الجريزوفولفوغرافيا من بلورات البروتين و Published: July 21, 2017 doi: 10.3791/55793

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Marion Boudes*¹, Damià Garriga*¹, Fasséli Coulibaly¹

¹Infection and Immunity Program, Monash Biomedicine Discovery Institute, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Monash University

* These authors contributed equally

Summary

يتم تقديم بروتوكول لعلم البلورات بالأشعة السينية باستخدام الجريزوفريستالز البروتين. يتم مقارنة مثالين تحليل في الجريزوفريستالز الجسم الحي -grown بعد تنقية أو في السليلو .

Abstract

وقد أتاح ظهور خطوط ميكروفوكوس عالية الجودة في العديد من مرافق السنكروترون التحليل الروتيني للبلورات أصغر من 10 ميكرون في أكبر بعد لها، والتي كانت تمثل تحديا. نقدم اثنين من سير العمل البديلة لتحديد هيكل البروتينات الكريستالات بواسطة البلورات بالأشعة السينية مع التركيز بشكل خاص على بلورات نمت في الجسم الحي . يتم استخراج الجريزوفولفات إما من الخلايا عن طريق سونيكاتيون وتنقيته بواسطة الطرد المركزي التفاضلي، أو تحليلها في السليلو بعد فرز الخلايا عن طريق التدفق الخلوي للخلايا التي تحتوي على الكريستال. اختياريا، بلورات نقية أو الخلايا المحتوية على الكريستال غارقة في حلول ذرة ثقيلة للمرحلة التجريبية. ثم يتم إعداد هذه العينات لتجربة الانعراج بطريقة مماثلة من خلال تطبيق على دعم ميكروميش والتبريد فلاش في النيتروجين السائل. نحن تصف بإيجاز ومقارنة التجارب حيود المسلسل من البلورات الصغيرة معزولة والكريستال،التي تحتوي على خلايا باستخدام شعاع ميكروفوكوس سينكروترون لانتاج مجموعات البيانات مناسبة للمرحلة، وبناء نموذج والصقل.

وتتمثل هذه سير العمل مع بلورات من بومبيكس موري سيبوفيروس 1 (BmCPV1) بوليهدرين تنتجها عدوى الخلايا الحشرية مع فيروس باكولوف المؤتلف. في هذه الدراسة الحالة، في تحليل السليلو هو أكثر كفاءة من تحليل البلورات المنقى وتنتج بنية في ~ 8 أيام من التعبير إلى صقل.

Introduction

وقد شهد استخدام بلورات الأشعة السينية لتحديد هياكل عالية الدقة من الجزيئات البيولوجية تقدما مطردا على مدى العقدين الماضيين. إن الإقبال المتزايد على التصوير البلوري بالأشعة السينية من قبل الباحثين غير الخبراء يمثل نموذجا ديموقراطيا لهذا النهج في العديد من مجالات علوم الحياة ¹ .

تاريخيا، بلورات مع أبعاد أدناه ~ 10 ميكرون وقد اعتبرت صعبة، إن لم يكن غير صالحة للاستعمال، لتحديد هيكل. وقد أدى ازدياد توافر مصادر الإشعاع السنكروتروني المكروية المتناهية الصغر في جميع أنحاء العالم، والتقدم التكنولوجي، مثل تطوير الأدوات لمعالجة الجراثيم الصغيرة، إلى إزالة الكثير من هذه الحواجز التي أعاقت الاستخدام الواسع النطاق للجرافيك البلوري بالأشعة السينية. التقدم في المسلسل الأشعة السينية ميكروفولستالوريوغرافي ^{2 ، 3} والحيود الإلكترون الجزئي ⁴ هكتارتبين أن استخدام البلورات الصغرى والبلورات النانوية لتحديد الهيكل ليس ممكنا فحسب بل أيضا يفضل أحيانا استخدام بلورات كبيرة ^{5 و 6 و 7} .

وقد تم تطبيق هذه التطورات لأول مرة لدراسة الببتيدات ⁸ والبلورات الطبيعية التي تنتجها فيروسات الحشرات ^{9 ، 10} . وهي تستخدم الآن لمجموعة متنوعة من الجزيئات البيولوجية بما في ذلك النظم الأكثر صعوبة مثل البروتينات الغشاء والمجمعات الكبيرة ¹¹ . لتسهيل تحليل هذه البلورات الصغيرة، وقد تم تحليلها في ميسو ، وخاصة البروتينات الغشاء ¹² وفي رقائق ميكروفلويديكش ¹³ .

توافر هذه المنهجيات الجريزوفولفوغرافيا الجديدة أثارت إمكانية استخدام فيفيفو تبلور كطريق جديد لبيولوجيا الهيكلية ^{14 ، 15 ، 16} تقدم بديلا عن البلورية الكلاسيكية في المختبر البلورية. لسوء الحظ، حتى عندما تكون في بلورات الجسم الحي يمكن أن تنتج، لا تزال هناك العديد من العقبات مثل تدهور أو فقدان بروابط خلال التنقية من الخلايا، وصعوبة في التلاعب والتصور من بلورات في خط شعاعي السنكروترون والتجارب حيود الأشعة السينية مملة. كما تم تحليل بلورات بديلة مباشرة داخل الخلية دون أي خطوة تنقية ^{17 ، 18 ، 19} . ويشير تحليل مقارن إلى أن مثل هذه المقاربات في السليلو قد تكون أكثر كفاءة من تحليل البلورات المنقاة وبيانات الغلة ذات الدقة العالية ²⁰ .

هذا البروتوكول فيتميل إلى مساعدة الباحثين الجدد على الجريزوفولفوغرافيا البروتين. ويوفر المنهجيات التي تركز على إعداد العينات والتلاعب للتجارب حيود الأشعة السينية في شعاع السنكروترون. ويقترح خياران باستخدام بلورات معزولة عن الجريزوفولفوغرافيا الكلاسيكية أو الخلايا المحتوية على الكريستال مرتبة حسب التدفق الخلوي لفي تحليل السليلو ( الشكل 1 ).

Protocol

ملاحظة: في التبلور الجسم الحي وقد ذكرت في العديد من الكائنات الحية بما في ذلك البكتيريا والخميرة والنباتات والحشرات والثدييات (استعرض في المرجع ²¹ ). كما تم تحقيق تبلور البروتينات المؤتلف في المختبر باستخدام ترنسفكأيشن عابرة من خلايا الثدييات وعدوى باكولوفيروس من خلايا الحشرات. وقد تم تطوير البروتوكول التالي باستخدام بومبيكس موري سيبوفيروس 1 (BmCPV1) بولهيدرين الجينات المستنسخة في فيروس باكولوف المؤتلف تحت المروج بولهيدرين باكولوفيرين، ولدت وفقا للتعليمات في المرجع ²² . وهكذا، على الرغم من أن هذا البروتوكول قد تتكيف مع أنواع الخلايا الأخرى (على سبيل المثال خلايا الثدييات)، ونحن تصف هنا إجراءات لخلايا الحشرات. ويفترض البروتوكول أن الإفراط في التعبير عن البروتين من الفائدة قد تحقق بالفعل. طرق لإنتاج بكولوفيروس المؤتلف واستخدامه للتعبير عن البروتين من الفائدة هي أفأيلابل إن ريفيرنسس ^{23 ، 24 ، 25 ، 26 ، 27} .

1. تحديد الخلايا التي تحتوي على كريستال

1. إذا زرع الخلايا في أحادي الطبقة، تفتيشها مباشرة في قارورة. إذا كانت الخلايا تزرع في ثقافة سائلة، استخدم البروتوكول التالي.
   1. باستخدام ماصة المصلية العقيمة، ونقل 500 ميكرولتر من الخلايا في أنبوب ميكروسنتريفوج. الحرص على الحفاظ على عقم الثقافة الرئيسية. والتعامل مع الخلايا في مجلس الوزراء الفئة الثانية للسلامة الأحيائية واتبع تقنيات العقيم القياسية.
   2. الماصة 5 ميكرولتر من الخلايا من أنبوب ميكروسنتريفوج على شريحة زجاجية.
   3. وضع بعناية ساترة الزجاج على السائل، وتجنب تشكيل فقاعات الهواء. إذا الشريحة لا يمكن تصور خلال 15 دقيقة، ختم ساترة مع فراغ الشحوم لتجنب التبخرأوجه.
2. صورة القارورة أو الشريحة مع المجهر مقلوب. إذا كان متوفرا، استخدام النقيض من المرحلة و / أو التفاضلية تدخل المجهر النقيض (ديك). كلا التقنيات تعزز التباين في عينات شفافة والتأكيد على خطوط وحواف، مما يسهل تحديد في بلورات الجسم الحي .
3. فحص بعناية الخلايا. تبدأ في التكبير 200X والتكبير في التكبير القصوى عند الكشف عن الكريستال المحتملين. وجود بلورات يمكن أن يقترح بشكل غير مباشر من خلال التغيرات في التشكل الخلية ( الشكل 2 ). البحث عن حواف حادة والتغيرات في الانكسارية (إذا كان استخدام المرحلة النقيض أو ديك). المعروف في بلورات الجسم الحي تتبنى أشكال مختلفة بما في ذلك قضبان، مداخن من الإبر، مكعبات، الأهرامات و بوليهيدرا (انظر الشكل 2 والجدول 1 لبعض الأمثلة).
   ملاحظة: نسبة الخلايا التي تحتوي على بلورات ستكون مختلفة في كل حالة ويمكن حواءن تختلف بين الاستعدادات ولكن بشكل عام لا ينبغي للمرء أن يتوقع أن تجد بلورات في جميع الخلايا. وبالمثل، فإن عدد البلورات في الخلية هو أيضا متغير (انظر الجدول 1 )، ويمكن العثور على أكثر من بلورة واحدة في خلية واحدة. هذه العوامل تحتاج إلى أن يكون الأمثل حيثما كان ذلك ممكنا من خلال تعديل تعدد العدوى، وتغيير طول التعبير وتفاوت بناء البروتين. من ناحية، فإن ظروف التعبير البروتين والنمو الخلية التي تعظيم عدد الخلايا التي تحتوي على الكريستال وتحسين الإنتاجية (على سبيل المثال ارتفاع تعدد العدوى والحصاد في وقت متأخر من زراعة الخلايا). من ناحية أخرى، فإن الظروف التي تحتوي فيها الخلايا على بلورة واحدة تسهل جمع البيانات (على سبيل المثال انخفاض تعدد العدوى). وبالنظر إلى الإثراء الناتج عن الفرز تدفق وصفها في الخطوة 2.2، ونحن نوصي تهدف لبلورات أكبر (على سبيل المثال وضوح الشمس واحد لكل خلية) حتى لو كانت نسبة الخلايا المحتوية على الكريستال منخفضة.
4. إذا الكريستاليتم تحديدها، وتسجيل موقفها (عند التصوير أحادي الطبقة في قارورة)، وتقدير النسبة المئوية للخلايا المحتوية على الكريستال. إذا كان متوفرا، استخدم المجهر مجهزة كاميرا قادرة على تتبع التغييرات على مستوى خلية واحدة.
5. للخلايا في تعليق، وتحديد درجة بقاء الخلية بعد بروتوكول مفصلة في المرجع ²⁸ . للخلايا المستزرعة في أحادي الطبقة، وتقدير من قبل الفحص البصري درجة تقريبية من التقاء وكمية من الخلايا المنفصلة.
6. رصد نمو الكريستال، نمو الخلايا وقابليتها مرتين في اليوم.
7. حصاد الخلايا حالما يبدو نمو الكريستال لوقف. لبلورات قوية بشكل ملحوظ مثل بوليهيدرا الفيروسية، مرات حضانة طويلة (> 4 أيام) زيادة عدد بلورات كبيرة. ومع ذلك، لبلورات البروتين نموذجية، نوصي لحصاد الخلايا عندما تنخفض قابليتها أقل من 80٪ لمنع الضرر الناجم عن تحلل الخلية.
8. إزالة القارورة من الحاضنة والمضي قدماالخطوة 2.2 في أقرب وقت ممكن. الحفاظ على الخلايا على الجليد خلال الخطوات التالية، ما لم يحدد خلاف ذلك.

2. عينة تنقية

ملاحظة: نحن تصف طريقتين لتحليل بلورات في الجسم الحي من بلورات تنقية وفي سيلولو ، على التوالي.

1. تنقية البلورات
   ملاحظة: ما لم يكن هناك دليل على أن بلورات الفائدة حساسة لدرجات الحرارة المنخفضة، والعمل على الجليد واستخدام المخازن المؤقتة الباردة الجليد لتجنب تدهور الكريستال.
   1. الماصة 50 مل من الخلايا المصابة Sf9 في 50 مل أنبوب الطرد المركزي المخروطية. ويمثل هذا ~ 4 × 10 ⁸ خلايا في تجربة نموذجية.
   2. خلايا بيليه في 450 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
   3. تجاهل طاف و ريسوسبيند بيليه في 40 مل من المبردة الفوسفات مخزنة المالحة (بس)، ودرجة الحموضة 7.4.
      ملاحظة: يقترح برنامج تلفزيوني كنقطة انطلاق لتنقية باعتبارها عازلة متساوي التوتر القياسية بهدف ميمإكينغ البيئة الخلوية حيث نمت بلورات في الجسم الحي. وقد تم استخدامه لمعظم في بلورات الجسم الحي نمت في زراعة الخلايا حتى الآن ^{9 ، 14 ، 29} . بدلا من ذلك، كما تم استخدام وسائل الإعلام دمم بنجاح في تنقية بلورات الجسم الحي من خلايا الثدييات ¹⁹ . إذا كانت البلورات تعاني بشكل واضح من نقلها في برنامج تلفزيوني أو الانعراج ضعيفة الحالية، وينبغي التحقيق هذه المعلمة كمصدر محتمل للتدهور.
   4. يصوتن بيليه معلق لمدة 30 ثانية في 10 مللي أمبير باستخدام سونيكاتور مجهزة التحقيق 19 ملم. لتجنب تسخين العينة، وضعه في كوب مليئة الجليد بينما سونيكاتينغ. يمكن استخدام خلل الخلايا الكيميائية أو الميكانيكية كبدائل إذا كانت البلورات تبدو معطوبة بسبب صوتنة كما تم تقييمها في الخطوة 2.1.7.
   5. أجهزة الطرد المركزي في 450 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. بعد الطرد المركزي، 2 طبقات واضحة:الطبقة العليا من الحطام الخلوي، وهو البني شاحب، وبيليه أقل من بلورات ثنائي الهيدرين، وهو الأبيض والطباشيري.
   6. تجاهل طاف وإزالة الطبقة العليا بواسطة بيبتينغ الحذر. إعادة بيليه أقل في 40 مل من برنامج تلفزيوني مبردة.
   7. تقييم نوعية العينات عن طريق التصوير مع المجهر الضوئي.
      1. الماصة 5 ميكرولتر من الخلايا أو البلورات المنقى على شريحة زجاجية. ويمكن القيام بذلك في درجة حرارة الغرفة.
      2. وضع بعناية ساترة الزجاج على السائل، وتجنب تشكيل فقاعات الهواء.
      3. صورة الشريحة مع المجهر مقلوب في 200X التكبير. صورة العينة في غضون 15 دقيقة من إعداده على الشريحة. إذا كانت الشريحة لا يمكن تصور خلال 15 دقيقة، ختم ساترة مع فراغ الشحوم لتجنب التبخر.
         ملاحظة: في حالة متعدد الأوجه، سوف تظهر بلورات كما مكعبات مانع من ~ 1 - 10 ميكرون لكل جانب. تحقق من سلامة البلورات تبحث عن علامات فقدان الحدة(على سبيل المثال حواف مستديرة)، والشقوق أو حل. أيضا مراقبة وجود الحطام الخلية التي سوف تظهر كتل وأشياء من حجم وشكل غير منتظم.
   8. كرر الخطوات من 2.1.5 إلى 2.1.7، وخفض حجم برنامج تلفزيوني المستخدمة ل ريسوسبيند بيليه في كل دورة حتى تظهر بلورات خالية من الحطام. ريسوسبيند بيليه النهائي في 1 مل من برنامج تلفزيوني المبرد ونقل البلورات إلى أنبوب ميكروسنتريفوج. تخزين البلورات المنقى في 4 درجات مئوية.
   9. تقدير تركيز بلورات باستخدام عدادة الكريات كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة. عد بلورات كما لو عد الخلايا.

الشكل 3 : تنقيته في البلورات الصغيرة فيفو . تنقية ممثل بلورات من بوليميدرين BmCPV1 من الخلايا الحشرية Sf9 تبين ( أ ) الحطام الخلية مكعبات والبكاءستالس بعد سونيكاتيون، و ( ب ) عن قرب على الحطام وطبقات الكريستال. طبقة الحطام يمكن معلق بعناية في طاف وتجاهل لتنقية الكريستال أسرع. ( ج ) صورة المجهر الضوئي من متعدد الأوجه النقي. شريط مقياس = 50 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. عزل الخلايا التي تحتوي على الكريستال عن طريق التدفق الخلوي
   ملاحظة: لتسهيل تعريف البوابات في التدفق الخلوي، فمن المستحسن أن تنمو ثقافة السيطرة بالتوازي مع واحد معربا عن البروتين من الفائدة. ويمكن أن يتم ذلك عن طريق إصابة قارورة من الخلايا Sf9 مع فيروس باكولوف المؤتلف غير ذات الصلة، أو عن طريق إعداد الخلايا المصابة وهمية. الفرز والتصوير من العينات وعادة ما يتم في درجة حرارة الغرفة.
   تنبيه: يوديد بروبيديوم هو مادة مسرطنة مشتبه بها ويجب التعامل معهاباهتمام.
   1. الماصة 4 مل من الخلايا المصابة Sf9 - تمثل ~ 3 × 10 ⁷ خلايا - في أنبوب تكييفها لتحليل التدفق الخلوي. أيضا، إعداد أنبوب الثاني مع عدد مماثل من الخلايا Sf9 مصابة بفيروس باكولوف غير المؤتلف.
   2. إضافة يوديد بروبيديوم (بي) لكلا العينات في تركيز النهائي من 1 ميكروغرام / مل فقط قبل تقييم سايتوميتريك التدفق. هذه الخطوة ضرورية لتحديد الخلايا الميتة، كتل الخلايا والحطام التي قد تغير أو تخفي توزيع الخلايا على المؤامرة الأمامية والانتثار الجانبي. إعداد مخزونات بي من 1 ملغ / مل في الماء وتخزينها في 4 درجات مئوية محمية من الضوء.
   3. تطبيق الخلايا إلى مقياس التدفق الخلوي القياسية قادرة على الفرز الخلية وفقا ل الأمام (فسك) ونثر جانبي (سك). تحليل ما لا يقل عن 20،000 الأحداث من السيطرة ( أي غير الكريستال تحتوي على) عينة. بعد التخلص من الخلايا الميتة، كتل الخلايا والحطام من التحليل، وتوليد فسك إلى مؤامرة سك.
   4. تحليل ما لا يقل عن 20،000 حتىتيسي من العينة التي تحتوي على الكريستال. قارن فسك إلى مؤامرة سك مع وهمية واحدة. ابحث عن مظهر السكان المتماثلين المقابلة للخلايا المحتوية على الكريستال. عادة، الخلايا مع بلورات داخل الخلايا سوف يكون أعلى سك بسبب زيادة في التعقيد المورفولوجية. و فسك قد يزيد أيضا إذا كان نمو الكريستال يسبب زيادة في حجم الخلية. تحديد بوابات فارز تدفق لعزل السكان الخلية المقابلة لمناطق مؤامرة مبعثر التي تختلف عن مؤامرة وهمية. صورة عينات فرزها من قبل المجهر الضوئي كما هو موضح في الخطوة 1 لتأكيد أي السكان يرتبط مع الخلايا التي تحتوي على الكريستال.
   5. باستخدام البوابات المحددة في الخطوة 2.2.4، فرز الخلايا التي تحتوي على الكريستال في برنامج تلفزيوني، أو في أي العازلة متساوي التوتر الأخرى. تسجيل عدد من الخلايا التي تحتوي على الكريستال فرزها فضلا عن الحجم النهائي لتسهيل الخطوات اللاحقة. تخزين الخلايا فرزها على الجليد أو في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: في ساعة،> 300،000 بوليهيدرا يخدعيتم فرز الخلايا تاينينغ على فارز الخلية مع فوهة 100 ملم (138 كيلو باسكال مع تردد 39 كيلو هرتز). هذا المبلغ من الخلايا يكفي لإعداد> 1000 تنسجم.
   6. بعد بروتوكول مفصل في الخطوة 2.1.7، صورة الخلايا مع المجهر الضوئي لتأكيد الإثراء في الخلايا التي تحتوي على الكريستال. وينبغي أن يتم إعداد عينة لجمع البيانات في أقرب وقت ممكن بعد الفرز الخلية منذ بلورات قد تتحلل مع مرور الوقت أو أن يطلق سراحه بسبب تحلل الخلية.

الشكل 4 : فرز الخلايا. تمثيلية تدفق الخلوي مؤامرات مبعثر من ( أ ) الخلايا غير المصابة (وهمية)، والتي لا تحتوي على بلورات، و ( ب ) خلايا Sf9 المصابة بفيروس باكولوف المؤتلف الإفراط في التعبير عن بوليميدرين BmCPV1. الاختلافات في نمط الانتثار بين المجموعتين آلوانخفاض الانبساط من السكان الخلية التي تحتوي على الكريستال (البوابة الحمراء، وارتفاع قيم سك). كل مؤامرة يمثل 20،000 الأحداث الفرز. سك: الجانب ضوء تشتت. فسك: تشتت الضوء إلى الأمام. ( ج ) صورة المجهر الضوئي من السكان ممثل للخلايا فرزها، والتي تبين وجود بلورات داخل الخلايا. مقياس = 50 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. إعداد عينة لجمع البيانات

ملاحظة: إذا كانت الخلايا أو البلورات هي ديريفاتيزد التجريبية المرحلة التدريجي اتبع بروتوكول مفصل في القسم 3.1. خلاف ذلك، انتقل مباشرة إلى أقسام 3.2 للبلورات المنقى أو 3.3 لفي تحليل السليلو .

1. اشتقاق المنقى أو في البلورات الصغيرة السليلو
   تنبيه: استشر جميع صحائف بيانات سلامة المواد ذات الصلة (مسس) قبل الاستخدام.ومعظم المواد الكيميائية المستخدمة في المراحل التجريبية هي سمية حادة. استخدام جميع ممارسات السلامة المناسبة بما في ذلك استخدام غطاء الدخان الكيميائية ومعدات الوقاية الشخصية. التخلص من منتجات النفايات وفقا لسياسة مؤسستك.
   ملاحظة: يتم إعطاء طبيعة الذرات الثقيلة، وتركيزها وحضانة الوقت على أساس إرشادي لبلورات من بوليمهدرين BmCPV1. يجب تحديد هذه المعلمات تجريبيا لكل هدف جديد. تلطيخ اللاحقة مع الأزرق التريبان في الخطوة 3.3.2 يمكن حذفها إذا كانت الخلايا الملونة بسهولة من قبل مركب كيميائي يستخدم للمرحلة.
   1. إعداد حلول مشبعة من الذرات الثقيلة المطلوبة (أو حلول المواد الكيميائية الأخرى المستخدمة في مراحل التجريبية). عادة، وحدات التخزين أقل من 100 ميكرولتر ستكون مطلوبة لكل ذرة ثقيلة. إزالة الأملاح غير منحل والحطام بواسطة الطرد المركزي في أقصى سرعة في ميكروسنتريفوج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   2. إعداد أليكوتس من ~ 50،000 بلوراتأو فرز الخلايا في مجمع الذرة الثقيلة. إذا كان برنامج تلفزيوني غير متوافق مع المواد الكيميائية المستخدمة في ديريفاتيزاتيون ( أي أشكال راسب ويصبح حل غائم)، بيليه بلورات في 4000 x ج لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة في ميكروسنتريفوج، أو الخلايا في 150 x ج لمدة 3 دقائق، وإزالة طاف و ريسوسبيند بلطف بلورات أو خلايا في 20 ميكرولتر من العازلة مناسبة. كرر التكوير وإعادة تعليق لضمان عدم وجود أي آثار لبرنامج تلفزيوني. ضبط الحجم النهائي إلى 20 ميكرولتر لجميع أليكوتس.
   3. إضافة 20 ميكرولتر من محلول الذرة الثقيلة أو مركب كيميائي آخر من اختيار للبلورات أو الخلايا. التركيز الأمثل للذرة الثقيلة تعتمد على مزيج من المعلمات الخلوية (نفاذية، البروتينات خارج الهدف ...) وطبيعة الكريستال من البروتين من الفائدة. كنقطة انطلاق، اختبار 3 تركيزات مختلفة: التشبع الكامل، 1 / ​​10e، 1 / ​​100e.
   4. إبقاء العينات في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أيام. بلورات بوليهإدرين هي مقاومة جدا وكثيفة وتتطلب طويلة غارقة لدمج الذرات الثقيلة. بالنسبة لأنواع أخرى من البلورات ينبغي تحديد فترة الحضانة وتركيز الذرات الثقيلة تجريبيا. أوقات الحضانة قصيرة جدا لن تسمح بإدراج كميات مناسبة من الذرة الثقيلة، في حين أن أوقات الحضانة الطويلة يمكن أن تؤثر على سلامة البلورات، وبالتالي خفض جودة الحيود أو حتى حلها. كنقطة انطلاق، حاول 3 مرات حضانة مختلفة لكل حل الذرة الثقيلة (على سبيل المثال 1 دقيقة، 1 ساعة وبين عشية وضحاها) يتم تقييم المشتقات الناجحة من خلال تحليل بيانات الانعراج كما هو موضح بإيجاز في القسم 5 والمراجع فيه.
   5. يغسل الزائدة من محلول الذرة الثقيلة عن طريق التكوير البلورات في 4000 x ج لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة في ميكروسنتريفوج، أو الخلايا في 150 x ج لمدة 3 دقائق، وإزالة طاف وإعادة تعليق بلطف بلورات أو خلايا في 10 ميكرولتر من العازلة .
2. تنبيه: يرتبط استخدام النيتروجين السائل بمخاطر مثل الاختناق والحروق الباردة والحرائق في الجو المخصب بالأكسجين والانفجار. يرجى مراجعة إدارة المخاطر وممارسات العمل الآمنة لمؤسستك.
   1. استنادا إلى تركيز الكريستال المحسوبة في الخطوة 2.1.9، وضبط تركيز إلى 10 ⁷ بلورات / مل عن طريق تمييع العينة. أو عن طريق التكوير البلورات في 4000 x ج لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة في ميكروسنتريفوج، وتعديل الحجم النهائي عن طريق إزالة طاف، وإعادة تعليق بلطف بلورات.
   2. إذا كان من المفترض تجميد العينات مقدما، تهدئة الشاحن الجاف أو ديوار مع النيتروجين السائل. إعداد قارورة أو كرات الصولجان، حسب الاقتضاء، وتبريدها مع النيتروجين السائل.
   3. ريسوسبيند الكريستال بيليه وتطبيق 0.5 ميكرولتر قطرة من بلورات على ميكروميش التي بيبتينغ. استخدام 700 ميكرون تنسجم مع 25 ميكرون مربعالثقوب كنقطة انطلاق. منطقة شبكة ليست حرجة ولكن مساحة أكبر يوفر المزيد من بلورات في شبكة ويؤدي إلى تباطؤ أبطأ أثناء التحضير. حجم الثقوب قد تحتاج إلى أن يكون الأمثل لتتناسب مع حجم بلورات أكبر من 25 ميكرون. إذا لزم الأمر للدراسات المنهجية، تنسجم مفهرسة متاحة لتسهيل مسح الشبكة منهجي أثناء جمع البيانات.
   4. إزالة معظم السائل الزائد عن طريق النشاف مع ورقة الفتيل. بلورات ينبغي أن تنتشر بالتساوي على شبكة، دون لمس بعضها البعض. كرر الخطوة 3.1.1. لتحسين تركيز العينة. المضي قدما وعدم إزالة الكثير من السائل. في غياب كريوبروتكتانت، السائل يتبخر بسرعة مع خطر تشكيل الكريستال الملح و / أو فقدان الفيلم.
   5. إضافة كريوبروتكتانت: ماصة 0.5 ميكرولتر من محلول من 50٪ جلايكول الإثيلين في الماء على شبكة (تكوين كريوبوفر هو أن تتكيف مع العينة؛ اقتراحات لتحسين جريوبروتكتانت يمكن العثور عليها في المرجع ³⁰ ). إزالة السائل الزائد عن طريق النشاف مع ورقة الفتيل. على النقيض من الخطوة السابقة، وهنا الفيلم المتبقية من المذيب يجب أن تكون رقيقة قدر الإمكان للحد من تأثيرات المنظر الذي يعقد عملية المواءمة بين الكريستال، ومسار شعاع ومقياس الزوايا. وتقليل الخلفية الناجمة عن تشتت الأشعة السينية بواسطة السائل في مسار الشعاع.
   6. على الفور فلاش بارد ميكروميش في النيتروجين السائل ونقلها إلى قارورة أو روبوت عفريت، ثم إلى الشاحن الجاف أو ديوار للتخزين.
3. إعداد ميكروميش مع الخلايا التي تحتوي على الكريستال
   تنبيه: يرتبط استخدام النيتروجين السائل بمخاطر مثل الاختناق والحروق الباردة والحرائق في الجو المخصب بالأكسجين والانفجار. يرجى مراجعة إدارة المخاطر وممارسات العمل الآمنة لمؤسستك.
   1. نقل الخلايا فرزها إلى أنبوب ميكروسنتريفوج 1.5 مل. استنادا إلى الخلية جأونس المسجلة من قبل فارز الخلية، وضبط تركيز إلى 10 ⁷ خلية / مل عن طريق تمييع العينة مع برنامج تلفزيوني. أو عن طريق التكوير الخلايا في 150 x ج لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة في ميكروسنتريفوج، وتعديل الحجم النهائي عن طريق إزالة طاف، وإعادة تعليق بلطف الخلايا.
   2. مزيج الخلايا مع حجم مساو من الحل الأزرق التريبان (0.4٪ ث / الخامس) إلى تركيز النهائي من 0.2٪ ث / الخامس.
   3. إذا كان من المفترض أن يتم تجميد العينات مقدما، تبريد الشاحن الجاف أو ديوار أسفل مع النيتروجين السائل. إعداد قارورة أو كرات الصولجان، حسب الاقتضاء، وأيضا تبريدها مع النيتروجين السائل.
   4. ريسوسبيند بلطف الخلايا والماصة 0.5 ميكرولتر من الخلايا فرزها على ميكروميش.
   5. إزالة السائل الزائد عن طريق النشاف مع ورقة الفتيل. وينبغي أن تنتشر الخلايا بالتساوي على الشبكة، دون لمس بعضها البعض. إذا لم يكن استخدام كريوبروتكتانت (الخطوة 3.3.6)، يجب أن يكون الفيلم المتبقية من المذيبات رقيقة قدر الإمكان للحد من آثار المنظر المعقدةه عملية المواءمة بين الكريستال، ومسار شعاع ومقياس الزوايا. وتقليل الخلفية الناجمة عن تشتت الأشعة السينية بواسطة السائل في مسار الشعاع.
   6. اختياريا، إضافة كريوبروتكتانت إلى الخلايا: ماصة 0.5 ميكرولتر من 50٪ غليكول الإثيلين، 50٪ حل برنامج تلفزيوني على شبكة. تكوين كريوبوفر هو أن تتكيف مع العينة. اقتراحات لتحسين كريوبروتكتانت يمكن العثور عليها في المرجع ³⁰ . إزالة السائل الزائد عن طريق النشاف مع ورقة الفتيل، وترك سوى طبقة رقيقة من المذيبات.
      ملاحظة: ان تجاهل خطوة الحماية بالتبريد لم يغير نوعية حيود الأشعة السينية عندما تم تحليل بلورات من بولهدرين في السليلو ، في حين كان مطلوبا هذه الخطوة للبلورات المنقى ²⁰ . وهذا ينطبق فقط على حضانة الخلايا مع حل كريوبروتكتانت. لا يزال ينبغي تحليل العينة في 100K للحد من آثار الضرر الإشعاع على بلورات.
   7. Immediأتيلي فلاش بارد ميكروميش في النيتروجين السائل ونقل إلى قارورة أو روبوت عفريت، ثم إلى الشاحن الجاف أو ديوار التخزين، حسب الاقتضاء.

4. جمع البيانات

ملاحظة: يتم إعطاء المعلمات المستخدمة لجمع البيانات كدليل وينبغي أن يكون الأمثل لكل نوع الكريستال و سينكروترون الحزم.

1. جمع البيانات على خط شعاعي بلوري ميكروفوكوس (راجع المرجع ⁷ للحصول على قائمة من الخطوط الدقيقة ميكروفوكوس وخصائصها). إذا كان متوفرا، استخدم شعاع مواز يطابق حجم البلورات.
2. للمرحلة التجريبية من قبل طريقة الطول الموجي واحد تشتت الشاذة (ساد)، وجمع في الطاقة تعظيم إشارة شاذة من ذرة الثقيلة من الاختيار. وبالنسبة للمراحل باستخدام طريقة الاستبدال المتعدد الأشكال (مير)، تجمع فوق طاقة حافة امتصاص مناسبة للذرة الثقيلة المختارة (متاحة على الموقع http://skuld.bmsc.washington.edu/scatter / AS_periodic.html).
3. بعد تحميل شبكة على مقياس الزوايا، تبدأ من خلال تركيز ميكروميش مع مسار شعاع باستخدام الوجه على (محدب الجانب) والتوجهات الجانبية على. ثم، مع ميكروميش الوجه على، وضبط محاذاة عن طريق محاذاة مركز حارة أفقية معينة من ميكروميش (على سبيل المثال، تبدأ مع واحد المركزي). ثم جمع البيانات على طول هذا الممر الأفقي مع تعديلات طفيفة فقط إلى المحاذاة. إذا كان متوفرا، استخدم التمركز على أساس التنقيط في جرعة منخفضة حيود الأشعة السينية لصقل محاذاة (استشارة الاتصال المحلي في شعاع السنكروترون).
   ملاحظة: كما يمكن جمع كمية محدودة من البيانات على البلورات الصغيرة بسبب الضرر الإشعاع (عادة، 10 إلى 30 صورة مع 1 درجة التذبذب)، من الناحية النظرية يحتاج الكريستال فقط لتكون محاذاة مع مسار شعاع لمدة 10-30 درجة. ومع ذلك، فمن الأهمية بمكان أن المحاذاة دقيقة كما وضوح الشمس يمكن بسهولة عن طريق غاب عن طريق ميكروبم (عموما مواز إلى دياميتإيه من ~ 10 ميكرون أو أصغر).
4. جمع بيانات الانعراج حتى يتم فقدان الانعراج بسبب الضرر الإشعاع. بالنسبة لبلورات بولهدرين، يستخدم زمن التعرض لمدة 10 ثوان عادة لتذبذب 1 ° لتدفق حوالي 3.6 × 10 ¹¹ فوتونات / ثانية عند 13 كيلو فولت مع كاشف كسد (الجرعة الكلية <30 مجي). تحسين هذه الإعدادات اعتمادا على خط شعاع وطبيعة الكريستال المستخدمة. على وجه الخصوص، يوصى بجرعات منخفضة وتشريح دقيق للكشف عن الأشعة السينية بكسل.
   ملاحظة: إذا كنت تستخدم في استراتيجية سيليولو ، فإن الخلايا الملون مع الأزرق التريبان تظهر كنقاط زرقاء ضد خلفية الدعم، مما يجعلها أسهل لمحاذاة إلى شعاع. إذا كان الميكروبام المصقول لديه تقريبا نفس حجم الخلايا (~ 10 ميكرون)، وسوف تكون مضيئة جميع البلورات الواردة في خلية في وقت واحد. بالنسبة للخلايا التي تحتوي على جريزوفريستالس متعددة، وهذا يؤدي إلى رصد أنماط حيود متعددة، والتي يمكن أن يكون من الصعب معالجة. ومع ذلك، ديففراكتيون من واحدة من البلورات غالبا ما يميل إلى السيطرة على نمط حيود ويتم فهرسة تفضيلي أثناء معالجة البيانات. بالنسبة للخطوط الشعاعية ذات شعاع الأشعة السينية أصغر بكثير أن الخلية، والتنقيط في تدفق الأشعة السينية منخفضة جدا (> توهين 95٪) ينبغي أن تستخدم في التركيز على بلورة واحدة قبل جمع البيانات.
5. انتقل إلى الكريستال المقبل في حارة.
6. مرة واحدة وقد تم اختبار كل بلورات من حارة، انتقل إلى حارة المقبل وتكرار إجراء المحاذاة. المضي قدما حتى يتم جمع البيانات الكافية أو تم اختبار جميع البلورات.
   1. تأكد من أن الممرات التي تم معالجتها محددة بوضوح بحيث لا يتم تفويتها بلورات أو اطلاق النار مرتين (إذا لزم الأمر، رسم رسم). عادة، أزرق تريبان يتحول إلى اللون الأصفر بعد أن تم تشعيع الخلية، والتي يمكن استخدامها كعلامة.

الشكل 5 : استراتيجية جمع البيانات من العينات على دعم ميكروميش. ( أ ) استراتيجية جمع البيانات لكل ممر؛ يتم محاذاة في بداية كل حارة (النقاط) ويتم جمع البيانات على طول الممر. ( ب ) عن قرب خلية تريبان زرقاء ملطخة، تحتوي على الكريستال على شبكة، كما رأينا على شاشة بيملين الجريزوفولفوغرافي. ( ج ) عن قرب من بوليهيدرا المنقى على شبكة، كما رأينا على الشاشة بيملين الجريزوفولفوغرافي. الساحات شبكة هي 25 ميكرون × 25 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

5. معالجة البيانات

ملاحظة: هنا، ونحن نذكر فقط بإيجاز خطوات معالجة البيانات التي هي محددة للجريزوفريستالوجي التسلسلي، حيث يتم دمج البيانات من بلورات متعددة. العديد من المقالات الممتازة هيمتاح وصف معالجة البيانات في العمق ^{31 ، 32 ، 33 ، 34 ، 35 ، 36} وتحديد هيكل هو أبعد من نطاق هذا البروتوكول.

1. حدد الكريستال مع أفضل قرار حيود ونوعية كمرجع.
2. معالجة كل الكريستال على حدة باستخدام حزم البلورات القياسية مثل هكل-2000 ³¹ ، موسفلم ³² ، أو شدس ³³ . للتأكد من أن الضرر الإشعاع لا تتدهور نوعية مجموعة البيانات، واختيار بعناية الصورة الأخيرة مع الضرر الإشعاع مقبول. معايير قطع تشير إلى الضرر الإشعاع المفرط هي محددة من كل نوع الكريستال، وممارسة المعالجة والغرض من التجربة. وبالنسبة إلى مراحل بلورات بوليميدرين BmCPV1، تم تجاهل البيانات بمجرد أن تكون الإشارة إلى nويز <I> / <σ (I)> في الصورة أقل من 2 أو R _سيم تجاوز 50٪ كما ذكرت هكل-2000 ³¹ .
3. لكل الكريستال، وتحديد الحد القرار وعدد من الإطارات وإعادة معالجة مع المعلمات الصحيحة لتجنب دمج البيانات مع إشارة قليلة أو معدومة.
4. مقياس ودمج البيانات من أفضل بلورات إلى الكريستال المرجعي (ق) باستخدام حزم القياسية مثل سكاليباك في هكل-2000 ³¹ ، سكالا في CCP4 ^{34 ، 35} أو زسكيل في شدس ³³ . إضافة البيانات من بلورات مختلفة تدريجيا أثناء مراقبة الجودة العالمية من مجموعة البيانات، من الناحية المثالية حتى تصل إلى مجموعة البيانات اكتمال مقبول (> 95٪). رفض البلورات التي تقدم إيسومورفيسم الفقراء مع أفضل / إشارة الكريستال كما تم الكشف عن الاختلافات في المعلمات خلية وحدة وسوء R _دمج / تشي مربع لكل صورة. إذا كان عدد كبير جدا من مجموعات البيانات ذات النوعية الجيدةلا مقياس مع الكريستال المرجعية (ق)، استخدام برنامج مثل بليند ³⁶ الذي يحمل التكتلات الهرمية لتحديد أفضل مزيج من مجموعات البيانات لدمج.
   ملاحظة: في بعض المجموعات الفضائية، يجب اختبار خيارات الفهرسة البديلة لتتناسب مع البلورة المرجعية.
5. انتقل إلى مراحل تجريبية، استبدال الجزيئي أو صقل باستخدام حزم البلورات القياسية.

Representative Results

يتم عرض لمحة عامة عن كل من الطرق البديلة لتحديد هيكل باستخدام في ميكروفروستالس الجسم الحي ( الشكل 1 ). بوليهيدرا يمكن بسهولة تنقيته سونيكاتيون والطرد المركزي. نظرا لكثافتها، فإنها تشكل طبقة في الجزء السفلي من الأنبوب تحت طبقة من الحطام التي يمكن إزالتها بواسطة بيبتينغ ( الشكل 3A و 3 B ). ثم يتم إخضاع العينة لعدة جولات من سونيكاتيون ويغسل حتى يتم التوصل إلى مستوى كاف من النقاء كما يحكم من الجانب الأبيض والطباشيري من بيليه ( الشكل 3C ).

بالنسبة لنهج السليلو ، تتم مقارنة الملف الخلوي التدفق الخلوي للخلايا غير المصابة مع لمحة عن الخلايا التي تحتوي على الكريستال وتستخدم لتحديد أي خلية السكان ينبغي اختيار لفرز الخلايا التي تحتوي على الكريستال بعيدا عنوالخلايا الأخرى ( الشكل 4 ). في هذا المثال، الخلايا التي تحتوي على متعدد الأقطاب لها تشتت جانبي أعلى من الخلايا غير المصابة. ويمكن ملاحظة الاختلافات الأخرى في أنماط الانتثار بالنسبة لأنواع الكريستال الأخرى وينبغي تعديل التباعد وفقا لذلك.

بيبيتدس الخلايا المحتوية على الكريستال أو بيبيتد على ميكروميش ( الشكل 5 ). خلايا ملطخة الأزرق التريبان يمكن تصور بسهولة باستخدام الكاميرات المتاحة في معظم بيميلينس السنكروترون ( الشكل 5B )، في حين أن بلورات تنقية شاقة لتحديد ومواءمة مع شعاع الأشعة السينية بسبب صغر حجمها ( الشكل 5C ). عند جمع البيانات، فمن الأفضل للمضي قدما في نمط الشبكة من أجل تقليل إجراءات التمركز، وتجنب تعريض مرتين نفس الخلية أو الكريستال، أو في عداد المفقودين أي ( الشكل 5A ). جمع البياناتينبغي معالجة تيد بعناية لمراعاة الاختلافات في حدود الانعراج، وتأثير الضرر الإشعاعي ونقص محتمل في التماثل.

الشكل 1 : نظرة عامة على طريقتين لتحديد الهيكل باستخدام في فيفو ميكروكريستالس. يتم إنتاج الجريزوفولفات في زراعة الخلايا عن طريق الإفراط في التعبير عن البروتين من الفائدة باستخدام نظام التعبير المؤتلف. في حالات محددة، قد تنتج أيضا الجريزوفولفات بشكل طبيعي من قبل الخلايا في ظروف معينة. يظهر الصف العلوي النهج الكلاسيكي حيث يتم ليسد الخلايا ويتم تنقية البلورات بواسطة الطرد المركزي التفاضلي. بيبيتدس بيبيتدس تنقية على ميكروميش. بعد إزالة السائل الزائد، يتم إضافة محلول كريوبروتكتانت، وينضح السائل الزائد مرة أخرى ويتم تبريد شبكة وميض. للحصول على الأشعة السينية ديف والتجارب الكسور، يتم محاذاة بلورات بعناية مع شعاع الأشعة السينية، والتي قد تكون خطوة الحد من معدل في جمع البيانات. يعرض الصف السفلي في النهج سيلولو . يتم فرز الخلايا عن طريق التدفق الخلوي لتحديد على وجه التحديد الخلايا التي تحتوي على الكريستال. تلطخ الخلايا مع الأزرق التريبان لتسهيل التصور وانتشارها على ميكروميش. في هذه الحالة، إضافة كريوبروتكتانت هو اختياري. لتجارب حيود الأشعة السينية، تصور الخلايا بسهولة باستخدام الكاميرات النموذجية المتاحة في خطوط شعاع السنكروترون تسهيل عملية التمركز.
الصور - أوتوماتيكي، سائل، كروماتوغرافي، جهاز، كورتيسي، بسبب، غي، هالثكار، أب، أوبسالا، سويدن. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

= "زفيغ"> الشكل 2 : أمثلة من في فيفو ميكروكريستالس. أمثلة مختارة من بلورات الجسم الحي: ( أ ) خلايا Sf9 مع بوليهيدرا سيبوفيروس؛ ( ب ) خلايا LD652 مع الكروية المضادة للفيروسات؛ ( ج ) عصيات ثورينجينزيس مع بلورات Cry3A (السهم). ( د ) خلايا Sf9 مع بلورات المثقبيات كاثبسين ب. ( ه ) خلايا Sf21 مع بلورات الكالسينورين (السهام)؛ ( و ) خلايا COS7 أحادي الطبقة مع يكا: بلورات Inka1؛ ( ز ) خلايا شو مع بلورات مفتش. مستنسخة من ^{14 ، 18 ، 29 ، 37 ، 39 ، 42} ، بإذن. شريط مقياس = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض أكبرإيه نسخة من هذا الرقم.

الجدول 1: ملخص في بلورات فيفو نمت في الخلايا المستزرعة التعبير عن البروتين المؤتلف. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

ويوفر هذا البروتوكول نهجين لتحليل البلورات الصغيرة بهدف تسهيل تحليل بلورات صغيرة جدا التي كان يمكن التغاضي عنها في الماضي.

خطوات حاسمة لتنقية ميكروكريستال
وقد تم تحسين البروتوكول المقدم باستخدام بومبيكس موري CPV1 بوليهدرين أعرب في الخلايا Sf9 كنموذج النظام. ومع ذلك، في ميكروفروستالس الجسم الحي عرض تباين كبير في المقاومة الميكانيكية. على سبيل المثال، كاثبسين B بلورات إبرة مثل نمت في خلايا الحشرات هي جامدة ومقاومة للغاية للإجهاد الميكانيكي، ويمكن تنقيته باستخدام بروتوكول مماثل لتلك الموصوفة هنا ¹⁴ . من ناحية أخرى، بلورات لوسيفيراس اليراع، نمت أيضا في خلايا الحشرات مثقف ومع التشبه إبرة مماثلة، حل فورا على تحلل الخلية ³⁸ . وهكذا، فإن بروتوكول لاستخراج وتنقية في الجسم الحيستحتاج البلورات إلى تكييفها على أساس الخطأ التجريبي لحالات معينة كما هو موضح في الخطوات 1.3 و 2 أ -3 و 4 و 2 ب 4 و 3-1-3 و 4 و 3-أ -5.

بالنسبة للبلورات الهشة، يمكن تحقيق الفصل (الجزئي) عن حطام الخلية عن طريق الطرد المركزي بسرعة منخفضة ( أي 200 x ج) أو إضافة وسادة سكروز في الجزء السفلي من الأنبوب بدلا من صوتنة متكررة. كقاعدة عامة، عينات الكريستال التي أعدت لأغراض جمع البيانات حيود لا حاجة إلى أن تكون عالية النقاء. وبالتالي، يفضل تنقية سريعة لتبريد البرد بلورات قبل أن تسوس.

تطبيق لفي المختبر وفي الجسم الحي ميكروفروستالس
على الرغم من أن كل من البروتوكولات هنا يتضح مع تحليل في الجسم الحي بلورات نمت، ويمكن استخدام المنهجية بسهولة للبلورات الصغيرة التي تزرع في صواني الكريستال من البروتين المؤتلف المنقى. في ثيs، ينبغي النظر في التعديلات التالية: 1) دعم شبكة يمكن استخدامها لحصاد الجريزوفولفات مباشرة من انخفاض التبلور، بدلا من نقلها بواسطة بيبتينغ. 2) نظرا لأن كمية البلورات قد تكون عاملا مقيدا، يجب أن تؤخذ عناية خاصة عند نشاف الفائض من السائل من شبكة الدعم، لتجنب الإفراط في إزالة البلورات. 3) ستحتاج إلى اختبار المخازن المؤقتة كريوبروتكتانت مختلفة، كما هو الحال في البلورات التقليدية (انظر المرجع ³⁰ ).

من ناحية أخرى، لفي الجسم الحي بلورات -grown ، في نهج السليلو ينصح بشدة. لأن الخلايا هي أسهل لتصور والتلاعب من بلورات المنقى، وهذا النهج هو أكثر كفاءة من حيث استخدام بيمتيمي وأكثر سهولة للباحثين مع خبرة ضئيلة أو معدومة في الجريزوفولفوغرافيا. بل هو أيضا أكثر ملاءمة للبلورات الهشة التي قد تتأثر الاستخراج وبور إيفيك من الخلية بسبب التغيرات في البيئة الكيميائية، التخفيف من البروتينات المحيطة والأضرار الميكانيكية. إلى جانب ذلك، توفر الخلايا بيئة واقية للبلورات، وتخفيف الحاجة إلى إضافة كريوبروتكتانت. وقد تبين سابقا من العلاج بالتبريد البارد لمنع تراكم العيوب وتحسين إيسومورفيسم بين بلورات الفردية، لجمع البيانات في درجة حرارة الغرفة ⁴⁰ . في بروتوكول سيليولو أيضا يتجاوز متطلبات الحضانة في حل كريوبروتكتانت، في حين لا يزال يسمح جمع البيانات في درجة حرارة المبردة. وعموما، في جمع البيانات سيلولو واثنين من المزايا الرئيسية: 1) قد تنتج بيانات من نوعية أفضل وأعلى دقة لفترة معينة من بيمتيمي ²⁰ ؛ و 2) أنه يحافظ على البروتين تبلور في بيئة الخلوية زيادة فرص الاحتفاظ بيغند ذات الصلة بيولوجيا.

أونتنت "> قيود هذه التقنية
ومن المضاعفات الجوهرية لجريئة الجريزوفولفوغرافيا التسلسلية هو العدد المهم من مجموعات البيانات الجزئية التي تم إنشاؤها أثناء جمع البيانات. وبالتالي، يصبح تجهيز البيانات عملية تستغرق وقتا طويلا. ومع ذلك، فإن سير العمل الأساسي لمعالجة البيانات يمكن أن يكون آليا إلى حد كبير. على سبيل المثال، يمكن تحديد التحديد الأمثل للبلورات غير المتجانسة بواسطة التحليل العنقودي الهرمي ²⁸ ، على سبيل المثال يتم تنفيذها في بليند ³⁶ . وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا أن تتكيف البرامج التي تم تطويرها لتحليل أشعة الليزر الإلكترون الحرة (زفيل) لمعالجة البيانات الجريزوفريستلوغرافي التسلسلية التي تم جمعها على بيملينس السنكروترون ² ، وفي بعض بيملينس الآلي النقطية من شبكة والكشف عن الكريستال قد نفذت إلى حد كبير تسهيل المسلسل جمع البيانات ^{2 ، 41} .

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sf9 cells	Life Technologies
SF900-SFM insect medium	Life Technologies
1 L cell culture flask	Thermofisher Scientific
Shaking incubator for insect cell culture	Eppendorf
50 mL conical tubes	Falcon
Centrifuge with swing buckets for 50 mL tubes	Eppendorf
Sonicator equiped with a 19 mm probe	MSE Soniprep 150
Glass slides	Hampton Research
Hemacytometer	Sigma-Aldrich
Propidium iodide	Thermofisher Scientific
BD Influx cell sorter	BD Biosciences
Hampton Heavy atom screens	Hampton Research
Microcentrifuge	Eppendorf
Micromesh	Mitigen		700/25 meshes offer a larger surface. Indexed meshes can be purchased for systematic studies.
Paper wick	Mitigen		The size of the paper wick can be varied for optimal flow. This will largely depend on the nature of the crystals and cryoprotectant used.
Ethylene glycol	Sigma-Aldrich
Trypan blue	Life Technologies
MX2 microfocus beamline	Australian Synchrotron		A list of available microfocus beamlines can be found in Boudes et al. (2014) Reflections on the Many Facets of Protein Microcrystallography. Australian Journal of Chemistry 67 (12), 1793–1806, doi:10.1071/CH14455.