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Biochemistry

प्रोटीन क्रिस्टल की माइक्रोक्रिस्ट्रॉलोग्राफ़ी और Published: July 21, 2017 doi: 10.3791/55793
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Infection and Immunity Program, Monash Biomedicine Discovery Institute, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Monash University
* These authors contributed equally

Summary

प्रोटीन माइक्रोक्रियास्टल्स का इस्तेमाल करते हुए एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफ़ी के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। शोधन के बाद या cellulo में microcrystals -grown विवो में विश्लेषण करने के दो उदाहरण तुलना की जाती है।

Abstract

कई सिंक्रोट्रॉन सुविधाओं पर उच्च गुणवत्ता वाली माइक्रोफोकस बीमलाइनों के आगमन ने अपने सबसे बड़े आयाम में 10 माइक्रोन से छोटे क्रिस्टल के नियमित विश्लेषण की अनुमति दी है, जो एक चुनौती का प्रतिनिधित्व करते थे। हम विवो में विकसित क्रिस्टल पर विशेष ध्यान देने के साथ एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफ़ी द्वारा प्रोटीन माइक्रोक्रॉस्टल के ढांचे के निर्धारण के लिए दो वैकल्पिक वर्कफ़्लो पेश करते हैं। माइक्रोक्रिस्ट्रॉल्स या तो सेलिंग द्वारा कोशिकाओं से निकाले जाते हैं और क्रिस्टल युक्त कोशिकाओं के फ्लो साइटोमेट्री द्वारा कोशिका छँटाई के बाद सेलुलो में विभेदक केन्द्रांकरण द्वारा शुद्ध या विश्लेषण करते हैं। वैकल्पिक रूप से, शुद्ध क्रिस्टल या क्रिस्टल युक्त कोशिकाएं प्रयोगात्मक चरणबद्ध करने के लिए भारी परमाणु समाधानों में भिगोती हैं। इन नमूनों को फिर से विवर्तन प्रयोगों के लिए एक समान तरीके से आवेदन करके एक तरल नाइट्रोजन में माइक्रोमॉश समर्थन और फ्लैश कूलिंग पर तैयार किया जाता है। हम संक्षेप में पृथक माइक्रोक्रियास्टल्स और क्रिस्टल के सीरियल विवर्तन प्रयोगों का वर्णन करते हैं और तुलना करते हैं-चरणबद्ध, मॉडल निर्माण और परिशोधन के लिए उपयुक्त डेटासेट का उत्पादन करने के लिए एक माइक्रोफोकस सिंक्रोट्रॉन बीमलाइन का उपयोग करने वाली कोशिकाओं को शामिल करना।

इन वर्कफ़्लो को बॉम्बेक्स मोरी साइपोवायरस 1 (बीएमसीपीवी 1) पॉलीहेड्रिन के क्रिस्टल के साथ मिसाल दिया गया है जो कीट कोशिकाओं के एक पुनः संयोजक बैकलोवियरस के संक्रमण से उत्पन्न होता है। इस मामले के अध्ययन में, सेल्युलो विश्लेषण में शुद्ध क्रिस्टल के विश्लेषण की तुलना में अधिक कुशल है और अभिव्यक्ति से रिफ्लेशन तक ~ 8 दिनों में एक संरचना पैदा करता है।

Introduction

जैविक अणुओं के उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचनाओं के निर्धारण के लिए एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफ़ी का उपयोग ने पिछले दो दशकों में एक स्थिर प्रगति का अनुभव किया है। गैर-विशेषज्ञ शोधकर्ताओं द्वारा एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी की बढ़ती गति से जीवन विज्ञान 1 के कई क्षेत्रों में इस दृष्टिकोण के लोकतांत्रिककरण का उदाहरण सामने आया है।

ऐतिहासिक रूप से, ~ 10 माइक्रोन के नीचे दिए गए आयामों के साथ क्रिस्टल को संरचना निर्धारण के लिए चुनौतीपूर्ण माना जाता है, यदि अनुपयोगी नहीं है। दुनिया भर में समर्पित माइक्रोफोकस बीमलेनेसेट सिंक्रोट्रॉन विकिरण स्रोतों की बढ़ती उपलब्धता और प्रौद्योगिकीय प्रगति, जैसे कि माइक्रोक्रॉस्टल के हेरफेर करने के लिए उपकरणों के विकास, ने एक्सरे माइक्रो क्रिस्टलोग्राफी के व्यापक उपयोग को रोकते हुए इन बाधाओं में से अधिकांश को हटा दिया है। धारावाहिक एक्स-रे माइक्रोक्रिस्ट्रॉलोग्राफ़ी 2 , 3 और माइक्रो इलेक्ट्रॉन डिफ्रेक्शन 4 हैक्टेयर में अग्रिमहमने दिखाया है कि संरचना निर्धारण के लिए सूक्ष्म और नैनोक्रॉस्टल का उपयोग केवल व्यावहारिक नहीं है बल्कि कभी-कभी बड़े क्रिस्टल 5 , 6 , 7 के उपयोग के लिए बेहतर है।

इन अग्रिमों को सबसे पहले पेप्टाइड 8 के अध्ययन और कीट वायरस 9 , 10 द्वारा उत्पादित प्राकृतिक क्रिस्टल पर लागू किया गया था। उनका उपयोग अब जैविक अणुओं के लिए किया जाता है जिनमें सबसे कठिन प्रणाली जैसे झिल्ली प्रोटीन और बड़े परिसरों 11 शामिल हैं । इन माइक्रोक्रॉस्टल्स के विश्लेषण की सुविधा के लिए, उनका विश्लेषण किया गया है मेसो , विशेष रूप से झिल्ली प्रोटीन 12 और माइक्रोफ्लिडिक्स चिप्स 13 में ।

इन उपन्यास माइक्रोक्रियास्टॉलोग्राफ़ी पद्धतियों की उपलब्धता ने इनका उपयोग करने की संभावना बढ़ा दी हैसंरचनात्मक जीव विज्ञान 14, 15, 16 के लिए एक नया मार्ग शास्त्रीय इन विट्रो crystallogenesis के लिए एक विकल्प की पेशकश के रूप में क्रिस्टलीकरण विवो। दुर्भाग्य से, जब भी विवो क्रिस्टल में उत्पादन किया जा सकता है, तब भी कई बाधाएं ऐसे होती हैं जैसे कोशिकाओं से शुद्धि के दौरान गिरावट या ligands के नुकसान, संकीर्ण बीमलाइन और थकाऊ एक्स-रे विवर्तन प्रयोगों में क्रिस्टल के हेरफेर और दृश्यता में कठिनाई। एक वैकल्पिक क्रिस्टल के रूप में किसी भी शुद्धि चरण 17 , 18 , 1 9 के बिना सेल के भीतर सीधे विश्लेषण किया गया है। एक तुलनात्मक विश्लेषण से पता चलता है कि सेल्युलो दृष्टिकोण में शुद्ध क्रिस्टल के विश्लेषण और उच्च संकल्प 20 के उपज डेटा से अधिक कुशल हो सकते हैं।

इस प्रोटोकॉल में हैप्रोटीन माइक्रोक्रियास्टॉलोग्राफी के लिए नए शोधकर्ताओं की सहायता करने के लिए रवाना हुए यह सिंक्रोट्रॉन बीमलाइन पर एक्स-रे विवर्तन प्रयोगों के लिए नमूना तैयार करने और हेरफेर पर ध्यान केंद्रित करने के तरीके प्रदान करता है। सेलुलो विश्लेषण ( चित्रा 1 ) में प्रवाह कोशिका द्वारा क्रमबद्ध शास्त्रीय माइक्रोक्रियास्टॉलोग्राफ़ी या क्रिस्टल युक्त कोशिकाओं के लिए पृथक क्रिस्टल का उपयोग करके दो विकल्प प्रस्तावित किए जाते हैं।

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Protocol

नोट: विवो क्रिस्टलीकरण में बैक्टीरिया, खमीर, पौधे, कीड़े और स्तनधारियों (संदर्भ 21 में समीक्षा) सहित कई जीवों में सूचना दी गई है। पुनः संयोजक प्रोटीन का क्रिस्टलीकरण स्तनधारी कोशिकाओं के क्षणिक अभिकर्मक और कीट कोशिकाओं के बाकुलोवायरस संक्रमण का उपयोग करके प्रयोगशाला में भी प्राप्त किया गया है। संदर्भ 22 में निर्देश के अनुसार उत्पन्न बेकोलॉवायरस पॉलीहेड्रिन प्रमोटर के तहत रिकॉमबिनेंट बैकलोवीरस में क्लोन किया गया बॉम्बेक्स मोरी साइपोवायरस 1 (बीएमसीपीवी 1) पॉलीहेड्रिन जीन का उपयोग करके निम्न प्रोटोकॉल विकसित किया गया है। इस प्रकार, हालांकि यह प्रोटोकॉल अन्य प्रकार की कोशिकाओं ( जैसे स्तनधारी कोशिकाओं) के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, हम यहां कीट कोशिकाओं के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन करते हैं। प्रोटोकॉल मानता है कि ब्याज की प्रोटीन की अधिक अभिव्यक्ति पहले से ही हासिल की जा चुकी है। एक पुनः संयोजक बाक्यूलोवायरस के उत्पादन के लिए और ब्याज की प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए इसका उपयोग एवि है23 , 24 , 25 , 26 , 27 में संदर्भों में उपयुक्त

1. क्रिस्टल युक्त कोशिकाओं की पहचान

  1. अगर कोशिका मोनोलायर में उगाई जाती हैं, तो उन्हें फ्लास्क में सीधे जांच कर। अगर कोशिकाओं को तरल संस्कृति में विकसित किया जाता है, तो निम्न प्रोटोकॉल का उपयोग करें
    1. एक बाँझ सीरमिक विंदुक का प्रयोग करना, 500 माइक्रोन कोशिकाओं को एक सूक्ष्मदर्शी ट्यूब में स्थानांतरित करें। यह सुनिश्चित करने के लिए सावधानी बरतें कि मुख्य संस्कृति की बाँझ रहती है; कक्षा द्वितीय जैव सुरक्षा कैबिनेट में कोशिकाओं को संभाल और मानक सड़न रोकनेवाला तकनीक का पालन करें।
    2. एक गिलास स्लाइड पर माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब से पाइपेट कोशिकाओं के 5 μL।
    3. ध्यान से हवा के बुलबुले के निर्माण से बचने, तरल पर एक गिलास कसलीप डालते हैं। यदि स्लाइड को 15 मिनट के भीतर नहीं देखा जा सकता है, तो बाष्पीकरण से बचने के लिए वैक्यूम ग्रीस के साथ कवरलाप को सील करेंसमझना।
  2. इण्डेक्ट फ्लेस्क या स्लाइड इनवर्टेड माइक्रोस्कोप के साथ। यदि उपलब्ध है, चरण के विपरीत और / या अंतर हस्तक्षेप विपरीत माइक्रोस्कोपी (डीआईसी) का उपयोग करें दोनों तकनीक पारदर्शी नमूनों में इसके विपरीत वृद्धि करते हैं और लाइनों और किनारों पर जोर देते हैं, इस प्रकार विवो क्रिस्टल की पहचान की सुविधा प्रदान करते हैं।
  3. कोशिकाओं को ध्यान से जांचें एक संभावित क्रिस्टल का पता लगाने के दौरान अधिकतम आवर्धन पर 200X बढ़ाई पर प्रारंभ करें और ज़ूम इन करें। कोशिका आकृति विज्ञान ( चित्रा 2 ) में परिवर्तनों से क्रिस्टल की उपस्थिति अप्रत्यक्ष रूप से सुझाई जा सकती है। तेज किनारों और अपवर्तनांकने में परिवर्तन (यदि चरण विपरीत या डीआईसी का उपयोग करना) के लिए देखो। विवो क्रिस्टल में जाना जाता है छड़, ढेर के सुइयों, क्यूब्स, पिरामिड और पॉलीहेड्रा (विभिन्न उदाहरणों के लिए चित्रा 2 और तालिका 1 देखें) सहित विभिन्न आकृतियां अपनाने।
    नोट: प्रत्येक मामले में क्रिस्टल युक्त कोशिकाओं का अनुपात अलग होगा और पूर्वोत्तर होगाएन तैयारी के बीच भिन्नता है लेकिन सामान्य रूप से किसी को सभी कोशिकाओं में क्रिस्टल खोजने की उम्मीद नहीं करनी चाहिए। इसी प्रकार, प्रति सेल क्रिस्टल की संख्या भी चर ( तालिका 1 देखें) है, और एक से अधिक क्रिस्टल को एक कोशिका में पाया जा सकता है। इन कारकों को संक्रमण की बहुलता को समायोजित करके, अभिव्यक्ति की लंबाई में परिवर्तन करके और प्रोटीन निर्माण को बदलकर संभवतः अनुकूलित किया जाना चाहिए। एक तरफ, प्रोटीन अभिव्यक्ति और कोशिका वृद्धि की स्थिति जो क्रिस्टल युक्त कोशिकाओं की संख्या को अधिकतम करती है, उत्पादकता में सुधार करती है ( जैसे संक्रमण की उच्च बहुलता और सेल संस्कृति के देर से कटाई)। दूसरी ओर, ऐसी स्थितियों में जहां कोशिकाओं में एक क्रिस्टल होते हैं, उनमें डेटा संग्रह ( उदाहरण के संक्रमण की कम बहुलता) की सुविधा होती है। चरण 2.2 में वर्णित प्रवाह क्रमबद्धता द्वारा लाया संवर्धन को देखते हुए, हम बड़े क्रिस्टल ( जैसे एक एकल क्रिस्टल प्रति सेल) के लक्ष्य की सलाह देते हैं, भले ही क्रिस्टल युक्त कोशिकाओं का अनुपात कम हो।
  4. अगर क्रिस्टलकी पहचान की जाती है, उनकी स्थिति रिकॉर्ड करते हैं (जब एक फ्लास्क में इमेजिंग मोनोलायर), और क्रिस्टल युक्त कोशिकाओं के प्रतिशत का अनुमान लगाते हैं। यदि उपलब्ध है, तो एक एकल सेल स्तर पर परिवर्तनों को ट्रैक करने में सक्षम कैमरे से लैस माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
  5. निलंबन में कोशिकाओं के लिए, संदर्भ में विस्तृत प्रोटोकॉल 28 के बाद सेल व्यवहार्यता की डिग्री का निर्धारण करें एक मोनोलायर में सुसंस्कृत कोशिकाओं के लिए, दृश्य निरीक्षण से अनुमानित डिग्री संगम और पृथक कोशिकाओं की मात्रा।
  6. दिन में दो बार क्रिस्टल ग्रोथ, सेल विकास और व्यवहार्यता की निगरानी करें।
  7. जैसे-जैसे क्रिस्टल वृद्धि बंद हो जाती है, कोशिकाओं को फसल लगाएं। उल्लेखनीय रूप से मजबूत क्रिस्टल जैसे वायरल पॉलीहेड्रा, बढ़ाया ऊष्मायन समय (> 4 दिन) बड़ी क्रिस्टल की संख्या में वृद्धि हालांकि, विशिष्ट प्रोटीन क्रिस्टल के लिए, हम फसल कोशिकाओं की सलाह देते हैं, जब व्यवहार्यता सेल रोग के कारण होने वाले नुकसान को रोकने के लिए 80% से कम हो जाती है।
  8. इनक्यूबेटर से फ्लास्क निकालें और आगे बढ़ेंचरण 2.2 जितनी जल्दी हो सके। निम्नलिखित चरणों के दौरान कोशिकाओं को बर्फ पर रखें, जब तक अन्यथा निर्दिष्ट नहीं किया गया हो।

2. नमूना शुद्धि

नोट: हम शुद्ध क्रिस्टल से vivo क्रिस्टल में और सेलूलो में , क्रमशः विश्लेषण के दो तरीकों का वर्णन करते हैं।

  1. क्रिस्टल की शुद्धि
    नोट: जब तक कोई सबूत नहीं है कि ब्याज की क्रिस्टल कम तापमान के प्रति संवेदनशील हैं, बर्फ पर काम करते हैं और क्रिस्टल गिरावट से बचने के लिए बर्फ-ठंड बफ़र्स का इस्तेमाल करते हैं।
    1. पाइपेट 50 एमएल शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब में संक्रमित Sf9 कोशिकाओं के 50 एमएल। यह एक सामान्य प्रयोग में ~ 4 x 10 8 कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है।
    2. 4 मिनट के लिए 4 मिनट के लिए 450 xg पर गोली कोशिकाओं 4 डिग्री सेल्सियस
    3. सतह पर तैरनेवाला को त्यागें और गोली को 40 मिलीलीटर ठंडा फॉस्फेट में खसरा (पीबीएस), पीएच 7.4 में बनी।
      नोट: पीबीएस को शुद्धि के शुरुआती बिंदु के रूप में प्रस्तावित किया गया है जो कि एमआईएम के उद्देश्य से मानक आइसोटोनिक बफर के रूप में हैसेलुलर माहौल को उठाते हुए जहां विवो क्रिस्टल में वृद्धि हुई। इसका उपयोग सेल संस्कृति में 9 से 14 , 2 9 तक बढ़े हुए विवो क्रिस्टल के लिए किया गया है। वैकल्पिक रूप से, स्तनधारी कोशिकाओं 19 से विवो क्रिस्टल के शुद्धिकरण में डीएमईएम मीडिया का सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है। यदि क्रिस्टल पीबीएस या वर्तमान खराब विवर्तन में उनके हस्तांतरण से स्पष्ट रूप से पीड़ित हैं, तो इस पैरामीटर को गिरावट के संभावित स्रोत के रूप में जांच करनी चाहिए।
    4. 1 9-एमएम जांच से सुसज्जित एक सोनिकेटर का उपयोग करके 10 एमए में 30 एस के लिए रिज़ोस्पेड गोली को दोहराएं। नमूनों को गर्म करने से बचने के लिए, इसे एक बीकर में रखकर बर्फ से भरी हुई है, जबकि सोनाईटिंग रासायनिक या यांत्रिक सेल व्यवधान का विकल्प विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है अगर चरण 2.1.7 में मूल्यांकन किया गया है तो क्रिस्टल को सोनिक द्वारा क्षतिग्रस्त होने की संभावना है।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 450 xg पर अपकेंद्रित्र सेंटीफ्यूगेशन के बाद, 2 परतें स्पष्ट होती हैं:सेलुलर मलबे की एक ऊपरी परत, जो हल्के भूरे रंग के होते हैं, और पॉलीहेड्रिन क्रिस्टल की एक निचली गोली, जो सफेद और चॉकली है।
    6. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और सतर्क pipetting द्वारा ऊपरी परत को हटा दें। ठंडा पीबीएस के 40 एमएल में निचले गोली को फिर से खोलें।
    7. एक प्रकाश सूक्ष्मदर्शी के साथ इमेजिंग द्वारा नमूने की गुणवत्ता का आकलन करें।
      1. पाइपेट 5 μL कोशिकाएं या एक गिलास स्लाइड पर शुद्ध क्रिस्टल। यह कमरे के तापमान पर किया जा सकता है
      2. ध्यान से हवा के बुलबुले के निर्माण से बचने, तरल पर एक गिलास कसलीप डालते हैं।
      3. 200X बढ़ाई पर उल्टे माइक्रोस्कोप के साथ स्लाइड स्लाइड करें। नमूना स्लाइड पर अपनी तैयारी के 15 मिनट के अंदर नमूना। यदि स्लाइड को 15 मिनट के भीतर नहीं देखा जा सकता है, तो वाष्पीकरण से बचने के लिए वैक्यूम ग्रीज़ के साथ coverslip को सील करें।
        नोट: पॉलीहेड्रा के मामले में, क्रिस्टल प्रति पक्ष ~ 1 - 10 माइक्रोन प्रति refringent cubes के रूप में दिखाई देंगे। तीव्रता के नुकसान के लक्षणों की तलाश में क्रिस्टल की अखंडता की जांच करें( जैसे गोल किनारों), दरारें या विघटन इसके अलावा सेल मलबे की उपस्थिति की निगरानी करें जो अनियमित आकार और आकार के क्लंप और ऑब्जेक्ट के रूप में दिखाई देंगे।
    8. 2.1.5 से 2.1.7 के चरणों को दोहराएं, प्रत्येक चक्र पर गोली को पुन: resppend करने के लिए पीबीएस के वॉल्यूम को आधा करना जब तक कि क्रिस्टल मलबे से मुक्त नहीं होते। ठंडा पीबीएस के 1 एमएल में अंतिम गोली को फिर से खोलें और क्रिस्टल को माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर शुद्ध क्रिस्टल को स्टोर करें
    9. निर्माता द्वारा वर्णित एक हेमोसिटामीटर का उपयोग करके क्रिस्टल की एकाग्रता का अनुमान लगाया गया है। गिनती कोशिकाओं के रूप में क्रिस्टल गिना।

चित्र तीन
चित्रा 3 : विवो माइक्रोक्रोस्ट्रॉल में शुद्ध। एसएफ 9 कीट कोशिकाओं से बीएमसीपीवी 1 पॉलीहेड्रन के क्रिस्टल का प्रतिनिधि शुद्धि ( ए ) पिलेटेड सेल मलबे और रोनासुक्ष्मता के बाद, और ( बी ) मलबे और क्रिस्टल परतों पर क्लोज-अप। मलबे की परत सतह पर तैरनेवाला में सावधानी से पुन: पेश किया जा सकता है और तेज क्रिस्टल शुद्धि के लिए त्याग दिया जा सकता है। ( सी ) शुद्ध पॉलीहेड्रा की ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी छवि स्केल बार = 50 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

  1. प्रवाह-कोशिका द्वारा क्रिस्टल युक्त कोशिकाओं के अलगाव
    नोट: प्रवाह cytometry में गेट्स की परिभाषा को सुविधाजनक बनाने के लिए, ब्याज की प्रोटीन व्यक्त करने वाले को समानांतर में एक नियंत्रण संस्कृति विकसित करने की सिफारिश की जाती है। यह गैर-प्रासंगिक पुनः संयोजक बैकोलॉवायरस के साथ Sf9 कोशिकाओं के फ्लास्क को संक्रमित या नकली संक्रमित कोशिकाओं को तैयार करके किया जा सकता है। नमूनों का छंटनी और इमेजिंग आमतौर पर कमरे के तापमान पर किया जाता है
    सावधानी: प्रेजिडियम आयोडाइड एक संदिग्ध कैसिनोजेन है और इसे संभालना चाहिएदेखभाल के साथ।
    1. पीपेट संक्रमित एसएफ 9 कोशिकाओं के 4 एमएल - ~ 3 x 10 7 कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं - प्रवाह-साइटमैट्री विश्लेषण के लिए अनुकूलित ट्यूब में। साथ ही, गैर-पुनः संयोजक बैकलोवीरस से संक्रमित एसएफ 9 कोशिकाओं की एक समान संख्या के साथ एक दूसरी ट्यूब तैयार करें।
    2. प्रोटोडियम आइडॉड (पीआई) को दोनों नमूनों को 1 माइक्रोग्राम / एमएल के अंतिम एकाग्रता में जोड़ें, इससे पहले कि cytometric मूल्यांकन प्रवाह शुरू करें। यह कदम मृत कोशिकाओं, सेल क्लंप और मलबे की पहचान करने के लिए आवश्यक है जो फॉरवर्ड- और साइड-स्कैटरिंग प्लॉट पर सेल डिस्ट्रीब्यूशन को बदल या मुखौटा कर सकता है। पानी में 1 मिलीग्राम / एमएल के पीआई शेयर तैयार करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश से सुरक्षित रखें।
    3. फॉरवर्ड- (एफएससी) और साइड-स्कैटरिंग (एसएससी) के अनुसार सेल सॉर्टिंग के लिए सक्षम एक मानक प्रवाह cytometer के लिए कोशिकाओं को लागू करें। नियंत्रण के कम से कम 20,000 घटनाओं का विश्लेषण करें ( अर्थात गैर-क्रिस्टल युक्त) नमूना। मृत कोशिकाओं को हटाने के बाद, विश्लेषण से सेल क्लंप्स और मलबे, एसएससी प्लॉट के लिए एफएससी उत्पन्न करते हैं।
    4. कम से कम 20,000 का भी विश्लेषण करेंक्रिस्टल युक्त नमूने के ts नकली एक के साथ एसएससी प्लॉट के लिए एफएससी की तुलना करें क्रिस्टल युक्त कोशिकाओं के अनुरूप एक विशिष्ट आबादी के रूप में दिखें। सामान्यतया, इंट्रासेल्युलर क्रिस्टल वाले कोशिकाओं में रूपात्मक जटिलता में वृद्धि के कारण उच्च एसएससी होगा। यदि क्रिस्टल वृद्धि सेल की मात्रा में वृद्धि का कारण बनती है तो एफएससी भी बढ़ सकता है। नकली साजिश से अलग होने वाले स्कैटर प्लॉट के क्षेत्रों के अनुरूप सेल आबादी को अलग करने के लिए प्रवाह सॉर्टर के द्वार को परिभाषित करें। क्रिस्टल युक्त कोशिकाओं से संबंधित आबादी की पुष्टि करने के लिए चरण 1 में वर्णित प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा क्रमबद्ध नमूनों को चित्रित करें।
    5. चरण 2.2.4 में परिभाषित गेट्स का उपयोग करना, पीबीएस में क्रिस्टल से युक्त कोशिकाओं या किसी अन्य आइसोटोनेट बफर में। क्रिस्टल युक्त कोशिकाओं की संख्या के साथ-साथ बाद के चरणों की सुविधा के लिए अंतिम मात्रा के अनुसार क्रमबद्ध करें। सॉर्ट किए गए सेल को बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें
      नोट: एक घंटे में,> 300,000 पॉलीहेड्रा-कॉनटीनिंग कोशिकाओं को एक सेल सॉर्टर पर 100 मिमी नोजल (39 kHz की आवृत्ति के साथ 138 केपीए) के साथ सॉर्ट किया जाता है। कोशिकाओं की यह राशि तैयार करने के लिए पर्याप्त है> 1,000 meshes
    6. चरण 2.1.7 में वर्णित प्रोटोकॉल के बाद, क्रिस्टल युक्त कोशिकाओं में संवर्धन की पुष्टि करने के लिए प्रकाश माइक्रोस्कोप वाले कक्षों को चित्रित करें। डेटा संग्रह के लिए नमूना तैयार करना जितनी जल्दी हो सके सेल वर्गीकरण के बाद किया जाना चाहिए क्योंकि क्रिस्टल समय के साथ नीचा हो सकता है या सेल रोग के कारण रिलीज हो सकता है।

चित्रा 4
चित्रा 4 : सेल-सॉर्टिंग प्रतिनिधि प्रवाह cytometry ( ए ) गैर-संक्रमित कोशिकाओं (नकली), जिसमें क्रिस्टल नहीं होते हैं और बी ( बी ) बीएमसीपीवी 1 पॉलीहेड्रिन के लिए पुनः संयोजक बाक्यूलोवायरस द्वारा संक्रमित एसएफ 9 कोशिकाएं हैं। दो आबादी अल के बीच बिखरने के पैटर्न में अंतरक्रिस्टल युक्त सेल की आबादी (लाल गेट, उच्च एसएससी मूल्यों) के घाट कम। प्रत्येक भूखंड 20,000 सॉर्टिंग इवेंट्स का प्रतिनिधित्व करता है। एसएससी: पक्ष प्रकाश बिखरने; एफएससी: आगे प्रकाश बिखरने ( सी ) सॉर्टेड कोशिकाओं की एक प्रतिनिधि आबादी की ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी छवि, इंट्रासेल्युलर क्रिस्टल की उपस्थिति दिखा रही है। स्केल = 50 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

3. डेटा संग्रह के लिए नमूना तैयार करना

नोट: यदि खंड 3.1 में विस्तृत प्रोटोकॉल का उपयोग प्रायोगिक चरणबद्ध करने के लिए कोशिकाओं या क्रिस्टल को व्युत्पन्न किया जाना है। अन्यथा, सीधे सेलुलो विश्लेषण में शुद्ध क्रिस्टल या 3.3 के लिए 3.2 वर्गों पर जाएं ।

  1. शुद्ध या सेल्युलो माइक्रोक्रियास्टल्स में व्युत्पत्तिकरण
    सावधानी: उपयोग करने से पहले सभी प्रासंगिक सामग्री सुरक्षा डेटा शीट (एमएसडीएस) से परामर्श करें।प्रायोगिक चरणबद्ध करने के लिए इस्तेमाल किए गए अधिकांश रसायनों तीव्रता से विषाक्त हैं। रासायनिक फ्यूम हुड और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों के उपयोग सहित सभी उपयुक्त सुरक्षा पद्धतियों का उपयोग करें आपकी संस्था नीति के अनुसार अपशिष्ट उत्पादों का निपटान करें
    नोट: भारी परमाणुओं की प्रकृति, उनकी एकाग्रता और ऊष्मायन समय बीएमसीपीवी 1 पॉलीहेड्रन के क्रिस्टल के लिए एक संकेत के आधार पर दिया जाता है। ये पैरामीटर प्रत्येक नए लक्ष्य के लिए प्रयोगात्मक निर्धारित होना चाहिए। स्टेपएप नीले रंग के साथ बाद में धुंधला हो जाना 3.3.2 को छोड़ा जा सकता है, यदि चरणबद्ध करने के लिए उपयोग किए जाने वाले रासायनिक परिसर से कोशिकाओं को आसानी से रंग दिया जाता है।
    1. वांछित भारी परमाणुओं के संतृप्त समाधान तैयार करें (या प्रयोगात्मक चरण के लिए इस्तेमाल किए गए अन्य रसायनों के समाधान)। आमतौर पर, प्रत्येक भारी परमाणु के लिए 100 μL से कम मात्रा की आवश्यकता होगी। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए एक microcentrifuge में अधिकतम गति पर centrifugation के द्वारा undissolved नमक और मलबे निकालें
    2. ~ 50,000 क्रिस्टल के अल्कोट्स तैयार करेंया भारी परमाणु परिसर के अनुसार क्रमबद्ध कोशिकाएं यदि पीबीएस व्युत्पन्नकरण के लिए इस्तेमाल रासायनिक के साथ संगत नहीं है ( यानी तरल पदार्थों के फार्म और समाधान बादल बन जाता है), माइक्रोसिंत्रिफ़्यूज में कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए 4000 xg पर क्रिस्टल, या 3 मिनट के लिए 150 xg पर कोशिकाओं को हटा दें सतह पर तैरनेवाला और धीरे से एक उपयुक्त बफर के 20 μL में क्रिस्टल या कोशिकाओं को पुन: resuspend। यह सुनिश्चित करने के लिए पेलेटिंग और रिसासपेंशन को दोहराएं कि पीबीएस का कोई निशान नहीं रहेगा। सभी अल्कोटों के लिए अंतिम मात्रा को 20 μL में समायोजित करें
    3. क्रिस्टल या कोशिकाओं के लिए 20 μL भारी अणु समाधान या पसंद के अन्य रासायनिक संयोजन जोड़ें। भारी परमाणु का इष्टतम एकाग्रता सेलुलर मापदंडों (पारगम्यता, ऑफ-लक्ष्य प्रोटीन ...) और ब्याज की प्रोटीन के क्रिस्टल की प्रकृति के संयोजन पर निर्भर करेगा। प्रारंभिक बिंदु के रूप में, 3 अलग सांद्रता का परीक्षण करें: पूर्ण संतृप्ति, 1 / 10e, 1/100 ए
    4. नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस तक 3 दिन तक रखें। पॉलीह के क्रिस्टलएड्रिन बहुत प्रतिरोधी और घने हैं और भारी परमाणुओं को शामिल करने के लिए लंबे समय तक साबुन की आवश्यकता होती है; अन्य प्रकार के क्रिस्टल के लिए ऊष्मायन अवधि और भारी परमाणुओं की एकाग्रता को प्रयोगात्मक रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए। बहुत कम इन्सुबेशन समय भारी परमाणु की उचित मात्रा में शामिल करने की अनुमति नहीं देगा, जबकि लंबे समय तक ऊष्मायन समय क्रिस्टल की अखंडता को प्रभावित कर सकता है, इसलिए उनकी विवर्तन की गुणवत्ता को कम कर सकता है या उन्हें भंग कर सकता है। प्रारंभिक बिंदु के रूप में, प्रत्येक भारी परमाणु समाधान ( जैसे 1 मिनट, 1 घंटे और रात भर) के लिए 3 अलग-अलग ऊष्मायन समयों की कोशिश करें। सफल व्युत्पत्ति का विवर्तन डेटा के विश्लेषण के आधार पर मूल्यांकन किया जाता है जैसा कि अनुभाग 5 में वर्णित है और उसमें संदर्भ हैं।
    5. क्रिस्टल को 4,000 x ग्राम पर माइक्रोसिंत्रिफ़ाइड में कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए, या 3 मिनट के लिए 150 xg पर कोशिकाओं को क्रिस्टल पेलेटिंग से दूर रखें, सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और धीरे-धीरे क्रिस्टल को पुन: आकार दें या 10 μ एल बफर में कोशिकाओं को फिर से खोलें ।
  2. सावधानी: तरल नाइट्रोजन का प्रयोग खतरे से जुड़ा होता है जैसे एफाइक्सिजन, कोल्ड बर्न, ऑक्सीजन-समृद्ध वातावरण और विस्फोट में आग। कृपया अपनी संस्था के जोखिम प्रबंधन और सुरक्षित कार्य प्रथाओं से परामर्श करें।
    1. चरण 2.1.9 में गणना की गई क्रिस्टल एकाग्रता के आधार पर, नमूना को कम करके 10 7 क्रिस्टल / एमएल को एकाग्रता को समायोजित करें; या माइक्रोसेंट्रिफ्यूज में कमरे के तापमान पर 4 मिनट के लिए 4,000 XG पर क्रिस्टल को छिद्रण करके, सतह पर तैरनेवाला को हटाकर अंतिम मात्रा को समायोजित कर सकते हैं, और धीरे-धीरे क्रिस्टल को पुन: resuspending
    2. यदि नमूनों को पहले से जमे हुए होने के लिए किया जाता है, तो तरल नाइट्रोजन के साथ शुष्क जहापर या देवर को शांत कर दें। शीशियों या पिक तैयार करें, जैसा उपयुक्त है, और उन्हें तरल नाइट्रोजन के साथ शांत करें।
    3. क्रिस्टल गोली resuspend और pipetting द्वारा एक micromesh पर एक क्रिस्टल की 0.5 μL छोटी बूंद लागू होते हैं। 25 माइक्रोग्राम वर्ग के साथ 700 सुक्ष्ममापी मेष का उपयोग करेंशुरुआती बिंदु के रूप में छेद मेष का क्षेत्र महत्वपूर्ण नहीं है, लेकिन एक बड़े क्षेत्र मेष प्रति अधिक क्रिस्टल प्रदान करता है और तैयारी के दौरान धीमी वाष्पीकरण की ओर जाता है। छेद के आकार को 25 माइक्रोन से बड़ा क्रिस्टल के आकार से मेल खाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। यदि व्यवस्थित अध्ययन के लिए जरूरी है, डेटा संग्रह के दौरान एक व्यवस्थित ग्रिड स्कैन की सुविधा के लिए अनुक्रमित मेष उपलब्ध हैं।
    4. एक कागज बाती के साथ धुंधला करके अतिरिक्त तरल निकालें। क्रिस्टल एक दूसरे को छूने के बिना, जाल पर समान रूप से फैला होना चाहिए चरण 3.1.1 दोहराएं नमूना एकाग्रता के अनुकूलन के लिए जल्दी से आगे बढ़ो और बहुत अधिक तरल पदार्थ को दूर नहीं करें। Cryoprotectant की अनुपस्थिति में, तरल लवण क्रिस्टल गठन और / या फिल्म के नुकसान के जोखिम के साथ तेजी से वाष्पीकरण।
    5. क्रियोप्रोटेक्टेंट जोड़ें: जिप पर पानी में 50% इथाइलीन ग्लाइकोल के समाधान का 0.5 μ एल पाइप जोड़ें (क्रोनबफ़र की संरचना नमूना के लिए अनुकूलन की जाती है; सी के अनुकूलन के लिए सुझाव;रिसोप्रक्टेंट को संदर्भ में पाया जा सकता है 30 ) एक कागज की विकट से धुंधला करके अतिरिक्त तरल निकालें। पिछले चरण के विपरीत, यहां विलायक की शेष फिल्म क्रॉलल, बीम पथ और गोनियोमीटर के बीच संरेखण की प्रक्रिया को जटिल बनाने वाले लंबक प्रभाव को कम करने के लिए जितनी पतली होनी चाहिए; और बीम पथ में तरल द्वारा एक्स-रे की बिखरने के कारण पृष्ठभूमि को कम करने के लिए।
    6. तुरंत तरल नाइट्रोजन में माइक्रोमुश फ्लैश करें और एक शीशी या रोबोट पक में स्थानांतरण करें, फिर एक ड्राई शिपर या भंडारण के लिए देवर के लिए।
  3. क्रिस्टल युक्त कोशिकाओं के साथ micromesh की तैयारी
    सावधानी: तरल नाइट्रोजन का प्रयोग खतरे से जुड़ा होता है जैसे एफाइक्सिजन, कोल्ड बर्न, ऑक्सीजन-समृद्ध वातावरण और विस्फोट में आग। कृपया अपनी संस्था के जोखिम प्रबंधन और सुरक्षित कार्य प्रथाओं से परामर्श करें।
    1. सॉर्ट किए गए कक्षों को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ़्यूज ट्यूब में ट्रांसफ़र करें। सेल सी के आधार परसेल सॉर्टर द्वारा दर्ज की गई मात्रा, पीबीएस के साथ नमूना को कम करके 10 7 कोशिकाओं / एमएल को एकाग्रता को समायोजित करें; या कोशिकाओं को कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए 150 xg को एक माइक्रोप्रोफ़्रिज में पेलेटिंग करके, सतह पर तैरनेवाला को हटाकर अंतिम मात्रा को समायोजित कर, और धीरे से कोशिकाओं को फिर से खोलना।
    2. 0.2% w / v के अंतिम एकाग्रता में ट्रिपैन नीले समाधान (0.4% w / v) के बराबर मात्रा वाले कोशिकाओं को मिलाएं।
    3. यदि नमूनों को पहले से जमे हुए होने के लिए किया जाता है, तरल नाइट्रोजन के साथ शुष्क जहापर या देवर को शांत कर दें। शीशियों या पिक तैयार करें, जैसा उपयुक्त है, और उन्हें तरल नाइट्रोजन के साथ शांत कर दें।
    4. धीरे से कोशिकाओं को पुन: resuspend और एक micromesh पर सॉर्ट किए गए कोशिकाओं के 0.5 μL pipet।
    5. एक कागज की विकट से धुंधला करके अतिरिक्त तरल निकालें। कोशिकाओं को एक दूसरे को छूने के बिना, मेष पर समान रूप से फैला होना चाहिए। यदि क्रियोप्रोटेक्टेंट (चरण 3.3.6) का उपयोग नहीं करते हैं, तो विलायक की शेष फिल्म लंबवत प्रभाव को कम करने के लिए जितनी पतली होनी चाहिए, वह जटिल हैक्रिस्टल, बीम पथ और गोनियोमीटर के बीच संरेखण की प्रक्रिया; और बीम पथ में तरल द्वारा एक्स-रे की बिखरने के कारण पृष्ठभूमि को कम करने के लिए।
    6. वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं में क्रियोप्रोटेक्टेंट जोड़ें: पाइपेट 0.5 μL 50% एथिलीन ग्लाइकॉल, 50% पीबीएस समाधान मेष पर। क्रोनबॉफ़र की संरचना को नमूना के रूप में अनुकूलित किया जाना है; Cryoprotectant के अनुकूलन के लिए सुझाव संदर्भ 30 में मिल सकते हैं। एक कागज की विकट के साथ धुंधला करके अतिरिक्त तरल निकालें, विलायक की केवल एक पतली फिल्म छोड़कर।
      नोट: क्रिप्ट्रैक्टेशन चरण को रद्द करने से एक्स-रे विवर्तन की गुणवत्ता में परिवर्तन नहीं हुआ जब सेल्युलो में क्रिस्टल पॉलीहेड्रिन का विश्लेषण किया गया था , जबकि यह चरण शुद्ध क्रिस्टल 20 के लिए आवश्यक था। यह केवल cryoprotectant समाधान के साथ कोशिकाओं के ऊष्मायन पर लागू होता है; क्रिस्टल पर विकिरण क्षति के प्रभाव को कम करने के लिए नमूना का 100K पर अभी भी विश्लेषण किया जाना चाहिए।
    7. तुरंतलिक्विड नाइट्रोजन में माइक्रोमुश फ्लैश करें और शीशी या रोबोट पक में स्थानांतरण करें, फिर एक सूखी जहापर या भंडारण देवर के रूप में उपयुक्त हो।

4. डेटा संग्रह

नोट: डेटा संग्रह के लिए उपयोग किए जाने वाले पैरामीटर एक मार्गदर्शिका के रूप में दिए गए हैं और प्रत्येक क्रिस्टल प्रकार और सिंक्रोट्रॉन बीमलाइन के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।

  1. माइक्रोफोकस क्रिस्टलोग्राफ़ी बीमलाइन पर डेटा लीजिए (माइक्रोफोकस बीमलाइन और उनकी विशेषताओं की सूची के लिए सीएफ संदर्भ 7 )। यदि उपलब्ध हो, तो क्रिस्टल के आकार से मेल खाने वाली एक संगम बीम का उपयोग करें।
  2. एकल-तरंग दैर्ध्य अनुचित विच्छेदन विधि (एसएडी) द्वारा प्रयोगात्मक चरणबद्धता के लिए, पसंद के भारी परमाणु के अनुचित संकेत को अधिकतम करने वाली ऊर्जा पर इकट्ठा करें। एकाधिक Isomorphous रिप्लेसमेंट विधि का उपयोग करने के लिए चरणबद्ध, (एमआईआर), पसंद के भारी परमाणु के लिए एक उपयुक्त अवशोषण बढ़त की ऊर्जा से ऊपर इकट्ठा (http://skuld.bmsc.washington.edu/sc पर उपलब्ध हैatter / AS_periodic.html)।
  3. गोनियोमीटर पर जाल को लोड करने के बाद, फेस-ऑन (उत्तल पक्ष) और साइड-ऑन ओरिएंटेशन का उपयोग करके बीम पथ के साथ micromesh को केंद्रित करके शुरू करें। फिर, micromesh चेहरे के साथ, micromesh के एक विशेष क्षैतिज लेन (उदाहरण के लिए, केंद्रीय एक के साथ शुरू) के केंद्र को संरेखित करके संरेखण को ठीक से संरेखित करें। फिर इस क्षैतिज लेन के साथ डेटा को संरेखण में केवल मामूली समायोजन के साथ एकत्रित करें। यदि उपलब्ध है, तो संरेखण के ठीक-ट्यूनिंग के लिए कम खुराक एक्स-रे विवर्तन पर भुनने के आधार पर केन्द्रित का उपयोग करें (सिंक्रोट्रॉन बीमलाइन पर स्थानीय संपर्क से परामर्श करें)
    नोट: सिद्धांत रूप में क्रिस्टल को केवल 10-30 डिग्री के लिए बीम पथ के साथ गठबंधन करने की आवश्यकता होती है, विकिरण क्षति (आमतौर पर, 10 से 30 छवियों को 1 डिग्री दोलन के साथ) के कारण सीमित मात्रा में डेटा एकत्र किया जा सकता है। हालांकि, यह महत्वपूर्ण है कि संरेखण सटीक है क्योंकि क्रिस्टल आसानी से मिरोबैम द्वारा याद किया जा सकता है (आमतौर पर एक व्यास से ढंका हुआ~ 10 माइक्रोन या छोटे के एर)
  4. विकिरण क्षति के कारण विवर्तन नष्ट हो जाने तक विवर्तन डेटा लीजिए। पॉलीहेड्रिन के क्रिस्टल के लिए, 10 सेकेंड का एक्सपोजर टाइम सीसीडी डिटेक्टर (कुल खुराक <30 एमजीआई) के साथ 13 केवी में लगभग 3.6 x 10 11 फोटॉनों के प्रवाह के लिए 1 डिग्री दोलन के लिए उपयोग किया जाता है। इस्तेमाल की गई क्रिस्टल की बीमलाइन और प्रकृति के आधार पर इन सेटिंग्स को अनुकूलित करें विशेष रूप से, पिक्सल एक्स-रे डिटेक्टरों के लिए कम खुराक और ठीक टुकड़ों की सिफारिश की जाती है
    नोट: यदि सेल्युलो रणनीति में उपयोग किया जाता है , तो ट्राप्पेन नीले रंग के साथ दाग वाले कक्षों को समर्थन पृष्ठभूमि के खिलाफ नीले बिंदु के रूप में दिखाई देगा, जिससे उन्हें बीम में संरेखित करना आसान हो जाएगा। यदि संमिलित माइक्रोबैम में लगभग समान आकार कोशिकाओं (~ 10 माइक्रोन) के रूप में होता है, तो एक सेल में निहित सभी क्रिस्टल एक साथ प्रकाशित हो जाएंगे। कई माइक्रोक्र्रीस्टल्स युक्त कोशिकाओं के लिए, यह कई विवर्तन पैटर्नों का अवलोकन करने की ओर जाता है, जो कि प्रक्रिया को मुश्किल हो सकता है हालांकि, diक्रिस्टल में से किसी एक से विवर्तन अक्सर विवर्तन पैटर्न पर हावी हो जाता है और डाटा प्रोसेसिंग के दौरान प्रैक्टिसिशन अनुक्रमित होता है। एक्स-रे किरण के साथ बीमलाइनों के लिए काफी छोटा है कि डेटा संग्रह से पहले एक क्रिस्टल पर केंद्र में बहुत कम एक्सरे फ्लक्स (> 95% एटैन्यूएशन) पर रेस्टरिंग का इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
  5. लेन में अगले क्रिस्टल के लिए आगे बढ़ें
  6. लेन के सभी क्रिस्टल का परीक्षण होने के बाद, अगली लेन पर आगे बढ़ें और संरेखण प्रक्रिया को दोहराएं। पर्याप्त डेटा एकत्र किया गया है या सभी क्रिस्टल का परीक्षण किया गया है तब तक आगे बढ़ें।
    1. सुनिश्चित करें कि जिस पर संसाधित किया गया लेन स्पष्ट रूप से पहचाना गया है ताकि क्रिस्टल को याद नहीं किया जा सकता है या दो बार शॉट (यदि आवश्यक हो, तो स्केच बनाएं)। आमतौर पर, सेल की विकिरण के बाद trypan नीले रंग बदल जाता है, जिसका उपयोग मार्कर के रूप में किया जा सकता है।

चित्रा 5
चित्रा 5 : माइक्रोमैशे समर्थन पर नमूनों से डेटा संग्रह रणनीति। ( ए ) प्रति लेन के आंकड़ों के संग्रह की रणनीति; संरेखण प्रत्येक लेन (डॉट्स) की शुरुआत में किया जाता है और डेटा लेन के साथ एकत्र किया जाता है। ( बी ) एक ट्रिपैन नीले-दाग वाले, एक जाल पर क्रिस्टल से युक्त सेल का क्लोज-अप, जैसा कि माइक्रोक्रियास्टॉलोग्राफी बीमलाइन स्क्रीन पर देखा गया है। ( सी ) एक जाली पर शुद्ध पॉलीहेड्रा का क्लोज-अप, जैसा कि माइक्रोक्रोस्ट्रॉलोग्राफी बीमलाइन स्क्रीन पर देखा गया है। मेष वर्ग 25 माइक्रोन x 25 माइक्रोन हैं। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

5. डाटा प्रोसेसिंग

नोट: यहां, हम केवल संक्षेप में डेटा प्रोसेसिंग के चरणों का उल्लेख करते हैं जो कि धारावाहिक माइक्रोक्रिस्ट्रॉलोग्राफी के लिए विशिष्ट हैं, जहां कई क्रिस्टल के डेटा मर्ज किए जाते हैं। कई उत्कृष्ट लेख हैं31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 की गहराई में डेटा प्रोसेसिंग का वर्णन और संरचना निर्धारण इस प्रोटोकॉल के दायरे से परे है।

  1. एक संदर्भ के रूप में सर्वोत्तम विवर्तन संकल्प और गुणवत्ता के साथ क्रिस्टल का चयन करें।
  2. प्रत्येक क्रिस्टल को मानक क्रिस्टलोग्राफ़ी पैकेज़ों का उपयोग करते हुए संसाधित करें जैसे कि HKL-2000 31 , Mosflm 32 , या XDS 33 यह सुनिश्चित करने के लिए कि विकिरण क्षति डेटासेट की गुणवत्ता खराब नहीं करता है, सावधानीपूर्वक पिछली छवि स्वीकार्य विकिरण क्षति के साथ चुनें। कट-ऑफ मानदंड जो अत्यधिक विकिरण क्षति दर्शाता है, प्रत्येक क्रिस्टल प्रकार, प्रसंस्करण अभ्यास और प्रयोग के उद्देश्य के विशिष्ट हैं। बीएमसीपीवी 1 पॉलीहेड्रिन क्रिस्टल के चरणबद्ध होने के लिए, सिग्नल-टू-एन के एक बार डेटा को त्याग दिया गया थाOise <I> / <σ (I)> प्रति छवि 2 से कम हो गई या आर सीएम की तुलना 50% से अधिक हो गई, जैसा कि एचएलएल -2000 31 द्वारा रिपोर्ट किया गया।
  3. प्रत्येक क्रिस्टल के लिए, संकल्प सीमा और फ़्रेम की संख्या को परिभाषित करें और सही पैरामीटर के साथ पुनप्रक्रिया को कम या कोई संकेत के साथ डेटा को एकीकृत करने से बचें।
  4. स्केलपैक जैसे एचएकेएल -2000 31 , एससीएएलए में सीसीपी 4 34 , 35 या एक्सएससीएडी 33 में मानक पैकेजों का उपयोग करते हुए सर्वोत्तम क्रिस्टल से संदर्भ क्रिस्टल के डेटा को स्केल और मर्ज करें। डेटासेट की वैश्विक गुणवत्ता की निगरानी करते हुए अलग-अलग क्रिस्टल के डेटा को धीरे-धीरे जोड़ दें, जब तक कि डाटासेट स्वीकार्य पूर्णता (> 95%) तक पहुंच न जाए। क्रिस्टल को नकार दें जो सबसे अच्छा / संदर्भ क्रिस्टल के साथ एक गरीब आइसोमोर्फिज़्म को प्रस्तुत करते हैं, जैसा कि इकाई सेल पैरामीटर और गरीब आर मर्ज / ची स्क्वायर प्रति छवि में अंतर से पता चला है। अगर बहुत अच्छे गुणवत्ता वाले डेटासेटसंदर्भ क्रिस्टल (स्कॉल्स) के साथ स्केल न करें, ब्लेंड 36 जैसे प्रोग्राम का उपयोग करें, जो मर्ज करने के लिए डेटासेट्स का सबसे अच्छा संयोजन को परिभाषित करने के लिए पदानुक्रमित क्लस्टरिंग करता है।
    नोट: कुछ अंतरिक्ष समूहों में, संदर्भ क्रिस्टल से मिलान करने के लिए वैकल्पिक अनुक्रमण विकल्पों का परीक्षण करने की आवश्यकता होती है।
  5. मानक क्रिस्टलोग्राफ़ी पैकेजों का उपयोग करके प्रयोगात्मक चरणबद्ध, आणविक प्रतिस्थापन या शोधन के लिए आगे बढ़ें।

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Representative Results

Vivo microcrystals में उपयोग संरचना निर्धारण के लिए दोनों वैकल्पिक तरीकों का एक सिंहावलोकन प्रस्तुत किया गया है ( चित्रा 1 )। Polyhedra आसानी से sonication और centrifugation द्वारा शुद्ध किया जा सकता है। उनके घनत्व के कारण, वे मलबे की एक परत के नीचे ट्यूब के नीचे एक परत बनाते हैं जो pipetting ( चित्रा 3 ए और 3 बी ) द्वारा हटाया जा सकता है। तब नमूना को कई प्रकार के सोनिकिंग और धोया जाता है जब तक कि गोली की सफेद और चॉकली पहलू ( चित्रा 3 सी ) से न्याय के रूप में शुद्धता के पर्याप्त स्तर तक नहीं पहुंच जाता।

सेलुलो दृष्टिकोण में, गैर-संक्रमित कोशिकाओं के प्रवाह कोशिकामितीय प्रोफाइल की तुलना क्रिस्टल से युक्त कोशिकाओं के प्रोफाइल से की जाती है और यह निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है कि क्रिस्टल से युक्त कोशिकाओं को किस प्रकार से दूर करने के लिए चयन किया जाना चाहिए।अन्य कोशिकाओं ( चित्रा 4 )। इस उदाहरण में, पॉलीहेड वाले युक्त कोशिकाओं में गैर-संक्रमित कोशिकाओं की तुलना में एक उच्च साइड स्कैटरिंग है। अन्य क्रिस्टल प्रकारों के लिए बिखराव पैटर्न में अन्य अंतर देखे जा सकते हैं और गेटिंग को तदनुसार संशोधित किया जाना चाहिए।

शुद्ध माइक्रोक्रिस्टल या क्रिस्टल युक्त कोशिकाएं एक माइक्रोमेश ( चित्रा 5 ) पर पाइपेट की जाती हैं। ट्रांस्पैन नीले रंग के साथ दाग कोशिकाओं को आसानी से सिंक्रोट्रॉन बीमलाइन ( चित्रा 5 बी ) में उपलब्ध कैमरों का उपयोग करके देखा जा सकता है, जबकि शुद्ध क्रिस्टल अपने छोटे आकार ( चित्रा 5 सी ) के कारण एक्स-रे बीम की पहचान और संरेखित करने के लिए श्रमसाध्य हैं। डेटा एकत्र करते समय, केंद्र प्रक्रियाओं को कम करने और एक ही सेल या क्रिस्टल को दो बार उजागर करने या किसी भी ( चित्रा 5 ए ) गायब होने से बचने के लिए ग्रिड पैटर्न में आगे बढ़ना सबसे अच्छा है। डेटा संग्रहविवर्तन सीमा में मतभेद, विकिरण क्षति का प्रभाव और आइसोमोर्फिज़्म की संभावित कमी के कारण खाते में सावधानीपूर्वक प्रोसेस किया जाना चाहिए।

आकृति 1
चित्रा 1 : विवो माइक्रोक्रियास्टल्स में संरचना के निर्धारण के लिए दो तरीकों का अवलोकन। रीकॉम्बिनेट अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग करके ब्याज की प्रोटीन की अधिक अभिव्यक्ति द्वारा सेल संस्कृति में माइक्रोक्र्रीस्टल्स का उत्पादन किया जाता है। विशिष्ट मामलों में, विशेष स्थितियों में कोशिकाओं द्वारा स्वाभाविक रूप से माइक्रोक्र्रीस्टल का भी उत्पादन किया जा सकता है शीर्ष पंक्ति शास्त्रीय दृष्टिकोण को दर्शाती है जहां कोशिकाएं लिसीड होती हैं और क्रिस्टल को विभेदक केन्द्रोत्सव द्वारा शुद्ध किया जाता है। शुद्ध microcrystals एक micromesh पर pipetted हैं अतिरिक्त तरल हटाने के बाद, एक cryoprotectant समाधान जोड़ा जाता है, अतिरिक्त तरल फिर से धमाकेदार है और जाल फ्लैश-कूल्ड है। एक्स-रे अंतर के लिए अंश प्रयोग, क्रिस्टल ध्यान से एक्सरे किरण के साथ गठबंधन कर रहे हैं, जो डेटा संग्रह में दर सीमित करने के लिए हो सकता है। नीचे की पंक्ति सेल्युलो दृष्टिकोण में प्रस्तुत करती है कोशिकाओं को विशेष रूप से क्रिस्टल युक्त कोशिकाओं को चुनने के लिए प्रवाह-साइटमैट्री द्वारा सॉर्ट किया जाता है। दृश्यों को सुगम बनाने और एक माइक्रोमॉड पर प्रसार करने के लिए कोशिकाओं को ट्राइपैप नीला के साथ दाग दिया गया है। इस मामले में, एक cryoprotectant के अलावा वैकल्पिक है। एक्स-रे विवर्तन प्रयोगों के लिए, कोशिका प्रक्रियाओं को सुगम बनाने वाली समवर्ती बीमलाइनों पर उपलब्ध विशिष्ट कैमरों के उपयोग से कोशिकाओं को आसानी से देखा जा सकता है।
स्वचालित तरल क्रोमैटोग्राफी सिस्टम की छवि जीई हेल्थकेयर एबी, अपसला, स्वीडन की सौजन्य इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
= "Xfig"> चित्रा 2 : विवो माइक्रोक्रोस्ट्रॉल के उदाहरण। विवो क्रिस्टल के चयनित उदाहरण: ( ए ) साइप्रोवायरस पॉलीहेड्रा के साथ एसएफ 9 कोशिकाएं; ( बी ) एलडी 652 कोशिकाएं एंटोमोक्कोविरस स्फेरोइड्स; ( सी ) Cry3A क्रिस्टल (तीर) के साथ बैसिलस थुरिंजियन्सिस ; (घ) ट्रिपैनोसोमा ब्रूसी cathepsin बी क्रिस्टल के साथ Sf9 कोशिकाओं; ( ई ) calcineurin क्रिस्टल (तीर) के साथ Sf21 कोशिकाओं; ( च ) पीओए के साथ सीओएस 7 कोशिका मोनोलायर: इनका 1 क्रिस्टल; ( जी ) आईजीजी क्रिस्टल के साथ सीओओ कोशिकाएं अनुमति के साथ 14 , 18 , 2 9 , 37 , 3 9 , 42 से प्रजनित। स्केल बार = 10 माइक्रोन कृपया एक बड़े पैमाने पर देखने के लिए यहां क्लिक करेंइस आंकड़े के एर संस्करण

तालिका एक
तालिका 1: रिवाइबिनेंट प्रोटीन को व्यक्त करने वाले संवर्धित कोशिकाओं में विवो क्रिस्टल का सारांश। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में बहुत कम क्रिस्टल के विश्लेषण को सुलझाने के उद्देश्य से माइक्रोक्रॉस्टिस्ट का विश्लेषण करने के लिए दो दृष्टिकोण दिए गए हैं जो कि अतीत में अनदेखी की गई होगी।

माइक्रोक्रिसल शुद्धि के लिए महत्वपूर्ण कदम
प्रस्तुत प्रोटोकॉल को बोम्बेक्स मोरी सीपीवी 1 पॉलीहेड्रन का उपयोग करके एक मॉडल प्रणाली के रूप में एसएफ 9 सेल में व्यक्त किया गया है। हालांकि, vivo microcrystals में यांत्रिक प्रतिरोध में एक महान परिवर्तनशीलता प्रदर्शित करते हैं। उदाहरण के लिए, cathepsin बी कीट कोशिकाओं में विकसित सूई की तरह क्रिस्टल यांत्रिक तनाव के लिए कठोर और अत्यधिक प्रतिरोधी हैं, और एक प्रोटोकॉल का उपयोग करके 14 को वर्णित एक के समान शुद्ध किया जा सकता है। दूसरी ओर, फायरफ़ीई ल्यूसिफेस क्रिस्टल, जिसे सुसंस्कृत कीट कोशिकाओं में भी विकसित किया गया और एक समान सुई की तरह आकृति विज्ञान के साथ, तुरंत सेल लैसिस 38 पर भंग हो जाता है। इस प्रकार, विवो में निकासी और शुद्धि के लिए प्रोटोकॉलचरण 1.3, 2 ए 3-4, 2 बी 4, 3.1.3-4 और 3.2 ए 5 में वर्णित विशेष मामलों के लिए क्रिस्टल को परीक्षण-त्रुटि के आधार पर रूपांतरित करने की आवश्यकता होगी।

नाजुक क्रिस्टल के लिए, सेल मलबे से अलग होने के कारण, कम गति से सेंटीफ्यूगेशन ( यानी 200 x) या ट्यूब के निचले भाग में एक सूक्रोज तकिया के अतिरिक्त दोहराए जाने वाले सोनिक के बजाय प्राप्त किया जा सकता है। एक सामान्य नियम के रूप में, विवर्तन डेटा संग्रह उद्देश्यों के लिए तैयार क्रिस्टल नमूने अत्यधिक शुद्ध होने की आवश्यकता नहीं करते हैं। इस प्रकार, तेजी से शुद्धि क्रोनिक-क्रिस्टल को ठंडा करने से पहले बेहतर हो सकती है।

इन विट्रो और विवो माइक्रोक्रियास्टल्स में आवेदन
यद्यपि दोनों प्रोटोकॉल यहां vivo में विकसित क्रिस्टल के विश्लेषण के साथ सचित्र हैं, तो इस पद्धति का इस्तेमाल आसानी से माइक्रोक्रॉस्टल के लिए किया जा सकता है जो शुद्ध रीकॉम्बीनंट प्रोटीन से क्रिस्टल ट्रे में उगाया जाता है। इस मैमामले में, निम्न संशोधनों को माना जाना चाहिए: i) पिपेटिंग द्वारा उन्हें स्थानांतरित करने के बजाय, मैश समर्थन का उपयोग सीधे क्रिस्टलीकरण ड्रॉप से ​​माइक्रोक्र्रीस्टल का उपयोग करने के लिए किया जा सकता है; Ii) क्योंकि क्रिस्टल की मात्रा एक सीमित कारक हो सकती है, क्रिस्टल के अत्यधिक हटाने से बचने के लिए, जाल समर्थन से तरल पदार्थ को अधिक से अधिक खाली करते समय विशेष देखभाल की आवश्यकता होगी; Iii) पारंपरिक क्रिस्टलोग्राफी में किए गए के रूप में अलग-अलग क्रियोप्रोटेक्टेंट बफ़र्स का परीक्षण करने की आवश्यकता होगी (संदर्भ 30 देखें)।

दूसरी तरफ, विवो -क्रिस्टल के लिए, सेलुलो दृष्टिकोण में दृढ़ता से सिफारिश की जाती है। क्योंकि शुद्ध क्रिस्टल की तुलना में कोशिकाओं को कल्पना और हेरफेर करना आसान है, बीमटाइम के उपयोग के संदर्भ में यह दृष्टिकोण अधिक कुशल है और शोधकर्ताओं के लिए माइक्रोपर्रीस्टॉलोग्राफी में बहुत कम या कोई अनुभव नहीं है। यह नाजुक क्रिस्टल के लिए भी अधिक उपयुक्त है जो निकासी और पारे से प्रभावित हो सकता है रासायनिक पर्यावरण में होने वाले बदलावों के कारण कोशिका से इजेक्शन, आस-पास के प्रोटीन और यांत्रिक क्षति को कम करना। इसके अलावा, कोशिकाओं को क्रिस्टल के लिए एक सुरक्षात्मक वातावरण प्रदान करते हैं, एक क्रियोप्रोटेक्टेंट के अलावा की आवश्यकता को कम करते हुए। क्रोनोफ्रांटेक्शन उपचार को रद्द करने से पहले दोषियों के संचय को रोकने के लिए दिखाया गया है और कमरे के तापमान 40 में डेटा संग्रह के लिए व्यक्तिगत क्रिस्टल के बीच आइसोमोर्फिज़्म में सुधार हुआ है। सेल्युलो प्रोटोकॉल में क्रायोजेत्रिक समाधान में ऊष्मायन की आवश्यकता को भी नजरअंदाज नहीं किया जाता है, जबकि अभी भी क्रायोजेनिक तापमान पर डेटा संग्रह की अनुमति है। कुल मिलाकर, सेल्यूलो डेटा संग्रह में दो मुख्य लाभ हैं: 1) यह बीम टाइम 20 की दी गई अवधि के लिए बेहतर गुणवत्ता और उच्च संकल्प के डेटा का उत्पादन कर सकता है; और 2) यह एक सेलुलर वातावरण में क्रिस्टाइज्ड प्रोटीन का रखरखाव करता है जिससे जैविक रूप से संबंधित लिगैंड को बनाए रखने की संभावना बढ़ जाती है।

ताकतवर "> तकनीक की सीमाएं
सीरियल माइक्रोक्रियास्टॉलोग्राफ़ी का एक आंतरिक जटिलता डेटा संग्रह के दौरान उत्पन्न आंशिक डेटासेट की महत्वपूर्ण संख्या है। नतीजतन, डेटा प्रोसेसिंग एक तेजी से समय लेने वाली प्रक्रिया बन जाती है हालांकि, डेटा प्रसंस्करण के लिए बुनियादी कार्यप्रवाह काफी हद तक स्वचालित हो सकता है। उदाहरण के लिए, आइसोमोर्फ़स क्रिस्टल का इष्टतम चयन, पदानुक्रमिक क्लस्टर विश्लेषण 28 द्वारा निर्धारित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए ब्लेंड 36 में कार्यान्वित किया गया। इसके अलावा, एक्स-रे फ्री इलेक्ट्रान लेसरों (एक्सएफईएल) के विश्लेषण के लिए विकसित किए गए कार्यक्रमों को सिंक्रोट्रॉन बीमलाइन 2 पर एकत्र किए गए सीरियल माइक्रोक्रियस्ट्रॉलोग्राफ़ी डेटा को संसाधित करने के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है, और कुछ बीमलाइनों में जाल और क्रिस्टल पहचान के स्वचालित रेस्टरिंग को सीरियल डेटा संग्रह 2 , 41

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों को मोनाश विश्वविद्यालय में फ्लोकोरे की सुविधा के लिए ऑस्ट्रेलियाई सिंक्रोट्रोन के एमएक्स 2 बीमलाइन और कैथ्रीन फ्लैनगन और एंड्रयू फ्रागा में समर्थन के लिए शुद्ध माइक्रोक्रॉस्टल्स, डैनियल एरिक्सन और टॉम कैरोडोक-डेविस की तस्वीरों को उपलब्ध कराने के लिए चैन-सीन ले को स्वीकार करना चाहेंगे। बहुमूल्य सहायता

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sf9 cells Life Technologies
SF900-SFM insect medium Life Technologies
1 L cell culture flask Thermofisher Scientific
Shaking incubator for insect cell culture Eppendorf
50 mL conical tubes Falcon
Centrifuge with swing buckets for 50 mL tubes Eppendorf
Sonicator equiped with a 19 mm probe MSE Soniprep 150 
Glass slides Hampton Research
Hemacytometer Sigma-Aldrich
Propidium iodide Thermofisher Scientific
BD Influx cell sorter  BD Biosciences
Hampton Heavy atom screens Hampton Research
Microcentrifuge Eppendorf
Micromesh Mitigen 700/25 meshes offer a larger surface. Indexed meshes can be purchased for systematic studies.
Paper wick Mitigen The size of the paper wick can be varied for optimal flow. This will largely depend on the nature of the crystals and cryoprotectant used.
Ethylene glycol Sigma-Aldrich
Trypan blue Life Technologies
MX2 microfocus beamline Australian Synchrotron A list of available microfocus beamlines can be found in Boudes et al. (2014) Reflections on the Many Facets of Protein
Microcrystallography. Australian Journal of Chemistry 67 (12), 1793–1806,
doi:10.1071/CH14455.

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References

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बायोकैमिस्ट्री अंक 125 माइक्रोक्रिस्ट्रॉलोग्राफ़ी माइक्रोक्रियास्टल्स एक्स-रे विवर्तन, पॉलीहेड्रा,
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Boudes, M., Garriga, D., Coulibaly, F. Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction. J. Vis. Exp. (125), e55793, doi:10.3791/55793 (2017).

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