di cristalli su un micromesco pipettando. Utilizzate le mesh di 700 μm con piazzale da 25 μmFori come punto di partenza. L'area della maglia non è critica, ma un'area più grande fornisce più cristalli per maglia e porta ad evaporazione più lenta durante la preparazione. La dimensione dei fori potrebbe essere necessaria per essere ottimizzata per adattarsi alla dimensione di cristalli di dimensioni superiori a 25 μm. Se necessario per studi sistematici, sono disponibili reticoli indicizzati per facilitare una scansione griglia metodica durante la raccolta dei dati.
    4. Rimuovere la maggior parte del liquido in eccesso bloccando con un fusto di carta. I cristalli devono essere sparsi uniformemente sulla maglia, senza toccarsi l'un l'altro. Ripetere la fase 3.1.1. Per ottimizzare la concentrazione del campione. Procedere rapidamente e non togliere troppo il liquido. In assenza di crioprotectant, il liquido evapora rapidamente con il rischio di formazione di cristalli di sale e / o perdita del film.
    5. Aggiungere crioprotectante: pipetta 0,5 μL di una soluzione di 50% di glicole etilenico in acqua sulla maglia (la composizione del criobufferto deve essere adattata al campione; suggerimenti per l'ottimizzazione della cIl ryoprotectant può essere trovato nel riferimento 30 ). Rimuovere il liquido in eccesso da blotting con un fusto di carta. A differenza della fase precedente, qui la rimanente pellicola di solvente dovrebbe essere il più sottile possibile per ridurre gli effetti parallassi che complicano il processo di allineamento tra il cristallo, il trave del fascio e il goniometro; E per ridurre al minimo lo sfondo causato dalla dispersione di raggi X da liquido nel percorso del fascio.
    6. Immediatamente raffreddare il micromesh in azoto liquido e trasferire in un flaconcino o un robot puck, quindi a un caricatore o un dewar asciutto per lo stoccaggio.
  3. Preparazione di micromesh con cellule contenenti cristalli
    ATTENZIONE: l'uso di azoto liquido è associato a pericoli quali asfissia, bruciature a freddo, incendi in atmosfera arricchita di ossigeno e esplosioni. Si prega di consultare la gestione dei rischi e le pratiche di lavoro sicure dell'istituzione.
    1. Trasferire le cellule ordinate in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml. Basato sulla cella cLe bacchette registrate dal sorter della cellula, regolare la concentrazione a 10 7 cellule / mL diluendo il campione con PBS; O pelleting le cellule a 150 xg per 3 minuti a temperatura ambiente in una microcentrifuga, regolando il volume finale rimuovendo il surnatante e riposaldando delicatamente le cellule.
    2. Mescolare le cellule con un uguale volume di soluzione di trypan blu (0,4% w / v) ad una concentrazione finale dello 0,2% w / v.
    3. Se i campioni devono essere congelati in anticipo, raffreddare il caricatore asciutto o dewar con l'azoto liquido. Preparare i flaconi oi pucchetti, se del caso, e anche raffreddarli con azoto liquido.
    4. Riposizionare delicatamente le cellule e pipettare 0,5 μL di cellule ordinate su un micromesh.
    5. Rimuovere il liquido in eccesso da blotting con un fusto di carta. Le cellule devono essere sparse uniformemente sulla maglia, senza toccarsi l'un l'altro. Se non usando crioprotucant (punto 3.3.6), la rimanente pellicola del solvente dovrebbe essere il più sottile possibile per ridurre gli effetti parallassi che complicanoE il processo di allineamento tra il cristallo, il percorso del fascio e il goniometro; E per ridurre al minimo lo sfondo causato dalla dispersione di raggi X da liquido nel percorso del fascio.
    6. Facoltativamente aggiungere crioprotectant alle cellule: pipettare 0,5 μl di 50% etilene glicole, 50% soluzione PBS sulla maglia. La composizione del criobuffer deve essere adattata al campione; Suggerimenti per l'ottimizzazione del cripto protettivo possono essere trovati nel riferimento 30 . Rimuovere il liquido in eccesso bloccando con un fusto di carta, lasciando solo un sottile film di solvente.
      Nota: L'emissione della fase di crioconservazione non ha alterato la qualità della diffrazione dei raggi X quando i cristalli del polihedrina sono stati analizzati in cellulo , mentre questo passaggio è stato richiesto per i cristalli purificati 20 . Questo vale solo per l'incubazione delle cellule con soluzione crioprotettori; Il campione dovrebbe ancora essere analizzato a 100K per ridurre al minimo gli effetti dei danni da radiazione sui cristalli.
    7. immeRaffreddare abbastanza il micromeso in azoto liquido e trasferire a un flaconcino o al robot, quindi ad un caricatore asciutto o al dewar di stoccaggio, come opportuno.

4. Raccolta dati

Nota: I parametri utilizzati per la raccolta dei dati sono forniti come guida e devono essere ottimizzati per ciascun tipo di cristallo e la beamline di sincrotrone.

  1. Raccogliere i dati su un beamline di cristallografia a microfocus (cfr. Riferimento 7 per un elenco di linee di microfocus e loro caratteristiche). Se disponibile, utilizzare un fascio collimato che corrisponda alla dimensione dei cristalli.
  2. Per la fasi sperimentale con il metodo di dispersione anomala di lunghezza d'onda a singola onda (SAD), raccogliere ad un'energia che massimizza il segnale anomalo dell'atomo pesante della scelta. Per la faseizzazione utilizzando il metodo di sostituzione isomorfa multipla (MIR), raccogliere sopra l'energia di un bordo di assorbimento appropriato per l'atomo pesante a scelta (disponibile all'indirizzo http://skuld.bmsc.washington.edu/scAtter / AS_periodic.html).
  3. Dopo aver caricato la mesh sul goniometro, iniziare centrando il micromesh con il percorso del fascio usando gli orientamenti frontali (laterali convessi) e laterali. Quindi, con il micromesh face-on, regolare l'allineamento allineando il centro di una determinata corsia orizzontale del micromesh (ad esempio, inizia con quella centrale). Quindi raccogliere i dati lungo questa corsia orizzontale con solo piccoli aggiustamenti all'allineamento. Se disponibile, utilizzare la centratura basata sulla rasterizzazione a bassa diffusione dei raggi X per la regolazione fine dell'allineamento (consultare il contatto locale sulla linea di sincronismo).
    Nota: poiché una quantità limitata di dati possono essere raccolti su microcristalli a causa di danni alla radiazione (tipicamente 10-30 immagini con oscillazione di 1 °), in teoria il cristallo deve essere allineato solo con il percorso del fascio per 10-30 °. Tuttavia, è fondamentale che l'allineamento sia accurato in quanto il cristallo può facilmente essere perso dal microbeam (generalmente collimato ad un diametroEr di ~ 10 μm o più piccoli).
  4. Raccogliere i dati di diffrazione fino a perdere la diffrazione a causa di danni alla radiazione. Per i cristalli del polyhedrin, il tempo di esposizione di 10 sec viene tipicamente utilizzato per una oscillazione di 1 ° per un flusso di circa 3,6 x 10 11 fotoni / s a ​​13 keV con un rilevatore CCD (dose totale <30 MGy). Ottimizzare queste impostazioni in base alla linea del beamline e alla natura del cristallo utilizzato. In particolare, è consigliata una bassa dose e una affettatura fine per i rivelatori a raggi X con pixel.
    Nota: Se si utilizza la strategia di cellulo , le cellule colorate con blue trypan appariranno come punti blu contro il supporto di sfondo, rendendoli più facili da allineare al fascio. Se la microbeam collimata ha circa la stessa dimensione delle cellule (~ 10 μm), tutti i cristalli contenuti in una cella verranno illuminati contemporaneamente. Per le celle contenenti più microcristalli, ciò porta all'osservazione di modelli di diffrazione multipli, che possono essere difficili da elaborare. Tuttavia, diLa frazione da uno dei cristalli spesso tende a dominare il modello di diffrazione e viene preferenzialmente indicizzato durante l'elaborazione dei dati. Per i fasci a raggi X con un raggio a raggi X è significativamente più piccolo che la cella, rastering a basso flusso di raggi X (> attenuazione del 95%) dovrebbe essere utilizzato per centrare su un singolo cristallo prima della raccolta dei dati.
  5. Procedere al cristallo successivo in corsia.
  6. Una volta che tutti i cristalli della corsia sono stati testati, passare alla corsia successiva e ripetere la procedura di allineamento. Procedere fino a quando non sono stati raccolti dati sufficienti o sono stati testati tutti i cristalli.
    1. Assicurarsi che le linee che sono state elaborate siano chiaramente identificate in modo che i cristalli non vengano persi o girati due volte (se necessario, disegnare uno schizzo). Tipicamente, il blu trypan diventa giallo dopo che la cellula è stata irradata, che può essere utilizzata come marcatore.

Figura 5
Figura 5 : Strategia di raccolta dati dai campioni sul supporto Micromesh. (A) strategia di raccolta dei dati per corsia; L'allineamento viene eseguito all'inizio di ogni corsia (punti) e i dati vengono raccolti lungo la corsia. ( B ) Primo piano di una cellula contenente cristalli contenenti cristalli a tampone in rete, come visto sullo schermo beamline a microcristallografia. C ) Close-up di una poliedra purificata su una maglia, come si vede sullo schermo beamline a microcristallografia. I quadrati delle maglie sono 25 μm x 25 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

5. Elaborazione dei dati

NOTA: qui, solo accenniamo brevemente i passaggi di elaborazione dati che sono specifici per la microcristallografia seriale, dove i dati di cristalli multipli sono fusi. Molti articoli sono eccellentiDisponibili descrivendo l'elaborazione dei dati in profondità 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 e la determinazione della struttura è al di là del campo di applicazione di questo protocollo.

  1. Seleziona il cristallo con la migliore risoluzione di diffrazione e la qualità come riferimento.
  2. Processare singolarmente ogni cristallo utilizzando pacchetti standard di cristallografia come HKL-2000 31 , Mosflm 32 o XDS 33 . Per garantire che il danneggiamento delle radiazioni non deteriori la qualità del set di dati, selezionare con cura l'ultima immagine con un danno di radiazioni accettabile. I criteri di taglio che indicano danni di radiazioni eccessivi sono specifici di ogni tipo di cristallo, pratica di elaborazione e lo scopo dell'esperimento. Per la fasi dei cristalli di polyhedrin BmCPV1, i dati sono stati scartati una volta che il segnale-a-nOise <I> / <σ (I)> per immagine scesa sotto 2 o il simbolo R super ha superato il 50% come riportato da HKL-2000 31 .
  3. Per ogni cristallo, definire il limite di risoluzione e il numero di fotogrammi e riprocessare con i parametri corretti per evitare l'integrazione dei dati con poco o nessun segnale.
  4. Scala e unisce dati dai migliori cristalli ai cristalli di riferimento usando pacchetti standard come Scalepack in HKL-2000 31 , SCALA in CCP4 34 , 35 o XSCALE in XDS 33 . Aggiungere i dati dai diversi cristalli progressivamente monitorando la qualità globale del set di dati, idealmente fino a quando il set di dati non raggiunge una completezza accettabile (> 95%). Rifiutare i cristalli che presentano un isomorfismo povero con il miglior cristallo di riferimento rilevato dalle differenze nei parametri delle cellule unità e dalla scarsa fusione / chi-square per immagine. Se troppi set di dati di buona qualitàNon scalare con i cristalli di riferimento, utilizzare un programma come BLEND 36 che trasporta clustering gerarchico per definire la migliore combinazione di set di dati da unire.
    Nota: in alcuni gruppi di spazio, è necessario testare le opzioni alternate di indicizzazione per adattarsi al cristallo di riferimento.
  5. Procedere alla fasi sperimentale, alla sostituzione o alla raffinazione molecolare utilizzando pacchetti di cristallografia standard.

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Representative Results

Viene presentata una panoramica di entrambi i metodi alternativi per la determinazione della struttura utilizzando microcristalli in vivo ( Figura 1 ). La polihedra può essere facilmente purificata mediante sonicazione e centrifugazione. A causa della loro densità, formano uno strato nella parte inferiore del tubo sotto uno strato di detriti che possono essere rimossi pipettando ( Figura 3a e 3b ). Il campione viene quindi sottoposto a diversi cicli di sonicazione e lavaggi fino a raggiungere un livello sufficiente di purezza come giudicato dall'aspetto bianco e gessoso del pellet ( Figura 3c ).

Per l'approccio in cellulo , il profilo di citometria di flusso di cellule non infette viene confrontato con il profilo di cellule contenenti cristalli e utilizzato per determinare quale popolazione cellulare deve essere selezionata per ordinare le cellule contenenti cristalli lontano daLe altre cellule ( Figura 4 ). In questo esempio, le celle contenenti poliedri hanno una dispersione laterale superiore rispetto alle cellule non infette. Altre differenze nei modelli di dispersione possono essere osservate per altri tipi di cristalli e il gating deve essere modificato di conseguenza.

I microcristalli purificati o le cellule contenenti cristalli vengono pipettate su un micromesh ( Figura 5 ). Le cellule colorate con blu di trypan possono essere facilmente visualizzate usando telecamere disponibili alla maggior parte delle linee di sincrotrone ( Figura 5b ), mentre i cristalli purificati sono laboriosi per identificare e allinearsi con il raggio a raggi X a causa della loro piccola dimensione ( Figura 5c ). Quando si raccolgono i dati, è meglio procedere in un modello di griglia al fine di ridurre al minimo le procedure di centraggio e per evitare di esporre due volte la stessa cella o cristallo, o mancanti ( Figura 5a ). Raccolta datiDevono essere trattati con attenzione per tenere conto delle differenze nei limiti di diffrazione, dell'effetto dei danni da radiazioni e di una possibile mancanza di isomorfismo.

Figura 1
Figura 1 : Panoramica di due metodi per la determinazione della struttura usando microcristalli in vivo . I microcristalli vengono prodotti in coltura cellulare mediante sovraespressione della proteina di interesse utilizzando un sistema di espressione ricombinante. In casi specifici, i microcristalli possono anche essere prodotti naturalmente dalle cellule in condizioni particolari. La fila superiore mostra l'approccio classico in cui le cellule sono lisate ei cristalli vengono purificati mediante centrifugazione differenziale. I microcristalli purificati vengono pipettati su un micromesh. Dopo la rimozione del liquido in eccesso, si aggiunge una soluzione di crioprotectant, si rimuove il liquido in eccesso e la maglia viene raffreddata a flash. Per raggi X dif Gli esperimenti di frazione, i cristalli sono accuratamente allineati con il raggio a raggi X, che può essere il passo di limitazione della velocità nella raccolta dei dati. La riga inferiore presenta l'approccio cellulare . Le cellule sono ordinate per citometria a flusso per selezionare specificamente le cellule contenenti cristalli. Le cellule sono macchiate con blu tripanico per facilitare la visualizzazione e diffondere su un micromesh. In questo caso, l'aggiunta di un crioprotectante è facoltativa. Per le esperienze di diffrazione dei raggi X, le cellule sono facilmente visualizzate usando tipiche telecamere disponibili nelle fasce di sincrotrone che facilitano il processo di centraggio.
Immagine di sistema automatico di cromatografia liquida a cura di GE Healthcare AB, Uppsala, Svezia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figura 2
= "Xfig"> Figura 2 : Esempi di microcristalli in vivo . Esempi selezionati di cristalli in vivo: ( a ) le cellule Sf9 con poliedra di cypovirus; ( B ) le cellule LD652 con sferoidi di entomopoxvirus; C ) Bacillus thuringiensis con cristalli Cry3A (freccia); ( D ) le cellule Sf9 con i cristalli Trypanosoma brucei cathepsin B; ( E ) le cellule Sf21 con cristalli calcineurin (frecce); ( F ) monoslocce COS7 con PKA: cristalli Inka1; ( G ) le cellule CHO con cristalli IgG. Riprodotto da 14 , 18 , 29 , 37 , 39 , 42 , con autorizzazione. Barra di scala = 10 μm. Clicca qui per vedere un largoEr di questa figura.

Tabella 1
Tabella 1: Sintesi dei cristalli in vivo cresciuti in cellule coltivate che esprimono la proteina ricombinante. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Questo protocollo fornisce due approcci per analizzare i microcristalli allo scopo di facilitare l'analisi di cristalli molto piccoli che sarebbero stati trascurati in passato.

Fasi critiche per la purificazione microcristallina
Il protocollo presentato è stato ottimizzato utilizzando il polyhedrin Bombyx mori CPV1 espresso in cellule Sf9 come sistema di modello. Tuttavia, i microcristalli in vivo presentano una grande variabilità nella resistenza meccanica. Ad esempio, i cristalli ago-cathepsina B coltivati ​​nelle cellule insettuali sono rigidi e altamente resistenti a sollecitazioni meccaniche e possono essere purificate usando un protocollo simile a quello descritto qui 14 . D'altra parte, i cristalli luciferasi a fiamma, anche coltivati ​​in cellule insettiche coltivate e con una simile morfologia ad ago, si dissolvono immediatamente sulla lisi cellulare 38 . Così, il protocollo di estrazione e purificazione di in vivoI cristalli dovranno essere adattati in una base di errori di prova per casi particolari come descritto nei passaggi 1.3, 2a.3-4, 2b.4, 3.1.3-4 e 3.2a.5.

Per i cristalli fragili, la separazione (parziale) dai detriti cellulari potrebbe essere ottenuta mediante centrifugazione a bassa velocità ( cioè 200 xg) o aggiunta di un cuscino di saccarosio nella parte inferiore del tubo invece di ripetuta sonicazione. Come regola generale, i campioni di cristalli preparati per la raccolta dei dati di diffrazione non hanno bisogno di essere altamente purificati. Pertanto, la purificazione rapida è preferibile per raffreddare i cristalli prima che possano decadere.

Applicazione a microcristalli in vitro e in vivo
Anche se entrambi i protocolli sono qui illustrati con l'analisi dei cristalli cresciuti in vivo , la metodologia può essere facilmente utilizzata per microcristalli coltivati ​​in vassoi di cristallo da proteine ​​ricombinanti purificate. In questoDovrebbero essere considerate le seguenti modifiche: i) il supporto della maglia può essere utilizzato per raccogliere i microcristalli direttamente dalla goccia di cristallizzazione piuttosto che trasferirli pipettando; Ii) poiché la quantità di cristalli può essere un fattore limitante, occorre prendere particolare attenzione quando si assorbe l'eccesso di liquido dal supporto della maglia per evitare l'eccessiva rimozione dei cristalli; Iii) devono essere testati diversi buffer di crioprotectant, come nella cristallografia convenzionale (vedi riferimento 30 ).

D'altra parte, per i cristalli in vivo , è fortemente raccomandato l'approccio cellulare . Poiché le cellule sono più facili da visualizzare e manipolate rispetto ai cristalli purificati, questo approccio è più efficiente in termini di utilizzo di tempo e più accessibile ai ricercatori con poca o nessuna esperienza in microcristallografia. È anche più adatto per cristalli fragili che possono essere influenzati dall'estrazione e pur Ificazione dalla cella dovuta a cambiamenti nell'ambiente chimico, diluizione delle proteine ​​circostanti e danni meccanici. Inoltre, le cellule offrono un ambiente protettivo ai cristalli, alleviando la necessità di aggiungere un crioprotettore. L'emissione del trattamento di crioconservazione è stata precedentemente dimostrata per prevenire l'accumulo di difetti e ha migliorato l'isomorfismo tra singoli cristalli, per la raccolta di dati a temperatura ambiente 40 . Il protocollo cellulare inoltra anche l'esigenza di incubazione in soluzione crioprotettori, consentendo comunque la raccolta dati a temperatura criogenica. Nel complesso, nella raccolta di dati di cellulo ha due vantaggi principali: 1) può produrre dati di migliore qualità e risoluzione più elevata per un determinato periodo di tempo di raggi 20 ; E 2) mantiene la proteina cristallizzata in un ambiente cellulare aumentando le possibilità di mantenere un ligando biologicamente rilevante.

Ontent "> Limitazioni della tecnica
Una complicazione intrinseca della microcristallografia seriale è l'importante numero di set di dati parziali generati durante la raccolta dei dati. Di conseguenza, l'elaborazione dei dati diventa un processo sempre più lungo. Tuttavia, il flusso di lavoro di base per l'elaborazione dei dati può essere ampiamente automatizzato. Ad esempio, la scelta ottimale dei cristalli isomorfi può essere determinata mediante l'analisi cluster gerarchica 28 , ad esempio realizzata in BLEND 36 . Inoltre, i programmi sviluppati per l'analisi dei laser a elettroni liberi a raggi X (XFEL) possono anche essere adattati per elaborare i dati di microcristallografia seriali raccolti sulle linee di travi 2 di sincrotrone e, in alcuni rivelatori automatici di reti di maglie e di rilevamento di cristalli sono state implementate notevolmente facilitando la Raccolta dati 2 , 41 .

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Disclosures

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Acknowledgments

Gli autori vorrebbero riconoscere Chan-Sien Lay per fornire immagini di microcristalli purificati, Daniel Eriksson e Tom Caradoc-Davies per il supporto alla linea MX2 del Synchrotron australiano e Kathryn Flanagan e Andrew Fryga della struttura FlowCore presso la Monash University per la loro Un'assistenza inestimabile.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sf9 cells Life Technologies
SF900-SFM insect medium Life Technologies
1 L cell culture flask Thermofisher Scientific
Shaking incubator for insect cell culture Eppendorf
50 mL conical tubes Falcon
Centrifuge with swing buckets for 50 mL tubes Eppendorf
Sonicator equiped with a 19 mm probe MSE Soniprep 150 
Glass slides Hampton Research
Hemacytometer Sigma-Aldrich
Propidium iodide Thermofisher Scientific
BD Influx cell sorter  BD Biosciences
Hampton Heavy atom screens Hampton Research
Microcentrifuge Eppendorf
Micromesh Mitigen 700/25 meshes offer a larger surface. Indexed meshes can be purchased for systematic studies.
Paper wick Mitigen The size of the paper wick can be varied for optimal flow. This will largely depend on the nature of the crystals and cryoprotectant used.
Ethylene glycol Sigma-Aldrich
Trypan blue Life Technologies
MX2 microfocus beamline Australian Synchrotron A list of available microfocus beamlines can be found in Boudes et al. (2014) Reflections on the Many Facets of Protein
Microcrystallography. Australian Journal of Chemistry 67 (12), 1793–1806,
doi:10.1071/CH14455.

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Microcristallografia dei cristalli proteici e<em&gt; In Cellulo</em&gt; Diffrazione
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Boudes, M., Garriga, D., Coulibaly, F. Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction. J. Vis. Exp. (125), e55793, doi:10.3791/55793 (2017).

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