Dette arbeidet demonstrerer en ny tilnærming til å vurdere spredning, differensiering og fartøydannende potensial av vaskulære endotelceller (VESCs) gjennom brystfettpute-transplantasjon etterfulgt av helfestet vevsberedning for mikroskopisk observasjon. En linjesporingsstrategi for å undersøke oppførselen til VESCs in vivo presenteres også.
Endotelceller (EC) er de grunnleggende byggeblokkene i den vaskulære arkitekturen og formidler vaskulær vekst og remodeling for å sikre riktig karutvikling og homeostase. Imidlertid forblir studier på endotel-lineærhierarki unnvikende på grunn av mangel på verktøy for å få tilgang samt å evaluere deres oppførsel in vivo direkte . For å løse denne mangelen er det utviklet en ny vevsmodell for å studere angiogenese ved bruk av brystfettpute. Mammekirtlen utvikler seg hovedsakelig i postnatalstadier, inkludert pubertet og graviditet, i løpet av hvilken robust epitelutbredelse er ledsaget av omfattende vaskulær remodeling. Mammarfettputer gir plass, matrise og rike angiogene stimuli fra det voksende brystepitelet. Videre er brystfettputer lokalisert utenfor bukhulen, noe som gjør dem til et lett tilgjengelig podningssted for å vurdere det angiogene potensialet til eksogene celler. Dette arbeidet beskriver også en effektivitetNt-sporingstilnærming ved bruk av fluorescerende reportermus for spesifikt å merke den målrettede populasjonen av vaskulære endotelceller (VESCs) in vivo . Denne linjesporingsmetoden, kombinert med etterfølgende fullmikroskopi av vev, muliggjør direkte visualisering av målrettede celler og deres etterkommere, hvorved spredningskapasiteten kan kvantifiseres og differensieringsforpliktelsen kan være skjebnesvart. Ved bruk av disse metodene har en populasjon av bipotent protein C-reseptor (Procr) som uttrykker VESCs nylig blitt identifisert i flere vaskulære systemer. Procr + VESC, som gir opphav til både nye EC og pericytter, bidrar aktivt til angiogenese under utvikling, homeostase og skadereparasjon. Samlet beskriver dette manuskriptet en ny brystfettpudstransplantasjon og in vivo linjesporingsteknikker som kan brukes til å evaluere stamcelleegenskapene til VESCs.
Under utvikling og homeostase skjer vaskulær vekst og remodeling trofast i samsvar med organs vekst og reparasjon. Angiogenese beskriver genereringen av nye fartøyer fra eksisterende blodkar og anses som en stor styrke som formidler disse dynamiske vaskulære endringene. Hvert blodkar er innert med et lag av endotelceller (EC), og de ser ut til å være grunnlaget for fartøyarkitekturen. I lang tid forblir mekanismen gjennom hvilken EC-bassenget fylles under homeostase, uklart, og argumenter ble hevet over hvorvidt vaskulær omsetning er et resultat av moden EC-proliferasjon eller er bidraget av vaskulær stamme / stamcelleraktivitet. På grunn av mangelen på direkte fysiologiske bevis forblir eksistensen og den cellulære identiteten til vaskulære endotelceller (VESCs) også kontroversielle.
En av de vanligste tilnærmingene som brukes til å verifisere stamcelleadferd er gjennom transplanenTasjon av formodede stamceller i mottakermus. Denne metoden måler stammen potensialet av kandidat stamceller in vivo. Transplantasjon ble først brukt på studien av knoglemarvstamceller 1 , som bidro til etableringen av de hierarkiske karakteristikkene til det hematopoietiske systemet 2 . I endotelfeltet er en basementmembranmatriksmatrise ( f.eks. Matrigel) -plugg satt subkutant under flankehuden et standard in vivo angiogenese-assay som brukes til å adressere fartøydannelsesevnen til transplanterte ECs. Flere eksperimentelle metoder, inkludert kolonidannelse i 3D-kultursystemer og transplantasjon, har foreslått potensielle EC-progenitor / VESC-populasjoner 3 , 4 , 5 , 6 . Imidlertid, siden ECs innebygd i kjellermembranmatrisen er relativt adskilt fraDet omkringliggende vevet, gir dette ikke det optimale nisjemiljøet som kreves for å fullt ut undersøke det angiogene potensialet for transplanterte celler. Som et resultat er kar som er dannet i matrikspluggen overveiende kapillærlignende og funksjonelt uimplementerbare.
Mammekirtlen utvikler seg postnatalt, med den mest robuste veksten som oppstår under pubertet og graviditet. I pubertetstadiet gjennomgår brystepitelet en rask ekspansjon, for å oppta hele brystfettpuden, ledsaget av effektiv remodeling av de omkringliggende vaskulære strukturer. Dermed gir brystkjertelen en utmerket modell for studier av angiogenese. Det gir rom, matrise og rike angiogene stimuli fra det voksende brystepitelet og er derfor et ideelt podningssted for å vurdere det angiogene potensialet til eksogene celler. I tillegg tillater brystfettpuden at de dannede eksogene karene integreres med vertscirkulasjonssystemet, hvilket muliggjør videre fUunksjonell evaluering og representerer en fordel over subkutan transplantasjon.
Selv om in vitro- dyrking og transplantasjonsanalyser er like effektiv måte å undersøke regenereringsegenskapene til en cellepopulasjon på, er det kjent at slike analyser kan stimulere plastisitet når celler tas bort fra deres native habitater, og endringer kan bli indusert når celler frakobles fra Deres fysiologiske omgivelser 7 . Derfor er oppnåelse av direkte in vivo bevis på celle skjebne nøkkelen til å fremme den nåværende forståelsen av endotel-populasjoners adferd.
Genetisk skjebne kartlegging ( dvs. in vivo lineage tracing) er viktig for identifisering av VESCs og for undersøkelse av deres egenskaper i kroppens system, da det kan avsløre in vivo stamcelleadferd i sin fysiologiske kontekst, og den faktiske stammen kan være vurdert. Lineage traciNg gir direkte bevis på langsiktig utholdenhet ( dvs. selvfornyelse) av kandidat VESCs og deres evne til å produsere celletyper for opprinnelsesvevet ( dvs. differensieringspotensial).
Denne protokollen beskriver en ny brysttransplantasjonsteknikk for brystfettfett og en linjesporingsmetode for å observere fartøygenerasjonsegenskapen til VESCs. Disse teknikkene overvinne mangler av tilgjengelige analyser og gir en ny måte å optimalisere stamcelleegenskapene til VESCs. Disse tilnærmingene er effektive verktøy som kan brukes til å vurdere endotel-populasjoners adferd og fartøyformende egenskaper, samt å bestemme endring av vaskulærcellepotensial i et patologisk miljø.
Angiogenese-analyser representerer en god eksperimentell tilnærming til å studere vaskulær dynamikk. Mus retinal vaskulatur, som utvikler seg postnatalt, har vist seg å være en attraktiv modell for å studere angiogenese 12 . Til tross for at den er relativt tilgjengelig, er faktisk manipulering i retina vaskulærsengen ganske vanskelig. Hittil har den best beskrevne in vivo transplantasjonen vært plug-analysen, som omslutter celler inne i en kjellermembranmatriksmasse og kirurgisk…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (31530045 og 31371500 til YAZ, 31401245 til QCY), Kinas departement for vitenskap og teknologi (2014CB964800), Det kinesiske vitenskapsakademiet (XDB19000000 til YAZ) og den kinesiske Society of Cell Biology (Early Career fellesskap til QCY).
0.05% Trypsin-Ethylene Diamine Tetraacetic Acid(EDTA) (1X) | Gibco (Life Technologies) | 25300-062 | 0.05% Trypsin |
0.22 µm Filter Unit | Merck Millipore Ltd. | SLGP033RB | 0.22 µm Filter |
2-Methylbutanol-2, ReagentPlus | Sigma-Aldrich | 24, 048-6 | Tert Amyl Alcohol |
222, Tribromethanol | Sigma-Aldrich | T48402-25g | 222, Tribromethanol |
4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI) | Invitrogen | D1306 | DAPI |
70 µm Cell Strainer | BD FAL | 352350 | 70 µm Cell Strainer |
Adhesion Microscope Slides | CITOGLAS | 188105 | Glass slides |
Anti-mouse CD105 APC | eBioscience | 17-1051-82, clone MJ7/18 | for FACS analusis use at 1 µg/mL |
Anti-mouse CD201 Biotin | eBioscience | 13-2012-82 | for FACS analusis use at 2.5 µg/mL |
Anti-mouse CD31 PE-Cyanine 7 | eBioscience | 25-0311-82, clone 390 | for FACS analusis use at 1 µg/mL |
BD FACSJazz Cell Sorter | BD Biosciences | 655489 | FACS |
Bovine Serum Albumin | Sigma | 100190332 | BSA |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Centrifuge |
Collagenase type 3 | Worthington-Biochem | #LS004183 | Collagenase III |
Confocal microscopy | Leica | sp8 | Confocal |
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D2463-5VL | Dnase I |
Donkey anti-Rat Cy3 | Jackson ImmunResearch | 712-165-150 | Secondary antibody, use at 0.5 µg/mL |
Dumont Forceps | WPI | 500342 | Froceps |
Dumont Forceps – Micro-Blunted Tips | FST | 11253-20 | Forceps |
Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | FBS |
FITC Ms CD3/Gr1/CD11b/CD45R(B220)/Ter-119 | BioLegend | 78022 | Blood lineage cocktail for FACS analysis, use at 25 µl per test |
Glycerol | Sigma | G6279 | Glycerol |
Iscov's Modified Dulbecco's Medium | Gibco (Life Technologies) | 12440-053 | IMDM |
Isolectin GS-IB4 from Griffonia Simplicifolia, Alexa Fluora 647 | Invitrogen | Z32450 | Isolectin-647 |
Matrigel Matrix (growth factor reduced) | BD | 356231 | Matrigel |
Mouse strain (Actin-GFP) | Jax Laboratories | 3773 | Actin-GFP |
Mouse strain (C57BL/6) | SLAC | C57BL/6 | C57BL/6 |
Mouse strain (BALB/c nude) | SLAC | BALB/c nude | Nude mice |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | PFA |
Penicilin Streptomycin | Gibco (Life Technologies) | 5140-122 | Pen/Strep |
Phosphate Buffered Saline (pH7.2) 1X | Gibco (Life Technologies) | c20012500BT | PBS |
PRIM1640 | Gibco (Life Technologies) | c11875500CP | PRIM1640 |
ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | Mounting Medium |
Rat anti CD144 | BD Biosciences | 550548 | for whole-mount analysis, anti-VE-Cadherin / Cdh5 antibdy for endothelial tight junction, use at 2.5 µg/mL |
Rat anti CD31-biotin | BD Biosciences | 553371 | for whole-mount analusis, anti-CD31/PECAM1 antibody for endothelial surface adhesion molecule, use at 10 ug/mL |
Red Cell Lysis Buffer | Sigma | R7767-100ML | Red blood cell lysing buffer |
Straight/Sharp-Blunt/10cm | FST | 14028-10 | Fine Scissors |
Streptavidin eFluor 450 | eBioscience | 48-4317-82 | for FACS analysis use at 0.5 µg/mL |
Tamoxifen | Sigma | 101551374 | TAM |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-250ML | TritonX |
Wax Coated Braided Silk (Size 5-0 USP (1 Metric), 18 inches (45 cm) BLACK on C-1 Needle) | COVIDIEN | S1173 | Suture |
Sterile Disposable Scaplels | Swann Morton | #10 | Scalpel |
Betadine | Yifeng Medical | 20160101 | Antiseptic solution |