Summary
Ett protokoll presenteras för röntgenkristallografi med användning av proteinmikrokristaller. Två exempel som analyserar in vivo- odlade mikrokristaller efter rening eller i cellulosa jämförs.
Abstract
Tillkomsten av högkvalitativa mikrofokusbalkar vid många synkrotronanläggningar har medfört en rutinanalys av kristaller mindre än 10 μm i sin största dimension, som brukade utgöra en utmaning. Vi presenterar två alternativa arbetsflöden för strukturbestämning av proteinmikrokristaller genom röntgenkristallografi med ett särskilt fokus på kristaller som odlas in vivo . Mikrokristallerna extraheras antingen från celler genom sonikering och renas genom differentiell centrifugering eller analyseras i cellulosa efter cellsortering genom flödescytometri hos kristallhaltiga celler. Eventuellt sugs renade kristaller eller kristallhaltiga celler i tunga atomlösningar för experimentell fasning. Dessa prover framställs sedan för diffraktionsexperiment på ett liknande sätt genom applicering på ett mikromesh-stöd och snabbkylning i flytande kväve. Vi beskriver kort och jämför seriediffraktionsexperiment av isolerade mikrokristaller och kristall-Innehållande celler med hjälp av en mikrofokussynkrotron-strållinje för att producera dataset lämpliga för fasning, modellbyggnad och förfining.
Dessa arbetsflöden exemplifieras med kristaller av Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) polyhedrin producerat genom infektion av insektsceller med ett rekombinant baculovirus. I denna fallstudie är cellanalys effektivare än analys av renade kristaller och ger en struktur i ~ 8 dagar från uttryck till förfining.
Introduction
Användningen av röntgenkristallografi för bestämning av högupplösningsstrukturer av biologiska makromolekyler har uppvisat en stadig progression under de senaste två decennierna. Den växande upptagningen av röntgenkristallografi av icke-expertforskare exemplifierar demokratisering av detta tillvägagångssätt inom många områden inom biovetenskap 1 .
Historiskt har kristaller med dimensioner under ~ 10 μm ansetts vara utmanande, om inte oanvändbara, för bestämning av strukturen. Den ökande tillgängligheten av dedikerade mikrofokusbalkar i synkrotronstrålningskällor över hela världen och tekniska framsteg, såsom utveckling av verktyg för att manipulera mikrokristaller, har avlägsnat mycket av dessa hinder som stymied den breda användningen av röntgenmikrokristallografi. Framsteg i seriell röntgenmikrokristallografi 2 , 3 och mikroelektrondiffraktion 4 haHar visat att användningen av mikro- och nanokristaller för strukturbestämning inte bara är möjlig men också ibland föredragen för användning av stora kristaller 5 , 6 , 7 .
Dessa framsteg användes först för studien av peptider 8 och naturliga kristaller framställda av insektsvirus 9 , 10 . De används nu för ett brett spektrum av biologiska makromolekyler, inklusive de svåraste systemen, såsom membranproteiner och stora komplex 11 . För att underlätta analysen av dessa mikrokristaller har de analyserats i meso , i synnerhet membranproteiner 12 och i mikrofluidikspån 13 .
Tillgängligheten av dessa nya mikrokristallografiska metoder har ökat möjligheten att använda iVivo-kristallisering som en ny väg för strukturell biologi 14 , 15 , 16 som erbjuder ett alternativ till klassisk in vitro kristallogenes. Olyckligtvis, även när in vivo kristaller kan produceras, förblir flera hinder såsom nedbrytning eller förlust av ligander under rening från celler, svårigheter vid manipulering och visualisering av kristallerna vid synkrotron-strållinjen och tråkiga röntgendiffraktionsexperiment. Som alternativa kristaller har också analyserats direkt i cellen utan något reningssteg 17 , 18 , 19 . En jämförande analys tyder på att sådana i cellulosaansatser kan vara effektivare än analysen av renade kristaller och ge data med högre upplösning 20 .
Detta protokoll finns iTenderade att hjälpa forskare som är nya för proteinmikrokristallografi. Det ger metoder som fokuserar på provberedning och manipulation för röntgendiffraktionsexperiment vid en synkrotron-strålningslinje. Två alternativ föreslås med användning av isolerade kristaller för klassisk mikrokristallografi eller kristallhaltiga celler sorterade genom flödescytometri för celluloidanalys ( Figur 1 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Anmärkning: In vivo har kristallisering rapporterats i många organismer, inklusive i bakterier, jäst, växter, insekter och däggdjur (ses i referens 21 ). Kristallisation av rekombinanta proteiner har också uppnåtts i laboratoriet med användning av transient transfektion av däggdjursceller och baculovirusinfektion av insektsceller. Följande protokoll har utvecklats med användning av Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) polyhedrengenen klonad i ett rekombinant baculovirus under baculoviruspolyhedrinpromotorn, alstrad enligt instruktionerna i referens 22 . Således, även om detta protokoll kan anpassas till andra celltyper (t ex däggdjursceller) beskriver vi här förfarandena för insektsceller. Protokollet antar att överuttryck av proteinet av intresse redan har uppnåtts. Metoder för framställning av ett rekombinant baculovirus och dess användning för expression av proteinet av intresse är avAilable i referenser 23 , 24 , 25 , 26 , 27 .
1. Identifiering av kristallhaltiga celler
- Om celler odlas i monolag, inspektera dem direkt i kolven. Om celler odlas i flytande odling, använd följande protokoll.
- Använd en steril serologisk pipett, överför 500 μl celler i ett mikrocentrifugrör. Var försiktig så att huvudkulturen steriliseras. Hantera cellerna i ett klass II biosäkerhetsskåp och följ standard aseptiska tekniker.
- Pipa 5 μL celler från mikrocentrifugröret på en glasskiva.
- Placera försiktigt ett glasöverdrag på vätskan och undvik bildandet av luftbubblor. Om objektglaset inte kan visualiseras inom 15 minuter, försegla täckglaset med vakuumfett för att undvika förångningation.
- Bild kolven eller glida med ett inverterat mikroskop. Om det är tillgängligt, använd faskontrast och / eller differentialinterferensmikroskopi (DIC). Båda teknikerna ökar kontrasten i transparenta prover och betonar linjer och kanter, vilket underlättar identifieringen av in vivo kristaller.
- Noggrant undersöka cellerna. Börja vid 200X förstoring och zooma in till maximal förstoring när du upptäcker en potentiell kristall. Närvaron av kristaller kan föreslås indirekt genom förändringar i cellmorfologin ( Figur 2 ). Leta efter skarpa kanter och förändringar i refraktivitet (om man använder faskontrast eller DIC). Kända in vivo kristaller adopterar olika former inklusive stavar, staplar av nålar, kuber, pyramider och polyeder (se figur 2 och tabell 1 för några exempel).
Obs: Andelen celler som innehåller kristaller kommer att vara olika i varje fall och kan äventyraN varierar mellan preparat men i allmänhet bör man inte förvänta sig att hitta kristaller i alla celler. På liknande sätt är antalet kristaller per cell också variabel (se tabell 1 ), och mer än en kristall kan hittas i en cell. Dessa faktorer måste optimeras om möjligt genom att justera multipliciteten av infektion, ändra längden av uttryck och variera proteinkonstruktionen. Å ena sidan kommer betingelserna för proteinuttryck och celltillväxt som maximerar antalet kristallhaltiga celler att förbättra produktiviteten ( t.ex. högre mångfald infektion och sen skörd av cellodling). Å andra sidan kan förhållanden där celler innehåller en enda kristall underlätta datainsamling ( t.ex. låg multiplicitet av infektion). Med tanke på berikningen av flödessortering som beskrivs i steg 2.2, rekommenderar vi att vi strävar efter större kristaller ( t.ex. en kristall per cell) även om andelen kristallhaltiga celler är låga. - Om kristallS identifieras, registrera sin position (vid bildbehandling av monoskikt i en kolv) och uppskatta andelen kristallhaltiga celler. Om det är tillgängligt, använd ett mikroskop utrustat med en kamera som kan spåra ändringar på en enda cellnivå.
- För celler i suspension, bestämma graden av cellleabilitet enligt protokollet som beskrivs i referens 28 . För celler odlade i ett monoskikt, uppskatta genom visuell inspektion den approximativa graden av sammanflöde och mängden avskiljda celler.
- Övervaka kristalltillväxten, celltillväxten och livskraften två gånger om dagen.
- Skörda cellerna så snart kristalltillväxt tycks stoppa. För anmärkningsvärt robusta kristaller som viral polyhedra, förlängda inkubationstider (> 4 dagar) ökar antalet stora kristaller. För typiska proteinkristaller rekommenderar vi dock att skörda celler när livskraften sjunker under 80% för att förhindra skador som orsakas av celllys.
- Ta bort kolven från inkubatorn och fortsätt tillSteg 2.2 så snart som möjligt. Håll cellerna på is under följande steg, om inte annat anges.
2. Provrening
Obs! Vi beskriver två analysmetoder för in vivo- kristallerna från renade kristaller respektive i cellulosa .
- Rening av kristaller
Obs! Om det inte finns bevis på att intressanta kristaller är känsliga för låg temperatur, arbeta på is och använd iskalla buffertar för att undvika kristallnedbrytning.- Pipa 50 ml infekterade Sf9-celler i ett 50 ml koniskt centrifugrör. Detta representerar ~ 4 x 10 8 celler i ett typiskt experiment.
- Pelletsceller vid 450 xg under 10 min vid 4 ° C.
- Kassera supernatanten och resuspendera pelleten i 40 ml kyld fosfatbuffrad saltlösning (PBS), pH 7,4.
Obs! PBS föreslås som utgångspunkt för rening som en standard isoton buffert med syftet med mimInte den cellulära miljön där in vivo kristaller växte. Det har använts för de flesta in vivo kristaller odlade i cellodling hittills 9 , 14 , 29 . Alternativt har DMEM-medier också framgångsrikt använts vid rening av kristaller in vivo från däggdjursceller 19 . Om kristaller synligt lider av överföring i PBS eller närvarande dålig diffraktion, bör denna parameter undersökas som en potentiell nedbrytningskälla. - Sonikera den resuspenderade pelleten under 30 s vid 10 mA med hjälp av en sonikator utrustad med en 19 mm sond. För att undvika att provet värms upp, placera det i en bägare fylld med is under sonicering. Kemisk eller mekanisk cellstörning kan användas som alternativ om kristaller verkar vara skadade genom sonikering som bedömts i steg 2.1.7.
- Centrifugera vid 450 xg i 10 min vid 4 ° C. Efter centrifugering är 2 skikt uppenbara:Ett övre lager av cellulärt skräp, vilket är blekbrunt och en lägre pellet av polyhedrinkristaller, som är vit och kralkig.
- Kassera supernatanten och ta bort det övre lagret genom försiktig pipettering. Resupendera den nedre pelleten i 40 ml kyld PBS.
- Bedöm proverens kvalitet genom bildbehandling med ett ljusmikroskop.
- Pipa 5 μL celler eller renade kristaller på en glasskiva. Detta kan göras vid rumstemperatur.
- Placera försiktigt ett glasöverdrag på vätskan och undvik bildandet av luftbubblor.
- Bild bilden med ett inverterat mikroskop vid 200X förstoring. Bild provet inom 15 minuter av dess förberedelse på bilden. Om sliden inte kan visualiseras inom 15 minuter, täta täckglaset med vakuumfett för att undvika förångning.
OBS: Vid polyeder kommer kristaller att visas som refringent kuber av ~ 1 - 10 μm per sida. Kontrollera kristallets integritet och leta efter tecken på förlust av skärpa( T.ex. runda kanter), sprickor eller upplösning. Övervaka även förekomsten av cellrester som kommer att uppstå som klumpar och föremål av oregelbunden storlek och form.
- Upprepa steg 2.1.5 till 2.1.7, halvera volymen PBS som används för att resuspendera pelleten vid varje cykel tills kristallerna är fria från skräp. Resuspendera den slutliga pelleten i 1 ml kyld PBS och överför kristallerna till ett mikrocentrifugrör. Förvara de renade kristallerna vid 4 ° C.
- Uppskatta koncentrationen av kristaller genom att använda en hemocytometer som beskrivits av tillverkaren. Räkna kristaller som om man räknar celler.
Figur 3 : Renade In Vivo Mikrokristaller. Representativ rening av kristaller från BmCPVl-polyhedrinet från Sf9-insektsceller som visar ( a ) pelleterad cellskräp och gråtStals efter sonication, och ( b ) närbild på skräp och kristallskikt. Skräpskikt kan resuspenderas omsorgsfullt i supernatanten och kasseras för snabbare kristallrening. ( C ) Optisk mikroskopi av renad polyeder. Skala bar = 50 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
- Isolering av kristallhaltiga celler genom flödescytometri
Obs! För att underlätta definitionen av grindar i flödescytometri rekommenderas att växa en kontrollkultur parallellt med den som uttrycker proteinet av intresse. Detta kan göras genom att infektera en kolv av Sf9-celler med ett icke relevant rekombinant baculovirus eller genom att bereda mock-infekterade celler. Sortering och avbildning av prover görs vanligtvis vid rumstemperatur.
VARNING: Propidiumjodid är ett misstänkt cancerogen och bör hanterasmed omsorg.- Pipet 4 ml infekterade Sf9-celler - representerar ~ 3 x 10 7 celler - i ett rör anpassat för flödescytometrianalys. Förbered också ett andra rör med ett ekvivalent antal Sf9-celler infekterade med ett icke rekombinant baculovirus.
- Tillsätt propidiumjodid (PI) till båda proverna vid en slutlig koncentration av 1 μg / ml precis före flödescytometrisk utvärdering. Detta steg är nödvändigt för att identifiera döda celler, cellklumpar och skräp som kan förändra eller maskera cellfördelningen på fram- och sidodistributionen. Förbered PI-lager av 1 mg / mL i vatten och förvara vid 4 ° C skyddad mot ljus.
- Applicera celler på en standardflödescytometer med förmåga att sortera cell enligt framåt- (FSC) och sidospridning (SSC). Analysera minst 20 000 händelser i kontrollen ( dvs icke-kristallhaltigt) prov. Efter bortskaffande av döda celler genererar cellklumpar och skräp från analysen FSC till SSC-plot.
- Analysera minst 20 000 jämnTs av det kristallhaltiga provet. Jämför FSC till SSC-plot med mock one. Leta efter utseendet av en distinkt population som motsvarar kristallhaltiga celler. Typiskt kommer celler med intracellulära kristaller att ha en högre SSC på grund av ökad morfologisk komplexitet. FSC kan också öka om kristalltillväxten orsakar en ökning av cellens volym. Definiera portarna för flödes sorteraren för att isolera cellpopulationer som motsvarar de områden av scatterplot som skiljer sig från det plottande diagrammet. Bild de sorterade proven genom ljusmikroskopi som beskrivet i steg 1 för att bekräfta vilken population som är associerad med kristallhaltiga celler.
- Använd de grindar som definieras i steg 2.2.4, sortera kristallhaltiga celler i PBS eller i någon annan isotonisk buffert. Notera antalet sorterade kristallinnehållna celler samt den slutliga volymen för att underlätta efterföljande steg. Förvara de sorterade cellerna på is eller vid 4 ° C.
Obs! På en timme,> 300.000 polyhedra-conBehållande celler sorteras på en cell sorterare med ett 100 mm munstycke (138 kPa med en frekvens på 39 kHz). Denna mängd celler är tillräcklig för att förbereda> 1 000 maskor. - Efter det protokoll som beskrivs i steg 2.1.7, bild cellerna med ett ljusmikroskop för att bekräfta anrikningen i kristallhaltiga celler. Provberedning för datainsamling bör ske så snart som möjligt efter cellsortering, eftersom kristaller kan nedbryta över tiden eller frigöras på grund av celllys.
Figur 4 : Cellsortering. Representativa flödescytometri scatter plots från ( a ) icke-infekterade celler (mock), vilka inte innehåller kristaller, och ( b ) Sf9-celler infekterade av ett rekombinant baculovirus överuttryckande för BmCPVl-polyhedrinet. Skillnader i spridningsmönstret mellan de två populationerna alSänkt gating av den kristallhaltiga cellpopulationen (röd grind, höga SSC-värden). Varje plot representerar 20.000 sorteringshändelser. SSC: sidljusspridning; FSC: framåtriktad ljusspridning. ( C ) Optisk mikroskopi av en representativ population av de sorterade cellerna, vilket visar närvaron av intracellulära kristaller. Skala = 50 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
3. Provberedning för datainsamling
Anm .: Om celler eller kristaller ska derivatiseras för experimentellt fasförebyggande protokoll som beskrivs i avsnitt 3.1. Annars går du direkt till avsnitt 3.2 för renade kristaller eller 3,3 för cellanalys .
- Derivatisering av renade eller i cellulosamikrokristaller
VARNING: Se alla relevanta säkerhetsdatablad (MSDS) före användning.De flesta kemikalier som används för experimentell fasning är akut giftiga. Använd alla lämpliga säkerhetsmetoder, inklusive användning av kemisk avloppsskydd och personlig skyddsutrustning. Kassera avfallsprodukter enligt din institutionspolicy.
Anmärkning: Typerna av tunga atomer, deras koncentration och inkubationstid ges på en vägledande grund för kristaller av BmCPV1 polyhedrin. Dessa parametrar måste bestämmas experimentellt för varje nytt mål. Efterföljande färgning med trypanblått i steg 3.3.2 kan utelämnas om celler lätt färgas av den kemiska förening som används för fasning.- Förbered mättade lösningar av önskade tunga atomer (eller lösningar av andra kemikalier som används för experimentell fasning). Typiskt krävs volymer lägre än 100 | il för varje tung atom. Ta bort oupplösta salter och skräp genom centrifugering med maximal hastighet i en mikrocentrifug i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Förbered alikvoter av ~ 50.000 kristallerEller sorterade celler per tung atomförening. Om PBS inte är kompatibel med kemikalien som används för derivatisering ( dvs fällningsformer och lösningen blir grumlig) pelletar kristallerna vid 4 000 xg i 3 minuter vid rumstemperatur i en mikrocentrifug, eller cellerna vid 150 xg i 3 min, tar bort Supernatanten och försiktigt resuspendera kristallerna eller cellerna i 20 pl av en lämplig buffert. Upprepa pelletering och resuspendering för att säkerställa att inga spår av PBS kvarstår. Justera slutvolymen till 20 μL för alla alikvoter.
- Tillsätt 20 μL tung atomlösning eller annan kemisk förening som valts till kristallerna eller cellerna. Den optimala koncentrationen av tunga atom kommer bero på en kombination av cellulära parametrar (permeabilitet, off-target proteiner ...) och naturen hos kristallen av proteinet av intresse. Som utgångspunkt, testa 3 olika koncentrationer: full mättnad, 1 / 10e, 1 / 100e.
- Håll proverna vid 4 ° C i upp till 3 dagar. Kristaller av polyhEdrin är mycket resistenta och täta och kräver långa soaker för att införliva de tunga atomer; För andra typer av kristaller bör inkubationsperioden och koncentrationen av tunga atomer bestämmas experimentellt. För korta inkubationstider tillåter inte inkorporering av lämpliga mängder av den tunga atomen, medan långa inkubationstider kan påverka kristallens integritet och därigenom sänka deras diffraktionskvalitet eller till och med lösa dem. Utgångspunkten, prova 3 olika inkubationstider för varje tung atomlösning (t ex 1 min, 1 h och över natten). Framgångsrik derivatisering utvärderas genom analys av diffraktionsdata som beskrivs kortfattat i avsnitt 5 och referenser däri.
- Tvätta bort överskottet av tung atomlösning genom pelletering av kristallerna vid 4 000 xg under 3 minuter vid rumstemperatur i en mikrocentrifug eller cellerna vid 150 xg under 3 min, avlägsnande av supernatanten och försiktigt resuspendering av kristallerna eller cellerna i 10 | il buffert .
- Baserat på kristallkoncentrationen beräknad i steg 2.1.9, justera koncentrationen till 10 7 kristaller / ml genom att späda provet; Eller genom pelletering av kristallerna vid 4 000 xg under 3 min vid rumstemperatur i en mikrocentrifug, justering av slutvolymen genom avlägsnande av supernatanten och försiktigt resuspendering av kristallerna.
- Om prov är avsedda att frysas i förväg, svalka av torrföraren eller dewar med flytande kväve. Förbered injektionsflaskorna eller puckarna, beroende på vad som är lämpligt, och kyla ner dem med flytande kväve.
- Resuspendera kristallpelleten och applicera en 0,5 μl droppe kristaller på en mikromesh genom pipettering. Använd 700 μm maskor med 25 μm kvadratHål som utgångspunkt. Maskens yta är inte kritiskt men ett större område ger mer kristaller per mask och leder till långsammare indunstning under framställning. Hålen kan behöva optimeras för att matcha storleken på kristaller större än 25 μm. Om det behövs för systematiska studier finns indexerade maskor tillgängliga för att underlätta en metodisk gridsökning vid datainsamling.
- Ta bort det mesta av överskottsvätskan genom att blotta med en pappersbit. Kristallerna ska fördelas jämnt på nätet, utan att röra varandra. Upprepa steg 3.1.1. För optimering av provkoncentrationen. Fortsätt snabbt och ta inte bort för mycket av vätskan. I frånvaro av kryoskyddande medel indunstar vätskan snabbt med risken för saltkristallbildning och / eller förlust av filmen.
- Lägg till kryoskyddsmedel: pipett 0,5 μL av en lösning av 50% etylenglykol i vatten på nätet (sammansättningen av cryobufferen ska anpassas till provet, förslag på optimering av cRyoprotectant finns i referens 30 ). Avlägsna överskottsvätskan genom att blotta med en pappersbit. I motsats till det föregående steget, bör den återstående filmen av lösningsmedel vara så tunn som möjligt för att minska parallaxeffekter som komplicerar processen för inriktning mellan kristallen, strålbanan och goniometern; Och för att minimera bakgrund som orsakas av spridning av röntgenstrålar med vätska i strålbanan.
- Omedelbart flash-kyla micromesh i flytande kväve och överföra till en flaska eller robotpuck, sedan till en torravlämnare eller dewar för förvaring.
- Framställning av mikromesh med kristallhaltiga celler
FÖRSIKTIGHET: Användning av flytande kväve är förknippat med faror som kvävning, förkylning, brand i syreberikad atmosfär och explosion. Vänligen kontakta din institutions riskhantering och säkra arbetssätt.- Överför de sorterade cellerna till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Baserat på cellen cOunter inspelade av cellsorteraren, justera koncentrationen till 10 7 celler / ml genom att späda provet med PBS; Eller genom pelletering av cellerna vid 150 xg i 3 min vid rumstemperatur i en mikrocentrifug, justering av slutvolymen genom avlägsnande av supernatanten och försiktigt resuspendering av cellerna.
- Blanda cellerna med en lika stor mängd trypanblå lösning (0,4% vikt / volym) till en slutlig koncentration av 0,2% vikt / volym.
- Om prov är avsedda att frysas i förväg, kyl av torravlämnaren eller dewar med flytande kväve. Förbered injektionsflaskorna eller puckarna, beroende på vad som är lämpligt, och kyl dem också med flytande kväve.
- Resuspendera cellerna och pipetten försiktigt 0,5 μL sorterade celler på en mikromesh.
- Avlägsna överskottsvätskan genom att blotta med en pappersbit. Cellerna ska sprida sig jämnt på nätet utan att röra varandra. Om man inte använder kryoskyddsmedel (steg 3.3.6), ska återstående film av lösningsmedel vara så tunn som möjligt för att minska parallaxeffekter som komplicerarE processen för inriktning mellan kristallen, strålbanan och goniometern; Och för att minimera bakgrund som orsakas av spridning av röntgenstrålar med vätska i strålbanan.
- Lägg eventuellt till kryoskyddsmedel till cellerna: pipett 0,5 | il 50% etylenglykol, 50% PBS-lösning på nätet. Kryobuffersammansättningen skall anpassas till provet; Förslag till optimering av kryoskyddsmedel finns i referens 30 . Avlägsna överskottsvätskan genom att blotta med en pappersbit och lämna endast en tunn film av lösningsmedel.
Anmärkning: Utelämnande av kryoprotektionsteget förändrade inte kvaliteten på röntgendiffraktion när kristaller av polyhedrinanalyserades i cellulosa , medan detta steg erfordras för renade kristaller 20 . Detta gäller endast inkubationen av cellerna med kryoskyddande lösning; Provet ska fortfarande analyseras vid 100K för att minimera effekterna av strålskador på kristallerna. - omedelFlash-coola mikromeshen i flytande kväve och överföra till en flaska eller robotpuck och sedan till en torravlämnare eller förvaringsdewar, beroende på vad som är lämpligt.
4. Datainsamling
Obs! Parametrar som används för datainsamling ges som en guide och bör optimeras för varje kristalltyp och synkrotronlinjelinje.
- Samla in data på en mikrofokus kristallografi strållinje (se referens 7 för en lista över mikrofokus strålkastare och deras egenskaper). Om tillgängligt, använd en kollimerad stråle som matchar kristallens storlek.
- För experimentell fasning med den enskilda våglängdsanomala dispersionsmetoden (SAD) samlas vid en energi som maximerar den anomala signalen hos den tunga atomen som är vald. För fasning med Multiple Isomorphic Replacement-metoden (MIR) samlar du över energin av en lämplig absorptionskant för den tunga atomen du väljer (tillgänglig på http://skuld.bmsc.washington.edu/scatter / AS_periodic.html).
- Efter att du har laddat nätet på goniometern börjar du med att centrera micromeshen med strålbanan med hjälp av framsidan (konvex sida) och sidoriktningar. Sedan, med micromesh-framsidan, finjustera inriktningen genom att anpassa mitten av en viss horisontell lane i mikromeshen (till exempel börja med den centrala). Därefter samlar du data längs den här horisontella körfältet med endast mindre justeringar till justeringen. Om det är tillgängligt, använd centrering baserat på rastering vid lågdiodsröntgendiffraktion för finjustering av inriktningen (se lokal kontakt vid synkrotronbalklinjen).
Obs! Eftersom en begränsad mängd data kan samlas på mikrokristaller på grund av strålningsskador (vanligen 10 till 30 bilder med 1 ° oscillation), behöver teorin endast justeras med strålbanan för 10-30 °. Det är emellertid kritiskt att inriktningen är korrekt eftersom kristallen lätt kan missas av mikrobiten (vanligtvis kollimerad till en diametEr av ~ 10 μm eller mindre). - Samla diffraktionsdata tills diffraktion förloras på grund av strålningsskada. För kristaller av polyhedrin används exponeringstiden av 10 sekunder typiskt för en 1 ° oscillation för ett flöde av ungefär 3,6 x 10 11 foton / s vid 13 keV med en CCD-detektor (totaldos <30 MGy). Optimera dessa inställningar beroende på kristallens strålkarta och natur. I synnerhet rekommenderas låg dosering och fin skivning för pixelröntgendetektorer.
Obs! Om du använder cellulosstrategin kommer cellerna som är färgade med trypanblå att visas som blå prickar mot stödbakgrunden, vilket gör dem enklare att anpassa sig till strålen. Om den kollimerade mikrobommen har ungefär samma storlek som cellerna (~ 10 μm), kommer alla kristaller som finns i en cell att lysas samtidigt. För celler innehållande flera mikrokristaller leder detta till observation av multipeldiffraktionsmönster, vilket kan vara svårt att bearbeta. Men diFraktion från en av kristaller tenderar ofta att dominera diffraktionsmönstret och är företrädesvis indexerad under databehandling. För strålkastare med en röntgenstråle är det betydligt mindre att cellen, rastering vid mycket lågt röntgenflöde (> 95% dämpning) borde användas för att centrera på en enkelkristall före datainsamling. - Fortsätt till nästa kristall i körfält.
- När alla krypor av körfältet har testats, fortsätt till nästa körfält och upprepa inställningsförfarandet. Fortsätt tills tillräcklig data har samlats in eller alla kristaller har testats.
- Se till att de banor som har bearbetats tydligt identifieras så att kristaller inte missas eller skottas två gånger (om nödvändigt, rita en skiss). Typiskt blir trypanblått gult efter att cellen har bestrålats, vilket kan användas som en markör.
Figur 5 : Datasamlingsstrategi från prover på Micromesh Support. (A) Strategi för datainsamling per bana; Justering sker i början av varje lane (prickar) och data samlas in längs banan. ( B ) Närbild av en trypanblåfärgad kristallhaltig cell på ett nät, såsom ses på mikrokristallografin-strålskärmen. ( C ) Närbild av en renad polyeder på ett nät, vilket ses på mikrokristallografin-strålskärmen. Maskans kvadrater är 25 μm x 25 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
5. Dataprocessering
OBS! Här nämns endast korta steg för databehandling som är specifika för seriell mikrokristallografi, där data från flera kristaller slås samman. Många utmärkta artiklar ärTillgänglig som beskriver databehandling i djupet 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 och strukturbestämning ligger utanför ramen för detta protokoll.
- Välj kristallen med bästa diffraktionsupplösning och kvalitet som referens.
- Individuellt bearbeta varje kristall med användning av standardkristallografipaket, såsom HKL-2000 31 , Mosflm 32 eller XDS 33 . För att säkerställa att strålskador inte försämrar datasetets kvalitet, välj försiktigt den sista bilden med acceptabel strålskada. Klippkriterier som indikerar överdriven strålningsskada är specifika för varje kristalltyp, bearbetningspraxis och syftet med experimentet. För fasning av BmCPVl-polyhedrinkristallerna kasseras data när signal-till-nOise <I> / <σ (I)> per bild sjönk under 2 eller R sym överskred 50% enligt HKL-2000 31 .
- För varje kristall definierar du upplösningsgränsen och antalet ramar och bearbetar med de korrekta parametrarna för att undvika att integrera data med liten eller ingen signal.
- Skala och slå samman data från de bästa kristallerna till referenskristallen med hjälp av standardpaket som Scalepack i HKL-2000 31 , SCALA i CCP4 34 , 35 eller XSCALE i XDS 33 . Lägg data från de olika kristallerna gradvis under övervakning av datasetets globala kvalitet, helst tills datasetet når en acceptabel fullständighet (> 95%). Avvisa kristaller som uppvisar en dålig isomorfism med den bästa / referenskristalen som detekteras av skillnader i enhetscellparametrar och dålig R- sammanslagning / chi-kvadrat per bild. Om det är för många bra kvalitetsdatabladSkala inte med referenskristallen, använd ett program som BLEND 36 som bär hierarkisk kluster för att definiera den bästa kombinationen av dataset för att slå samman.
Obs! I vissa rymdgrupper måste alternativa indexeringsalternativ testas för att matcha referenskristalen. - Fortsätt till experimentell fasning, molekylär ersättning eller förfining med användning av standardkristallografipaket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En översikt över båda alternativa metoderna för strukturbestämning med användning av in vitro mikrokristaller presenteras ( Figur 1 ). Polyhedra kan lätt renas genom sonikering och centrifugering. På grund av densiteten bildar de ett skikt i botten av röret under ett skikt av skräp som kan avlägsnas genom pipettering ( Figur 3a och 3b ). Provet utsätts sedan för flera ringar av sonikering och tvättas tills en tillräcklig renhetsgrad uppnås som bedöms från den vita och kralkiga aspekten av pelleten ( Figur 3c ).
För cellulosametoden jämförs flödescytometriprofilen för icke-infekterade celler med profilen av kristallhaltiga celler och användes för att bestämma vilken cellpopulation som bör väljas för att sortera kristallhaltiga celler bort frånDe andra cellerna ( Figur 4 ). I detta exempel har celler innehållande polyederra en högre sidospridning än icke-infekterade celler. Andra skillnader i spridningsmönster kan observeras för andra kristalltyper och gating bör ändras i enlighet därmed.
Renade mikrokristaller eller kristallhaltiga celler pipetteras på en mikromesh ( figur 5 ). Celler färgade med trypanblå kan enkelt visualiseras med hjälp av kameror som är tillgängliga i synnerhet av synkrotronstrålkastare ( Figur 5b ), medan renade kristaller är mödosamma att identifiera och anpassa sig till röntgenstrålen på grund av sin lilla storlek ( Figur 5c ). När man samlar data är det bäst att fortsätta i ett rutmönster för att minimera centreringsprocedurerna och för att undvika att utsätta två gånger samma cell eller kristall eller sakna något ( Figur 5a ). DatainsamlingTed bör behandlas noggrant för att ta hänsyn till skillnader i diffraktionsgränser, effekten av strålningsskador och en eventuell brist på isomorfism.
Figur 1 : Översikt över två metoder för strukturbestämning med användning av in vivo mikrokristaller. Mikrokristaller produceras i cellodling genom överuttryck av proteinet av intresse med användning av ett rekombinant expressionssystem. I specifika fall kan mikrokristaller också framställas naturligt av cellerna under speciella förhållanden. Den övre raden visar det klassiska sättet där celler lyseras och kristaller renas genom differentiell centrifugering. Renade mikrokristaller pipetteras på en mikromesh. Efter avlägsnande av överskottsvätskan tillsättes en kryoprotektionslösning, överskottsvätska blottas igen och nätet flashkyldes. För röntgen dif Fraktionsexperiment, kristaller är noggrant inriktade mot röntgenstrålen, vilket kan vara hastighetsbegränsande steg i datainsamling. Den nedersta raden presenterar cellulosaansatsen . Cellerna sorteras genom flödescytometri för att specifikt välja kristallhaltiga celler. Celler färgas med trypanblått för att underlätta visualisering och sprida sig på en mikromesh. I detta fall är tillägget av en kryoskyddsmedel valfri. För röntgendiffraktionsexperiment kan celler lätt visualiseras med hjälp av typiska kameror som är tillgängliga vid synkrotron-strålningslinjer som underlättar centreringsprocessen.
Bild av automatiserat vätskekromatografi system med tillstånd av GE Healthcare AB, Uppsala, Sverige. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
= "Xfig"> Figur 2 : Exempel på mikrokristaller in vivo. Valda exempel på in vivo kristaller: ( a ) Sf9-celler med cypoviruspolyeder; ( B ) LD652-celler med entomopoxvirus sfäroider; ( C ) Bacillus thuringiensis med Cry3A-kristaller (pil); ( D ) Sf9-celler med Trypanosoma brucei cathepsin B-kristaller; ( E ) Sf21-celler med kalcineurinkristaller (pilar); ( F ) COS7-celler monolager med PKA: Inka1-kristaller; ( G ) CHO-celler med IgG-kristaller. Reproducerad från 14 , 18 , 29 , 37 , 39 , 42 , med tillstånd. Skala bar = 10 μm. Vänligen klicka här för att se en storEr version av denna figur.
Tabell 1: Sammanfattning av in vivo kristaller odlade i odlade celler som uttrycker rekombinant protein. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll tillhandahåller två metoder för att analysera mikrokristaller i syfte att underlätta analysen av mycket små kristaller som skulle ha förbisetts tidigare.
Kritiska steg för mikrokristallrening
Det presenterade protokollet har optimerats med användning av Bombyx mori CPV1 polyhedrin uttryckt i Sf9-celler som ett modellsystem. In vivo mikrokristaller visar emellertid en stor variation i mekanisk resistans. Exempelvis är kathepsin B-nålliknande kristaller odlade i insektsceller styva och starkt resistenta mot mekanisk stress och kan renas med användning av ett protokoll som liknar det som beskrivs här 14 . Å andra sidan upplöses eldfjäderluciferaskristaller, som också odlas i odlade insektsceller och med en liknande nålliknande morfologi, omedelbart upplösning på celllys 38 . Således protokollet för extraktion och rening av in vivoKristaller kommer att behöva anpassas på provfel för specifika fall som beskrivs i steg 1.3, 2a.3-4, 2b.4, 3.1.3-4 och 3.2a.5.
För bräckliga kristaller kan partiell separation från cellrester uppnås genom centrifugering med låg hastighet ( dvs 200 xg) eller tillsats av en sackaroskudde vid botten av röret i stället för upprepad sonikering. Som en allmän regel behöver kristallprover som är beredda för diffraktionens insamlingsändamål inte behöva vara mycket renade. Således är snabb rening föredragen att kryokyla kristallerna innan de kan förfallna.
Applicering på in vitro och in vivo mikrokristaller
Fastän båda protokollen illustreras här med analysen av vuxna kristaller in vivo kan metoden lätt användas för mikrokristaller som odlas i kristallbrickor från renat rekombinant protein. I dennaS fall bör följande ändringar beaktas: i) nätstödet kan användas för att skörda mikrokristallerna direkt från kristalliseringsfallet istället för att överföra dem genom pipettering; Ii) eftersom mängden kristaller kan vara en begränsande faktor måste särskild vård behövas vid blottning av överskottet av vätska från nätbäraren för att undvika överdriven avlägsnande av kristaller; Iii) olika kryoprotektionsbuffertar måste testas, såsom gjord i konventionell kristallografi (se referens 30 ).
Å andra sidan, för in vivo- odlade kristaller, rekommenderas cellulosametoden starkt. Eftersom cellerna är enklare att visualisera och manipulera än renade kristaller, är detta tillvägagångssätt effektivare när det gäller användning av stråltid och mer tillgängligt för forskare med liten eller ingen erfarenhet av mikrokristallografi. Det är också mer lämpligt för bräckliga kristaller som kan påverkas av extraktionen och pur Ification från cellen på grund av förändringar i den kemiska miljön, utspädning av de omgivande proteinerna och mekanisk skada. Dessutom ger celler en skyddsmiljö till kristallerna, vilket lindrar behovet av tillsats av ett kryoskyddsmedel. Utelämnandet av kryoprotektionsbehandlingen har tidigare visats för att förhindra ackumulering av defekter och förbättrade isomorfismen mellan individuella kristaller, för datainsamling vid rumstemperatur 40 . Celloprotokollet överträffar också kravet på inkubation i kryoprotektionslösning, samtidigt som datainsamling vid kryogen temperatur tillåts. Sammantaget har cellulärdatainsamling två huvudsakliga fördelar: 1) det kan producera data av bättre kvalitet och högre upplösning under en given stråltidstakt 20 ; Och 2) det upprätthåller det kristalliserade proteinet i en cellulär miljö vilket ökar chanserna att behålla en biologiskt relevant ligand.
Ontent "> Begränsningar av teknikenEn inneboende komplikation av seriell mikrokristallografi är det viktiga antalet partiella dataset som genereras vid datainsamling. Följaktligen blir databehandling en allt mer tidskrävande process. Det grundläggande arbetsflödet för databehandling kan dock i stor utsträckning automatiseras. Exempelvis kan det optimala urvalet av isomorfa kristaller bestämmas genom hierarkisk klusteranalys 28 , exempelvis implementerad i BLEND 36 . Dessutom kan program som utvecklats för analys av röntgenfria elektronlasrar (XFEL) också anpassas för att bearbeta seriell mikrokristallografidata samlad på synkrotronstrålelinjer 2 och vid vissa strålknippar har automatiserad rastering av nät- och kristalldetektering genomförts avsevärt underlättande seriell Datainsamling 2 , 41 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Författarna skulle vilja bekräfta Chan-Sien Lay för att tillhandahålla bilder av renade mikrokristaller, Daniel Eriksson och Tom Caradoc-Davies för stöd vid Australiens synkrotron MX2-strålning, och Kathryn Flanagan och Andrew Fryga från FlowCore-anläggningen vid Monash University för deras Ovärderligt bistånd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sf9 cells | Life Technologies | ||
| SF900-SFM insect medium | Life Technologies | ||
| 1 L cell culture flask | Thermofisher Scientific | ||
| Shaking incubator for insect cell culture | Eppendorf | ||
| 50 mL conical tubes | Falcon | ||
| Centrifuge with swing buckets for 50 mL tubes | Eppendorf | ||
| Sonicator equiped with a 19 mm probe | MSE Soniprep 150 | ||
| Glass slides | Hampton Research | ||
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | ||
| Propidium iodide | Thermofisher Scientific | ||
| BD Influx cell sorter | BD Biosciences | ||
| Hampton Heavy atom screens | Hampton Research | ||
| Microcentrifuge | Eppendorf | ||
| Micromesh | Mitigen | 700/25 meshes offer a larger surface. Indexed meshes can be purchased for systematic studies. | |
| Paper wick | Mitigen | The size of the paper wick can be varied for optimal flow. This will largely depend on the nature of the crystals and cryoprotectant used. | |
| Ethylene glycol | Sigma-Aldrich | ||
| Trypan blue | Life Technologies | ||
| MX2 microfocus beamline | Australian Synchrotron | A list of available microfocus beamlines can be found in Boudes et al. (2014) Reflections on the Many Facets of Protein Microcrystallography. Australian Journal of Chemistry 67 (12), 1793–1806, doi:10.1071/CH14455. |
References
- Tari, L. W. The utility of structural biology in drug discovery. Methods Mol Bio (Clifton, N.J). 841, 1-27 (2012).
- Gati, C., et al. Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (2), 0(2014).
- Redecke, L., et al. Natively inhibited Trypanosoma brucei cathepsin B structure determined by using an X-ray laser. Science. 339 (2013), 227-230 (2013).
- Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals. eLife. 2 (0), e01345 (2013).
- Evans, G., Axford, D., Waterman, D., Owen, R. L. Macromolecular microcrystallography. Crystallog. Rev. 17 (2), 105-142 (2011).
- Smith, J. L., Fischetti, R. F., Yamamoto, M.
- Boudes, M., Garriga, D., Coulibaly, F. Reflections on the Many Facets of Protein Microcrystallography. Aust J Chem. 67 (12), 1793-1806 (2014).
- Nelson, R., et al. Structure of the cross-beta spine of amyloid-like fibrils. Nature. 435 (7043), 773-778 (2005).
- Coulibaly, F., et al. The molecular organization of cypovirus polyhedra. Nature. 446 (7131), 97-101 (2007).
- Coulibaly, F., et al. The atomic structure of baculovirus polyhedra reveals the independent emergence of infectious crystals in DNA and RNA viruses. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22205-22210 (2009).
- Johansson, L. C., et al. Structure of a photosynthetic reaction centre determined by serial femtosecond crystallography. Nat Comm. 4, (2013).
- Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography. J Vis Exp. (67), (2012).
- Roedig, P., et al. A micro-patterned silicon chip as sample holder for macromolecular crystallography experiments with minimal background scattering. Sci Rep. 5, 10451 (2015).
- Koopmann, R., et al. In vivo protein crystallization opens new routes in structural biology. Nature Methods. 9 (3), 259-262 (2012).
- Gallat, F. -X., et al. In vivo crystallography at X-ray free-electron lasers: the next generation of structural biology. Phil Trans R Soc B. 369 (1647), 20130497 (2014).
- Duszenko, M., et al. In vivo protein crystallization in combination with highly brilliant radiation sources offers novel opportunities for the structural analysis of post-translationally modified eukaryotic proteins. Acta Cryst. F. 71 (8), 929-937 (2015).
- Axford, D., Ji, X., Stuart, D. I., Sutton, G. In cellulo structure determination of a novel cypovirus polyhedrin. Acta Cryst D. 70 (5), 1435-1441 (2014).
- Sawaya, M. R., et al. Protein crystal structure obtained at 2.9 Å resolution from injecting bacterial cells into an X-ray free-electron laser beam. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (35), 12769-12774 (2014).
- Tsutsui, H., et al. A Diffraction-Quality Protein Crystal Processed as an Autophagic Cargo. Mol Cell. 58 (1), 186-193 (2015).
- Boudes, M., Garriga, D., Fryga, A., Caradoc-Davies, T., Coulibaly, F. A pipeline for structure determination of in vivo-grown crystals using in cellulo diffraction. Acta Cryst D. 72, 576-585 (2016).
- Doye, J. P. K., Poon, W. C. K. Protein crystallization in vivo. Curr Opin Colloid Interface Sci. 11 (1), 40-46 (2006).
- Mori, H., et al. Expression of Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus polyhedrin in insect cells by using a baculovirus expression vector, and its assembly into polyhedra. J Gen Virol. 74, Pt 1 99-102 (1993).
- Arevalo, M. T., Wong, T. M., Ross, T. M. Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination. J Vis Exp. (112), (2016).
- Yates, L. A., Gilbert, R. J. C. Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies. J Vis Exp. (85), (2014).
- Berger, I., et al. The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL. J Vis Exp. (77), (2013).
- Margine, I., Palese, P., Krammer, F. Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System. J Vis Exp. (81), (2013).
- Khurana, A., Kronenberg, M. A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells. J Vis Exp. (10), (2007).
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J Vis Exp. (16), (2008).
- Baskaran, Y., et al. An in cellulo-derived structure of PAK4 in complex with its inhibitor Inka1. Nat Comm. 6, 1-11 (2015).
- Armour, B. L., et al. Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit. J Vis Exp. (76), (2013).
- Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods Enzymol. 276, 307-326 (1997).
- Battye, T. G. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. W. iMOSFLM: a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM. Acta Cryst D. 67, Pt 4 271-281 (2011).
- Kabsch, W.
- French, S., Wilson, K. On the treatment of negative intensity observations. Acta Cryst.A. 34, 517-525 (1978).
- Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Cryst D. 67, Pt 4 235-242 (2011).
- Foadi, J., et al. Clustering procedures for the optimal selection of data sets from multiple crystals in macromolecular crystallography. Acta Cryst D. 69 (8), 1617-1632 (2013).
- Rey, F. A. Virology: holed up in a natural crystal. Nature. 446 (7131), 35-37 (2007).
- Schönherr, R., et al. Real-time investigation of dynamic protein crystallization in living cells. Struct Dyn. 2 (4), 041712 (2015).
- Hasegawa, H., et al. In vivo crystallization of human IgG in the endoplasmic reticulum of engineered Chinese hamster ovary (CHO) cells. J Biol Chem. 286 (22), 19917-19931 (2011).
- Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography. J Vis Exp. (115), e54463 (2016).
- Zander, U., et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Cryst. D. 71, 2328-2343 (2015).
- Fan, G. Y., et al. In vivo calcineurin crystals formed using the baculovirus expression system. Micros Res Tech. 34 (1), 77-86 (1996).
- Nass, K. Investigation of protein structure determination using X-ray free-electron lasers. , Hamburg University. PhD dissertation (2013).
