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Biochemistry

Microcristalografía de Protein Crystals y Published: July 21, 2017 doi: 10.3791/55793
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Infection and Immunity Program, Monash Biomedicine Discovery Institute, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Monash University
* These authors contributed equally

Summary

Se presenta un protocolo para la cristalografía de rayos X utilizando microcristales de proteínas. Se comparan dos ejemplos que analizan microcristales de crecimiento in vivo después de la purificación o en celulo .

Abstract

El advenimiento de líneas de luz de microfoco de alta calidad en muchas instalaciones de sincrotrón ha permitido el análisis de rutina de cristales menores de 10 μm en su dimensión más grande, lo que representaba un desafío. Presentamos dos flujos de trabajo alternativos para la determinación de la estructura de microcristales de proteínas por cristalografía de rayos X con un enfoque particular en los cristales crecidos in vivo . Los microcristales se extraen de las células mediante sonicación y se purifican mediante centrifugación diferencial o se analizan en celulo después de la clasificación celular mediante citometría de flujo de células que contienen cristal. Opcionalmente, los cristales purificados o las células que contienen cristal se empapan en soluciones de átomos pesados ​​para el phasing experimental. Estas muestras se preparan entonces para experimentos de difracción de una manera similar por aplicación sobre un soporte de micromesh y enfriamiento rápido en nitrógeno líquido. Describimos brevemente y comparar los experimentos de difracción en serie de microcristales aislados y cristal-Que contienen células que utilizan una línea de luz de sincrotrón microfoco para producir conjuntos de datos adecuados para la fase, la construcción de modelos y el refinamiento.

Estos flujos de trabajo se ejemplifican con cristales de la poliedrina Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) producida por la infección de células de insecto con un baculovirus recombinante. En este caso de estudio, en el análisis de celulo es más eficiente que el análisis de cristales purificados y produce una estructura en ~ 8 días desde la expresión hasta el refinamiento.

Introduction

El uso de la cristalografía de rayos X para la determinación de estructuras de alta resolución de macromoléculas biológicas ha experimentado una progresión constante en las últimas dos décadas. La creciente aceptación de la cristalografía de rayos X por investigadores no expertos ejemplifica la democratización de este enfoque en muchos campos de las ciencias de la vida 1 .

Históricamente, los cristales con dimensiones inferiores a ~ 10 μm han sido considerados como desafiantes, si no inutilizables, para la determinación de la estructura. La creciente disponibilidad de rayos de luz de microfoco dedicados a fuentes de radiación de sincrotrón en todo el mundo y los avances tecnológicos, tales como el desarrollo de herramientas para manipular microcristales, han eliminado gran parte de estas barreras que obstaculizan el amplio uso de la microcristalografía de rayos X. Avances en microcristalografía de rayos X serie 2 , 3 y micro difracción de electrones 4 haHemos demostrado que el uso de micro y nanocristales para la determinación de la estructura no sólo es factible, sino que a veces es preferible al uso de grandes cristales 5 , 6 , 7 .

Estos avances se aplicaron por primera vez al estudio de péptidos [ 8] y cristales naturales producidos por virus de insectos [ 9 , 10] . Ahora se utilizan para una amplia gama de macromoléculas biológicas, incluyendo los sistemas más difíciles, como proteínas de membrana y grandes complejos [ 11] . Para facilitar el análisis de estos microcristales, se han analizado en meso , en particular proteínas de membrana 12 y en chips microfluídicos 13 .

La disponibilidad de estas nuevas metodologías microcrystallography ha planteado la posibilidad de utilizar enComo una nueva ruta para la biología estructural 14 , 15 , 16 que ofrece una alternativa a la cristalogénesis clásica in vitro . Desafortunadamente, incluso cuando se pueden producir cristales in vivo , quedan varios obstáculos tales como la degradación o pérdida de ligandos durante la purificación de las células, dificultad en la manipulación y visualización de los cristales en la línea de luz del sincrotrón y tediosos experimentos de difracción de rayos X. Como una alternativa cristales también se han analizado directamente dentro de la célula sin ningún paso de purificación 17 , 18 , 19 . Un análisis comparativo sugiere que tal en los enfoques cellulo puede ser más eficiente que el análisis de cristales purificados y los datos de rendimiento de mayor resolución [ 20] .

Este protocolo está enTendieron a ayudar a los investigadores nuevos a la microcristalografía de proteínas. Proporciona metodologías centradas en la preparación y manipulación de muestras para experimentos de difracción de rayos X en una línea de luz de sincrotrón. Se proponen dos opciones utilizando cristales aislados para microcristalografía clásica o células que contienen cristal ordenadas por citometría de flujo para análisis de celulo ( Figura 1 ).

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Protocol

Nota: Se ha descrito cristalización in vivo en muchos organismos incluyendo bacterias, levaduras, plantas, insectos y mamíferos (revisado en la referencia 21 ). La cristalización de proteínas recombinantes también se ha conseguido en el laboratorio usando transfección transitoria de células de mamífero e infección por baculovirus de células de insecto. El protocolo siguiente se ha desarrollado utilizando el gen de poliedrina Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) clonado en un baculovirus recombinante bajo el promotor de poliedrina de baculovirus, generado según las instrucciones de la referencia 22 . Por lo tanto, aunque este protocolo puede adaptarse a otros tipos de células ( por ejemplo células de mamífero), describimos aquí los procedimientos para las células de insecto. El protocolo supone que ya se ha alcanzado la sobreexpresión de la proteína de interés. Los métodos para la producción de un baculovirus recombinante y su uso para la expresión de la proteína de interés son avEn las referencias 23 , 24 , 25 , 26 , 27 .

1. Identificación de células que contienen cristal

  1. Si las células se cultivan en monocapa, inspeccionarlas directamente en el matraz. Si las células se cultivan en cultivo líquido, utilice el siguiente protocolo.
    1. Utilizando una pipeta serológica estéril, transfiera 500 μl de células en un tubo de microcentrífuga. Tenga cuidado de asegurar que se mantenga la esterilidad del cultivo principal; Manejar las células en un gabinete de bioseguridad Clase II y seguir las técnicas asépticas estándar.
    2. Pipetee 5 μl de células del tubo de microcentrífuga sobre un portaobjetos de vidrio.
    3. Cuidadosamente colocar un cubreobjetos de vidrio sobre el líquido, evitando la formación de burbujas de aire. Si la diapositiva no se puede visualizar en 15 minutos, selle la cubreobjetos con grasa al vacío para evitar la evaporaciónCión.
  2. Imagen del frasco o la diapositiva con un microscopio invertido. Si está disponible, use contraste de fase y / o microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC). Ambas técnicas mejoran el contraste en muestras transparentes y enfatizan líneas y bordes, facilitando así la identificación de cristales in vivo .
  3. Examine cuidadosamente las células. Comience con una ampliación de 200X y realice el zoom con un aumento máximo al detectar un cristal potencial. La presencia de cristales puede sugerirse indirectamente por cambios en la morfología celular ( Figura 2 ). Busque bordes afilados y cambios en la refractividad (si usa contraste de fase o DIC). Los cristales conocidos in vivo adoptan diferentes formas incluyendo varillas, pilas de agujas, cubos, pirámides y poliedros (véanse la Figura 2 y la Tabla 1 para algunos ejemplos).
    Nota: La proporción de células que contienen cristales será diferente en cada caso y puede ser eveN varían entre las preparaciones pero en general uno no debe esperar encontrar cristales en todas las células. De manera similar, el número de cristales por célula es también variable (véase la Tabla 1 ), y puede encontrarse más de un cristal en una célula. Estos factores deben optimizarse cuando sea posible ajustando la multiplicidad de infección, alterando la longitud de expresión y variando el constructo de proteína. Por un lado, las condiciones de expresión de proteínas y el crecimiento celular que maximizan el número de células que contienen cristal mejorará la productividad ( por ejemplo, mayor multiplicidad de infección y recolección tardía de cultivo celular). Por otro lado, las condiciones en las que las células contienen un solo cristal facilitan la recolección de datos ( p . Ej., Baja multiplicidad de infección). Dado el enriquecimiento provocado por la clasificación por flujo descrito en el paso 2.2, se recomienda apuntar a cristales más grandes ( por ejemplo, un solo cristal por célula) incluso si la proporción de células que contienen cristales es baja.
  4. Si cristalS se identifican, registran su posición (cuando monocapa de imágenes en un matraz), y estimar el porcentaje de células que contienen cristales. Si está disponible, utilice un microscopio equipado con una cámara capaz de rastrear los cambios a nivel de una sola célula.
  5. Para las células en suspensión, determinar el grado de viabilidad celular siguiendo el protocolo detallado en la referencia 28 . Para las células cultivadas en una monocapa, estimar mediante inspección visual el grado aproximado de confluencia y cantidad de células desprendidas.
  6. Supervisar el crecimiento de los cristales, el crecimiento celular y la viabilidad dos veces al día.
  7. Cosechar las células tan pronto como el crecimiento del cristal parece detenerse. Para cristales notablemente robustos como poliedros virales, los tiempos de incubación extendidos (> 4 días) aumentan el número de cristales grandes. Sin embargo, para los cristales típicos de proteínas, se recomienda cosechar las células cuando la viabilidad cae por debajo del 80% para evitar daños causados ​​por la lisis celular.
  8. Retire el frasco de la incubadora y proceda aPaso 2.2 tan pronto como sea posible. Mantenga las células en hielo durante los siguientes pasos, a menos que se especifique lo contrario.

2. Purificación de la muestra

Nota: Se describen dos métodos de análisis de los cristales in vivo a partir de cristales purificados y en celulo , respectivamente.

  1. Purificación de cristales
    Nota: A menos que haya evidencia de que los cristales de interés son sensibles a temperaturas bajas, trabaje en hielo y utilice tampones helados para evitar la degradación del cristal.
    1. Pipetee 50 mL de células Sf9 infectadas en un tubo cónico de centrífuga de 50 mL. Esto representa ~ 4 x 10 ^ { 8} células en un experimento típico.
    2. Se sedimentan células a 450 xg durante 10 min a 4ºC.
    3. Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 40 ml de solución salina tamponada con fosfato enfriado (PBS), pH 7,4.
      Nota: PBS se propone como punto de partida para la purificación como un tampón isotónico estándar con el objetivo de mimIcking el ambiente celular donde los cristales in vivo crecieron. Se ha utilizado para la mayoría de los cristales in vivo cultivados en cultivo celular hasta la fecha 9 , 14 , 29 . Alternativamente, los medios DMEM también se ha utilizado con éxito en la purificación de cristales in vivo de células de mamíferos [ 19] . Si los cristales sufren visiblemente su transferencia en PBS o presentan una difracción pobre, este parámetro debe investigarse como fuente potencial de degradación.
    4. Sonicar el sedimento resuspendido durante 30 s a 10 mA usando un sonicador equipado con una sonda de 19 mm. Para evitar el calentamiento de la muestra, colóquela en un vaso lleno de hielo mientras sonica. Pueden usarse alteraciones químicas o mecánicas de las células como alternativas si los cristales parecen estar dañados por la sonicación como se evaluó en el paso 2.1.7.
    5. Centrifugar a 450 xg durante 10 min a 4 ° C. Después de la centrifugación, 2 capas son evidentes:Una capa superior de desechos celulares, que es de color marrón claro, y una pastilla inferior de cristales de poliedrina, que es blanca y calcárea.
    6. Deseche el sobrenadante y retire la capa superior por pipeteado cauteloso. Resupender el sedimento inferior en 40 ml de PBS enfriado.
    7. Evaluar la calidad de las muestras mediante imágenes con un microscopio óptico.
      1. Pipetee 5 μl de células o cristales purificados sobre un portaobjetos de vidrio. Esto se puede hacer a temperatura ambiente.
      2. Cuidadosamente colocar un cubreobjetos de vidrio sobre el líquido, evitando la formación de burbujas de aire.
      3. Imagine la diapositiva con un microscopio invertido con una ampliación de 200X. Imagen de la muestra dentro de los 15 minutos de su preparación en la diapositiva. Si la diapositiva no se puede visualizar en 15 minutos, selle la cubreobjetos con grasa al vacío para evitar la evaporación.
        NOTA: En el caso de los poliedros, los cristales aparecerán como cubos refringentes de ~ 1 - 10 μm por lado. Compruebe la integridad de los cristales en busca de signos de pérdida de nitidez(Por ejemplo, bordes redondeados), grietas o disolución. También monitorear la presencia de desechos celulares que aparecerán como grupos y objetos de tamaño y forma irregulares.
    8. Repita los pasos 2.1.5 a 2.1.7, reduciendo a la mitad el volumen de PBS utilizado para resuspender el gránulo en cada ciclo hasta que los cristales aparezcan libres de desechos. Resuspender el gránulo final en 1 ml de PBS enfriado y transferir los cristales a un tubo de microcentrífuga. Almacenar los cristales purificados a 4 ° C.
    9. Estime la concentración de cristales usando un hemocitómetro como lo describe el fabricante. Contar los cristales como si contara células.

figura 3
Figura 3 : Microcristales purificados in vivo . La purificación representativa de cristales de la poliedrina BmCPV1 de células de insecto Sf9 mostrando ( a ) restos de células sedimentadas y llorandoStals después de la sonicación, y ( b ) cerca de los escombros y capas de cristal. La capa de desechos se puede resuspender cuidadosamente en el sobrenadante y descartarse para una purificación más rápida de los cristales. ( C ) Imagen de microscopía óptica de poliedros purificados. Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Aislamiento de células que contienen cristal mediante citometría de flujo
    Nota: Para facilitar la definición de puertas en citometría de flujo, se recomienda cultivar un cultivo de control en paralelo al que expresa la proteína de interés. Esto puede hacerse infectando un matraz de células Sf9 con un baculovirus recombinante no relevante o preparando células simuladas infectadas. La clasificación y la obtención de imágenes de las muestras se realiza normalmente a temperatura ambiente.
    PRECAUCIÓN: El yoduro de propidio es un posible carcinógeno y debe manipularsecon cuidado.
    1. Pipetear 4 mL de células Sf9 infectadas - que representan ~ 3 x 10 7 células - en un tubo adaptado al análisis de citometría de flujo. También, preparar un segundo tubo con un número equivalente de células Sf9 infectadas con un baculovirus no recombinante.
    2. Añadir el yoduro de propidio (PI) a ambas muestras a una concentración final de 1 μg / mL justo antes de la evaluación citométrica de flujo. Este paso es necesario para identificar células muertas, aglomeraciones celulares y escombros que pueden alterar o enmascarar la distribución celular en el diagrama de dispersión hacia adelante y hacia el lado. Prepare las existencias de PI de 1 mg / ml en agua y guarde a 4 ° C protegido de la luz.
    3. Aplicar las células a un citómetro de flujo estándar capaz de clasificar las células de acuerdo con el FSC y el lado de dispersión (SSC). Analizar al menos 20.000 eventos de la muestra de control ( es decir, que no contenga cristal). Después de descartar las células muertas, los aglomerados celulares y los desechos del análisis, generar la trama FSC a SSC.
    4. Analizar al menos 20.000Ts de la muestra que contiene cristal. Compare el diagrama FSC a SSC con el simulacro. Busque la apariencia de una población distinta que corresponde a las células que contienen cristal. Típicamente, las células con cristales intracelulares tendrán un SSC más alto debido a un aumento en la complejidad morfológica. El FSC también puede aumentar si el crecimiento del cristal causa un aumento en el volumen de la célula. Definir las puertas del clasificador de flujo para aislar las poblaciones de células correspondientes a las áreas de la parcela de dispersión que difieren de la parcela simulada. Imagen de las muestras clasificadas por microscopía de luz como se describe en el paso 1 para confirmar qué población se asocia con células que contienen el cristal.
    5. Utilizando las compuertas definidas en el paso 2.2.4, se ordenan las células que contienen cristal en PBS, o en cualquier otro tampón isotónico. Anote el número de células que contienen cristales ordenadas, así como el volumen final para facilitar las etapas posteriores. Almacenar las células clasificadas en hielo o a 4 ° C.
      Nota: En una hora,> 300.000 polihedra-conLas celdas de almacenamiento se clasifican en un clasificador de celdas con una boquilla de 100 mm (138 kPa con una frecuencia de 39 kHz). Esta cantidad de células es suficiente para preparar> 1.000 mallas.
    6. Siguiendo el protocolo detallado en el paso 2.1.7, imagen de las células con un microscopio de luz para confirmar el enriquecimiento en las células que contienen cristales. La preparación de la muestra para la recolección de datos debe hacerse tan pronto como sea posible después de la clasificación celular ya que los cristales pueden degradarse con el tiempo o liberarse debido a la lisis celular.

Figura 4
Figura 4 : Clasificación celular. Los diagramas de dispersión de citometría de flujo representativos a partir de ( a ) células no infectadas (simuladas), que no contienen cristales, y ( b ) células Sf9 infectadas por un baculovirus recombinante sobreexpresado para la poliedrina BmCPV1. Las diferencias en el patrón de dispersión entre las dos poblaciones alDe la población celular que contiene cristal (puerta roja, valores altos de SSC). Cada parcela representa 20.000 eventos de clasificación. SSC: dispersión lateral de la luz; FSC: difusión de luz hacia adelante. ( C ) Imagen de microscopía óptica de una población representativa de las células clasificadas, que muestra la presencia de cristales intracelulares. Escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Preparación de muestras para la recolección de datos

Nota: Si las células o cristales van a derivatizarse para el phasing experimental, siga el protocolo detallado en la sección 3.1. De lo contrario, vaya directamente a las secciones 3.2 para los cristales purificados o 3.3 para el análisis de celulo .

  1. Derivatización de microcristales purificados o en celulo
    PRECAUCIÓN: Antes de usar, consulte todas las hojas de datos de seguridad del material (MSDS) pertinentes.La mayoría de los productos químicos utilizados para la fase experimental son extremadamente tóxicos. Use todas las prácticas de seguridad apropiadas, incluyendo el uso de una campana extractora de químicos y equipo de protección personal. Deseche los productos de desecho de acuerdo con la política de su institución.
    Nota: La naturaleza de los átomos pesados, su concentración y el tiempo de incubación se dan a título indicativo para cristales de la poliedrina BmCPV1. Estos parámetros deben determinarse experimentalmente para cada nuevo objetivo. La tinción subsiguiente con azul de tripano en la etapa 3.3.2 puede omitirse si las células son fácilmente coloreadas por el compuesto químico usado para la fase.
    1. Preparar soluciones saturadas de los átomos pesados ​​deseados (o soluciones de otros productos químicos utilizados para phasing experimental). Tıpicamente, se requerirán volúmenes inferiores a 100 μl para cada átomo pesado. Eliminar las sales no disueltas y los residuos por centrifugación a velocidad máxima en una microcentrífuga durante 5 min a temperatura ambiente.
    2. Preparar alícuotas de ~ 50.000 cristalesO células ordenadas por compuesto de átomo pesado. Si el PBS no es compatible con el producto químico utilizado para la derivatización ( es decir, las formas de precipitado y la solución se convierte en turbia), sedimentar los cristales a 4000 xg durante 3 min a temperatura ambiente en una microcentrífuga o las células a 150 xg durante 3 min, Sobrenadante y resuspender suavemente los cristales o células en 20 μl de un tampón adecuado. Repita la peletización y la resuspensión para asegurarse de que no queden restos de PBS. Ajuste el volumen final a 20 μl para todas las alícuotas.
    3. Añadir 20 μL de solución de átomo pesado u otro compuesto químico de elección a los cristales o células. La concentración óptima de átomos pesados ​​dependerá de una combinación de parámetros celulares (permeabilidad, proteínas fuera de destino ...) y la naturaleza del cristal de la proteína de interés. Como punto de partida, probar 3 concentraciones diferentes: saturación completa, 1 / 10e, 1 / 100e.
    4. Mantenga las muestras a 4 ° C durante un máximo de 3 días. Cristales de la polyhEdrin son muy resistentes y densos y requieren largos empapados para incorporar los átomos pesados; Para otros tipos de cristales el período de incubación y la concentración de átomos pesados ​​deben determinarse experimentalmente. Los tiempos de incubación demasiado cortos no permitirán la incorporación de cantidades adecuadas del átomo pesado, mientras que los tiempos de incubación prolongados pueden afectar a la integridad de los cristales, disminuyendo así su calidad de difracción o incluso disolviéndolos. Como punto de partida, se prueban 3 tiempos de incubación diferentes para cada solución de átomo pesado ( por ejemplo, 1 min, 1 h y durante la noche). La derivatización satisfactoria se evalúa mediante el análisis de los datos de difracción como brevemente se describe en la sección 5 y las referencias en la misma.
    5. Lavar el exceso de solución de átomos pesados ​​por granulación de los cristales a 4.000 xg durante 3 min a temperatura ambiente en una microcentrífuga o las células a 150 xg durante 3 min, retirar el sobrenadante y resuspender suavemente los cristales o células en 10 μl de tampón .
  2. PRECAUCIÓN: El uso de nitrógeno líquido está asociado con peligros tales como asfixia, quemaduras en frío, fuego en atmósfera enriquecida con oxígeno y explosión. Consulte las prácticas de gestión de riesgos y de trabajo seguro de su institución.
    1. Sobre la base de la concentración de cristal calculada en la etapa 2.1.9, ajustar la concentración a 10 7 cristales / ml diluyendo la muestra; O por sedimentación de los cristales a 4.000 xg durante 3 min a temperatura ambiente en una microcentrífuga, ajuste del volumen final por eliminación del sobrenadante y resuspendiendo suavemente los cristales.
    2. Si las muestras están destinadas a ser congeladas por adelantado, enfriar el cargador seco o dewar con nitrógeno líquido. Preparar los viales o discos, según corresponda, y enfriarlos con nitrógeno líquido.
    3. Resuspender el gránulo de cristal y aplicar una gota de 0.5 μL de cristales en un micrómetro por pipeteado. Utilizar mallas de 700 μm con un cuadrado de 25 μmComo punto de partida. El área de la malla no es crítica, pero una mayor área proporciona más cristales por malla y conduce a una evaporación más lenta durante la preparación. El tamaño de los orificios puede necesitar ser optimizado para que coincida con el tamaño de los cristales mayores de 25 μm. Si se requiere para estudios sistemáticos, las mallas indexadas están disponibles para facilitar una exploración de cuadrícula metódica durante la recopilación de datos.
    4. Retire la mayor parte del exceso de líquido con una mecha de papel. Los cristales deben ser repartidos uniformemente en la malla, sin tocarse. Repita el paso 3.1.1. Para la optimización de la concentración de la muestra. Proceder rápidamente y no quitar demasiado del líquido. En ausencia de crioprotector, el líquido se evapora rápidamente con el riesgo de formación de cristales de sal y / o pérdida de la película.
    5. Añadir crioprotector: pipetear 0,5 μl de una solución de etilenglicol al 50% en agua sobre la malla (la composición del criobuffer debe adaptarse a la muestra;Ryoprotector se puede encontrar en la referencia 30 ). Retire el exceso de líquido con una mecha de papel. En contraste con la etapa anterior, aquí la película restante de disolvente debe ser lo más delgada posible para reducir los efectos de paralaje que complican el proceso de alineación entre el cristal, la trayectoria del haz y el goniómetro; Y para minimizar el fondo causado por la dispersión de rayos X por el líquido en la trayectoria del haz.
    6. Inmediatamente enfriar rápidamente el micromesh en nitrógeno líquido y transferirlo a un vial o un disco de robot, luego a un cargador seco o dewar para el almacenamiento.
  3. Preparación de micromesh con células que contienen cristal
    PRECAUCIÓN: El uso de nitrógeno líquido está asociado con peligros tales como asfixia, quemaduras en frío, fuego en atmósfera enriquecida con oxígeno y explosión. Consulte las prácticas de gestión de riesgos y de trabajo seguro de su institución.
    1. Transferir las células clasificadas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Basado en la celda cLos valores registrados por el clasificador de células, ajustar la concentración a 10 7 células / ml por dilución de la muestra con PBS; O por sedimentación de las células a 150 xg durante 3 min a temperatura ambiente en una microcentrífuga, ajustando el volumen final por eliminación del sobrenadante y resuspendiendo suavemente las células.
    2. Mezclar las células con un volumen igual de solución de azul de tripano (0,4% p / v) hasta una concentración final de 0,2% p / v.
    3. Si las muestras están destinadas a ser congeladas por adelantado, enfriar el cargador seco o dewar con nitrógeno líquido. Preparar los viales o discos, según corresponda, y también enfriarlos con nitrógeno líquido.
    4. Suavemente resuspender las células y pipeta 0,5 μ l de células clasificadas en una micromesh.
    5. Retire el exceso de líquido con una mecha de papel. Las células deben extenderse uniformemente sobre la malla, sin tocarse entre sí. Si no se utiliza crioprotector (paso 3.3.6), la película restante de disolvente debe ser lo más delgada posible para reducir los efectos de paralaje que complicanE el proceso de alineación entre el cristal, la trayectoria del haz y el goniómetro; Y para minimizar el fondo causado por la dispersión de rayos X por el líquido en la trayectoria del haz.
    6. Opcionalmente, añadir crioprotector a las células: pipeta 0,5 μL de etilenglicol al 50%, solución de PBS al 50% sobre la malla. La composición del criobufrador debe adaptarse a la muestra; Se pueden encontrar sugerencias para la optimización del crioprotector en la referencia 30 . Elimine el líquido en exceso con una mecha de papel, dejando sólo una delgada capa de disolvente.
      Nota: La omisión de la etapa de crioprotección no alteró la calidad de la difracción de rayos X cuando los cristales de la poliedrina se analizaron en celulo , mientras que este paso fue requerido para cristales purificados 20 . Esto sólo se aplica a la incubación de las células con solución crioprotectora; La muestra todavía debe analizarse a 100 K para minimizar los efectos del daño por radiación en los cristales.
    7. InmediEnfriar rápidamente el micromesh en nitrógeno líquido y transferirlo a un vial o un disco de robot, luego a un cargador seco o al almacenamiento dewar, según corresponda.

4. Recopilación de datos

Nota: Los parámetros utilizados para la recolección de datos se dan como guía y se deben optimizar para cada tipo de cristal y línea de luz de sincrotrón.

  1. Recopilar datos sobre una línea de luz de cristalografía microfoco (véase la referencia 7 para una lista de líneas de luz microfoco y sus características). Si está disponible, utilice un haz colimado que coincida con el tamaño de los cristales.
  2. Para el phasing experimental por el método de dispersión anómala de longitud de onda única (SAD), recoger a una energía maximizando la señal anómala del átomo pesado de elección. Para el phasing usando el método de Reemplazo Isomorfo Múltiple (MIR), recoja sobre la energía de un borde de absorción adecuado para el átomo pesado de elección (disponible en http://skuld.bmsc.washington.edu/scAtter / AS_periodic.html).
  3. Después de cargar la malla sobre el goniómetro, comience por centrar la micromesh con la trayectoria del haz usando las orientaciones de cara en (lado convexo) y de lado en. Luego, con el micromesh boca arriba, ajuste la alineación alineando el centro de un carril horizontal particular del micromesh (por ejemplo, comience con el central). A continuación, recopile datos a lo largo de este carril horizontal con sólo pequeños reajustes a la alineación. Si está disponible, utilice el centrado basado en rasterizar en difracción de rayos X de baja dosis para ajustar la alineación (consulte el contacto local en la línea de luz del sincrotrón).
    Nota: Como se puede recolectar una cantidad limitada de datos sobre microcristales debido a daños por radiación (normalmente de 10 a 30 imágenes con oscilación de 1 °), en teoría el cristal sólo necesita alinearse con la trayectoria del haz durante 10-30 °. Sin embargo, es crítico que la alineación sea exacta como el cristal puede fácilmente por faltado por el microbeam (colimado generalmente a un diametroEr de ~ 10 μm o menor).
  4. Recoger los datos de difracción hasta que se pierda la difracción debido al daño por radiación. Para los cristales de la poliedrina, el tiempo de exposición de 10 s se utiliza típicamente para una oscilación de 1 ° para un flujo de aproximadamente 3,6 x 10 11 fotones / s a ​​13 keV con un detector CCD (dosis total <30 MGy). Optimice estos ajustes dependiendo de la línea de haz y la naturaleza del cristal utilizado. En particular, se recomiendan dosis bajas y rebanado fino para detectores de rayos X de píxeles.
    Nota: Si utiliza la estrategia en celulo , las celdas teñidas con azul trypan aparecerán como puntos azules contra el fondo del soporte, haciéndolos más fáciles de alinear con el haz. Si el micro-haz colimado tiene aproximadamente el mismo tamaño que las células (~ 10 μm), todos los cristales contenidos en una célula se iluminarán simultáneamente. Para las células que contienen microcristales múltiples, esto conduce a la observación de patrones de difracción múltiples, que pueden ser difíciles de procesar. Sin embargo, diLa fracción de uno de los cristales suele tender a dominar el patrón de difracción y se indexa preferentemente durante el procesamiento de datos. Para las líneas de luz con un haz de rayos X significativamente menor que la célula, rastering a muy bajo flujo de rayos X (> 95% de atenuación) se debe utilizar para centrarse en un solo cristal antes de la recopilación de datos.
  5. Continúe con el siguiente cristal en el carril.
  6. Una vez que todos los cristales del carril han sido probados, continúe con el siguiente carril y repita el procedimiento de alineación. Proceda hasta que se hayan recogido suficientes datos o se hayan probado todos los cristales.
    1. Asegúrese de que los carriles que han sido procesados ​​están claramente identificados para que los cristales no se pierda o se dispare dos veces (si es necesario, dibuje un boceto). Típicamente, el azul de tripano se vuelve amarillo después de que la célula ha sido irradiada, que puede usarse como marcador.

Figura 5
Figura 5 : Estrategia de recopilación de datos de muestras sobre soporte Micromesh. (A) Estrategia de recolección de datos por línea; La alineación se hace al principio de cada carril (puntos) y los datos se recogen a lo largo del carril. ( B ) Primer plano de una célula con cristal que contiene azul de tripán en una malla, tal como se ve en la pantalla de la línea de luz de microcristalografía. ( C ) Primer plano de un poliedro purificado en una malla, tal como se ve en la pantalla de microcristalografía de la línea de luz. Los cuadrados de malla son 25 μm x 25 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

5. Procesamiento de datos

NOTA: Aquí, sólo mencionamos brevemente los pasos del procesamiento de datos que son específicos para la microcristalografía serial, donde los datos de múltiples cristales se fusionan. Muchos artículos excelentes sonDisponible que describe el procesamiento de datos en profundidad 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 y la determinación de estructura está más allá del alcance de este protocolo.

  1. Seleccione el cristal con la mejor resolución y calidad de difracción como referencia.
  2. Procesar individualmente cada cristal utilizando paquetes de cristalografía estándar como HKL-2000 31 , Mosflm 32 o XDS 33 . Para asegurar que los daños por radiación no deterioren la calidad del conjunto de datos, seleccione cuidadosamente la última imagen con un daño de radiación aceptable. Los criterios de corte que indican un daño de radiación excesivo son específicos de cada tipo de cristal, la práctica de procesamiento y el propósito del experimento. Para el phasing de los cristales de polihedrina BmCPV1, los datos se descartaron una vez que la señal a nOise <I> / <σ (I)> por imagen disminuida por debajo de 2 o el R sym superado el 50% según lo reportado por HKL-2000 31 .
  3. Para cada cristal, defina el límite de resolución y el número de tramas y reprocese con los parámetros correctos para evitar la integración de datos con poca o ninguna señal.
  4. Escalar y combinar los datos de los mejores cristales al cristal de referencia utilizando paquetes estándar tales como Scalepack en HKL-2000 31 , SCALA en CCP4 34 , 35 o XSCALE en XDS 33 . Agregue los datos de los diferentes cristales progresivamente mientras supervisa la calidad global del conjunto de datos, idealmente hasta que el conjunto de datos alcance una integridad aceptable (> 95%). Rechazan los cristales que presentan un pobre isomorfismo con el mejor / cristal de referencia, tal como se detecta por las diferencias en los parámetros de las celdas unitarias y la mala fusión R / chi cuadrado por imagen. Si hay demasiados conjuntos de datos de buena calidadNo se escala con el (los) cristal (es) de referencia, utilice un programa como BLEND 36 que lleva agrupación jerárquica para definir la mejor combinación de conjuntos de datos para combinar.
    Nota: En algunos grupos de espacio, las opciones de indexación alternativas deben ser probadas para que coincidan con el cristal de referencia.
  5. Proceder al phasing experimental, reemplazo molecular o refinamiento usando paquetes de cristalografía estándar.

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Representative Results

Una presentación general de ambos métodos alternativos para la determinación de la estructura utilizando microcristales in vivo se presenta ( Figura 1 ]. Los poliedros se pueden purificar fácilmente mediante sonicación y centrifugación. Debido a su densidad, forman una capa en la parte inferior del tubo por debajo de una capa de desechos que se pueden eliminar por pipeteado ( Figura 3a y 3b ). La muestra se somete luego a varias rondas de sonicación y se lava hasta que se alcanza un nivel de pureza suficiente como se juzga a partir del aspecto blanco y calcáreo del gránulo ( Figura 3c ).

Para el enfoque en celulo , el perfil de citometría de flujo de las células no infectadas se compara con el perfil de las células que contienen cristal y se utiliza para determinar qué población de células debe seleccionarse para clasificar las células que contienen cristal alejadas deLas otras células ( Figura 4 ). En este ejemplo, las células que contienen poliedros tienen una mayor dispersión lateral que las células no infectadas. Pueden observarse otras diferencias en los patrones de dispersión para otros tipos de cristales y la modificación debe modificarse en consecuencia.

Los microcristales purificados o las células que contienen cristal se pipetean sobre una micromesh ( Figura 5 ). Las células teñidas con azul de tripano se pueden visualizar fácilmente usando cámaras disponibles en la mayoría de líneas de luz de sincrotrón (Figura 5b), mientras que los cristales purificados son laboriosos para identificar y alinear con el haz de rayos X debido a su pequeño tamaño (Figura 5c). Cuando se recopilan datos, lo mejor es proceder en un patrón de rejilla para minimizar los procedimientos de centrado, y para evitar exponer el doble de la misma celda o cristal, o faltar alguno ( Figura 5a ). Colección de datosDeben ser procesados ​​cuidadosamente para tener en cuenta las diferencias en los límites de difracción, el efecto del daño por radiación y una posible falta de isomorfismo.

Figura 1
Figura 1 : Visión general de dos métodos para la determinación de estructuras utilizando microcristales in vivo . Los microcristales se producen en cultivo celular mediante sobreexpresión de la proteína de interés utilizando un sistema de expresión recombinante. En casos específicos, los microcristales también pueden producirse naturalmente por las células en condiciones particulares. La fila superior muestra el enfoque clásico en el que las células se lisan y los cristales se purifican mediante centrifugación diferencial. Los microcristales purificados se pipetean sobre una micromesh. Después de la eliminación del exceso de líquido, se añade una solución crioprotectora, el líquido sobrante se vuelve a secar y la malla se enfría por enfriamiento rápido. Para los rayos X dif Los cristales se alinean cuidadosamente con el haz de rayos X, que puede ser el paso limitante en la recolección de datos. La fila inferior presenta el enfoque en celulo . Las células se clasifican por citometría de flujo para seleccionar específicamente células que contienen cristal. Las células se tiñen con azul trypan para facilitar la visualización y propagación sobre una micromesh. En este caso, la adición de un crioprotector es opcional. Para los experimentos de difracción de rayos X, las células se visualizan fácilmente usando cámaras típicas disponibles en las líneas de luz de sincrotrón facilitando el proceso de centrado.
Imagen del sistema automatizado de cromatografía líquida cortesía de GE Healthcare AB, Uppsala, Suecia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
= "Xfig"> Figura 2 : Ejemplos de Microcristales In Vivo . Ejemplos seleccionados de cristales in vivo: ( a ) células Sf9 con poliedros de cipovirus; ( B ) células LD652 con esferoides de entomopoxvirus; ( C ) Bacillus thuringiensis con cristales Cry3A (flecha); ( D ) células Sf9 con cristales de catepsina B de Trypanosoma brucei ; ( E ) células Sf21 con cristales de calcineurina (flechas); ( F ) células COS7 monocapa con PKA: cristales Inka1; ( G ) células CHO con cristales de IgG. Reproducido de 14 , 18 , 29 , 37 , 39 , 42 , con permiso. Barra de escala = 10 μm. Por favor, haga clic aquí para ver unaDe esta cifra.

tabla 1
Tabla 1: Resumen de cristales in vivo cultivados en células cultivadas que expresan proteína recombinante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Este protocolo proporciona dos enfoques para analizar microcristales con el objetivo de facilitar el análisis de cristales muy pequeños que se hubieran pasado por alto en el pasado.

Pasos críticos para la purificación de microcristales
El protocolo presentado ha sido optimizado utilizando la poliedrina Bombyx mori CPV1 expresada en células Sf9 como sistema modelo. Sin embargo, los microcristales in vivo muestran una gran variabilidad en la resistencia mecánica. Por ejemplo, los cristales de catepsina B similares a agujas crecidos en células de insecto son rígidos y altamente resistentes al estrés mecánico, y podrían purificarse usando un protocolo similar al descrito aquí 14 . Por otra parte, los cristales de luciferasa de la luciérnaga, también crecidos en células de insecto cultivadas y con una morfología análoga similar a aguja, se disuelven inmediatamente tras la lisis celular 38 . Por lo tanto, el protocolo para la extracción y purificación de in vivoLos cristales tendrán que adaptarse en una base de error de ensayo para casos particulares como se describe en los pasos 1.3, 2a.3-4, 2b.4, 3.1.3-4 y 3.2a.5.

Para los cristales frágiles, la separación (parcial) de los residuos celulares puede conseguirse mediante centrifugación a baja velocidad ( es decir, 200 xg) o adición de un cojín de sacarosa en la parte inferior del tubo en lugar de sonicación repetida. Como regla general, las muestras de cristal preparadas para la recopilación de datos de difracción no necesitan ser altamente purificadas. Por lo tanto, una purificación rápida es preferible a cryo-enfriar los cristales antes de que pudieran decaer.

Aplicación a microcristales in vitro e in vivo
Aunque ambos protocolos se ilustran aquí con el análisis de cristales crecidos in vivo , la metodología se puede usar fácilmente para microcristales crecidos en bandejas de cristal a partir de proteína recombinante purificada. En esteSe deben considerar las siguientes modificaciones: i) el soporte de malla puede usarse para recoger los microcristales directamente de la gota de cristalización, en lugar de transferirlos por pipeteo; Ii) puesto que la cantidad de cristales puede ser un factor limitante, se necesitará cuidado especial cuando se borre el exceso de líquido del soporte de malla, para evitar la eliminación excesiva de cristales; Iii) se necesitarán ensayar diferentes tampones crioprotectores, tal como se hace en cristalografía convencional (véase la referencia 30 ).

Por otro lado, para in vivo cristales -grown, el enfoque en cellulo es muy recomendable. Debido a que las células son más fáciles de visualizar y manipular que los cristales purificados, este enfoque es más eficiente en términos de uso de la viga y más accesible a los investigadores con poca o ninguna experiencia en microcristalografía. También es más adecuado para cristales frágiles que pueden verse afectados por la extracción y purificación. De la célula debido a cambios en el ambiente químico, dilución de las proteínas circundantes y daño mecánico. Además, las células proporcionan un ambiente protector a los cristales, aliviando la necesidad de la adición de un crioprotector. Se ha demostrado previamente la omisión del tratamiento de crioprotección para prevenir la acumulación de defectos y mejorar el isomorfismo entre cristales individuales, para la recogida de datos a temperatura ambiente 40 . El protocolo in cellulo también elimina el requisito de incubación en solución crioprotectora, al mismo tiempo que permite la recolección de datos a temperatura criogénica. En general, en el celulo la recopilación de datos tiene dos ventajas principales: 1) puede producir datos de mejor calidad y mayor resolución para un período determinado de tiempo de haz 20 ; Y 2) mantiene la proteína cristalizada en un entorno celular aumentando las posibilidades de retener un ligando biológicamente relevante.

Ontent "> Limitaciones de la técnica
Una complicación intrínseca de la microcristalografía serial es el importante número de conjuntos de datos parciales generados durante la recolección de datos. En consecuencia, el procesamiento de datos se convierte en un proceso cada vez más lento. Sin embargo, el flujo de trabajo básico para el procesamiento de datos puede ser ampliamente automatizado. Por ejemplo, la selección óptima de cristales isomorfos puede determinarse mediante un análisis de agrupamiento jerárquico 28 , por ejemplo implementado en BLEND 36 . Además, los programas desarrollados para el análisis de rayos X de láser de electrones libres (XFEL) también pueden adaptarse para procesar datos de microcristalografía en serie recopilados en líneas de luz de sincrotrón 2 y, en algunas líneas de haz, se han implementado rasterizaciones automatizadas de malla y detección de cristales. Recogida de datos 2 , 41 .

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores desean reconocer a Chan-Sien Lay por proporcionar fotografías de microcristales purificados, Daniel Eriksson y Tom Caradoc-Davies para apoyo en la línea de rayos MX2 del sincrotrón australiano y Kathryn Flanagan y Andrew Fryga de la instalación FlowCore de la Universidad Monash por su Ayuda invaluable.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sf9 cells Life Technologies
SF900-SFM insect medium Life Technologies
1 L cell culture flask Thermofisher Scientific
Shaking incubator for insect cell culture Eppendorf
50 mL conical tubes Falcon
Centrifuge with swing buckets for 50 mL tubes Eppendorf
Sonicator equiped with a 19 mm probe MSE Soniprep 150 
Glass slides Hampton Research
Hemacytometer Sigma-Aldrich
Propidium iodide Thermofisher Scientific
BD Influx cell sorter  BD Biosciences
Hampton Heavy atom screens Hampton Research
Microcentrifuge Eppendorf
Micromesh Mitigen 700/25 meshes offer a larger surface. Indexed meshes can be purchased for systematic studies.
Paper wick Mitigen The size of the paper wick can be varied for optimal flow. This will largely depend on the nature of the crystals and cryoprotectant used.
Ethylene glycol Sigma-Aldrich
Trypan blue Life Technologies
MX2 microfocus beamline Australian Synchrotron A list of available microfocus beamlines can be found in Boudes et al. (2014) Reflections on the Many Facets of Protein
Microcrystallography. Australian Journal of Chemistry 67 (12), 1793–1806,
doi:10.1071/CH14455.

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Bioquímica Número 125 Microcristalografía microcristales difracción de rayos X, poliedros,
Microcristalografía de Protein Crystals y<em&gt; En Cellulo</em&gt; Difracción
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Boudes, M., Garriga, D., Coulibaly, F. Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction. J. Vis. Exp. (125), e55793, doi:10.3791/55793 (2017).

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