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Developmental Biology

संवहनी एंडोथिलियल स्टेम सेल के पोत जनरेशन को विज़ुअलाइज़ करने के लिए एक उपन्यास स्तनधारी फैट पैड ट्रांसप्लांटेशन तकनीक

Published: August 3, 2017 doi: 10.3791/55795
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1State Key Laboratory of Cell Biology, CAS Center for Excellence in Molecular Cell Science, Institute of Biochemistry and Cell Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences

Summary

यह काम स्तन वसा पैड ट्रांसप्लांटेशन के माध्यम से संवहनी एंडोथिलियल स्टेम कोशिकाओं (वीजेएससी) के प्रसार, भेदभाव और पोत बनाने की क्षमता का आकलन करने के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण को दर्शाता है, जिसके बाद माइक्रोस्कोपिक अवलोकन के लिए पूरे माउंट ऊतक की तैयारी होती है। विवो में वीजेएससी के व्यवहार की जांच करने के लिए एक वंशावली अनुरेखण रणनीति भी प्रस्तुत की गई है।

Abstract

एंडोथेलियल कोशिकाएं (ईसीएस) नाड़ी की वास्तुकला के मौलिक बिल्डिंग ब्लॉक हैं और समुचित पोत विकास और होमोस्टैसिस को सुनिश्चित करने के लिए नाड़ी विकास और रीमॉडेलिंग मध्यस्थता है। हालांकि, एंडोथेलियल वंशावली पदानुक्रम पर अध्ययन उपकरण के अभाव के कारण पहुंच हासिल करने के साथ-साथ सीधे विवो में अपने व्यवहार का मूल्यांकन करने के लिए मायावी रहते हैं। इस कमी को हल करने के लिए स्तन वसा पैड का उपयोग करके एंजियोजेनेसिस का अध्ययन करने के लिए एक नया ऊतक मॉडल विकसित किया गया है। स्तन ग्रंथि ज्यादातर प्रसवोत्तर चरणों में विकसित होती है, जिसमें यौवन और गर्भावस्था शामिल होती है, जिसके दौरान मजबूत उपकला प्रसार के साथ व्यापक संवहनी रीमॉडेलिंग होता है। स्तनधारी वसा पैड बढ़ते स्तन उपकला से अंतरिक्ष, मैट्रिक्स और अमीर एंजियोजेनिक उत्तेजना प्रदान करते हैं। इसके अलावा, स्तन वसा पैड पेरिटोनियल गुहा के बाहर स्थित हैं, जिससे उन्हें एक्सोजेनस कोशिकाओं की एंजियोजेनिक क्षमता का आकलन करने के लिए एक आसानी से सुलभ ग्राफ्टिंग साइट मिलती है। यह काम भी एक प्रभावकारिता का वर्णन करता हैविशेष रूप से vivo में नाड़ी endothelial स्टेम कोशिकाओं (वीजेएससी) की लक्षित आबादी लेबल करने के लिए फ्लोरोसेंट रिपोर्टर चूहों के उपयोग से एनटी ट्रेसिंग दृष्टिकोण। बाद में ऊतक पूरे माउंट माइक्रोस्कोपी के साथ युग्मित इस वंश निशान विधि, लक्षित कोशिकाओं और उनके वंश की प्रत्यक्ष दृश्यता को सक्षम करती है, जिसके माध्यम से प्रसार क्षमता की मात्रा निर्धारित की जा सकती है और भेदभाव प्रतिबद्धता भाग्य-मैप हो सकती है। इन विधियों का इस्तेमाल करते हुए, वीओएससी को व्यक्त करने वाले बायोटोतेंट प्रोटीन सी रिसेप्टर (प्रोक्रेट) की आबादी हाल ही में कई संवहनी प्रणालियों में की गई है। प्रोक्र + + वीजेएस, नए ईसीएस और पेरिसिट दोनों को जन्म देते हुए, विकास के दौरान एंजियोजेनेसिस में योगदान, होमोस्टैसिस, और चोट की मरम्मत। कुल मिलाकर, यह पांडुलिपि एक नया स्तनमय वसा पैड ट्रांसप्लांटेशन और विवो वंशावली अनुरेखण तकनीकों का वर्णन करता है जो कि वीजेएससी के स्टेम सेल गुणों का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Introduction

विकास और होमोस्टेसिस के दौरान, संवहनी विकास और रीमॉडलिंग ईमानदारी से अंग विकास और मरम्मत के अनुसार होते हैं। एंजियोजेनेसिस पहले से मौजूद रक्त वाहिकाओं से नए जहाजों की पीढ़ी का वर्णन करता है और इन गतिशील नाड़ी परिवर्तनों की मध्यस्थता में एक प्रमुख बल माना जाता है। प्रत्येक रक्त वाहिका को एंडोथेलियल कोशिकाओं (ईसीएस) की एक परत के साथ आंतरिक रूप से खड़ा किया जाता है, और वे जहाज की वास्तुकला की नींव प्रतीत होते हैं। लंबे समय के लिए, होमियोस्टासिस के दौरान ईसी पूल की भरपाई की जाने वाली तंत्र अस्पष्ट बनी रही और बहस यह थी कि संवहनी टर्नओवर परिपक्व ईसी प्रसार का परिणाम है या संवहनी स्टेम / पूर्वज सेल गतिविधियों का योगदान है या नहीं। प्रत्यक्ष शारीरिक सबूत की कमी के कारण, संवहनी एंडोथिलियल स्टेम सेल (वीजेएससी) की अस्तित्व और सेलुलर पहचान भी विवादास्पद रही।

स्टेम सेल व्यवहार को सत्यापित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले सबसे आम दृष्टिकोणों में से एक ट्रांसप्लान हैग्रहणशील स्टेम कोशिकाओं को प्राप्तकर्ता चूहों में मिला। यह विधि विवो में अभ्यर्थी स्टेम कोशिकाओं की स्टेमनेस क्षमता को मापता है । प्रत्यारोपण सबसे पहले अस्थि मज्जा स्टेम कोशिकाओं 1 के अध्ययन के लिए लागू किया गया था, जो हेमेटोपोएटिक प्रणाली 2 के पदानुक्रमिक विशेषताओं की स्थापना में योगदान दिया था। एंडोथेलियल फील्ड में, एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स ( जैसे, मैटिगिल) प्लग को नीचे की तरफ के नीचे डाला जाता है जो कि प्रत्यारोपित ईसीएस के पोत निर्माण क्षमताओं को संबोधित करने के लिए इस्तेमाल किए गए विवो एंजियोजेनेसिस परख में एक मानक था । 3 डी संस्कृति प्रणालियों और प्रत्यारोपण में कॉलोनी गठन सहित कई प्रयोगात्मक विधियों ने संभावित ईसी पूर्वज / वीजेएससी जनसंख्या 3 , 4 , 5 , 6 का सुझाव दिया है। हालांकि, चूंकि तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में एम्बेडेड ईसीएस अपेक्षाकृत से अलग हैंआसपास के ऊतक, यह प्रत्यारोपित कोशिकाओं की एंजियोजेनिक क्षमता का पूरी तरह से पता लगाने के लिए आवश्यक अनुकूल वातावरण प्रदान नहीं करता है। नतीजतन, मैट्रिक्स प्लग के भीतर निर्मित जहाजों को मुख्य रूप से केशिका-समान होते हैं और वे कार्यात्मक रूप से अपरिहार्य होते हैं।

स्तन ग्रंथि प्रसवोत्तर रूप से विकसित होती है, जिसमें यौवन और गर्भावस्था के दौरान होने वाली सबसे मजबूत वृद्धि होती है। पौष्टिक अवस्था में, स्तन उपकला तेजी से विस्तार से गुजरती है, पूरे स्तनमय वसा वाले पैड पर कब्जा करने के लिए, आसपास के नाड़ी संरचनाओं के कुशल रीमॉडेलिंग के साथ। इस प्रकार, स्तन ग्रंथि एंजिोजेनेसिस के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रदान करती है। यह बढ़ते स्तन उपकला से अंतरिक्ष, मैट्रिक्स और अमीर एंजियोजेनिक उत्तेजना प्रदान करता है और इसलिए बाहरी कोशिकाओं की एंजियोजेनिक क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए एक आदर्श ग्राफ्टिंग साइट है। इसके अलावा, स्तन वसा वाला पैड मेजबान परिसंचरण प्रणाली के साथ गठित बहिर्जात जहाजों को एकीकृत करने की अनुमति देता है, जिससे आगे बढ़ेगाएक्सेक्शनल मूल्यांकन और चमड़े के नीचे प्रत्यारोपण पर एक लाभ का प्रतिनिधित्व करते हैं।

हालांकि इन विट्रो संवर्धन और प्रत्यारोपण assays सेल आबादी के उत्थान गुणों की जांच करने के लिए प्रभावी तरीका हैं, यह ज्ञात है कि ऐसे assays plasticity को उत्तेजित कर सकते हैं के रूप में कोशिकाओं को अपने मूल निवास से दूर ले जाया जाता है, और जब सेल से डिस्कनेक्ट कर रहे हैं तो परिवर्तन हो सकता है उनके शारीरिक परिवेश 7 इसलिए, सेल भाग्य के विवो सबूत में सीधा प्राप्त करना एंडोथेलियल आबादी के व्यवहार की वर्तमान समझ को आगे बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण दृष्टिकोण है।

आनुवंशिक भाग्य मानचित्रण ( अर्थात्, विवो वंशावली अनुरेखण में) VESCs की पहचान के लिए आवश्यक है और शरीर की प्रणाली में उनकी संपत्ति की जांच के लिए आवश्यक है, क्योंकि यह शारीरिक संदर्भ में विवो स्टेम कोशिका व्यवहार में प्रकट हो सकता है, और वास्तविक स्टेमनेस हो सकता है आकलन किया। वंशावली traciएनजी उम्मीदवार वीजेएस के दीर्घकालिक दृढ़ता ( यानी, आत्म-नवीकरण) के प्रत्यक्ष प्रमाण प्रदान करता है और मूल के ऊतक के लिए सेल प्रकार का उत्पादन करने की उनकी क्षमता ( यानी, भिन्नता शक्ति)।

इस प्रोटोकॉल में एक उपन्यास स्तनमय वसा पैड ट्रांसप्लांटेशन तकनीक और वीजेएससी की पोत उत्पादन क्षमता को देखने के लिए एक वंश अनुरेखण विधि का वर्णन किया गया है। इन तकनीकों को वर्तमान में उपलब्ध assays की कमियों पर काबू पाने और VESCs के स्टेम सेल गुणों का बेहतर मूल्यांकन करने का एक नया तरीका प्रदान करते हैं। ये दृष्टिकोण कुशल उपकरण हैं जिनका उपयोग ऐन्डोथेलियल आबादी के व्यवहार और पोत-निर्माण गुणों का आकलन करने के लिए किया जा सकता है, साथ ही रोग के वातावरण में संवहनी सेल शक्ति परिवर्तन को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Protocol

प्रायोगिक प्रक्रियाएं अनुमोदित प्रोटोकॉल SIBCB-NAF-15-002-S335-003 के तहत चीनी एकेडमी ऑफ साइंसेज के शंघाई इंस्टीट्यूट ऑफ बायोकैमिस्ट्री और सेल बायोलॉजी की पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित की गईं।

1. माउस स्तन ग्रंथि से VESCs का अलगाव

  1. स्तन ग्रंथि फसल और ऊतक पाचन।
    1. ऊतक दाताओं के रूप में 20 और 25 ग्रा के बीच वजन की सीमा के साथ, 8 सप्ताहीय एक्टिन-जीएफपी परिपक्व कुंवारी संवाददाता चूहों का उपयोग करें।
      नोट: दाता से उत्पन्न कोशिकाओं को आसानी से जीएफपी अभिव्यक्ति द्वारा ट्रैक किया जा सकता है
    2. आरपीएमआई 1640 में 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 1% पेन / सीआरपी, और 25 एमएम HEPES वाला टिशू पाचन आधार मध्यम तैयार करें। 0.22 सुक्ष्ममापी फिल्टर के माध्यम से मिश्रण को बाष्पीकरण और पानी के नहाने में 37 डिग्री सेल्सियस से पहले गरम करें।
    3. सीओ 2 चैम्बर में चूहों को त्याग दें पहले एक ऊर्ध्वाधर त्वचा बनाकर इनगेंनल स्तन ग्रंथियों की चौथी जोड़ी को बाहर निकालनाएक स्केलपेल (या शल्य कैंची) का उपयोग करके निचले पेट के मध्य लाइन पर निक्सन संदंश का उपयोग करते हुए इनगेंनल स्तन ग्रंथि का पर्दाफाश करने के लिए त्वचा को एक तरफ धीरे से छील कर दें। दोनों तरफ से चौथे संघीय स्तन ग्रंथियों को प्राप्त करें और उन्हें कैंची का उपयोग करके 6 सेमी पेट्री डिश में ठीक टुकड़ों में काट लें।
      1. कीमा बनाया हुआ ऊतक के कुल वजन को मापें और इसे 50 एमएल ट्यूब में रखें।
        नोट: सुनिश्चित करें कि प्रत्येक टुकड़े के लिए परिणामी ऊतक खसरा 1 मिमी 3 आकार से छोटा है। एक विशिष्ट उपज प्रति पशु लगभग 5,000 वीजेएससी है।
    4. ऊतक खनिज के प्रति 1 ग्राम प्रति 10 मिलीलीटर की मात्रा पर 50 मिलीलीटर वाली कैप वाली अपकेंद्रित्र ट्यूब में पाचन बेस मध्यम तैयार करें। पाचन बफर का गठन करने के लिए पाचन आधार माध्यम के प्रति 10 एमएल प्रति 300 इकाइयों की एकाग्रता में कोलेजनज़ टाइप 3 जोड़ें। समान रूप से मिक्स करें और इसे ऊतक कीट से जोड़ें
    5. क्षैतिज रूप से एक कमाल की प्लेटफार्म पर 50-एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब रखें और गति को 100 आरपीएम और तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें। उत्तेजित करना2 घंटे के लिए स्तन ऊतक उचित पाचन सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक 20 मिनट की जांच करें और मैन्युअल रूप से ट्यूब को हिलाएं।
      नोट: एफएसीएस से पहले ऊतक पाचन का उद्देश्य ठोस ऊतक से एक एकल सेल समाधान तैयार करना है। इसलिए, पाचन के अंत तक, सामग्री दृश्यित ऊतक के टुकड़े बिना एक मोटी समाधान होना चाहिए।
  2. एकल सेल समाधान की तैयारी
    1. पाचन के बाद, पूर्व गर्म, बाँझ पीबीएस के साथ 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब को टॉप-अप करें और समान रूप से मिश्रण करने के लिए ट्यूब को उलटा दें। एक सेल गोली प्राप्त करने के लिए 5 मिनट के लिए 200 xg पर ट्यूब अपकेंद्रित्र।
    2. सतह पर तैरनेवाला निकालें और सेल गोली को ढकने के लिए ट्यूब के नीचे झटका। लाल रक्त कोशिका lysing बफर (देखें सामग्री की तालिका देखें) के 3 एमएल में जोड़ें और लाल रक्त कोशिकाओं को खत्म करने के लिए 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर टिशू कल्चर हुड में सेते हैं।
    3. 10 एमएल की बाँझ पीबीएस जोड़ें और समान रूप से मिश्रण करने के लिए ट्यूब उलटें। 5 मिनट और डिस्क के लिए 200 xg पर ऊतक सामग्री को अपकेंद्रित्रसतह पर तैरनेवाला सुस्त पूर्व गर्म 0.05% ट्रिप्सिन के 3 एमएल में जोड़ें और ट्यूब को 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए शेष ऊतक को पचा करें।
    4. पूर्व गर्म आईएमडीएम के 3 एमएल में जोड़ें और उसके बाद 100 μL डीएनस आई समाधान जोड़ें (0.25 मिलीग्राम DNase I पीबीएस के 1 एमएल में पतला)। डीएनए तंतुओं को तोड़ने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब स्टोर करें। सेल समाधान प्राप्त करने के लिए 70-माइक्रोन सेल छलनी के माध्यम से ऊतक मिश्रण को पास करें। एंजाइमेटिक पाचन को बेअसर करने के लिए 2 एमएल ऑफ पीबीएस + 5% एफबीएस से दो बार झिल्लीदार कुल्ला।
    5. कोशिकाओं को गोली मारने के लिए 5 मिनट के लिए 200 xg पर सेल मिश्रण अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और एंटीबॉडी धुंधला हो जाने के लिए 1 एमएल पीबीएस + 5% एफबीएस में सेल गोली resuspend।
  3. एफएसीएस आधारित प्रोक्र + + वीजेएसई अलगाव।
    1. सेल मिश्रण प्रकाशित दिनचर्या प्रोटोकॉल 8 निम्नलिखित दाता स्तन के ऊतकों से एंटीबॉडी धुंधला करने के लिए प्राप्त अधीन।
      नोट: निम्नलिखित एंटीबॉडी का उपयोग किया गया: एंटी-माउसरक्त वंश- एफआईटीसी, एंटी-माउस सीडी 31 (पीईसीएएम 1) -पीसीवाई 7, एंटी-माउस सीडी 10 5-एपीसी (सभी 1 माइक्रोग्राम / एमएल की एकाग्रता में इस्तेमाल होता है), एंटी-माउस सीडी 201 (प्रोक्रेट) -बोटीन (2.5 की एकाग्रता में इस्तेमाल किया जाता है) माइक्रोग्राम / एमएल), और स्ट्रेप्टिविडिन-वी 450 (0.5 माइग्राम / एमएल की एकाग्रता में उपयोग किया जाता है)।
      1. एंटीबॉडी धुंधला होने के बाद, पीबीएस + 5% एफबीएस के साथ कोशिकाओं को टॉप-अप और फिर 5 मिनट के लिए 200 ग्राम अपकेंद्रित। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 1 एमएल की पीबीएस + 5% एफबीएस के साथ कोशिकाओं को फिर से खोलें। एक 40-माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से फ़िल्टर करें एफएसीएस छँटाई तक बर्फ पर रखें।
    2. Proc + VESCs को अलग करने के लिए FACS- आधारित सॉर्टिंग करने के लिए आगे बढ़ें
      1. प्रत्येक रंग के लिए वोल्टेज निर्धारित करने के लिए अस्थिर नमूना और प्रत्येक एकल-रंग नियंत्रण का विश्लेषण करें। स्वत: प्रतिदीप्ति या पृष्ठभूमि धुंधला होने से बचने के लिए क्षतिपूर्ति मानकों की गणना करें। उचित गैटिंग के लिए टेम्पलेट सेट करें और वांछित सेल आबादी के लिए सॉर्टिंग करें।
      2. एफएसीएस छंटाई की पदानुक्रम स्थापित करने के लिए, पहले से मलबे को समाप्त करेंसभी घटनाओं और फिर चौड़ाई के साथ ट्रिगर द्वारा दोहरी या चिपकने वाला सेल समूहों त्यागें। गेट-आउट रक्त वंश-कोशिकाओं और फिर एंडोथेलियल आबादी को परिभाषित करने के लिए सीडी 31 + और सीडी 10 5 + का उपयोग करें।
        नोट: एक एफएमओ नियंत्रण की तुलना में सीक्रोन + सीडी 10 5 + ईसीएस से प्रोक्र + + सेल को अलग किया गया था। एक प्रतिनिधि एफएसीएस विश्लेषण प्लॉट चित्रा 1 में दिखाया गया है। एक एफएसीएस-पृथक वीजेएससी आबादी को आईएमडीएम + 50% एफबीएस में निलंबित किया जाना चाहिए और आगे की प्रक्रिया तक बर्फ पर संग्रहीत किया जाना चाहिए।

2. स्तन वसा पैड का इस्तेमाल करते हुए विवो वीजेसी पोत अवसंरचना परख में

  1. प्रत्यारोपण के लिए प्राथमिक ईसीएस तैयार करें।
    1. 10 एमएल की पीबीएस + 5% एफबीएस के साथ एफएसीएस-सॉर्ट किए गए कोशिकाओं को टॉप-अप करें और तब सेंटीफ्यूज 200 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए नीचे से नीचे कोशिकाओं को व्यवस्थित करने के लिए।
    2. तरल सावधानी से महाप्राणित करें, एक हेमोसाइटेटोमीटर का उपयोग करके सेल नंबर की गणना करें, और तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स मिश्रण के साथ सेल गोली resuspend (consi50% तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स और पीबीएस 20% एफबीएस, 100 एनजी / एमएल आरएमवीईजीएफ और 60 यू / एमएल हेपरिन के साथ पूरक) 15,000 कोशिकाओं / 15 μL के कामकाज एकाग्रता तक पहुंचने के लिए।
      नोट: तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स मिश्रण हमेशा बर्फ पर संग्रहीत किया जाना चाहिए।
    3. 1.5-एमएल माइक्रोट्यूब में आवश्यक इनपुट सांद्रता तक पहुंचने के लिए सॉर्ट किए गए और गिनती वाली कोशिकाओं को धीरे-धीरे पतला करें, जिससे सुनिश्चित करें कि अंतिम इंजेक्शन मात्रा कुल 15 μL से अधिक नहीं होनी चाहिए। प्रत्यारोपण के दौरान बेहतर सामग्री विज़ुअलाइज़ेशन के लिए प्रत्येक ट्यूब में 0.1% ट्राइपैन नीला जोड़ें। पिपेट मिश्रण करने के लिए अच्छी तरह से इस्तेमाल होने तक बर्फ पर ट्यूबों को स्टोर करें।
      नोट: सफल पोत पीढ़ी को कम से कम 100 वीजेएससी के साथ हासिल किया जा सकता है।
  2. प्राथमिक वरीयता प्रत्यारोपण स्तन वसा पैड में।
    1. सर्जिकल उपकरणों और बेंचटॉप कीटाणुशोधन यदि कई जानवरों पर एक ही यंत्र का उपयोग करते हैं, तो एक बीड स्टीरिलर का उपयोग कीटाणुशोधन के लिए किया जा सकता है।
    2. 3 सप्ताहीय बीएएलबी / सी नग्न माइक एनेस्थेटेज़ करेंई आपके संस्थान के पशुचिकित्सा और आईएसीयूसी द्वारा अनुशंसित एनेस्थेटिक प्रोटोकॉल का उपयोग कर। ऑपरेशन टेबल पर अपनी पीठ के साथ, प्रत्येक माउस को लापरवाह स्थिति में रखना चाहिए। चिपकने वाली टेप का उपयोग कर अपने अंग को स्थिर करें।
    3. आयोडीन-आधारित एंटीसेप्टिक समाधान में एक कपास झाड़ू डुबकी। सर्जरी से पहले त्वचा की सतह को बाँझ करने के लिए माउस के पूरे पेट क्षेत्र को पूरी तरह मिटा दें।
    4. संदंश के साथ माउस के पेट की त्वचा को पकड़ और उठाएं। एक छोटा, 1 सेमी ऊर्ध्वाधर चीरा बनाने के लिए एक शल्य चिकित्सा स्केलपेल का प्रयोग करें। दो कटौती के बारे में 0.5 - लंबाई में 1 सेंटीमीटर, हिंद पैर की तरफ प्रत्येक, एक उल्टा, वाई के आकार का चीरा प्राप्त करने के लिए।
      1. पेट से त्वचा को धीरे से अलग करने के लिए संदंश और एक कपास झाड़ू का प्रयोग करें और इनगेंनल स्तन ग्रंथियों का पर्दाफाश करने के लिए त्वचा को बग़ल में पिन करें। एक त्रिविम के नीचे माउस रखें और 2.0X पर आवर्धन सेट करें। फोकस समायोजित करने के लिए सुनिश्चित करें ताकि स्तन वसा पैड स्पष्ट रूप से देखा और संचालित हो सकता है।
    5. एक 27 जी 1/2 "सुई रखेंई पर बर्फ पर प्री-सर्दी सुई-एच्चिंग क्षेत्र में फंसे संभावित हवा के बुलबुले को हटाने के लिए तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स मिश्रण के साथ प्राइम 1 एमएल सिरिंज। सूक्ष्मदर्शी ट्यूब की टोपी पर 15 μL मिश्रित समाधान का पिपेट करें और फिर संपूर्ण मात्रा को प्राइमरी सिरिंज में तरक्की करें।
    6. द्विमितीय लिम्फ नोड के सामने स्तन चरबी पैड को पकड़ो, ठीक चिमटी का उपयोग करके, और थोड़ा आसान इंजेक्शन के लिए उठाएं। लगभग 1/4 सिरिंज सुई को धीरे से वसा पैड में डालें।
      1. धुंध पैड से पकड़ने और सिरिंज सुई को स्थिर करने के लिए चिमटी को छोड़ दें। तरल रिसाव को रोकने के लिए धीरे धीरे समाधान इंजेक्ट करें कुछ सेकंड के लिए यह सुनिश्चित करने के लिए रखें कि सुई बाहर खींचते समय सेल मिश्रण रिसाव को कम करने के लिए मजबूत होता है।
    7. अवशोषित टायर्स के साथ त्वचा फ्लैप को बंद करें आकार 5-0 नॉन-रिएक्टिव मोनोफिलामेंट सिवनी का उपयोग करके त्वचा फ्लैप सिवनी करें और एक सर्जन-शैली के समुद्री मील के साथ घावों को बंद करें, प्रत्येक गाँठ को लगभगAtely 0.3 सेमी अलग। वैकल्पिक रूप से, घाव स्टेपल के साथ त्वचा को बंद करें
    8. पुनर्प्राप्ति के लिए एक अलग पिंजरे में संचालित चूहों को रखें हाइपोथर्मिया से पीड़ित से anesthetized चूहों को रोकने के लिए पिंजरे पर हीटिंग दीपक रखें। पिंजरे के निचले भाग में सॉफ्ट पेपर और कपास रखें, जो चूहों को गर्म पोस्ट सर्जरी के लिए रखें।
      1. जब तक सभी प्राप्तकर्ता पूरी तरह से जाग न हो जाएं, तब तक चूहों को ध्यान से देखें। अगले कुछ दिनों के लिए, सर्जिकल दर्दनाशक दवाओं के सभी जानवरों के लिए पहले से आसानी से या सुविधा पशु चिकित्सक द्वारा निर्देशित पोस्ट करें। यदि घाव संक्रमण होता है तो अनुमोदित पशु प्रोटोकॉल के अनुसार एंटीबायोटिक्स को लागू करें। अगर सर्जिकल घाव को घाव स्टेपल के साथ बंद किया गया था, सर्जरी के 10 दिनों के बाद घाव पूरी तरह से बंद हो जाने पर घाव क्लिप निकालें।

सूक्ष्म निरीक्षण के लिए 3. संपूर्ण-माउंट टिशू तैयारी

  1. टिशू फसल
    1. प्रत्यारोपण के बाद 2-4 सप्ताह के बाद प्राप्तकर्ता बीएएलबी / सीनग्न चूहों 2.5% एनेस्थेटीटिंग एजेंट के इंट्रा-पेरिटोनियल इंजेक्शन के साथ चरण 20.2 के अनुसार, शरीर की प्रति 20 ग्राम 0.12 मिलीलीटर की खुराक पर।
      नोट: सकारात्मक वाहक वृद्धि का पता लगाया जा सकता है - सेल प्रत्यारोपण के 4 सप्ताह बाद।
    2. 50 μg / 25 ग्राम bodyweight के एक खुराक पर आईसोलेक्टिन -647 डाई के पूंछ-नस इंजेक्शन के साथ प्राप्तकर्ता प्रणालीगत परिसंचरण को लेबल करें, 50 μL बाँझ पीबीएस में पुन: आराम की अवधि 5 - 10 मिनट की अनुमति दें सीओ 2 का उपयोग कर चूहों को बलिदान करना
    3. स्तन ऊतक के क्षेत्र का विच्छेद जहां कोशिकाओं को शुरू में चरण 2.2.4 के बाद अंतःक्षेपण किया गया था; शल्य कैंची का उपयोग करें एक सर्जिकल ब्लेड का प्रयोग करके, 6 सेमी पेट्री डिश में लगभग 3 से 4 मिमी 3 क्यूब्स में ऊतक को काट लें।
  2. एंटीबॉडी धुंधला के लिए ऊतक पाचन और तैयारी
    1. कोलाजेनेस III के पूरक के साथ पूर्व गर्म पाचन आहार आधार (चरण 1.1.2) के 10 मिलीलीटर से भरा 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में ऊतक के टुकड़े डाइजेस्ट करें(300 यू प्रति 10 एमएल)।
    2. 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब क्षैतिज रूप से एक कमाल की प्लेटफार्म पर 100 आरपीएम पर सेट गति के साथ रखें और 37 डिग्री सेल्सियस तक का तापमान लगभग 1 घंटे के लिए ऊतक संरचना को ढीला कर लेना और अत्यधिक एडिपोसाइट टिश्यू को दूर करने के लिए।
      नोट: एडीओपोसाइट्स स्वत: प्रतिदीप्ति का उत्पादन करते हैं जिसके परिणामस्वरूप एक शोर फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि हो सकता है। पाचन के अंत तक, ऊतक के टुकड़े को नरम, बादलों वाला दिखना चाहिए। इष्टतम पाचन अवधि कटा हुआ ऊतक के टुकड़ों के आकार पर निर्भर करता है और इसलिए सर्वोत्तम परिणामों को प्राप्त करने के लिए तदनुसार समायोजित किया जाना चाहिए। चूंकि ऊतक पेशाब को पहले से ही प्रतिदीप्ति-टैग Isolectin के साथ लेबल किया गया है, सभी निम्नलिखित प्रक्रियाओं को प्रकाश से सुरक्षित किया जाना चाहिए।
    3. 10 मिनट के लिए आरटी पर पीबीएस के साथ ऊतक के टुकड़े धोएं। प्रतिदीप्ति को बनाए रखने के लिए 4% पीएफए ​​(पीएच 7.2 - 7.4) के साथ 6 सेमी पेट्री डिश के आधे से भरा में टुकड़ों को ध्यान में रखते हुए पूरे माउंट ऊतक को ठीक करें। पेट्री डिश रखेंएक कमाल की प्लेटफार्म पर और आरटी पर 30 मिनट के लिए ऊतक को धीरे से चूसना।
      नोट: पीएफए ​​कैसरजन है और इसे सावधानी के साथ संभाला जाना चाहिए।
    4. शेष पीएफए ​​को निकालें और फ्रिज टिशू को तीन बार पूरे माउंट वॉश बफर (पीबीएस में 0.1% ट्विल) के साथ धो लें, प्रत्येक वॉश के बीच 10 मिनट की अंतराल के साथ।
  3. पूरे माउंट ऊतक एंटीबॉडी धुंधला हो जाना
    1. एंटीबॉडी धुंधला बफर में 2 एमएल सेंट्रीविज ट्यूब में प्राथमिक एंटीबॉडी पतला। 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ ऊतक सेते हैं
      नोट: प्राथमिक एंटीबॉडी के रूप में एंटी-सीडी 31 (एकाग्रता: 10 माइक्रोग्राम / एमएल) या चूहा एंटी-वीई-कैडरिन (सीडी 144 / सीडीएच 5, एकाग्रता: 2.5 माइक्रोग्राम / एमएल) का इस्तेमाल किया गया था। सीडी 31 और वीई-कैदरिन दोनों ही सेल सतह मार्कर हैं जो एन्डोथिलियम को पहचानते थे। 5x एंटीबॉडी धुंधला बफर 500 एमएम पुरुष एसिड, पीएच 7.5 के साथ तैयार है; 750 मिमी NaCl; और 0.5% (वी / वी) के बीच पीबीएस में भंग। ताजा 1x काम कर रहे समाधान तैयार करते समय केवल एक उचित सीरम वॉल्यूम (5%) में जोड़ें9
    2. एंटीबॉडी धुंधला बफर निकालें और पूरे माउंट टिश्यू को धोने के बफर के साथ तीन बार धोएं, 10 मिनट की अंतराल के साथ। द्वितीयक एंटीबॉडी ( सामग्री की सारणी देखें) के साथ ऊतक सेते हैं, आरटी पर डीएपीआई चार घंटों से 4 डिग्री सेल्सियस पर आते हैं।
      नोट: नाभिक की कल्पना करने के लिए 5 μg / mL की अंतिम एकाग्रता में डीएपीआई (4 ', 6-डायरिडिनो-2-फेनिलंडोल) का उपयोग करें
    3. 10 मिनट प्रत्येक के लिए धोने बफर के साथ पूरे माउंट ऊतक को धो लें बेहतर संरक्षण के लिए ऊतक का निर्जलीकरण करने के लिए रातोंरात 80% ग्लिसरॉल या 80% सुक्रोज़ में ऊतक के टुकड़े को सेते हैं।
    4. एक गिलास स्लाइड पर व्यक्तिगत ऊतक के टुकड़े रखें और अत्यधिक निर्जलीकरण बफर को हटा दें। बढ़ते माध्यम के साथ ऊतक को कवर करें, कवरलाप रखें, और इसे सेट करने के लिए ऊतक को धीरे से दबाएं।
    5. Confocal सूक्ष्म छवि अधिग्रहण प्रदर्शन। पूरे माउंट स्तन ग्रंथियों के लिए, एनए = 1.3 तेल ऑब्जेसि के साथ 40 एक्स का उपयोग करके चित्र प्राप्त करेंकर दिया है। 1.20 माइक्रोन के एक ऑप्टिकल खंड रिज़ॉल्यूशन पर जेड-स्टैक्स के टाइल स्कैन को प्राप्त करें और 1.0 - 1.2 की परत पृथक्करण करें।
      नोट: सही फ्लोरोसेंस लाइट सिग्नल पर कब्जा करने के लिए, फिल्टर बीम फाड़िलाटर पीएमटी हासिल करने पर 600-800 के लाभ सेटिंग के साथ ट्रिपल डाइक्रोकॉइस (टीडी) 488/553/638 पर सेट किया जाना चाहिए। निम्न उत्तेजना / उत्सर्जन स्रोतों का उपयोग किया जाना चाहिए: एमजीएफपी, उत्तेजना / उत्सर्जन अधिकतममा से 488/50 9 एनएम; 532/588 एनएम की उत्तेजना / उत्सर्जन अधिकतममा के साथ एमटैमेटो; एलेक्सा -647, उत्तेजना / उत्सर्जन अधिकतममा के साथ 594/665; और डीएपीआई, 350/470 की उत्तेजना / उत्सर्जन मैक्सिमा के साथ

4. आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस मॉडल का उपयोग करने के लिए वंश अनुरेखण

  1. माउस मॉडल का उपयोग करके प्रोट्र + VESC का पता लगाएं
    1. प्रोक्रेट क्रेएरटी 2-आईआरईएस-टीडीटामाटो / + ( प्रोक्रेट क्रेएआरटी 2 के रूप में संदर्भित) का प्रयोग करें दस्तक-इन माउस स्ट्रेन।
      नोट: इस माउस मॉडल में, एक क्रेएरटी 2-आईआरईएस-टीडीटैमेटो कैसेट प्रोट्रैप 11 के पहले एटीजी कोडन के बाद डाली जाती है।
      1. Rosa26 mTtomatomGFP (R26 mTmG के रूप में) संवाददाता तनाव के साथ क्रॉस Procr CreERT2 चूहों विवो 11 में अंतर्जात Procr + ईसी के भाग्य का पता लगाने के लिए। जीएफपी अभिव्यक्ति का उपयोग करते हुए सभी लेबल अंतर्जात प्रक्रिया + ईसीएस और उनके वंशज को पहचानें
    2. तांबॉक्सिफेन समाधान 11 (10 मिलीग्राम के टैमोक्सिफेन को 1 मिलीलीटर मूंगफली तेल + 10% इथेनॉल में भंग कर 10 मिलीग्राम / एमएल का स्टॉक समाधान करने के लिए) प्रशासित कराएं इन्फ्राटेरिटोनियल रूप से 4 एमजी / 25 जी बॉडीवेट के दौरान यौवन स्तर (5 सप्ताह) बूढ़े) Procr + ईसीएस के विकास भाग्य को ट्रैक करने के लिए
    3. चरण 3 में उल्लिखित तैयारी कदमों के बाद लेबल-युक्त कोशिकाओं की क्लोन-बनाने की क्षमता का विश्लेषण करें। पूर्ण-माउंट प्रतिरक्षण द्वारा चरण 3 में उल्लिखित चरणों का पालन करें। शॉर्ट-टर्म के बाद इलाज चूहों से स्तन वसा पैड प्राप्त करें (2 दिन) और विस्तारित समय अवधि (10 महीने तक)। चित्र 3 देखें

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Representative Results

स्तन VESCs अलगाव:

परिणामी प्रत्यारोपण परख के लिए एंडोथेलियल आबादी को अलग करने के लिए, परिपक्व (8 सप्ताहीय), कुंवारी माउस स्तन ग्रंथियों को दाता सामग्री के रूप में काटा गया था एंडोथेलियल कोशिकाओं को एक एंटीबॉडी-आधारित सेल सॉर्टिंग तकनीक का उपयोग करके पृथक किया गया था। 8 सप्ताह के पुराने C57BL / 6 स्तन ग्रंथि ईसीएस में वीजेएससी आबादी के एफएसीएस विश्लेषण के प्रतिनिधि भूखंडों चित्रा 1 (यू एट अल। 8 से अनुमोदित चित्रा) में दिखाया गया है।

स्तन वसा पैड प्रत्यारोपण:

स्तन वसा पैड एंजियोजेनेसिस के अध्ययन के लिए एक आदर्श स्थल प्रदान करता है। एफएसीएस आधारित अलगाव के बाद, प्रोक्र + + ईसीएस 0.5% तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स और 0.1% ट्राइपैन नीला सूचक के साथ मिश्रित थे और तब ट्रांसप्लान थे3 सप्ताह के पुराने एससीआईडी ​​प्राप्तकर्ताओं के खाली वेट पैड के लिए टेड यौवन के दौरान, स्तन वसा पैड स्तनवर्धक उपकला विस्तार के साथ संरेखण में vasculature के remodeling को बढ़ावा देने, एक angiogenic वातावरण बनाता है। नतीजतन, ट्रांसप्लांट प्रोक्र + + ईसीएस (जीएफपी + ) मेजबान के बड़े जहाजों ( चित्रा 2 बी , तीरों) में शामिल किया गया और उन्होंने द्वितीयक और तृतीयक जीएफपी + पोत शाखाओं ( चित्रा 2 बी , एरोहेड्स) का गठन किया। हालांकि प्रत्यारोपित प्रोक्र + + ईसीएस मैट्रिक्स प्लग परख (पंख की त्वचा के नीचे डाली जाती है) में जहाजों को उत्पन्न कर सकती हैं, तो गठित ब्रह्मांड केवल केशिका-जैसा दिखते हैं ( चित्रा 2 ए , यू यू एट अल। 8 से स्वीकृत आकृति)।

प्रक्रिया + वीजेएस द्वारा स्थापित वेसल्स की कार्यक्षमता:

जांच करने के लिए कि क्या जीएफपी + वीस्तन वसा पैड में एस्सेल, कार्यात्मक परिसंचरण वास्क्यूलेट का हिस्सा होते हैं, आइसोचिन को फसल से पहले नसों के इंजेक्शन द्वारा प्रशासित किया जाता था। GFP + जहाजों को आइसोलिकिन + था, यह दर्शाता है कि बनाई हुई बर्तन चमकते हैं और मेजबान vasculature ( चित्रा 2 बी , यू यू एट अल। 8 से स्वीकृत आकृति) के साथ जुड़ा हुआ है।

प्रोसेसर क्रेएरटी 2 का उपयोग करने वाली स्तन VESC वंशावली अनुरेखण ; Rosa26 mTmG माउस मॉडल:

प्रोक्रेट क्रेएरटी 2 ; Rosa26 mTmG चूहों विवो (चित्रा 3 ए) में Procr + VESCs के भाग्य ट्रेसिंग के लिए इस्तेमाल किया गया। प्रोटीर + वीजेएससी स्तन ग्रंथि के विकास के दौरान मजबूत एंजियोजेनेसिस और संवहनी रीमॉडेलिंग में योगदान करने के लिए, प्रोक्रेट क्रेएरटी 2 ; रोजा 26 एमटीएमजी प्रशासित थेडी प्रोटी + एंडोथेलियल आबादी में जीएफपी अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए टेमॉक्सीफाइन के साथ। मादक पदार्थों के इलाज की प्रोस्ट क्रेएरटी 2 के स्तन वसा पैड ; और (10 महीने इंजेक्शन के बाद अप करने के लिए; चित्रा -3 सी एफ; आंकड़ा, यू एट अल 8 से अनुकूलित अनुमति के साथ।) लंबे समय तक; Rosa26 mTmG चूहों दोनों अल्पकालिक (चित्रा 3 बी 2 दिन इंजेक्शन के बाद) काटा गया था। अनुरेखण परिणाम की कल्पना करने के लिए पूरे माउंट की तैयारी की गई थी। संवहनी एन्डोथेलियम पहचान एंडोथिलियल सतह मार्कर वीई-कैडरीन (सीडीएच 5; चित्रा 3 बी , सही छवि) के साथ धुंधला होकर मान्य हो सकती है।

आकृति 1
चित्रा 1: माउस मैमरी ग्लैंड में वीजेएससी का विश्लेषण। 8 सप्ताह के पुराने C57BL / 6 स्तन ग्रंथि ईसीएस में प्रोक्रॉन एक्सप्रेशन का एफएसीएस विश्लेषण। 8 सप्ताह पुराने वीस्तन ग्रंथि संग्रह के लिए एर्गिन सी 67 बीएल / 6 मादा चूहों का इस्तेमाल किया गया था। सेल के नमूने तैयार किए जाने के बाद, प्रत्येक रंग के लिए वोल्टेज निर्धारित करने के लिए अनसक्षित नमूना और प्रत्येक एकल-रंग नियंत्रण का विश्लेषण किया गया। क्षतिपूर्ति के मापदंडों की गणना ऑटो-प्रतिदीप्ति या पृष्ठभूमि धुंधला से बचने के लिए की गई थी। उचित गैटिंग के लिए एक टेम्प्लेट स्थापित किया गया था और वांछित सेल आबादी के लिए सॉर्ट किया गया था। एफएसीएस छंटाई के पदानुक्रम को स्थापित करने के लिए, सभी घटनाओं से मलबे का सफाया कर दिया गया और फिर दोहराया या चिपकने वाला सेल क्लस्टर हटा दिया गया। वंशावली- कोशिकाओं को बाहर निकाला गया, और सीडी 31 और सीडी 10 5 का उपयोग एन्डोथेलियल आबादी को परिभाषित करने के लिए किया गया। एफएमओ नियंत्रण की तुलना में सीक्रोन + सीडी105 + ईसीएस से प्रोक्रोट + सेल्स अलग थे। यह आंकड़ा यू एट अल से संशोधित किया गया है 8 , अनुमति के साथ इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें


चित्रा 2: VESC स्तन वसा पैड प्रत्यारोपण परख। ( ए ) एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स प्लग के भीतर प्रोक्र + + ईसीएस से बने एक जहाज जो पंख की त्वचा के नीचे स्थित है। ( बी ) एक प्राप्तकर्ता स्तन वसा पैड की कन्फोकल छवि, स्तन वाहिका को होस्ट करने के लिए ट्रांसप्लांट प्रोक्रेट + ईसीएस (जीएफपी +) के एकीकरण और योगदान का संकेत देता है। ईसीएस को सीडी 31 के साथ उलट कर दिया गया था। ( सी ) आइसोचेंट के साथ प्राप्तकर्ता चूहों में अंतःशिरा इंजेक्शन से पता चला है कि परिणामों में चमकदार बर्तन हैं। स्केल बार, 50 माइक्रोन छवियां 40 एक्स एनए 1.3 तेल उद्देश्य का उपयोग कर ली गई थीं। Z-stacks के टाइल स्कैन को ऑप्टिकल खंड संकल्प पर 1,024 x 1,024 के अधिग्रहण किया गया था, और प्रत्येक परत 1.0 - 1.2 माइक्रोन अलग था। सही प्रतिदीप्ति प्रकाश संकेत पर कब्जा करने के लिए, फ़िल्टर बीम फाड़नेवाला टीडी 488/553/638 पर सेट किया गया था, जी के साथपीएमटी पर ऐन सेटिंग 600-800 प्राप्त करें। निम्नलिखित उत्तेजना / उत्सर्जन स्रोतों का उपयोग किया गया था: एमजीएफपी, 488/50 9 एनएम के उत्तेजना / उत्सर्जन अधिकतममामा के साथ; 532/588 एनएम की उत्तेजना / उत्सर्जन अधिकतममा के साथ एमटैमेटो; एलेक्सा -647, उत्तेजना / उत्सर्जन अधिकतममा के साथ 594/665; और डीएपीआई, 350/470 की उत्तेजना / उत्सर्जन मैक्सिमा के साथ यह आंकड़ा यू एट अल से संशोधित किया गया है 8 , अनुमति के साथ इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3: प्रक्रिया + ईसीएस के वंश अनुरेखण विकास के दौरान ईसी क्लोनल विस्तार के लिए उनके योगदान का प्रावधान करता है। ( ए ) प्रोक्रेट क्रेएरटी 2 का उपयोग करते हुए वंश अनुरेखण रणनीति का चित्र ; रोसा 26 एमटीएमजी लाइन (वाम पैनल)। प्रयोगात्मकसंकेतक (सही पैनल) के अनुसार, अल्पकालिक (2 दिन) और लंबी अवधि (7 दिन से 10 महीने) में उपयोग की जाने वाली सेटअप। ( बीएफ ) लेबलिंग प्रक्रिया + ईसीएस के प्रारंभिक स्थान और विभिन्न ट्रेसिंग चरणों में स्तन कैंसर के प्रति उनके योगदान का संकेत देते हुए, tracing periods के विभिन्न लंबाई के बाद स्तन vasculature के पूरे-माउंट confocal इमेजिंग। स्केल बार = 50 माइक्रोन यह आंकड़ा यू एट अल से संशोधित किया गया है 8 , अनुमति के साथ इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

एंजियोजेनेस एसेसन नाड़ी गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एक अच्छा प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करते हैं। माउस रेटिनल vasculature, जो पोस्टनेटिकल रूप से विकसित होता है, ने एंजियोजेनेसिस 12 का अध्ययन करने के लिए एक आकर्षक मॉडल साबित कर दिया है। यह अपेक्षाकृत सुलभ होने के बावजूद, रेटिना संवहनी बिस्तर के भीतर वास्तविक हेरिपूल बल्कि मुश्किल है। अब तक, विवो प्रत्यारोपण में सबसे अच्छा वर्णित प्लग परख किया गया है, जो एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स द्रव्यमान के अंदर कोशिकाओं को घेरता है और शल्यचिकरण प्रत्यारोपण / प्राप्तकर्ता माउस के पार्श्व क्षेत्र में उपकक्षता से इंजेक्शन करता है। यह एंजियोजेनेसिस परख एम्बेडेड कोशिकाओं की पुनर्योजी क्षमता और पोत बनाने की क्षमता का परीक्षण करने में प्रभावी है। हालांकि, क्योंकि इम्प्लांट मैट्रिक्स प्लग के स्थान के भीतर कोशिकाओं के लिए एक अपेक्षाकृत पृथक वातावरण बनाता है, यह एक इष्टतम शारीरिक आला प्रदान नहीं करता है। हाल ही में, एक नया फेफड़े का एंजियोजेनेसिस मॉडल भी विकसित किया गया है जो एक आतंच पैच को सरफे पर लगाया गया हैमाउस फेफड़े 13 के सीई साइट हालांकि, यह एक अन्य जोखिम का प्रबंधन करता है, क्योंकि यह तकनीक माउस सीने की गुहा के अंदर आक्रामक तरीके से संचालित होती है, इस प्रकार इसने अधिक सामान्यीकृत परख सेटिंग में उपयोग करना मुश्किल बना दिया है।

यहाँ वर्णित एंजियोजेनेसिस परख में, स्तन मिश्रण की एक छोटी मात्रा स्तन ग्रंथि के वसा पैड के अंदर प्रत्यारोपित हो जाती है, जो यौवन के दौरान अंतरिक्ष, मैट्रिक्स और अमीर एंजियोजेनिक उत्तेजना प्रदान करती है। यह जनरेट किए गए जहाजों को रिमॉडेलिंग मेजबान वैसक्लिचर में अनुपालन और एकीकृत करने की अनुमति देता है, जिससे आगे कार्यात्मक मूल्यांकन किया जा सकता है, साथ ही चमड़े के नीचे प्लग परख के लाभ का प्रतिनिधित्व कर सकता है। इसके अलावा, स्तन वसा पैड पेरिटोनियल गुहा से बाहर स्थित है, जिससे यह बहुत ही सुलभ साइट बनती है। स्तन वसा पैड पर ऑपरेशन प्राप्तकर्ता जानवर को सीमित संकट का परिचय देता है, रेटिना और फेफड़े-आधारित assays में शामिल आक्रामक सर्जिकल प्रक्रियाओं से बचने।

रक्त वाहिकात्मक बुद्धिएक अंग को अक्सर ऊतक घटकों के बीच अंतःवाही करने के लिए संवहनी कवरेज को अधिकतम करने के लिए किया जाता है ताकि रक्त ऑक्सीजन और भौतिक हस्तांतरण का प्रावधान अनुकूलित किया जा सके। इस कारण से, ऊतक के पारंपरिक सेक्शनिंग ने अक्सर अपने जहाजों के ट्यूबलर ढांचे को रोक दिया है। वास्कुलर गुणों पर विश्लेषण सर्वोत्तम किया जाता है जब जहाजों को संरक्षित किया जा सकता है और अक्षुण्ण रह सकते हैं। एक ऊतक की पूरी माउंट तैयार करने के लिए बड़े पैमाने पर संवहनी वास्तुकला की पूरीता को संरक्षित किया जा सकता है। यह विधि न केवल अंग के भीतर रक्त वाहिका के प्रामाणिक स्थानिक वितरण का अवलोकन करती है, बल्कि अन्य ऊतक घटकों के साथ संबंध भी प्रदान करता है।

स्टेम सेल युक्त टिशू के होमोस्टैसिस पीढ़ी और कोशिका द्रव्यमान की हानि के संतुलन के कारण निरंतर रहता है। विशिष्ट जीवित अंग के भीतर स्टेम कोशिकाओं को अक्सर आश्रय किया जाता है और आस-पास के ऊतक वातावरण के साथ निकट संपर्क में होता है, जिसे स्टेम सेल आला कहा जाता है। इसलिए, स्टुप्रौढ़ स्टेम सेल ऊतक का विश्लेषण मर जाता है, इसे एक बरकरार शारीरिक संदर्भ में किया जाना चाहिए। प्रत्यारोपण assays सेल की क्षमता का आकलन करने का एक साधन प्रदान कर सकता है, जबकि वंशावली-ट्रेसिंग तकनीक देशी आवास के भीतर सच सेल भाग्य की खोज में सक्षम बनाता है। हाल के वर्षों में, विवो वंशावली के निशान में दाग के गुणों के प्रयोगात्मक मूल्यांकन के लिए एक शक्तिशाली तकनीक बन गई है। इस रणनीति का उपयोग ऊतक अवशेषों स्टेम कोशिकाओं और उनके ऊतकों के कई ऊतकों में, आंतों 10 , 14 , बालों के रोम 15 , पेट 16 और अग्न्याशय 17 सहित, को पहचानने के लिए किया गया है। वंश अनुरेखण पद्धति मोटे तौर पर स्टेम कोशिकाओं के आनुवंशिक अंकन पर निर्भर करती है और परिभाषित जनसंख्या में शुरू होती है। इसलिए, संभावना को छोड़ना मुश्किल है कि वास्तविक दाग लेबल वाले कोशिकाओं के भीतर एक भी छोटे उप-जनन में पाया जाता है। इसलिए सटीकता के साथ पता लगाए गए क्लोनों के सेल-मूल को मानचित्रित करना और समय के साथ अनुरेखण क्षमता को मात्रात्मक रूप से मापना अनिवार्य है। इस प्रकार, लेबल की आबादी की स्व-नवीकरण क्षमता को पकड़ लिया जा सकता है।

वर्णित एंजियोजेनेसिस परख विशिष्ट अध्ययन प्रयोजनों के लिए संशोधित किया जा सकता है: इसका उपयोग न केवल ब्याज की अंतःोत्थान की आबादी की पोत निर्माण क्षमता का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है, बल्कि स्थानीय पोत रीमॉडेलिंग पर एंजियोजेनिक कारकों के प्रभाव का मूल्यांकन भी किया जा सकता है। हालांकि, चूंकि स्तन ग्रंथि विभिन्न विकासात्मक चरणों ( जैसे, यौवन, स्वाभाविक चक्र और गर्भधारण) के दौरान गतिशील आकृतिगत परिवर्तनों से गुजरती हैं, उन्हें परिणामस्वरूप व्याख्या के दौरान, हार्मोनल स्तर की उतार-चढ़ाव जैसे सिस्टमिक परिवर्तनों के प्रभाव को ध्यान में रखना चाहिए। इस परख में महत्वपूर्ण कदम प्राथमिक endothelial सेल अलगाव शामिल हैं प्रत्यारोपण के लिए व्यवहार्य कोशिकाओं को बेहतर ढंग से प्राप्त करने के लिए, एफएसीएस अलगाव के लिए प्रक्रियाएं चाहिएई धीरे बाहर किया सेल की तैयारी के दौरान कठोर हैंडलिंग से बचने के लिए सावधानी बरतनी चाहिए, जैसे कि सेल गोली ढीली और निलंबित। एक और महत्वपूर्ण कदम वसा पेट में सेल मिश्रण इंजेक्शन है। वसा पैड इंजेक्शन के दौरान, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि सेल मिश्रण ठीक वसा पैड के अंदर जमा हो। यह मुश्किल हो सकता है यदि सुई प्रविष्टि बहुत गहरा / उथला है या यदि कुल मात्रा में सिफारिश की गई खुराक से अधिक है।

यह प्रोटोकॉल एक प्रयोगात्मक विधियों की एक श्रृंखला प्रदान करता है जो एक एंडोथेलियल स्टेम सेल आबादी की पहचान में सहायता करता है। इन तकनीकों के माध्यम से, प्रत्यारोपण के माध्यम से स्टेम कोशिका गुणों का मूल्यांकन करना संभव है, साथ ही विवो में शारीरिक प्रक्रियाओं के तहत उनके व्यवहार को ट्रैक और निरीक्षण करना संभव है। ये दृष्टिकोण कुशल उपकरण हैं जो कई विषयों पर लागू किया जा सकता है, जिनमें ट्यूमर के वातावरण में एंडोथेलियल आबादी के अध्ययन और उनके सेल शक्ति में परिवर्तन शामिल हैं। मैंविशेष रूप से, वसा पैड ट्रांसप्लांटेशन और पूरे माउंट की तैयारी प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और शक्तिशाली विधियां हैं जो वास्कुलर जीव विज्ञान के विभिन्न पहलुओं की जांच के लिए भविष्य के प्रयासों में सहायता कर सकती हैं।

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Disclosures

लेखकों ने घोषणा की कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धात्मक वित्तीय हित नहीं है

Acknowledgments

यह काम चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (31530045 और 31371500 से YAZ, 31401245 से QCY), चीन के विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (2014 सीबी 9 64800), चीनी अकादमी विज्ञान (XDB 1 9 000000 से YAZ), और चीनी सोसायटी ऑफ सेल बायोलॉजी (अर्ली कैरियर फेलोशिप टू क्यूसीवाई)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin-Ethylene Diamine Tetraacetic Acid(EDTA) (1x) Gibco (Life Technologies) 25300-062 0.05% Trypsin
0.22 µm Filter Unit Merck Millipore Ltd. SLGP033RB 0.22 µm Filter
2-Methylbutanol-2, ReagentPlus Sigma-Aldrich 24, 048-6 Tert Amyl Alcohol
222, Tribromethanol Sigma-Aldrich T48402-25g 222, Tribromethanol
4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI) Invitrogen D1306 DAPI
70 µm Cell Strainer BD FAL 352350 70 µm Cell Strainer
Adhesion Microscope Slides CITOGLAS 188105 Glass slides
Anti-mouse CD105 APC eBioscience 17-1051-82, clone MJ7/18 for FACS analusis use at 1 µg/mL
Anti-mouse CD201 Biotin eBioscience 13-2012-82 for FACS analusis use at 2.5 µg/mL
Anti-mouse CD31 PE-Cyanine 7 eBioscience 25-0311-82, clone 390 for FACS analusis use at 1 µg/mL
BD FACSJazz Cell Sorter BD Biosciences 655489 FACS
Bovine Serum Albumin Sigma 100190332 BSA
Centrifuge Eppendorf 5810R Centrifuge
Collagenase type 3 Worthington-Biochem #LS004183 Collagenase III
Confocal microscopy Leica sp8 Confocal
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma D2463-5VL Dnase I
Donkey anti-Rat Cy3 Jackson ImmunResearch 712-165-150 Secondary antibody, use at 0.5 µg/mL
Dumont Forceps WPI 500342 Froceps
Dumont Forceps - Micro-Blunted Tips FST 11253-20 Forceps
Fetal Bovine Serum Hyclone SH30396.03 FBS
FITC Ms CD3/Gr1/CD11b/CD45R(B220)/Ter-119 BioLegend 78022 Blood lineage cocktail for FACS analysis, use at 25 µL per test
Glycerol Sigma G6279 Glycerol
Iscov's Modified Dulbecco's Medium Gibco (Life Technologies) 12440-053 IMDM
Isolectin GS-IB4 from Griffonia Simplicifolia, Alexa Fluora  647 Invitrogen Z32450 Isolectin-647
Matrigel  Matrix (growth factor reduced) BD 356231 Matrigel
Mouse strain (Actin-GFP) Jax Laboratories 3773 Actin-GFP
Mouse strain (C57BL/6) SLAC C57BL/6 C57BL/6
Mouse strain  (BALB/c nude) SLAC BALB/c nude Nude mice
Paraformaldehyde Sigma P6148 PFA
Penicilin Streptomycin Gibco (Life Technologies) 5140-122 Pen/Strep
Phosphate Buffered Saline (pH7.2) 1x Gibco (Life Technologies) c20012500BT PBS
PRIM1640 Gibco (Life Technologies) c11875500CP PRIM1640
ProLong Gold antifade reagent Life Technologies P36934 Mounting Medium
Rat anti CD144 BD Biosciences 550548 for whole-mount analysis, anti-VE-Cadherin / Cdh5 antibdy for endothelial tight junction, use at 2.5 µg/mL
Rat anti CD31-biotin BD Biosciences 553371 for whole-mount analusis, anti-CD31/PECAM1 antibody for endothelial surface adhesion molecule, use at 10 µg/mL
Red Cell Lysis Buffer Sigma R7767-100ML Red blood cell lysing buffer
Straight/Sharp-Blunt/10cm FST 14028-10 Fine Scissors
Streptavidin eFluor 450 eBioscience 48-4317-82 for FACS analysis use at 0.5 µg/mL
Tamoxifen Sigma 101551374 TAM
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787-250ML TritonX
Wax Coated Braided Silk (Size 5-0 USP (1 Metric), 18 inches (45 cm) BLACK on C-1 Needle) COVIDIEN S1173 Suture 
Sterile Disposable Scaplels Swann Morton #10 Scalpel
Betadine Yifeng Medical 20160101 Antiseptic solution

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References

  1. Thomas, E. D., Lochte, H. L., Lu, W. C., Ferrebee, J. W. Intravenous infusion of bone marrow in patients receiving radiation and chemotherapy. N Engl J Med. 257 (11), 491-496 (1957).
  2. Chao, M. P., Seita, J., Weissman, I. L. Establishment of a normal hematopoietic and leukemia stem cell hierarchy. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 73, 439-449 (2008).
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विकास जीवविज्ञान अंक 126 संवहनी endothelial स्टेम सेल एंडोथेलियल पदानुक्रम एंजियोजेनेसिस नाड़ी पुनर्जनन संवहनी रीमॉडेलिंग वंश अनुरेखण स्तन ग्रंथि वसा पैड प्रत्यारोपण
संवहनी एंडोथिलियल स्टेम सेल के पोत जनरेशन को विज़ुअलाइज़ करने के लिए एक उपन्यास स्तनधारी फैट पैड ट्रांसप्लांटेशन तकनीक
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Yu, Q. C., Song, W., Lai, D., Zeng, Y. A. A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells. J. Vis. Exp. (126), e55795, doi:10.3791/55795 (2017).

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