Summary
Este trabajo demuestra un nuevo enfoque para evaluar la proliferación, la diferenciación y el potencial de formación de vasos de células madre endoteliales vasculares (VESCs) a través de trasplante de almohadillas de grasa mamaria seguido de preparación de tejido de montaje completo para la observación microscópica. También se presenta una estrategia de seguimiento de linaje para investigar el comportamiento de VESCs in vivo .
Abstract
Las células endoteliales son los bloques fundamentales de la arquitectura vascular y median el crecimiento vascular y la remodelación para asegurar el desarrollo adecuado de los vasos y la homeostasis. Sin embargo, los estudios sobre la jerarquía del linaje endotelial siguen siendo esquivos debido a la falta de herramientas para obtener acceso, así como para evaluar directamente su comportamiento in vivo . Para abordar esta deficiencia, se ha desarrollado un nuevo modelo de tejido para estudiar la angiogénesis utilizando la almohadilla de grasa mamaria. La glándula mamaria se desarrolla principalmente en las etapas posnatales, incluyendo la pubertad y el embarazo, durante los cuales la proliferación robusta del epitelio se acompaña de un extenso remodelado vascular. Las almohadillas de grasa mamaria proporcionan espacio, matriz y estímulos angiogénicos ricos a partir del epitelio mamario en crecimiento. Además, las almohadillas de grasa mamaria están situadas fuera de la cavidad peritoneal, haciéndolas un sitio de injerto fácilmente accesible para evaluar el potencial angiogénico de las células exógenas. Este trabajo también describe unaNt utilizando ratones reporteros fluorescentes para etiquetar específicamente la población diana de células madre endoteliales vasculares (VESCs) in vivo . Este método de rastreo de linaje, junto con la posterior microscopía de montaje completo de tejidos, permite la visualización directa de células diana y sus descendientes, a través de los cuales se puede cuantificar la capacidad de proliferación y el compromiso de diferenciación puede ser asignado al destino. Usando estos métodos, recientemente se ha identificado una población de receptor B bipotente (Procr) que expresa VESCs en múltiples sistemas vasculares. Procr + VESCs, que dan lugar tanto a nuevas CE como a pericitos, contribuyen activamente a la angiogénesis durante el desarrollo, la homeostasis y la reparación de lesiones. En general, este manuscrito describe un nuevo trasplante de almohadillas de grasa mamaria y técnicas de rastreo de linaje in vivo que pueden usarse para evaluar las propiedades de células madre de VESCs.
Introduction
Durante el desarrollo y la homeostasis, el crecimiento vascular y la remodelación se llevan a cabo fielmente de acuerdo con el crecimiento y la reparación del órgano. La angiogénesis describe la generación de nuevos vasos a partir de vasos sanguíneos preexistentes y se considera una fuerza principal que media en estos cambios vasculares dinámicos. Cada vaso sanguíneo está revestido interiormente con una capa de células endoteliales (ECs), y parecen ser la base de la arquitectura de los vasos. Durante mucho tiempo, el mecanismo a través del cual se repone el pool de EC durante la homeostasis permaneció incierto, y se discutieron si la rotación vascular es el resultado de la proliferación madura de la EC o es la contribución de las actividades vasculares de la madre / progenitor. Debido a la falta de evidencia fisiológica directa, la existencia y la identidad celular de las células madre endoteliales vasculares (VESCs) también permanecieron controversiales.
Uno de los métodos más comunes utilizados para verificar el comportamiento de las células madre es a través del transplanTación de células madre putativas en ratones receptores. Este método mide el potencial stemness de células madre candidatas in vivo. El trasplante se aplicó por primera vez al estudio de las células madre de la médula ósea 1 , lo que contribuyó al establecimiento de las características jerárquicas del sistema hematopoyético 2 . En el campo endotelial, un tapón de matriz de membrana basal ( por ejemplo, matrigel) insertado subcutáneamente bajo la piel de flanco ha sido un ensayo de angiogénesis in vivo estándar usado para dirigir las capacidades de formación de vasos de ECs trasplantadas. Múltiples métodos experimentales, incluyendo la formación de colonias en sistemas de cultivo 3D y el trasplante, han sugerido potencial de EC progenitor / VESC poblaciones 3 , 4 , 5 , 6 . Sin embargo, dado que las CE incrustadas en la matriz de la membrana basal están relativamente separadas deEl tejido circundante, esto no proporciona el ambiente de nicho óptimo requerido para explorar completamente el potencial angiogénico de las células trasplantadas. Como resultado, los vasos formados dentro del tapón de la matriz son predominantemente capilares y son funcionalmente no medibles.
La glándula mamaria se desarrolla postnatalmente, con el crecimiento más robusto que se produce durante la pubertad y el embarazo. En la etapa puberal, el epitelio mamario experimenta una rápida expansión, para ocupar toda la almohadilla de grasa mamaria, acompañada de la remodelación eficiente de las estructuras vasculares circundantes. Así, la glándula mamaria ofrece un excelente modelo para el estudio de la angiogénesis. Proporciona espacio, matriz y estímulos angiogénicos ricos a partir del epitelio mamario en crecimiento y por lo tanto es un sitio de injerto ideal para evaluar el potencial angiogénico de células exógenas. Además, la almohadilla de grasa mamaria permite que los vasos exógenos formados se integren con el sistema de circulación del huésped, permitiendo además fY que representan una ventaja sobre el trasplante subcutáneo.
Aunque los ensayos de cultivo y trasplante in vitro son una manera eficaz de investigar las propiedades de regeneración de una población celular, se sabe que tales ensayos pueden estimular la plasticidad cuando las células son retiradas de sus hábitats nativos y pueden ser inducidos cuando las células se desconectan de Su entorno fisiológico 7 . Por lo tanto, obtener la evidencia directa in vivo del destino celular es el enfoque clave para avanzar en la comprensión actual del comportamiento de las poblaciones endoteliales.
El mapeo genético del destino ( es decir, el rastreo del linaje in vivo ) es imprescindible para la identificación de VESCs y para la investigación de sus propiedades en el sistema corporal, ya que puede revelar el comportamiento in vivo de las células madre en su contexto fisiológico y la stemness real puede ser juzgado. Lineage traciNg proporciona evidencia directa de la persistencia a largo plazo ( es decir, auto-renovación) de los VESC candidatos y su capacidad para producir tipos celulares para el tejido de origen ( es decir, la potencia de diferenciación).
Este protocolo describe una nueva técnica de trasplante de grasa mamaria y un método de seguimiento de linaje para observar la capacidad de generación de vasos de VESCs. Estas técnicas superan las deficiencias de los ensayos disponibles actualmente y proporcionan una nueva forma de evaluar óptimamente las propiedades de las células madre de los VESC. Estos enfoques son herramientas eficientes que pueden usarse para evaluar el comportamiento y las propiedades formadoras de vasos de las poblaciones endoteliales, así como para determinar la alteración de la potencia de las células vasculares en un ambiente patológico.
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Protocol
Los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Instituto de Bioquímica y Biología Celular de Shanghai, Academia China de Ciencias bajo el protocolo aprobado SIBCB-NAF-15-002-S335-003.
1. Aislamiento de VESCs de la Glándula Mamaria de Ratón
- Cosecha de glándulas mamarias y digestión de tejidos.
- Utilizar ratones reportero virgen maduro Actin-GFP de 8 semanas de edad, con pesos comprendidos entre 20 y 25 g, como donantes de tejidos.
Nota: Las células originadas del donante pueden ser fácilmente rastreadas por la expresión de GFP. - Preparar el medio base de la digestión del tejido que consiste en 5% de suero bovino fetal (FBS), 1% pen / strep y HEPES 25 mM en RPMI1640. Filtrar la mezcla a través de un filtro de 0,22 μm para esterilizar y precalentarlo a 37 ° C en un baño de agua.
- Sacrificar a los ratones en una cámara de CO 2 . Disecar el cuarto par de glándulas mamarias inguinales haciendo primero una piel vertical iNcisión en la línea media inferior del abdomen usando un bisturí (o tijeras quirúrgicas). Suavemente pelar la piel a un lado para exponer la glándula mamaria inguinal con fórceps. Obtener la cuarta glándulas mamarias inguinales de ambos lados y cortarlos en trozos finos en una placa de Petri de 6 cm usando tijeras.
- Mida el peso total del tejido fino y colóquelo en un tubo de 50 ml.
Nota: Asegúrese de que la mecha de tejido resultante sea menor de 1 mm 3 de tamaño para cada pieza. Un rendimiento típico es de aproximadamente 5.000 VESC por animal.
- Mida el peso total del tejido fino y colóquelo en un tubo de 50 ml.
- Preparar el medio base de la digestión en un tubo centrífugo tapado de 50 ml con un volumen de 10 ml por 1 g de picado de tejido. Añadir la colagenasa Tipo 3 a la concentración de 300 unidades por 10 ml de medio base de digestión para constituir el tampón de digestión. Mezcle uniformemente y añádalo al picado de tejido.
- Coloque horizontalmente el tubo de centrífuga de 50 ml en una plataforma oscilante y ajuste la velocidad a 100 rpm y la temperatura a 37 ° C. AgitarEl tejido mamario durante 2 h. Compruebe y agite manualmente el tubo cada 20 min para asegurar una digestión adecuada.
Nota: El propósito de la digestión del tejido antes de FACS es preparar una solución de una sola célula de tejido sólido. Por lo tanto, al final de la digestión, el contenido debe ser una solución gruesa sin piezas de tejido visibles.
- Utilizar ratones reportero virgen maduro Actin-GFP de 8 semanas de edad, con pesos comprendidos entre 20 y 25 g, como donantes de tejidos.
- Preparación de la solución de una sola célula.
- Después de la digestión, recargar el tubo de centrífuga de 50 ml con PBS estéril precalentado e invertir el tubo para que se mezcle uniformemente. Centrifugar el tubo a 200 xg durante 5 min para obtener un sedimento celular.
- Elimine el sobrenadante y deslice el fondo del tubo para aflojar el sedimento celular. Añadir 3 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos (véase la tabla de materiales) e incubar en una campana de cultivo de tejidos a temperatura ambiente (RT) durante 5 minutos para eliminar los glóbulos rojos.
- Añadir 10 ml de PBS estéril e invertir el tubo para mezclar uniformemente. Centrifugar el contenido de tejido a 200 xg durante 5 min y el discoY el sobrenadante. Añadir en 3 ml de tripsina precalentada al 0,05% y almacenar el tubo a 37 ° C durante 5 minutos para digerir aún más el tejido restante.
- Añadir 3 ml de IMDM pre-calentado y luego agregar 100 μl de solución de DNasa I (0,25 mg de DNasa I diluida en 1 ml de PBS). Guarde el tubo a 37 ° C para romper los filamentos de ADN. Pasar la mezcla de tejidos a través de un filtro de células de 70 μm para obtener la solución celular. Enjuague el filtro dos veces con 2 mL de PBS + 5% de FBS para neutralizar la digestión enzimática.
- Centrifugar la mezcla de células a 200 xg durante 5 minutos para sedimentar las células. Deseche el sobrenadante y resuspenda el sedimento celular en 1 ml de PBS + 5% de FBS para la tinción del anticuerpo.
- FACS basado en Procr + VESC aislamiento.
- Sujetar la mezcla celular obtenida de tejido mamario donante a la tinción de anticuerpos siguiendo los protocolos de rutina publicados 8 .
Nota: Se utilizaron los siguientes anticuerpos: anti-ratónCD110-PCC1 anti-ratón CD110 (PECAM1) -PECY7, CD105-APC anti-ratón (todas ellas usadas a una concentración de 1 μg / mL), CD201 (Procr) -biotina anti-ratón (utilizada a una concentración de 2,5 Μg / ml) y estreptavidina-v450 (utilizada a una concentración de 0,5 μg / ml).- Después de la tinción del anticuerpo, recargar las células con PBS + FBS al 5% y luego centrifugar a 200 g durante 5 min. Deseche el sobrenadante y resuspenda las células con 1 mL de PBS + 5% de FBS. Filtrar a través de un tamiz celular de 40 μm. Colocar en hielo hasta la clasificación FACS.
- Proceda a realizar la clasificación basada en FACS para aislar Procr + VESC.
- Analizar la muestra sin color y cada control de un solo color para determinar el voltaje de cada color. Calcular los parámetros de compensación para evitar la auto-fluorescencia o la tinción de fondo. Establecer la plantilla para el gating y la clasificación adecuada para las poblaciones de células deseadas.
- Para establecer la jerarquía de clasificación FACS, primero elimine los desechos deTodos los eventos y luego desechar los dobletes o grupos de células adhesivas activando con ancho. Gate-out células de linaje de sangre y luego usar CD31 + y CD105 + para definir las poblaciones endoteliales.
Nota: Las células Procr + se aislaron de CD31 + CD105 + ECs en comparación con un control de FMO. Un gráfico de análisis FACS representativo se muestra en la Figura 1 . Una población VESC aislada con FACS debe suspenderse en IMDM + 50% FBS y almacenarse en hielo hasta su posterior procesamiento.
- Sujetar la mezcla celular obtenida de tejido mamario donante a la tinción de anticuerpos siguiendo los protocolos de rutina publicados 8 .
2. Ensayo de formación de vasos VESC in vivo usando el cojín de grasa mamaria
- Preparar las EC primarias para el trasplante.
- Completar las células FACS-clasificadas con 10 ml de PBS + FBS al 5% y luego centrifugar a 200 xg durante 5 min para sedimentar las células hasta el fondo.
- Aspirar el líquido con cuidado, contar el número de células utilizando un hemocitómetro, y resuspender el sedimento celular con la mezcla de matriz de membrana basal (consiPicadura de matriz de membrana basal al 50% y PBS con FBS al 20%, suplementado con rmVEGF 100 ng / mL y heparina 60 U / mL) para alcanzar una concentración de trabajo de 15.000 células / 15 μl.
Nota: La mezcla de la matriz de la membrana basal siempre debe almacenarse en hielo. - Diluya en serie las células clasificadas y contadas para alcanzar las concentraciones de entrada requeridas en un microtubo de 1,5 ml, asegurándose de que los volúmenes finales de inyección no excedan de 15 μL en total. Añadir 0,1% de azul tripán a cada tubo para una mejor visualización del contenido durante el trasplante. Pipete bien para mezclar. Guarde los tubos en hielo hasta su uso.
Nota: Se puede lograr una generación de buques con un mínimo de 100 VESCs.
- Transplantar EC primarias a la almohadilla de grasa mamaria.
- Desinfecte los instrumentos quirúrgicos y la bancada. Si se usan los mismos instrumentos en múltiples animales, se puede usar un esterilizador de talón para la desinfección.
- Anestesiar 3 semanas de edad BALB / c desnuda micE utilizando el protocolo anestésico recomendado por el veterinario de su institución y el IACUC. Coloque cada ratón en posición supina, con la espalda en la mesa de operaciones. Inmovilice sus extremidades con cinta adhesiva.
- Sumerja un hisopo de algodón en solución antiséptica a base de yodo. Limpie el área entera del abdomen del ratón a fondo para esterilizar la superficie de la piel antes de la cirugía.
- Mantenga y levante la piel del abdomen del ratón con fórceps. Utilice un bisturí quirúrgico para realizar una pequeña incisión vertical de 1 cm. Haga dos cortes de aproximadamente 0,5 a 1 cm de longitud, cada uno hacia la pata trasera, para lograr una incisión invertida, con forma de Y.
- Use fórceps y un hisopo de algodón para separar suavemente la piel del abdomen y pin la piel de lado para exponer las glándulas mamarias inguinales. Coloque el ratón debajo de un estereoscopio y ajuste la ampliación a 2.0X. Asegúrese de ajustar el foco para que la almohadilla de grasa mamaria se ve claramente y se puede operar.
- Coloque un 27G 1/2 "needlE en hielo para precalentar. Aplique una jeringa de 1 ml con una mezcla de matriz de membrana basal con antelación para eliminar posibles burbujas de aire atrapadas en la región de fijación de la aguja. Pipetear 15 μL de solución mezclada sobre la tapa del tubo de microcentrífuga y luego aspirar todo el volumen en la jeringa con cebado.
- Mantenga la almohadilla de grasa mamaria delante del ganglio linfático inguinal, usando pinzas finas, y levántela ligeramente para facilitar la inyección. Inserte suavemente alrededor de 1/4 de la aguja de la jeringa en la almohadilla de grasa.
- Suelte las pinzas de la almohadilla de manía para agarrar y estabilizar la aguja de la jeringa. Inyecte lentamente la solución para evitar fugas de líquido. Mantenga durante unos segundos para asegurarse de que la mezcla celular se solidifica para minimizar la fuga al sacar la aguja.
- Cierre la solapa de la piel con suturas absorbibles. Suturar la aleta de la piel usando sutura de monofilamento no reactivo de tamaño 5-0 y cerrar las heridas con nudos tipo cirujano, cada nudo aproximadoDistancia de 0,3 cm. Alternativamente, cierre la piel con grapas heridas.
- Coloque los ratones operados en una jaula separada para su recuperación. Coloque una lámpara de calefacción sobre la jaula para evitar que los ratones anestesiados sufren de hipotermia. Coloque papel blando y algodón en el fondo de la jaula para mantener a los ratones calientes después de la cirugía.
- Observe cuidadosamente a los ratones hasta que todos los receptores estén completamente despiertos. Durante los próximos días, aplique analgésicos posquirúrgicos de manera preventiva a todos los animales o según las instrucciones del veterinario de la instalación. Aplicar antibióticos según el protocolo animal aprobado si ocurre infección de la herida. Si la herida quirúrgica se cerró con grapas heridas, retire los clips de la herida 10 días después de la cirugía, cuando la herida esté completamente cerrada.
3. Preparación de tejidos de montaje completo para la observación microscópica
- Cosecha de tejidos
- A las 2 - 4 semanas después de la implantación, anestesiar al receptor BALB / cNude con una inyección intraperitoneal de 2,5% de agente anestesiante a una dosis de 0,12 ml por 20 g de peso corporal, como en el paso 2.2.2.
Nota: El crecimiento positivo de los vasos puede detectarse 2 - 4 semanas después del trasplante celular. - Etiquetar la circulación sistémica del receptor con una inyección de vena de cola de colorante isolectina-647 a una dosis de 50 μg / 25 g de peso corporal, resuspendido en 50 μl de PBS estéril. Permita un período de reposo de 5 - 10 min. Sacrificar a los ratones usando CO 2 .
- Diseccionar el área de tejido mamario donde las células se inyectaron inicialmente después de la etapa 2.2.4; Use tijeras quirúrgicas. Utilizando una cuchilla quirúrgica, cortar el tejido en aproximadamente 3 a 4 mm 3 cubos en una placa de Petri de 6 cm.
- A las 2 - 4 semanas después de la implantación, anestesiar al receptor BALB / cNude con una inyección intraperitoneal de 2,5% de agente anestesiante a una dosis de 0,12 ml por 20 g de peso corporal, como en el paso 2.2.2.
- La digestión y preparación del tejido para la tinción de anticuerpos.
- Digerir los trozos de tejido en un tubo de centrífuga de 15 ml llena con 10 ml de medio de base de digestión precalentada (etapa 1.1.2) suplementado con colagenasa III(300 U por 10 ml).
- Coloque el tubo de centrífuga de 15 ml horizontalmente sobre una plataforma mecedora con la velocidad ajustada a 100 rpm y la temperatura ajustada a 37 ° C durante aproximadamente 1 h para aflojar la estructura del tejido y para eliminar excesivo tejido adipocito.
Nota: Los adipocitos tienden a producir autofluorescencia lo que podría resultar en un fondo fluorescente ruidoso. Al final de la digestión, las piezas de tejido deben tener un aspecto suave y turbio. El período óptimo de digestión depende del tamaño de las piezas de tejido cortadas y por lo tanto debe ajustarse en consecuencia para obtener los mejores resultados. Dado que la vasculatura tisular ya ha sido etiquetada con Isolectina marcada con fluorescencia, todos los procedimientos siguientes deben llevarse a cabo protegidos de la luz. - Lave las piezas de tejido con PBS a RT durante 10 min. Fijar el tejido de montaje completo colocando cuidadosamente las piezas en una placa de Petri de 6 cm a medio llenar con PFA al 4% (pH 7,2-7,4) para preservar la fluorescencia. Coloque la placa de PetriSobre una plataforma mecedora y agitar suavemente el tejido durante 30 min a RT.
Nota: PFA es carcinógeno y debe manejarse con precaución. - Eliminar el PFA restante y lavar el tejido fijo tres veces con tampón de lavado de montaje completo (tween al 0,1% en PBS), con un intervalo de 10 min entre cada lavado.
- Coloración del anticuerpo del tejido de montaje completo.
- Diluir el anticuerpo primario en tampón de tinción de anticuerpos en un tubo de centrífuga de 2 ml. Incubar el tejido con el anticuerpo primario durante la noche a 4 ° C.
Nota: Como anticuerpos primarios se utilizaron anti-CD31 de rata (concentración: 10 μg / ml) o cadherina anti-VE de rata (concentración de CD144 / Cdh5: 2,5 μg / ml). Tanto CD31 como VE-cadherina son marcadores de superficie celular usados para reconocer el endotelio. Se prepara un tampón de tinción de anticuerpos 5x con ácido maleico 500 mM, pH 7,5; NaCl 750 mM; Y el tween del 0,5% (v / v) se disuelve en PBS. A~nadir solamente en un volumen de suero apropiado (5%) al preparar una nueva solución de trabajo 1x9 . - Eliminar el tampón de tinción de anticuerpos y lavar el tejido de montaje completo tres veces con tampón de lavado, con un intervalo de 10 minutos. Incubar el tejido con anticuerpos secundarios (véase la Tabla de Materiales ) más DAPI a RT durante 4 h en una plataforma oscilante o durante una noche a 4ºC.
Nota: Utilizar DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) a una concentración final de 5 μg / mL para visualizar los núcleos. - Lavar el tejido de montaje completo con tampón de lavado 3 veces durante 10 minutos cada uno. Incubar las piezas de tejido en 80% de glicerol o 80% de sacarosa durante la noche para deshidratar el tejido para una mejor preservación.
- Coloque las piezas de tejido individuales en una diapositiva de vidrio y eliminar el exceso de buffer de deshidratación. Cubra el tejido con medio de montaje, coloque un cubreobjetos, y suavemente exprimir el tejido para establecerlo.
- Realizar adquisición de imágenes microscópicas confocales. Para las glándulas mamarias de todo el montaje, adquirir imágenes utilizando un 40X con NA = 1.3 objetiVe Adquirir escaneos de azulejos de pilas Z con una resolución de sección óptica de 1.024 x 1.024 y una separación de capas de 1.0 - 1.2 μm.
Nota: Para capturar la señal de luz de fluorescencia correcta, el divisor de haz de filtro debe ajustarse a triple dicroico (TD) 488/553/638, con el ajuste de ganancia en PMT Gain 600-800. Se utilizarán las siguientes fuentes de excitación / emisión: mGFP, con máximos de excitación / emisión de 488/509 nm; MTomato con máximos de excitación / emisión de 532/588 nm; Alexa-647, con máximos de excitación / emisión de 594/665; Y DAPI, con máximos de excitación / emisión de 350/470.
- Diluir el anticuerpo primario en tampón de tinción de anticuerpos en un tubo de centrífuga de 2 ml. Incubar el tejido con el anticuerpo primario durante la noche a 4 ° C.
4. Rastreo de linaje utilizando un modelo de ratón modificado genéticamente
- Detectar Procr + VESC usando el modelo de ratón.
- Utilice la cepa de ratones knock-in Procr CreERT2-IRES-tdTomato / + (denominada Procr CreERT2 ).
Nota: En este modelo de ratón, un casete CreERT2-IRES-tdTomatoProcr 11 . - Cross Procr CreERT2 ratones con el Rosa26 mTtomatomGFP (denominado R26 mTmG ) reportero cepa para rastrear el destino de la endógena Procr + CE in vivo [ 11] . Identifique todas las ECs endógenas de Procr + marcadas y sus descendientes usando expresión de GFP.
- Administrar la solución de tamoxifeno 11 (10 mg de tamoxifeno disuelto en 1 ml de aceite de cacahuete + etanol al 10% para formar una solución madre de 10 mg / ml) intraperitonealmente a una dosis de 4 mg / 25 g de peso corporal durante la etapa puberal Viejos) para rastrear el destino del desarrollo de las CE de Procr +.
- Analizar la eficiencia de formación de clones de las células marcadas mediante inmunoticción de montaje completo después de las etapas de preparación delineadas en el paso 3. Obtener almohadillas de grasa mamaria de ratones tratados después de un corto plazo (2 días) y períodos de tiempo prolongados (hasta 10 meses). Vea la Figura 3 .
- Utilice la cepa de ratones knock-in Procr CreERT2-IRES-tdTomato / + (denominada Procr CreERT2 ).
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Representative Results
Mamario VESCs Aislamiento:
Para aislar la población endotelial para el ensayo de trasplante consecuente, las glandulas mamarias maduras (de 8 semanas de edad) fueron cosechadas como material donante. Las células endoteliales se aislaron usando una técnica de clasificación de células basada en anticuerpos. Gráficos representativos de la FACS análisis de la población VESC en 8 semanas de edad C57BL / 6 glándulas mamarias ECs se muestran en la Figura 1 (Figura adaptada de Yu et al 8 , con permiso).
Trasplante de la almohadilla grasa mamaria:
La almohadilla de grasa mamaria proporciona un sitio ideal para el estudio de la angiogénesis. Después del aislamiento basado en FACS, se mezclaron Procr + ECs con una matriz de membrana basal al 0,5% y un indicador de azul Trypan al 0,1% y luego se transplanDe grasa vacía de los receptores SCID de 3 semanas de edad. Durante la pubertad, la almohadilla de grasa mamaria crea un ambiente angiogénico, promoviendo la remodelación de la vasculatura en alineación con la expansión del epitelio mamario. Como resultado, las células Procr + CE trasplantadas (GFP + ) se incorporaron a los grandes vasos del huésped ( Figura 2B , flechas) y también formaron ramas de los vasos GFP + secundarios y terciarios ( Figura 2B , puntas de flecha). Aunque trasplantado Procr + ECs también puede generar vasos en un ensayo de tapón de matriz (insertado bajo la piel del flanco), los vasos formados sólo aparecen similares a capilares (Figura 2A; figura adaptado de Yu et al 8, con permiso.).
Funcionalidad de los buques Formados por Procr + VESCs:
Para investigar si el GFP + vLos essels en las almohadillas de grasa mamaria son parte de la vasculatura circulatoria funcional, la isolectina se administró por inyección intravenosa antes de la cosecha. Los vasos GFP + fueron isolectina +, lo que indica que los vasos formados están luminizados y conectados con la vasculatura del huésped ( figura 2B , figura adaptada de Yu et al 8 , con permiso).
Seguimiento de linaje VESC mamario usando Procr CreERT2 ; Rosa26 mTmG Modelo de ratón:
Procr CreERT2 ; Rosa26 mTmG ratones fueron utilizados para el destino de seguimiento de Procr + VESCs in vivo ( Figura 3A ]. Investigar cómo Procr + VESCs contribuye a la robusta angiogénesis y remodelación vascular durante el desarrollo puberal de las glándulas mamarias, Procr CreERT2 ; Rosa26 mTmG fueron administradosD con tamoxifeno para inducir la expresión de GFP en la población endotelial de Procr +. Las almohadillas de grasa mamaria de ProcR CreERT2 tratado con fármaco ; Los ratones Rosa26 mTmG fueron cosechados a corto plazo (2 días después de la inyección, Figura 3B ) ya largo plazo (hasta 10 meses después de la inyección, figura 3C -F, adaptada de Yu et al 8 , con permiso). La preparación de montaje completo se llevó a cabo para visualizar el resultado del rastreo. La identidad del endotelio vascular puede ser validada por tinción con marcador de superficie endotelial VE-Cadherina (Cdh5, Figura 3B , imagen derecha).
Figura 1: Análisis de VESCs en glándula mamaria de ratón. Análisis FACS de la expresión de Procr en ECs C57BL / 6 de 8 semanas de edad. 8 semanas de edad vSe usaron ratones hembra irgen C67BL / 6 para la recolección de glándulas mamarias. Después de preparar las muestras de células, se analizó la muestra sin pigmentar y cada control de un solo color para determinar el voltaje para cada color. Los parámetros de compensación se calcularon para evitar la auto-fluorescencia o tinción de fondo. Se estableció una plantilla para el gating adecuado y para clasificar para las poblaciones de células deseadas. Para establecer la jerarquía de la clasificación FACS, se eliminaron los desechos de todos los eventos y, a continuación, los dobletes o los grupos de células adhesivas se descartaron. Las células de linaje se cerraron, y CD31 y CD105 se usaron para definir las poblaciones endoteliales. Procr + células fueron aisladas de CD31 + CD105 + EC en comparación con el control de FMO. Esta cifra ha sido modificada de Yu et al. 8 , con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Ensayo de transplante de grasa mamaria VESC. ( A ) Un recipiente formado a partir de Procr + ECs dentro de un tapón de matriz de membrana basal insertado subcutáneamente bajo la piel de flanco. ( B ) Imagen confocal de una almohadilla de grasa mamaria receptora, que indica la integración y contribución de Procr + ECs trasplantados (GFP +) a la vasculatura mamaria del huésped. Las CE se contracoloraron con CD31. ( C ) La inyección intravenosa en ratones receptores con isolectina mostró que los excrementos formaban vasos luminosos. Barra de escala, 50 μm. Las imágenes fueron adquiridas usando un objetivo 40X NA 1.3. Los escaneos de baldosas de pilas Z se adquirieron con una resolución de sección óptica de 1.024 x 1.024, y cada capa era de 1,0 - 1,2 μm de separación. Para capturar la señal de luz de fluorescencia correcta, el divisor de haz de filtro se ajustó a TD 488/553/638, con el gAin en PMT Gain 600 - 800. Se utilizaron las siguientes fuentes de excitación / emisión: mGFP, con máximos de excitación / emisión de 488/509 nm; MTomato, con máximos de excitación / emisión de 532/588 nm; Alexa-647, con máximos de excitación / emisión de 594/665; Y DAPI, con máximos de excitación / emisión de 350/470. Esta cifra ha sido modificada de Yu et al. 8 , con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: El rastreo de linaje de las CE de Procr + demuestra su contribución a la expansión clonal de la CE durante el desarrollo. ( A ) Ilustración de la estrategia de rastreo de linaje utilizando Procr CreERT2 ; Rosa26 mTmG línea (panel izquierdo). ExperimentalConfiguración utilizada en el corto plazo (2 días) y largo plazo (7 días a 10 meses), como se indica (panel derecho). ( BF ) Imágenes confocales de montaje completo de la vasculatura mamaria después de diferentes longitudes de los períodos de rastreo, lo que indica la ubicación inicial de los CEs marcados con Procr + y su contribución a la vasculatura mamaria en diversas etapas de rastreo. Barra de escala = 50 μm. Esta cifra ha sido modificada de Yu et al. 8 , con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los ensayos de angiogénesis representan un buen enfoque experimental para estudiar la dinámica vascular. La vasculatura retiniana del ratón, que se desarrolla postnatalmente, ha demostrado ser un modelo atractivo para estudiar la angiogénesis [ 12] . A pesar de ser relativamente accesible, la manipulación real dentro del lecho vascular de la retina es bastante difícil. Hasta ahora, el trasplante in vivo mejor descrito ha sido el ensayo de tapón, que encierra células dentro de una masa de matriz de membrana basal e implantes quirúrgicos / inyecta subcutáneamente en la región de flanco de un ratón receptor. Este ensayo de angiogénesis es eficaz para probar el potencial regenerativo y la capacidad de formación de vasos de las células embebidas. Sin embargo, puesto que la ubicación del tapón de matriz implantado crea un entorno comparativamente aislado para las células en su interior, no proporciona un nicho fisiológico óptimo. Recientemente, también se ha desarrollado un nuevo modelo de angiogénesis pulmonar aplicando un parche de fibrina sobre la superficieCe sitio del pulmón de ratón 13 . Sin embargo, los manipuladores plantean otro riesgo, ya que esta técnica opera de manera invasiva dentro de la cavidad torácica del ratón, por lo que es difícil de usar en un ensayo más generalizado.
En el ensayo de angiogénesis descrito aquí, se transplanta un pequeño volumen de mezcla celular dentro de la almohadilla grasa de la glándula mamaria, que proporciona espacio, matriz y estímulos angiogénicos ricos durante la pubertad. Esto permite que los vasos generados cumplan e integren en la remodelación vascular del huésped, permitiendo una evaluación funcional adicional, así como representando una ventaja sobre el ensayo de tapón subcutáneo. Además, la almohadilla de grasa mamaria se encuentra fuera de la cavidad peritoneal, por lo que es un sitio muy accesible. La operación en la almohadilla de grasa mamaria introduce una angustia limitada al animal receptor, evitando los procedimientos quirúrgicos invasivos implicados en ensayos de retina y de base pulmonar.
Ingenio vascular de la sangreHin un órgano a menudo se entrelaza entre los componentes del tejido para maximizar la cobertura vascular de modo que la prestación de oxígeno en sangre y la transferencia de material se puede optimizar. Por esta razón, la sección convencional del tejido frecuentemente intercepta la estructura tubular de sus vasos. El análisis de las propiedades vasculares se realiza mejor cuando los vasos se pueden conservar y permanecer intactos. La preparación de todo el montaje de un tejido puede preservar en gran medida la totalidad de la arquitectura vascular en su interior. Este método permite no sólo la observación de la auténtica distribución espacial del vaso sanguíneo dentro de un órgano, sino también la relación con otros componentes tisulares.
La homeostasis de un tejido que contiene células madre se mantiene equilibrando la generación y la pérdida de masa celular. Las células madre dentro del órgano habitante específico a menudo están protegidas y en estrecho contacto con el entorno de tejido circundante, denominado nicho de células madre. Por lo tanto, stuLos troqueles que analizan el tejido de células madre adultas deben realizarse preferiblemente en un contexto fisiológico intacto. Los ensayos de trasplante podrían proporcionar un medio para evaluar el potencial celular, mientras que la técnica de localización del linaje permite explorar el verdadero destino celular dentro del hábitat nativo. En los últimos años, el rastreo de linajes in vivo se ha convertido en una poderosa técnica para la evaluación experimental de las propiedades del tallo. Esta estrategia se ha utilizado para identificar células madre de residuos de tejidos y sus descendientes en múltiples tejidos, incluyendo el intestino 10 , 14 , folículos pilosos 15 , estómago 16 y páncreas 17 . El método de rastreo del linaje depende en gran medida del marcado genético de las células madre y se inicia en poblaciones definidas. Por lo tanto, es difícil excluir la posibilidad de que stemness real se encuentra en una subpoblación aún más pequeña dentro de las células marcadas. Por lo tanto, es imprescindible mapear la célula de origen de los clones trazados con precisión y medir cuantitativamente las eficiencias de rastreo a lo largo del tiempo. De esta manera, la capacidad de auto-renovación de la población etiquetada puede ser aprehendida.
El ensayo de angiogénesis descrito puede modificarse con fines de estudio específicos: puede utilizarse no sólo para probar la capacidad de generación de vasos de las poblaciones endoteliales de interés, sino también para evaluar el efecto de factores angiogénicos en la remodelación localizada de vasos. Sin embargo, dado que la glándula mamaria experimenta cambios morfológicos dinámicos durante diferentes etapas de desarrollo ( por ejemplo, la pubertad, los ciclos de estro y el embarazo), debe tenerse en cuenta el efecto de cambios sistémicos, como la fluctuación hormonal durante la interpretación de los resultados. Los pasos críticos en este ensayo incluyen el aislamiento de células endoteliales primarias. Para obtener óptimamente células viables para el trasplante, los procedimientos para el aislamiento de FACS deberíanE se lleva a cabo suavemente. Debe tenerse precaución para evitar un manejo severo durante las preparaciones celulares, tales como el desprendimiento y la suspensión de las pastillas celulares. Otro paso crítico es la inyección de la mezcla celular en la grasa pat. Durante la inyección de la almohadilla de grasa, es importante asegurarse de que la mezcla de células se deposita con precisión dentro de la almohadilla de grasa. Esto puede ser complicado si la inserción de la aguja es demasiado profunda o superficial o si el volumen total excede la dosis recomendada.
Este protocolo proporciona una serie de métodos experimentales que ayudaron en la identificación de una población de células madre endoteliales. A través de estas técnicas, fue posible evaluar las propiedades de las células madre a través del trasplante, así como rastrear y observar su comportamiento bajo procesos fisiológicos in vivo . Estos enfoques son eficientes herramientas que pueden aplicarse a múltiples disciplinas, incluyendo estudios de poblaciones endoteliales en entornos tumorales y de alteraciones en su potencia celular. yoEn particular, el trasplante de almohadillas de grasa y la preparación de todo el montaje son métodos reproducibles y poderosos que pueden ayudar en futuros esfuerzos para investigar diferentes aspectos de la biología vascular.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31530045 y 31371500 a YAZ, 31401245 a QCY), el Ministerio de Ciencia y Tecnología de China (2014CB964800), la Academia China de Ciencias (XDB19000000 a YAZ) y el chino Sociedad de Biología Celular (Early Career Fellowship to QCY).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-Ethylene Diamine Tetraacetic Acid(EDTA) (1x) | Gibco (Life Technologies) | 25300-062 | 0.05% Trypsin |
| 0.22 µm Filter Unit | Merck Millipore Ltd. | SLGP033RB | 0.22 µm Filter |
| 2-Methylbutanol-2, ReagentPlus | Sigma-Aldrich | 24, 048-6 | Tert Amyl Alcohol |
| 222, Tribromethanol | Sigma-Aldrich | T48402-25g | 222, Tribromethanol |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI) | Invitrogen | D1306 | DAPI |
| 70 µm Cell Strainer | BD FAL | 352350 | 70 µm Cell Strainer |
| Adhesion Microscope Slides | CITOGLAS | 188105 | Glass slides |
| Anti-mouse CD105 APC | eBioscience | 17-1051-82, clone MJ7/18 | for FACS analusis use at 1 µg/mL |
| Anti-mouse CD201 Biotin | eBioscience | 13-2012-82 | for FACS analusis use at 2.5 µg/mL |
| Anti-mouse CD31 PE-Cyanine 7 | eBioscience | 25-0311-82, clone 390 | for FACS analusis use at 1 µg/mL |
| BD FACSJazz Cell Sorter | BD Biosciences | 655489 | FACS |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 100190332 | BSA |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Centrifuge |
| Collagenase type 3 | Worthington-Biochem | #LS004183 | Collagenase III |
| Confocal microscopy | Leica | sp8 | Confocal |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D2463-5VL | Dnase I |
| Donkey anti-Rat Cy3 | Jackson ImmunResearch | 712-165-150 | Secondary antibody, use at 0.5 µg/mL |
| Dumont Forceps | WPI | 500342 | Froceps |
| Dumont Forceps - Micro-Blunted Tips | FST | 11253-20 | Forceps |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | FBS |
| FITC Ms CD3/Gr1/CD11b/CD45R(B220)/Ter-119 | BioLegend | 78022 | Blood lineage cocktail for FACS analysis, use at 25 µL per test |
| Glycerol | Sigma | G6279 | Glycerol |
| Iscov's Modified Dulbecco's Medium | Gibco (Life Technologies) | 12440-053 | IMDM |
| Isolectin GS-IB4 from Griffonia Simplicifolia, Alexa Fluora 647 | Invitrogen | Z32450 | Isolectin-647 |
| Matrigel Matrix (growth factor reduced) | BD | 356231 | Matrigel |
| Mouse strain (Actin-GFP) | Jax Laboratories | 3773 | Actin-GFP |
| Mouse strain (C57BL/6) | SLAC | C57BL/6 | C57BL/6 |
| Mouse strain (BALB/c nude) | SLAC | BALB/c nude | Nude mice |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | PFA |
| Penicilin Streptomycin | Gibco (Life Technologies) | 5140-122 | Pen/Strep |
| Phosphate Buffered Saline (pH7.2) 1x | Gibco (Life Technologies) | c20012500BT | PBS |
| PRIM1640 | Gibco (Life Technologies) | c11875500CP | PRIM1640 |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | Mounting Medium |
| Rat anti CD144 | BD Biosciences | 550548 | for whole-mount analysis, anti-VE-Cadherin / Cdh5 antibdy for endothelial tight junction, use at 2.5 µg/mL |
| Rat anti CD31-biotin | BD Biosciences | 553371 | for whole-mount analusis, anti-CD31/PECAM1 antibody for endothelial surface adhesion molecule, use at 10 µg/mL |
| Red Cell Lysis Buffer | Sigma | R7767-100ML | Red blood cell lysing buffer |
| Straight/Sharp-Blunt/10cm | FST | 14028-10 | Fine Scissors |
| Streptavidin eFluor 450 | eBioscience | 48-4317-82 | for FACS analysis use at 0.5 µg/mL |
| Tamoxifen | Sigma | 101551374 | TAM |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-250ML | TritonX |
| Wax Coated Braided Silk (Size 5-0 USP (1 Metric), 18 inches (45 cm) BLACK on C-1 Needle) | COVIDIEN | S1173 | Suture |
| Sterile Disposable Scaplels | Swann Morton | #10 | Scalpel |
| Betadine | Yifeng Medical | 20160101 | Antiseptic solution |
References
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