Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Mikrokrystallografi av proteinkrystaller og Published: July 21, 2017 doi: 10.3791/55793
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Infection and Immunity Program, Monash Biomedicine Discovery Institute, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Monash University
* These authors contributed equally

Summary

En protokoll presenteres for røntgenkrystallografi ved bruk av proteinmikrokrystaller. To eksempler som analyserer in vivo- vokst mikrokrystaller etter rensing eller i cellulose , sammenlignes.

Abstract

Tilkomsten av mikrofokus av høy kvalitet på mange synkrotronanlegg har tillatt rutinemessig analyse av krystaller mindre enn 10 μm i sin største dimensjon, som pleide å utgjøre en utfordring. Vi presenterer to alternative arbeidsflyter for strukturbestemmelsen av proteinmikrokrystaller ved røntgenkrystallografi med et spesielt fokus på krystaller vokst in vivo . Mikrokrystallerne ekstraheres enten fra celler ved sonikering og renses ved differensiell sentrifugering, eller analyseres i cellulose etter cellesortering ved hjelp av flytcytometri av krystallholdige celler. Eventuelt blir rensede krystaller eller krystallholdige celler gjennomvåt i tunge atomløsninger for eksperimentell fasering. Disse prøvene fremstilles deretter for diffraksjonseksperimenter på lignende måte ved påføring på en mikromesh-støtte og flash-avkjøling i flytende nitrogen. Vi beskriver kort og sammenligner seriediffraksjon eksperimenter av isolerte mikrokrystaller og krystall-Inneholdende celler ved hjelp av en mikrofokus synkrotron strålelinje for å produsere datasett som er egnet for fasing, modellbygging og forfining.

Disse arbeidsflytene er eksemplifisert med krystaller av Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) polyhedrin produsert ved infeksjon av insektceller med et rekombinant baculovirus. I denne case-studien er celluloseanalyse mer effektiv enn analyse av rensede krystaller og gir en struktur på ~ 8 dager fra uttrykk til forfining.

Introduction

Bruken av røntgenkrystallografi for bestemmelse av høyoppløsningsstrukturer av biologiske makromolekyler har opplevd en jevn progresjon de siste to tiårene. Den voksende opptaket av røntgenkrystallografi av ikke-ekspertforskere eksemplifiserer demokratisering av denne tilnærmingen på mange områder av biovitenskap 1 .

Historisk sett har krystaller med dimensjoner under ~ 10 μm blitt betraktet som utfordrende, om ikke ubrukelige, for strukturbestemmelse. Den økende tilgjengeligheten av dedikerte mikrofokus stråler i synkrotron strålingskilder over hele verden og teknologiske fremskritt, for eksempel utviklingen av verktøy for å manipulere mikrokrystaller, har fjernet mye av disse barrierer som stymied den brede bruken av røntgen mikrokrystallografi. Fremskritt i seriell røntgenmikrokrystallografi 2 , 3 og mikroelektrondiffraksjon 4 haHar vist at bruken av mikro- og nanokrystaller for strukturbestemmelse ikke bare er mulig, men også noen ganger foretrukket for bruk av store krystaller 5 , 6 , 7 .

Disse fremskrittene ble først anvendt på studiet av peptider 8 og naturlige krystaller produsert av insektvirusene 9 , 10 . De brukes nå til et mangfoldig utvalg av biologiske makromolekyler, inkludert de vanskeligste systemene som membranproteiner og store komplekser 11 . For å lette analysen av disse mikrokrystaller, har de blitt analysert i meso , spesielt membranproteiner 12 og i mikrofluidikk-chips 13 .

Tilgjengeligheten av disse nye mikrokrystallografimetodikkene har økt muligheten for å bruke iVivo-krystallisering som en ny rute for strukturell biologi 14 , 15 , 16 som tilbyr et alternativ til klassisk in vitro- krystallogenese. Dessverre, selv når in vivo krystaller kan fremstilles, forblir flere hindringer som for eksempel nedbrytning eller tap av ligander under rensning fra celler, vanskeligheter med manipulering og visualisering av krystallene ved synkrotronstrenglinjen og kjedelige røntgendiffraksjonseksperimenter. Som en alternativ krystaller har også blitt analysert direkte i cellen uten noe rensingstrinn 17 , 18 , 19 . En komparativ analyse antyder at slike i cellulo- tilnærminger kan være mer effektive enn analysen av rensede krystaller og gi data med høyere oppløsning 20 .

Denne protokollen er innePleide å hjelpe forskere ny til protein mikrokrystallografi. Den gir metoder som fokuserer på prøvepreparering og manipulering for røntgendiffraksjon eksperimenter ved en synkrotron stråle linje. To alternativer er foreslått ved å bruke isolerte krystaller for klassisk mikrokrystallografi eller krystallholdige celler sortert ved hjelp av flytcytometri for celluloseanalyse ( figur 1 ).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Merk: In vivo krystallisering har blitt rapportert i mange organismer, inkludert i bakterier, gjær, planter, insekter og pattedyr (omtalt i referanse 21 ). Krystallisering av rekombinante proteiner har også blitt oppnådd i laboratoriet ved bruk av forbigående transfeksjon av pattedyrceller og baculovirusinfeksjon av insektceller. Følgende protokoll er blitt utviklet ved bruk av Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) polyhedrin-genet klonet i et rekombinant baculovirus under baculovirus polyhedrinpromotoren, generert som per instruksjon i referanse 22 . Selv om denne protokollen kan tilpasses til andre celletyper ( f.eks. Pattedyrceller), beskriver vi her prosedyrene for insektceller. Protokollen antar at overuttrykk av proteinet av interesse allerede er oppnådd. Fremgangsmåter for fremstilling av et rekombinant baculovirus og dets bruk for ekspresjon av proteinet av interesse er avAilable i referanser 23 , 24 , 25 , 26 , 27 .

1. Identifikasjon av krystallholdige celler

  1. Hvis celler dyrkes i monolag, undersøk dem direkte i kolben. Hvis celler dyrkes i flytende kultur, bruk følgende protokoll.
    1. Ved hjelp av en steril serologisk pipette, overfør 500 μL celler til et mikrocentrifugerør. Pass på å sikre at steriliteten til hovedkulturen opprettholdes; Håndtere cellene i et klasse II biosikkerhetsskap og følg standard aseptiske teknikker.
    2. Pipett 5 μL celler fra mikrocentrifugerøret på en glideskinne.
    3. Legg forsiktig et glassdeksel på væsken, unngå dannelse av luftbobler. Hvis lysbildet ikke kan visualiseres innen 15 minutter, forsegl dekselet med vakuumfett for å unngå fordampningasjon.
  2. Bild flasken eller skyv med et invertert mikroskop. Hvis tilgjengelig, bruk fasekontrast og / eller differensial interferens-kontrastmikroskopi (DIC). Begge teknikkene forsterker kontrasten i gjennomsiktige prøver og understreker linjer og kanter, og dermed letter identifiseringen av in vivo krystaller.
  3. Forsiktig undersøk cellene. Start ved 200X forstørrelse og zoom inn for maksimal forstørrelse når du oppdager en potensiell krystall. Tilstedeværelsen av krystaller kan foreslås indirekte ved endringer i cellemorfologien ( figur 2 ). Se etter skarpe kanter og endringer i brytbarhet (ved bruk av fasekontrast eller DIC). Kjente in vivo krystaller adopterer forskjellige former, inkludert stenger, stabler av nåler, kuber, pyramider og polyederer (se figur 2 og tabell 1 for noen eksempler).
    Merk: Andelen celler som inneholder krystaller, vil være forskjellige i hvert tilfelle og kan eveN varierer mellom preparater, men generelt bør man ikke forvente å finne krystaller i alle celler. Tilsvarende er antall krystaller per celle også variabel (se tabell 1 ), og mer enn en krystall kan bli funnet i en celle. Disse faktorene må optimaliseres der det er mulig ved å justere infeksjons multiplikasjon, endre lengden på uttrykket og variere proteinkonstruksjonen. På den ene siden vil betingelsene for proteinuttrykk og cellevekst som maksimerer antall krystallholdige celler, forbedre produktiviteten ( f.eks. Høyere infeksjonsmengde og sen høsting av cellekultur). På den annen side, forhold der cellene inneholder en enkelt krystall letter datainnsamling ( f.eks. Lav multiplikasjon av infeksjon). Gitt anrikningen brakt ved flyt sortering beskrevet i trinn 2.2, anbefaler vi at du sikter mot større krystaller ( f.eks. En krystall per celle) selv om andelen krystallholdige celler er lav.
  4. Hvis krystallS identifiseres, registrer deres posisjon (når bildebehandlingsmonolaget i en kolbe), og estimer prosentandelen av krystallholdige celler. Hvis det er tilgjengelig, bruk et mikroskop utstyrt med et kamera som er i stand til å spore endringer på ett enkelt cellenivå.
  5. For celler i suspensjon bestemme graden av celle-levedyktighet etter protokollen som er beskrevet i referanse 28 . For celler dyrket i et monolag, estimerer ved visuell inspeksjon den omtrentlige grad av sammenføyning og mengden av frittliggende celler.
  6. Overvåk krystallveksten, celleveksten og levedyktigheten to ganger om dagen.
  7. Høst cellene så snart krystallveksten ser ut til å stoppe. For bemerkelsesverdig sterke krystaller som viral polyhedra øker utvidet inkubasjonstid (> 4 dager) antall store krystaller. For typiske proteinkrystaller anbefaler vi imidlertid å høste celler når levedyktigheten faller under 80% for å forhindre skade forårsaket av cellelys.
  8. Fjern kolben fra inkubatoren og fortsett tilTrinn 2.2 så snart som mulig. Hold cellene på is under følgende trinn, med mindre annet er angitt.

2. Prøverensing

Merk: Vi beskriver to analysemetoder av in vivo krystallene fra henholdsvis rensede krystaller og cellulose .

  1. Rensing av krystaller
    Merk: Med mindre det er tegn på at krystallene av interesse er følsomme for lav temperatur, arbeid på is og bruk iskald buffere for å unngå krystallforringelse.
    1. Pipett 50 ml infiserte Sf9-celler i et 50 ml konisk sentrifugerør. Dette representerer ~ 4 x 10 8 celler i et typisk eksperiment.
    2. Pelletceller ved 450 xg i 10 minutter ved 4 ° C.
    3. Kast supernatanten og resuspender pelleten i 40 ml avkjølt fosfatbuffert saltvann (PBS), pH 7,4.
      Merk: PBS er foreslått som utgangspunkt for rensing som en standard isotonisk buffer med sikte på mimIcking det cellulære miljøet hvor in vivo krystaller vokste. Den har blitt brukt for de fleste in vivo krystaller dyrket i cellekultur til dato 9 , 14 , 29 . Alternativt har DMEM-medier også blitt vellykket anvendt ved rensing av in vivo krystaller fra pattedyrceller 19 . Hvis krystaller synlig lider av overføring i PBS eller tilstede dårlig diffraksjon, bør denne parameteren undersøkes som en potensiell kilde til nedbrytning.
    4. Sonikere den resuspenderte pellet i 30 s ved 10 mA ved hjelp av en sonikator utstyrt med en 19 mm probe. For å unngå oppvarming av prøven, plasser den i et beger fylt med is under lydbehandling. Kjemisk eller mekanisk celleforstyrrelse kan brukes som alternativer hvis krystaller ser ut til å bli skadet ved sonikering som vurdert i trinn 2.1.7.
    5. Sentrifuger ved 450 xg i 10 minutter ved 4 ° C. Etter sentrifugering er 2 lag tydelige:Et øvre lag av cellulært avfall, som er blekbrunt, og en nedre pellet av polyhedrinkrystaller, som er hvit og kalkaktig.
    6. Kast supernatanten og fjern det øvre laget ved forsiktig pipetting. Oppløs den nedre pellet i 40 ml avkjølt PBS.
    7. Vurder kvaliteten på prøvene ved å ta bilder med et lysmikroskop.
      1. Pipett 5 μl celler eller rensede krystaller på en glassglass. Dette kan gjøres ved romtemperatur.
      2. Legg forsiktig et glassdeksel på væsken, unngå dannelse av luftbobler.
      3. Bild lysbildet med et invertert mikroskop ved 200X forstørrelse. Bildet prøven innen 15 minutter av forberedelsen på lysbildet. Hvis lysbildet ikke kan visualiseres innen 15 minutter, forsegl dekselet med vakuumfett for å unngå fordampning.
        MERK: I tilfelle av polyeder vil krystaller fremstå som refringent terninger på ~ 1 - 10 μm per side. Kontroller integriteten til krystallene på jakt etter tegn på tap av skarphet( F.eks. Runde kanter), sprekker eller oppløsning. Overvåk også forekomsten av celleavfall som vil oppstå som klumper og objekter av uregelmessig størrelse og form.
    8. Gjenta trinn 2.1.5 til 2.1.7, halvere volumet av PBS som brukes til å resuspendere pelleten i hver syklus til krystallene er fri for rusk. Resuspender den endelige pelleten i 1 ml avkjølt PBS og overfør krystallene til et mikrocentrifugerør. Oppbevar de rensede krystaller ved 4 ° C.
    9. Beregn konsentrasjonen av krystaller ved å bruke et hemocytometer som beskrevet av produsenten. Telle krystaller som om vi teller celler.

Figur 3
Figur 3 : Renset In Vivo Mikrokrystaller. Representativ rensing av krystaller av BmCPV1-polyhedrinet fra Sf9-insektsceller som viser ( a ) pelleterte celleavfall og gråteStaler etter sonikering, og ( b ) nærbilde på rusk og krystallskikt. Debrislag kan resuspenderes grundig i supernatanten og kasseres for raskere krystallrensing. ( C ) Optisk mikroskopi av renset polyeder. Skalbjelke = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Isolering av krystallholdige celler ved hjelp av flytcytometri
    Merk: For å lette definisjonen av portene i flytcytometri, anbefales det å dyrke en kontrollkultur parallelt med den som uttrykker proteinet av interesse. Dette kan gjøres ved å infisere en kolbe med Sf9-celler med et ikke relevant rekombinant baculovirus, eller ved å fremstille mock-infiserte celler. Sortering og avbildning av prøver utføres vanligvis ved romtemperatur.
    FORSIKTIG: Propidiumjodid er et mistenkt karsinogen og skal håndteresMed forsiktighet.
    1. Pipet 4 ml infiserte Sf9-celler - som representerer ~ 3 x 10 7 celler - i et rør tilpasset flyt-cytometri analyse. Forbered også et andre rør med et ekvivalent antall Sf9-celler infisert med et ikke-rekombinant baculovirus.
    2. Legg propidiumjodid (PI) i begge prøver ved en sluttkonsentrasjon på 1 μg / ml like før strømningscytometrisk evaluering. Dette trinnet er nødvendig for å identifisere døde celler, celleklemmer og rusk som kan endre eller maskere cellefordelingen på forover- og sidestrømsplottet. Forbered PI-bestandene på 1 mg / ml i vann og oppbevar ved 4 ° C beskyttet mot lys.
    3. Påfør celler til et standardflytcytometer som er i stand til cellesortering i henhold til forward- (FSC) og sidestrømning (SSC). Analyser minst 20.000 hendelser i kontrollen ( dvs. ikke-krystallholdig) prøve. Etter bortkastning av døde celler, genererer celleklumper og rusk fra analysen FSC til SSC-plottet.
    4. Analyser minst 20.000 jevnTs av den krystallholdige prøven. Sammenligne FSC til SSC-plott med den stikkende. Se etter utseendet av en tydelig befolkning som korresponderer med krystallholdige celler. Vanligvis vil celler med intracellulære krystaller ha en høyere SSC på grunn av en økning i morfologisk kompleksitet. FSC kan også øke dersom krystallvekst fører til en økning i volumet av cellen. Definer portene til strømnings sorterer for å isolere cellepopulasjoner som svarer til områdene av scatterplot som avviger fra spotplottet. Bildér de sorterte prøvene ved lysmikroskopi som beskrevet i trinn 1 for å bekrefte hvilken populasjon som er assosiert med krystallholdige celler.
    5. Bruk portene definert i trinn 2.2.4, sorter krystallholdige celler i PBS, eller i en hvilken som helst annen isotonisk buffer. Ta opp antall krystallholdige celler sortert så vel som sluttvolumet for å lette påfølgende trinn. Oppbevar de sorterte cellene på is eller ved 4 ° C.
      Merk: I en time,> 300.000 polyhedra-conTaining celler sorteres på en celle sorterer med en 100 mm dyse (138 kPa med en frekvens på 39 kHz). Denne mengden celler er nok til å forberede> 1000 masker.
    6. Følg protokollen som er beskrevet i trinn 2.1.7, bild cellerne med et lysmikroskop for å bekrefte anrikningen i krystallholdige celler. Prøveberedning for datainnsamling bør gjøres så snart som mulig etter cellesortering, siden krystaller kan nedbrytes over tid eller bli frigjort på grunn av cellelys.

Figur 4
Figur 4 : Cellesortering. Representative flowcytometri scatter plots fra ( a ) ikke-infiserte celler (mock), som ikke inneholder krystaller, og ( b ) Sf9-celler infisert av en rekombinant baculovirus overuttrykkende for BmCPV1 polyhedrin. Forskjeller i spredningsmønsteret mellom de to befolkningene alNedsatt gating av den krystallholdige cellepopulasjonen (rød gate, høye SSC-verdier). Hvert plott representerer 20.000 sorteringshendelser. SSC: side lys spredning; FSC: fremover lys spredning. ( C ) Optisk mikroskopi av en representativ populasjon av de sorterte celler, som viser tilstedeværelsen av intracellulære krystaller. Skala = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

3. Prøveforberedelse for datainnsamling

Merk: Hvis celler eller krystaller skal derivatiseres for eksperimentell fasebehandlingsprotokoll som er beskrevet i avsnitt 3.1. Ellers gå direkte til avsnitt 3.2 for rensede krystaller eller 3,3 for i celluloseanalyse .

  1. Derivatisering av renset eller i cellulokronkrystaller
    FORSIKTIG: Rådfør deg med alle relevante sikkerhetsdatablad (MSDS) før bruk.De fleste kjemikalier som brukes til eksperimentell fasing er akutt giftige. Bruk all hensiktsmessig sikkerhetspraksis, inkludert bruk av kjemisk avtrekksdeksel og personlig verneutstyr. Kast avfall i henhold til institusjonens retningslinjer.
    Merk: Tyngden av tunge atomer, konsentrasjon og inkubasjonstid er gitt på en indikativ basis for krystaller av BmCPV1 polyhedrin. Disse parametrene må bestemmes eksperimentelt for hvert nytt mål. Etterfølgende farging med trypanblått i trinn 3.3.2 kan utelates dersom celler lett farves av den kjemiske forbindelse som brukes til fasing.
    1. Klargjør mettede løsninger av de ønskede tunge atomer (eller løsninger av andre kjemikalier som brukes til eksperimentell fasering). Vanligvis vil volumer under 100 μl være påkrevd for hvert tungt atom. Fjern uoppløste salter og rusk ved sentrifugering ved maksimal hastighet i en mikrocentrifuge i 5 minutter ved romtemperatur.
    2. Forbered alikvoter på ~ 50.000 krystallerEller sorterte celler per tung atomforbindelse. Hvis PBS ikke er kompatibel med kjemikaliet som brukes til derivatisering ( dvs. utfellingen danner og løsningen blir overskyet), pellet krystallene ved 4.000 xg i 3 minutter ved romtemperatur i en mikrocentrifuge, eller cellene ved 150 xg i 3 minutter, fjern den Supernatant og forsiktig resuspendere krystaller eller celler i 20 μl av en egnet buffer. Gjenta pelletering og resuspensjon for å sikre at ingen spor av PBS forblir. Juster sluttvolumet til 20 μL for alle alikvoter.
    3. Tilsett 20 μL tung atomløsning eller annen kjemisk forbindelse av valg til krystaller eller celler. Den optimale konsentrasjonen av tungt atom vil avhenge av en kombinasjon av cellulære parametere (permeabilitet, off-target proteiner ...) og typen av krystallet av proteinet av interesse. Som utgangspunkt skal du prøve 3 forskjellige konsentrasjoner: fullmetning, 1/10, 1 / 100e.
    4. Oppbevar prøvene ved 4 ° C i opptil 3 dager. Krystaller av polyhEdrin er meget motstandsdyktig og tett og krever lange soaks for å innlemme de tunge atomer; For andre typer krystaller bør inkubasjonsperioden og konsentrasjonen av tunge atomer bestemmes eksperimentelt. For korte inkubasjonstider vil ikke tillate innlemmelse av riktige mengder av det tunge atom, mens lange inkubasjonstider kan påvirke krystallets integritet, derved redusere diffraksjonskvaliteten eller til og med oppløse dem. Som utgangspunkt skal du prøve 3 forskjellige inkubasjonstider for hver tung atomløsning ( f.eks 1 min, 1 h og over natten). Suksessiv derivatisering vurderes ved analyse av diffraksjonsdata som beskrevet kort i avsnitt 5 og referanser deri.
    5. Vask bort overskudd av tung atomoppløsning ved å pelletere krystallene ved 4.000 xg i 3 minutter ved romtemperatur i en mikrosentrifuge, eller cellene ved 150 xg i 3 minutter, fjern supernatanten og forsiktig resuspendere krystaller eller celler i 10 μl buffer .
  2. FORSIKTIG: Bruk av flytende nitrogen er forbundet med farer som for eksempel kvælning, forkjølelse, brann i oksygenberiget atmosfære og eksplosjon. Ta kontakt med risikostyring og sikker arbeidspraksis i din institusjon.
    1. Basert på krystallkonsentrasjonen beregnet i trinn 2.1.9, juster konsentrasjonen til 10 7 krystaller / ml ved å fortynne prøven; Eller ved pelletering av krystallene ved 4000 xg i 3 minutter ved romtemperatur i en mikrosentrifuge, justering av sluttvolumet ved fjerning av supernatant og forsiktig oppslemming av krystallene.
    2. Hvis prøver skal fryses på forhånd, avkjøl den tørre avsenderen eller dewar med flytende nitrogen. Forbered hetteglassene eller puckene, etter behov, og avkjøl dem med flytende nitrogen.
    3. Resuspender krystallpellet og påfør en 0,5 μl dråpe krystaller på en mikromesh ved pipettering. Bruk 700 μm masker med 25 μm firkantHull som utgangspunkt. Området av masken er ikke kritisk, men et større område gir flere krystaller per maske og fører til langsommere fordampning under fremstilling. Størrelsen på hullene må kanskje optimaliseres for å matche størrelsen på krystaller større enn 25 μm. Hvis det er nødvendig for systematiske studier, er indekserte masker tilgjengelige for å lette en metodisk gridsøk under datainnsamling.
    4. Fjern det meste av overflødig væske ved å blotting med et papirpresse. Krystallene skal spres jevnt på nettverket, uten å berøre hverandre. Gjenta trinn 3.1.1. For optimalisering av prøve konsentrasjon. Fortsett raskt og fjern ikke for mye av væsken. I fravær av kryobeskyttelsesmiddel fordampes væsken raskt med risiko for saltkrystalldannelse og / eller tap av filmen.
    5. Tilsett kryobeskyttelsesmiddel: pipett 0,5 μl av en oppløsning av 50% etylenglykol i vann på masken (sammensetningen av kryobufferen skal tilpasses prøven, forslag til optimalisering av cRyoprotectant finnes i referanse 30 ). Fjern overflødig væske ved blotting med en papirpresse. I motsetning til det forrige trinnet, bør den gjenværende filmen av løsningsmiddel være så tynn som mulig for å redusere parallaxeffekter som kompliserer prosessen med tilpasning mellom krystall, strålebane og goniometer; Og for å minimere bakgrunn forårsaket av spredning av røntgenstråler med væske i strålebanen.
    6. Koble øyeblikkelig mikromeshen i flytende nitrogen og overfør til et hetteglass eller en robotpuck, deretter til en tørr avsender eller dewar for lagring.
  3. Fremstilling av mikromesh med krystallholdige celler
    FORSIKTIG: Bruk av flytende nitrogen er forbundet med farer som for eksempel kvælning, forkjølelse, brann i oksygenberiget atmosfære og eksplosjon. Ta kontakt med risikostyring og sikker arbeidspraksis i din institusjon.
    1. Overfør de sorterte cellene til et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Basert på cellen cOunter registrert av cellesorteren, juster konsentrasjonen til 10 7 celler / ml ved å fortynne prøven med PBS; Eller ved pelletering av cellene ved 150 xg i 3 minutter ved romtemperatur i en mikrocentrifuge, justering av sluttvolumet ved fjerning av supernatant og forsiktig resuspendering av cellene.
    2. Bland cellene med et like stort volum trypanblått oppløsning (0,4% vekt / volum) til en sluttkonsentrasjon på 0,2% vekt / volum.
    3. Hvis prøver skal fryses på forhånd, må du avkjøle den tørre avsenderen eller dewar ned med flytende nitrogen. Forbered hetteglassene eller puckene, etter behov, og avkjøl dem også med flytende nitrogen.
    4. Resuspender cellene og pipetten forsiktig opp 0,5 μl sorterte celler på en mikromesh.
    5. Fjern overflødig væske ved blotting med en papirpresse. Cellene skal spres jevnt på nettverket, uten å berøre hverandre. Hvis ikke bruke kryobeskyttende middel (trinn 3.3.6), bør gjenværende film av løsningsmiddel være så tynn som mulig for å redusere parallaxeffekter som komplisererE prosessen med justering mellom krystallet, strålebanen og goniometeret; Og for å minimere bakgrunn forårsaket av spredning av røntgenstråler med væske i strålebanen.
    6. Tilsett eventuelt kryoskyddsmiddel til cellene: pipett 0,5 μl 50% etylenglykol, 50% PBS-løsning på masken. Kryobufferens sammensetning skal tilpasses prøven; Forslag til optimalisering av kryoskyddsmiddel finnes i referanse 30 . Fjern overflødig væske ved å bløte med en papirpresse, og bare etterlate en tynn film av løsningsmiddel.
      Merk: Utelatelse av kryobeskyttelsestrinnet endret ikke kvaliteten på røntgendiffraksjon når krystallene av polyhedrinet ble analysert i cellulose , mens dette trinnet var nødvendig for rensede krystaller 20 . Dette gjelder bare inkuberingen av cellene med krybeskyttelsesløsning; Prøven skal fortsatt analyseres ved 100K for å minimere effekten av strålingsskader på krystallene.
    7. umiddelFlash-kjøle mikromeshen i flytende nitrogen og overfør til et hetteglass eller en robotpuck, deretter til en tørr avsender eller lagringsdewar, etter behov.

4. Datainnsamling

Merk: Parametre som brukes til datainnsamling er gitt som en veiledning og bør optimaliseres for hver krystalltype og synkrotronlinjelinje.

  1. Samle inn data på en mikrofokuskrystallografi-strålelinje (se referanse 7 for en liste over mikrofokusbalklinjer og deres egenskaper). Hvis det er tilgjengelig, bruk en kollimert stråle som stemmer overens med krystallstørrelsen.
  2. For eksperimentell fasering med den enkle bølgelengde-anomaløse dispersjonsmetoden (SAD), samles ved en energi som maksimerer det uregelmessige signalet til det valgte tunge atom. For phasing ved bruk av Multiple Isomorphous Replacement-metoden (MIR), samle over energien av en passende absorpsjonskant for det tunge atomet som er valgt (tilgjengelig på http://skuld.bmsc.washington.edu/scAtter / AS_periodic.html).
  3. Etter at du har lagt inn masken på goniometeret, begynner du med å sentrere mikromeshen med strålebanen ved hjelp av den forsiden på (konvekse side) og side-orienteringen. Deretter finjusterer justeringen med micromesh-ansiktet ved å justere midten av en bestemt horisontal bane i mikromeshen (for eksempel starte med den sentrale). Deretter samler du data langs denne horisontale banen med bare mindre justeringer til justeringen. Hvis det er tilgjengelig, bruk sentrering basert på rastering ved lavdose-røntgendiffraksjon for finjustering av justeringen (se lokal kontakt på synkronstrømlinjen).
    Merk: Som en begrenset mengde data kan oppsamles på mikrokrystaller på grunn av strålingsskade (vanligvis 10 til 30 bilder med 1 ° oscillasjon), må teorien bare justeres med strålebanen for 10-30 °. Imidlertid er det kritisk at justeringen er nøyaktig som krystallet lett kan unngås av mikrobjelken (generelt kollimert til en diameterEr på ~ 10 μm eller mindre).
  4. Samle diffraksjonsdata til diffraksjon går tapt på grunn av strålingsskade. For krystaller av polyhedrin brukes eksponeringstid på 10 sek typisk for en 1 ° oscillasjon for en fluss på ca. 3,6 x 10 11 foton / s ved 13 keV med en CCD detektor (total dose <30 MGy). Optimaliser disse innstillingene avhengig av strålelinjen og naturen til krystallet som brukes. Spesielt anbefales lav dose og fint skiver for pikselrøntgendetektorer.
    Merk: Ved bruk av cellulosestrategien vil cellene som er farget med trypanblå, vises som blå prikker mot støttebakgrunnen, noe som gjør dem lettere å justere seg til strålen. Hvis den kollimerte mikrobeam har omtrent samme størrelse som cellene (~ 10 μm), vil alle krystaller som er inneholdt i en celle bli belyst samtidig. For celler som inneholder flere mikrokrystaller, fører dette til observasjon av multiple diffraksjonsmønstre, noe som kan være vanskelig å behandle. Imidlertid diFraksjonen fra en av krystallene har ofte en tendens til å dominere diffraksjonsmønsteret og er fortrinnsvis indeksert under databehandling. For strålebaner med en røntgenstråle er det betydelig mindre at cellen, rastering ved svært lav røntgenflux (> 95% demping) skal brukes til å sitte på en enkelt krystall før datainnsamling.
  5. Fortsett til neste krystall i kjørefelt.
  6. Når alle krystallene i banen er testet, fortsett til neste felt og gjenta justeringsprosedyren. Fortsett til tilstrekkelig data er blitt samlet eller alle krystaller har blitt testet.
    1. Pass på at banene som er behandlet, er tydelig identifisert slik at krystaller ikke blir savnet eller skutt to ganger (om nødvendig, tegne en skisse). Typisk blir trypanblått gul etter at cellen har blitt bestrålt, som kan brukes som markør.

Figur 5
Figur 5 : Datainnsamlingsstrategi fra prøver på Micromesh Support. ( A ) Strategi for datainnsamling per kjørefelt Justering er gjort i begynnelsen av hver bane (prikker) og data samles langs banen. ( B ) Nærbilde av en trypanblåfarget, krystallholdig celle på et nett, sett på mikrokrystallografi-strålelinjeskjermen. ( C ) Nærbilde av en renset polyeder på et nett, sett på mikrokrystallografien strålelinjeskjermen. Maskorgruppene er 25 μm x 25 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

5. Databehandling

MERK: Her nevner vi bare kort trinnene med databehandling som er spesifikke for seriell mikrokrystallografi, hvor data fra flere krystaller slås sammen. Mange gode artikler erTilgjengelig som beskriver databehandling i dybde 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 og strukturbestemmelse er utenfor rammen av denne protokollen.

  1. Velg krystall med best diffraksjon oppløsning og kvalitet som referanse.
  2. Individuelt behandle hver krystall ved bruk av standardkrystallografipakker som HKL-2000 31 , Mosflm 32 eller XDS 33 . For å sikre at strålingsskader ikke forringer datasettets kvalitet, velg forsiktig det siste bildet med akseptabel strålingsskade. Klippkriterier som angir overdreven strålingsskade er spesifikke for hver krystalltype, behandlingspraksis og formålet med eksperimentet. For fasing av BmCPV1 polyhedrin krystaller ble data kassert når signalet til nOise <I> / <σ (I)> per bilde falt under 2 eller R sym overskredet 50% som rapportert av HKL-2000 31 .
  3. For hver krystall definerer du oppløsningsgrensen og antall rammer og reprosesserer med de riktige parametrene for å unngå å integrere data med lite eller ingen signal.
  4. Skala og slå sammen data fra de beste krystallene til referanse krystallene ved hjelp av standardpakker som Scalepack i HKL-2000 31 , SCALA i CCP4 34 , 35 eller XSCALE i XDS 33 . Legg dataene fra de forskjellige krystallene progressivt mens du overvåker datasettets globale kvalitet, ideelt til datasettet når en akseptabel fullstendighet (> 95%). Avvis krystaller som presenterer en dårlig isomorfisme med best / referanse krystall som oppdaget av forskjeller i enhedscelleparametere og dårlig R- fusjon / chi-firkant per bilde. Hvis for mange gode datasettIkke skala med referanse krystall (er), bruk et program som BLEND 36 som bærer hierarkisk clustering for å definere den beste kombinasjonen av datasett for å slå sammen.
    Merk: I enkelte mellomromgrupper må alternative indekseringsalternativer testes for å matche referanse-krystallet.
  5. Fortsett til eksperimentell fasing, molekylær erstatning eller forfining ved bruk av standardkrystallografipakker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En oversikt over begge alternative metoder for strukturbestemmelse ved bruk av in vitro mikrokrystaller presenteres ( figur 1 ). Polyhedra kan lett renses ved sonikering og sentrifugering. På grunn av dens tetthet danner de et lag på bunnen av røret under et lag av rusk som kan fjernes ved pipettering ( figur 3a og 3b ). Prøven blir deretter utsatt for flere runder av sonikering og vasker til et tilstrekkelig renhetsnivå er nådd som dømt fra det hvite og kalkholdige aspektet av pelleten ( figur 3c ).

For cellulose- tilnærming sammenlignes strømningscytometriprofilen for ikke-infiserte celler med profilen av krystallholdige celler og brukes til å bestemme hvilken cellepopulasjon som skal velges for å sortere krystallholdige celler bort fraDe andre cellene ( figur 4 ). I dette eksemplet har celler som inneholder polyederer en høyere sidestrømning enn ikke-infiserte celler. Andre forskjeller i spredningsmønstre kan observeres for andre krystalltyper, og gating bør endres tilsvarende.

Rensede mikrokrystaller eller krystallholdige celler pipetteres på en mikromesh ( figur 5 ). Celler som er farget med trypanblå kan enkelt visualiseres ved bruk av kameraer som er tilgjengelige i det meste av synkrotronstrålelinjer ( figur 5b ), mens rensede krystaller er arbeidsomme å identifisere og justere med røntgenstrålen på grunn av deres lille størrelse ( figur 5c ). Når du samler data, er det best å fortsette i et rutemønster for å minimere sentreringsprosedyrene, og for å unngå å utsette to ganger samme celle eller krystall, eller mangler noen ( Figur 5a ). DatainsamlingTed bør behandles forsiktig for å ta hensyn til forskjeller i diffraksjonsgrenser, effekten av strålingsskader og en mulig mangel på isomorfisme.

Figur 1
Figur 1 : Oversikt over to metoder for strukturbestemmelse ved bruk av in vivo mikrokrystaller. Mikrokrystaller fremstilles i cellekultur ved overuttrykk av proteinet av interesse ved anvendelse av et rekombinant ekspresjonssystem. I spesielle tilfeller kan mikrokrystaller også produseres naturlig av cellene under spesielle forhold. Den øverste raden viser den klassiske tilnærmingen hvor celler lyseres og krystaller renses ved differensial sentrifugering. Renset mikrokrystaller pipetteres på en mikromesh. Etter fjerning av overflødig væske tilsettes en kryobeskyttelsesoppløsning, overskytende væske utblåses igjen og masken blir flashkjølt. For røntgen dif Fraksjon eksperimenter, krystallene er nøye justert med røntgenstrålen, som kan være hastighetsbegrensende trinn i datainnsamling. Den nederste raden presenterer den cellulose- tilnærmingen. Celler sorteres ved hjelp av flytcytometri for spesifikt å velge krystallholdige celler. Cellene er farget med trypanblått for å lette visualisering og spre seg på en mikromesh. I dette tilfellet er tilsetningen av et kryoskyddsmiddel valgfritt. For røntgendiffraksjonseksperimenter kan celler enkelt visualiseres ved hjelp av typiske kameraer som er tilgjengelige på synkrotronlinjelinjer som letter sentreringsprosessen.
Bilde av automatisert væskekromatografisystem med hilsen til GE Healthcare AB, Uppsala, Sverige. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2
= "Xfig"> Figur 2 : Eksempler på in vivo mikrokrystaller. Utvalgte eksempler på in vivo krystaller: ( a ) Sf9 celler med cypovirus polyhedra; ( B ) LD652-celler med entomopoxvirus sfæroider; ( C ) Bacillus thuringiensis med Cry3A krystaller (pil); ( D ) Sf9-celler med Trypanosoma brucei cathepsin B-krystaller; ( E ) Sf21-celler med kalsineurinkrystaller (piler); ( F ) COS7-celler monolag med PKA: Inka1-krystaller; ( G ) CHO-celler med IgG-krystaller. Gjengitt fra 14 , 18 , 29 , 37 , 39 , 42 , med tillatelse. Skalbjelke = 10 μm. Vennligst klikk her for å se en storEr versjon av denne figuren.

Tabell 1
Tabell 1: Sammendrag av in vivo krystaller vokst i dyrkede celler som uttrykker rekombinant protein. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen gir to tilnærminger til å analysere mikrokrystaller med sikte på å lette analysen av svært små krystaller som tidligere hadde blitt oversett.

Kritiske skritt for mikrokrystallrensing
Den presenterte protokollen er optimalisert ved bruk av Bombyx mori CPV1 polyhedrin uttrykt i Sf9-celler som modellsystem. Imidlertid viser in vivo mikrokrystaller en stor variasjon i mekanisk motstand. For eksempel er cathepsin B nålignende krystaller dyrket i insektceller stive og svært motstandsdyktige overfor mekanisk stress, og kan renses ved hjelp av en protokoll som ligner den som er beskrevet her 14 . På den annen side oppløses firefly luciferase krystaller, som også dyrkes i dyrkede insektceller og med en lignende nålliknende morfologi, umiddelbart oppløses på cellelys 38 . Dermed er protokollen for ekstraksjon og rensing av in vivoKrystaller må tilpasses på prøvefeil for bestemte tilfeller som beskrevet i trinnene 1.3, 2a.3-4, 2b.4, 3.1.3-4 og 3.2a.5.

For skjøre krystaller kan (delvis) separasjon fra celleavfall oppnås ved sentrifugering med lav hastighet ( dvs. 200 xg) eller tilsetning av en sukrosepute i bunnen av røret i stedet for gjentatt sonikering. Som en generell regel trenger ikke krystallprøver forberedt for diffraksjonsinnsamlingsformål å være sterkt renset. Således er hurtig rensing foretrukket å kryo-kjøle krystallene før de kan forfall.

Søknad på in vitro og in vivo mikrokrystaller
Selv om begge protokollene er illustrert her med analyse av in vivo dyrkede krystaller, kan metoden lett brukes til mikrokrystaller dyrket i krystallbakker fra renset rekombinant protein. I denneS tilfelle, bør følgende modifikasjoner vurderes: i) meshstøtten kan brukes til å høste mikrokrystaller direkte fra krystallisasjonsdråpet, i stedet for å overføre dem ved pipettering; Ii) siden mengden av krystaller kan være en begrensende faktor, må det tas spesiell forsiktighet når blotting av overskudd av væske fra maskebæreren for å unngå overdreven fjerning av krystaller; Iii) forskjellige kryobeskyttelsesbuffere må testes, som gjort ved konvensjonell krystallografi (se referanse 30 ).

På den annen side, for in vivo- vokste krystaller, anbefales cellulose- tilnærming sterkt. Fordi celler er lettere å visualisere og manipulere enn rensede krystaller, er denne tilnærmingen mer effektiv når det gjelder strålebruk og mer tilgjengelig for forskere med liten eller ingen erfaring med mikrokrystallografi. Det er også mer egnet for skjøre krystaller som kan bli påvirket av ekstraksjonen og pur Ification fra cellen på grunn av endringer i det kjemiske miljøet, fortynning av de omkringliggende proteiner og mekanisk skade. Dessuten gir celler et beskyttelsesmiljø til krystallene, hvilket lindrer behovet for tilsetning av et kryobeskyttelsesmiddel. Utelatelse av kryobeskyttelsesbehandlingen har tidligere vist seg å forhindre akkumulering av defekter og forbedret isomorfismen mellom individuelle krystaller, for datainnsamling ved romtemperatur 40 . Den cellulose- protokollen omgår også kravet til inkubering i kryobeskyttelsesløsning, mens det fortsatt tillates datainnsamling ved kryogen temperatur. Samlet sett har datainnsamling i cellulose to hovedfordeler: 1) det kan produsere data av bedre kvalitet og høyere oppløsning for en gitt periode med stråletid 20 ; Og 2) den opprettholder det krystalliserte proteinet i en cellulær miljø som øker sjansene for å beholde en biologisk relevant ligand.

Ontent "> Begrensninger av teknikken
En inneboende komplikasjon av seriell mikrokrystallografi er det viktige antall partielle datasett som genereres under datainnsamling. Følgelig blir databehandling en stadig mer tidkrevende prosess. Den grunnleggende arbeidsflyten for databehandling kan imidlertid i stor grad automatiseres. For eksempel kan det optimale utvalget av isomorfe krystaller bestemmes av hierarkisk klyngeanalyse 28 , for eksempel implementert i BLEND 36 . I tillegg kan programmer utviklet for analyse av røntgenfrie elektronlasere (XFEL) også tilpasses for å behandle seriell mikrokrystallografidata samlet på synkrotronstrålelinjer 2, og ved noen strålelinjer har automatisert rastering av mesh og krystall deteksjon blitt implementert i stor grad forenkling av seriell Datainnsamling 2 , 41 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gjerne anerkjenne Chan-Sien Lay for å gi bilder av rensede mikrokrystaller, Daniel Eriksson og Tom Caradoc-Davies for støtte på MX2-strålen i den australske synkrotronen, og Kathryn Flanagan og Andrew Fryga fra FlowCore-anlegget ved Monash University for deres Uvurderlig hjelp.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sf9 cells Life Technologies
SF900-SFM insect medium Life Technologies
1 L cell culture flask Thermofisher Scientific
Shaking incubator for insect cell culture Eppendorf
50 mL conical tubes Falcon
Centrifuge with swing buckets for 50 mL tubes Eppendorf
Sonicator equiped with a 19 mm probe MSE Soniprep 150 
Glass slides Hampton Research
Hemacytometer Sigma-Aldrich
Propidium iodide Thermofisher Scientific
BD Influx cell sorter  BD Biosciences
Hampton Heavy atom screens Hampton Research
Microcentrifuge Eppendorf
Micromesh Mitigen 700/25 meshes offer a larger surface. Indexed meshes can be purchased for systematic studies.
Paper wick Mitigen The size of the paper wick can be varied for optimal flow. This will largely depend on the nature of the crystals and cryoprotectant used.
Ethylene glycol Sigma-Aldrich
Trypan blue Life Technologies
MX2 microfocus beamline Australian Synchrotron A list of available microfocus beamlines can be found in Boudes et al. (2014) Reflections on the Many Facets of Protein
Microcrystallography. Australian Journal of Chemistry 67 (12), 1793–1806,
doi:10.1071/CH14455.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tari, L. W. The utility of structural biology in drug discovery. Methods Mol Bio (Clifton, N.J). 841, 1-27 (2012).
  2. Gati, C., et al. Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (2), 0(2014).
  3. Redecke, L., et al. Natively inhibited Trypanosoma brucei cathepsin B structure determined by using an X-ray laser. Science. 339 (2013), 227-230 (2013).
  4. Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals. eLife. 2 (0), e01345 (2013).
  5. Evans, G., Axford, D., Waterman, D., Owen, R. L. Macromolecular microcrystallography. Crystallog. Rev. 17 (2), 105-142 (2011).
  6. Smith, J. L., Fischetti, R. F., Yamamoto, M. Micro-crystallography comes of age. Curr Opin Struct Biol. 22 (5), 602-612 (2012).
  7. Boudes, M., Garriga, D., Coulibaly, F. Reflections on the Many Facets of Protein Microcrystallography. Aust J Chem. 67 (12), 1793-1806 (2014).
  8. Nelson, R., et al. Structure of the cross-beta spine of amyloid-like fibrils. Nature. 435 (7043), 773-778 (2005).
  9. Coulibaly, F., et al. The molecular organization of cypovirus polyhedra. Nature. 446 (7131), 97-101 (2007).
  10. Coulibaly, F., et al. The atomic structure of baculovirus polyhedra reveals the independent emergence of infectious crystals in DNA and RNA viruses. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22205-22210 (2009).
  11. Johansson, L. C., et al. Structure of a photosynthetic reaction centre determined by serial femtosecond crystallography. Nat Comm. 4, (2013).
  12. Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography. J Vis Exp. (67), (2012).
  13. Roedig, P., et al. A micro-patterned silicon chip as sample holder for macromolecular crystallography experiments with minimal background scattering. Sci Rep. 5, 10451 (2015).
  14. Koopmann, R., et al. In vivo protein crystallization opens new routes in structural biology. Nature Methods. 9 (3), 259-262 (2012).
  15. Gallat, F. -X., et al. In vivo crystallography at X-ray free-electron lasers: the next generation of structural biology. Phil Trans R Soc B. 369 (1647), 20130497 (2014).
  16. Duszenko, M., et al. In vivo protein crystallization in combination with highly brilliant radiation sources offers novel opportunities for the structural analysis of post-translationally modified eukaryotic proteins. Acta Cryst. F. 71 (8), 929-937 (2015).
  17. Axford, D., Ji, X., Stuart, D. I., Sutton, G. In cellulo structure determination of a novel cypovirus polyhedrin. Acta Cryst D. 70 (5), 1435-1441 (2014).
  18. Sawaya, M. R., et al. Protein crystal structure obtained at 2.9 Å resolution from injecting bacterial cells into an X-ray free-electron laser beam. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (35), 12769-12774 (2014).
  19. Tsutsui, H., et al. A Diffraction-Quality Protein Crystal Processed as an Autophagic Cargo. Mol Cell. 58 (1), 186-193 (2015).
  20. Boudes, M., Garriga, D., Fryga, A., Caradoc-Davies, T., Coulibaly, F. A pipeline for structure determination of in vivo-grown crystals using in cellulo diffraction. Acta Cryst D. 72, 576-585 (2016).
  21. Doye, J. P. K., Poon, W. C. K. Protein crystallization in vivo. Curr Opin Colloid Interface Sci. 11 (1), 40-46 (2006).
  22. Mori, H., et al. Expression of Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus polyhedrin in insect cells by using a baculovirus expression vector, and its assembly into polyhedra. J Gen Virol. 74, Pt 1 99-102 (1993).
  23. Arevalo, M. T., Wong, T. M., Ross, T. M. Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination. J Vis Exp. (112), (2016).
  24. Yates, L. A., Gilbert, R. J. C. Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies. J Vis Exp. (85), (2014).
  25. Berger, I., et al. The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL. J Vis Exp. (77), (2013).
  26. Margine, I., Palese, P., Krammer, F. Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System. J Vis Exp. (81), (2013).
  27. Khurana, A., Kronenberg, M. A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells. J Vis Exp. (10), (2007).
  28. Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J Vis Exp. (16), (2008).
  29. Baskaran, Y., et al. An in cellulo-derived structure of PAK4 in complex with its inhibitor Inka1. Nat Comm. 6, 1-11 (2015).
  30. Armour, B. L., et al. Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit. J Vis Exp. (76), (2013).
  31. Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods Enzymol. 276, 307-326 (1997).
  32. Battye, T. G. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. W. iMOSFLM: a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM. Acta Cryst D. 67, Pt 4 271-281 (2011).
  33. Kabsch, W. XDS. Acta Cryst D. 66, Pt 2 125-132 (2010).
  34. French, S., Wilson, K. On the treatment of negative intensity observations. Acta Cryst.A. 34, 517-525 (1978).
  35. Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Cryst D. 67, Pt 4 235-242 (2011).
  36. Foadi, J., et al. Clustering procedures for the optimal selection of data sets from multiple crystals in macromolecular crystallography. Acta Cryst D. 69 (8), 1617-1632 (2013).
  37. Rey, F. A. Virology: holed up in a natural crystal. Nature. 446 (7131), 35-37 (2007).
  38. Schönherr, R., et al. Real-time investigation of dynamic protein crystallization in living cells. Struct Dyn. 2 (4), 041712 (2015).
  39. Hasegawa, H., et al. In vivo crystallization of human IgG in the endoplasmic reticulum of engineered Chinese hamster ovary (CHO) cells. J Biol Chem. 286 (22), 19917-19931 (2011).
  40. Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography. J Vis Exp. (115), e54463 (2016).
  41. Zander, U., et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Cryst. D. 71, 2328-2343 (2015).
  42. Fan, G. Y., et al. In vivo calcineurin crystals formed using the baculovirus expression system. Micros Res Tech. 34 (1), 77-86 (1996).
  43. Nass, K. Investigation of protein structure determination using X-ray free-electron lasers. , Hamburg University. PhD dissertation (2013).

Tags

Biochemistry utgave 125 mikrokrystallografi mikrokrystaller røntgendiffraksjon, polyeder,
Mikrokrystallografi av proteinkrystaller og<em&gt; I Cellulo</em&gt; Diffraksjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boudes, M., Garriga, D., Coulibaly,… More

Boudes, M., Garriga, D., Coulibaly, F. Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction. J. Vis. Exp. (125), e55793, doi:10.3791/55793 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter