Summary
Dit werk demonstreert een nieuwe aanpak om het proliferatie-, differentiatie- en vaartuigvormende potentieel van vasculaire endotheliale stamcellen (VESC's) te beoordelen door middel van transpiratie van de dikke dikvliesvoeding, gevolgd door een full-mount weefselbereiding voor microscopische observatie. Ook wordt een lineage-tracingsstrategie om het gedrag van VESC's in vivo te onderzoeken, ook voorgesteld.
Abstract
Endotheelcellen (EC's) zijn de fundamentele bouwstenen van de vasculaire architectuur en bemiddelen van vasculaire groei en remodeling om de juiste ontwikkeling van het vaartuig en homeostase te waarborgen. Echter, studies over de endotheliale afstammingshiërarchie blijven onduidelijk wegens het gebrek aan hulpmiddelen om toegang te krijgen en hun gedrag in vivo direct te evalueren. Om deze tekortkoming aan te pakken, is een nieuw weefselmodel ontwikkeld om angiogenese te bestuderen met behulp van het vetpadschuim. De borstklier ontwikkelt zich meestal in de postnatale stadia, waaronder puberteit en zwangerschap, gedurende welke robuuste epithelium proliferatie gepaard gaat met uitgebreide vasculaire remodeling. Mammary fat pads bieden ruimte, matrix en rijke angiogene stimuli uit het groeiende mammary epithelium. Bovendien bevinden zich dikke vetpadsjes buiten de peritoneale holte, waardoor ze een gemakkelijk toegankelijke inplantingsplaats zijn voor het beoordelen van het angiogene potentieel van exogene cellen. Dit werk beschrijft ook een efficiëntieNt tracing benadering met behulp van fluorescerende reporter muizen om specifiek de doelgroep van vasculaire endotheliale stamcellen (VESCs) in vivo te meten. Deze afstammingsmethode, gekoppeld aan de daaropvolgende microscopie van het weefsel, maakt de directe visualisatie van gerichte cellen en hun nakomelingen mogelijk, waardoor de proliferatiecapaciteit kan worden gekwantificeerd en de differentiatieverbintenis kan worden vastgelegd. Met behulp van deze methoden is onlangs een populatie van bipotente proteïne C-receptor (Procr) die VESC's uitdrukt, geïdentificeerd in meerdere vasculaire systemen. Procr + VESCs, die aanleiding geven tot zowel nieuwe EC's als pericytes, actief bijdragen tot angiogenese tijdens de ontwikkeling, homeostase en herstel van letsels. In het algemeen beschrijft dit manuscript een nieuwe transplantatie van de dikke dikke padtransplantatie en in vivo lineage tracing technieken die kunnen worden gebruikt om de stamcel eigenschappen van VESCs te evalueren.
Introduction
Tijdens ontwikkeling en homeostase vinden vasculaire groei en remodeling trouwen plaats in overeenstemming met orgaantengroei en reparatie. Angiogenese beschrijft de opkomst van nieuwe vaten van bestaande bloedvaten en wordt beschouwd als een belangrijke kracht die deze dynamische vasculaire veranderingen bemiddelt. Elk bloedvat is binnenkant met een laag endotheliale cellen (EC's), en ze lijken de basis te zijn van de vaartuigarchitectuur. Het mechanisme waardoor de EC-pool tijdens de homeostase is aangevuld, bleef lang en onduidelijk, en er werden argumenten aangevoerd over de vraag of vasculaire omzet het gevolg is van volwassen EC proliferatie of is de bijdrage van vasculaire stam- / stamcellenactiviteiten. Door het gebrek aan direct fysiologisch bewijs bleef het bestaan en de cellulaire identiteit van vasculaire endotheel stamcellen (VESC's) ook controversieel.
Een van de meest voorkomende benaderingen die gebruikt worden om het gedrag van stamcellen te verifiëren, is via het transplanTation van vermeende stamcellen in ontvanger muizen. Deze methode meet het stamme potentieel van kandidaat stamcellen in vivo. Transplantatie werd eerst toegepast op het onderzoek van beenmergstamcellen 1 , die bijgedragen heeft tot de vaststelling van de hiërarchische kenmerken van het hematopoietische systeem 2 . In het endotheel veld, een basaalmembraan matrix (bv Matrigel) plug subcutaan ingebracht onder de huid flank een standaard in vivo angiogenese assay toegepast om de bloedvatvorming mogelijkheden van getransplanteerde EC pakken. Veelvoudige experimentele methoden, waaronder kolonievorming in 3D-cultuursystemen en transplantatie, hebben potentiële EC-stamvogens / VESC-populaties 3 , 4 , 5 , 6 voorgesteld. Echter, aangezien EC's ingebed in basismembraanmatrix relatief gescheiden zijn vanHet omliggende weefsel biedt dit niet de optimale nicheomgeving die nodig is om het angiogene potentieel van getransplanteerde cellen volledig te onderzoeken. Als gevolg daarvan zijn vaten die in de matrixplug zijn gevormd overwegend capillaireachtig en functioneel onmetelijk.
De borstkanker ontwikkelt postnataal, met de meest robuuste groei die zich voordoet tijdens puberteit en zwangerschap. In het pubertalische stadium ondergaat het mammary epithelium een snelle expansie, om het hele dikke vetpadsysteem in te nemen, vergezeld van een efficiënte remodellering van de omliggende vasculaire structuren. Zo biedt de borstklier een uitstekend model voor de studie van angiogenese. Het biedt ruimte, matrix en rijke angiogene stimuli uit het groeiende mammary epithelium en is daarom een ideale transplantatieplaats voor het beoordelen van het angiogene potentieel van exogene cellen. Daarnaast maakt het vetvoet van het mammarium de gevormde exogene vaten mogelijk te integreren met het gastheercirculatiesysteem, waardoor verdere f mogelijk wordt gemaaktUnctionele evaluatie en een voordeel over subcutane transplantatie.
Hoewel in vitro- kweek- en transplantatietesten even doeltreffend zijn om de regeneratie-eigenschappen van een celpopulatie te onderzoeken, is het bekend dat dergelijke analyses plasticiteit kunnen stimuleren als cellen weggenomen worden van hun natieve habitats en veranderingen kunnen worden geïnduceerd wanneer cellen worden losgekoppeld van Hun fysiologische omgeving 7 . Daarom is het verkrijgen van direct in vivo bewijs van celfate de sleutelbenadering om het huidige begrip van het gedrag van endotheelbevolkingen te bevorderen.
Genetische kaartvorming ( dwz in vivo lineage tracing) is essentieel voor de identificatie van VESC's en voor het onderzoek van hun eigenschappen in het lichaamsysteem, omdat het in vivo stamcellen gedrag in zijn fysiologische context kan onthullen en de werkelijke stevigheid kan zijn beoordeeld. Lineage traciNg biedt direct bewijs van de langdurige persistentie ( dwz zelfvernieuwing) van kandidaat-VESC's en hun vermogen om celtypen voor het weefsel van oorsprong te produceren ( dwz differentiatiekracht).
Dit protocol beschrijft een nieuwe transplantatietechniek voor mammary fat pad transplantatie en een lineage traceringsmethode om het vaartuiggeneratievermogen van VESC's te waarnemen. Deze technieken overwinnen tekortkomingen van momenteel beschikbare analyses en bieden een nieuwe manier om de stamcel eigenschappen van VESCs optimaal te evalueren. Deze benaderingen zijn efficiënte hulpmiddelen die kunnen worden gebruikt om het gedrag en de vaatvormende eigenschappen van endotheelbevolkingen te beoordelen, evenals om veranderingen in de vasculaire celsterkte binnen een pathologische omgeving te bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Experimentele procedures werden goedgekeurd door het Animal Care and Use Committee van het Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, Chinese Academie van Wetenschappen onder het goedgekeurde protocol SIBCB-NAF-15-002-S335-003.
1. Isolatie van VESC's uit de Mammary Mammary Gland
- Mammary gland oogst en weefsel spijsvertering.
- Gebruik 8 week oude Actin-GFP rijpe maagdelijke muizen, met gewichten tussen 20 en 25 g, als weefseldonoren.
Opmerking: Cellen die afkomstig zijn van de donor kunnen gemakkelijk worden gevolgd door GFP expressie. - Bereid weefsel-verteringsbasismedium op bestaande uit 5% foetaal bovenserum (FBS), 1% pen / strep en 25 mM HEPES in RPMI1640. Filter het mengsel door een 0,22 μm filter om te steriliseren en voorverwarmen tot 37 ° C in een waterbad.
- Offer de muizen in een CO 2 kamer. Dissecteer het vierde paar inguinale borstklippen door eerst een verticale huid te makenNcision bij de onderste buikmidlijn met behulp van een scalpel (of chirurgische schaar). Schil de huid voorzichtig naar de ene kant om de ingewandenkanker met behulp van tang te openbaren. Verkrijg de vierde inguinale borstklachten van beide kanten en snijd ze in fijne stukken in een 6 cm petrische schotel met behulp van een schaar.
- Meet het totale gewicht van gehakt weefsel en plaats het in een 50 ml buis.
Opmerking: Zorg ervoor dat het resulterende weefselmesje kleiner is dan 1 mm 3 in grootte voor elk stuk. Een typische opbrengst is ongeveer 5000 VESC's per dier.
- Meet het totale gewicht van gehakt weefsel en plaats het in een 50 ml buis.
- Bereid het verteringsbasismedium in een 50 ml afgedekte centrifugebuis met een volume van 10 ml per 1 g weefselgraan. Voeg collageen type 3 toe bij een concentratie van 300 eenheden per 10 ml verteringsbasismedium om de verteringsbuffer te vormen. Meng gelijkmatig en voeg het toe aan het weefselmesje.
- Plaats de 50 ml-centrifugebuis horizontaal op een schommelplatform en stel de snelheid in op 100 rpm en de temperatuur tot 37 ° C. agiterenHet weefselweefsel gedurende 2 uur Controleer en manueel de buis handmatig om de 20 minuten om de juiste spijsvertering te verzekeren.
Opmerking: Het doel van weefselvertering voorafgaand aan FACS is het bereiden van een enkelvoudige oplossing uit vast weefsel. Daarom, bij het einde van de spijsvertering, moet de inhoud een dikke oplossing zijn zonder zichtbare weefselstukken.
- Gebruik 8 week oude Actin-GFP rijpe maagdelijke muizen, met gewichten tussen 20 en 25 g, als weefseldonoren.
- Eén-cel oplossing bereiding.
- Na de spijsvertering, vul de 50 ml centrifugebuis met voorverwarmen, steriele PBS en draai de buis om om gelijkmatig te mengen. Centrifugeer de buis bij 200 xg gedurende 5 minuten om een celpelletje te verkrijgen.
- Verwijder de supernatant en flip de bodem van de buis om de celpelletje los te maken. Voeg in 3 ml rode bloedcel lyseringsbuffer toe (zie de tabel van materialen) en incubeer gedurende 5 minuten in een weefselkweekkap bij kamertemperatuur (RT) om de rode bloedcellen te elimineren.
- Voeg 10 ml steriele PBS toe en draai de buis in om gelijkmatig te mengen. Centrifugeer het weefselgehalte bij 200 xg gedurende 5 minuten en schijfHet supernatant Voeg in 3 ml voorverhitte 0,05% trypsine toe en houd de buis bij 37 ° C gedurende 5 minuten om het resterende weefsel verder te verteren.
- Voeg in 3 ml voorverwarmde IMDM toe en voeg vervolgens 100 μL DNase I oplossing (0,25 mg DNase I verdund in 1 ml PBS) toe. Bewaar de buis bij 37 ° C om de DNA-filamenten op te breken. Verzend het weefselmengsel door een 70 μm celfilter om de celoplossing te verkrijgen. Spoel de zeef tweemaal tweemaal met 2 ml PBS + 5% FBS om de enzymatische spijsvertering te neutraliseren.
- Centrifugeer het celmengsel bij 200 xg gedurende 5 minuten om de cellen te pelletiseren. Verwijder de supernatant en resuspendeer de celpellet in 1 ml PBS + 5% FBS voor antilichamen kleuring.
- FACS-gebaseerde Procr + VESC isolatie.
- Onderwerp het celmengsel dat is verkregen van donor mammierweefsel tot antilichamenkleuring volgens gepubliceerde routineprotocollen 8 .
Opmerking: De volgende antilichamen werden gebruikt: anti-muisBloedafstoting-FITC, anti-muis CD31 (PECAM1) -PECY7, anti-muis CD105-APC (alle gebruikt bij een concentratie van 1 μg / ml), anti-muis CD201 (Procr) biotine (gebruikt bij een concentratie van 2,5 Μg / ml) en streptavidine-v450 (gebruikt bij een concentratie van 0,5 μg / ml).- Na het antilichamen kleuren, vul de cellen op met PBS + 5% FBS en centrifugeer vervolgens gedurende 5 minuten bij 200 g. Gooi de supernatant weg en verwijder de cellen met 1 ml PBS + 5% FBS. Filter door een 40 μm celsuur. Plaats op ijs tot FACS sorteren.
- Ga door naar FACS-gebaseerde sortering om Procr + VESC's te isoleren.
- Analyseer het niet-gestikte monster en elke enkele kleurregeling om de spanning voor elke kleur te bepalen. Bereken de compensatieparameters om automatische fluorescentie of achtergrondkleuring te vermijden. Stel de sjabloon op voor het juiste gaten en sorteren voor de gewenste celpopulaties.
- Om de hiërarchie van FACS-sortering vast te stellen, verwijder eerst afval uitAlle gebeurtenissen en verwijder dan dubleten of kleefcellen clusters door te treden met breedte. Gate-out bloedlijncellen en gebruik dan CD31 + en CD105 + om de endotheliale populaties te definiëren.
Opmerking: Procr + cellen werden geïsoleerd uit CD31 + CD105 + ECs in vergelijking met een FMO-controle. Een representatief FACS analyse-grafiek is weergegeven in figuur 1 . Een FACS-geïsoleerde VESC-populatie moet worden opgehangen in IMDM + 50% FBS en op ijs opgeslagen tot verdere verwerking.
- Onderwerp het celmengsel dat is verkregen van donor mammierweefsel tot antilichamenkleuring volgens gepubliceerde routineprotocollen 8 .
2. Vivo VESC Vessel Formation Assay Met behulp van het Mammary Fat Pad
- Bereid de primaire EC's voor transplantatie op.
- Vul de FACS-gesorteerde cellen op met 10 ml PBS + 5% FBS en centrifugeer vervolgens gedurende 5 minuten bij 200 xg om de cellen naar beneden te vestigen.
- Aspireer de vloeistof zorgvuldig, tel het celnummer met behulp van een hemocytometer en resuspendeer de celpelletje met basismembraanmatrixmengsel (consiSting van 50% basementmembraanmatrix en PBS met 20% FBS, aangevuld met 100 ng / ml rmVEGF en 60 U / ml heparine) om een werkconcentratie van 15.000 cellen / 15 μl te bereiken.
Opmerking: Het keldermembraanmatrixmengsel moet altijd op ijs worden opgeslagen. - Verdun de gesorteerde en getelde cellen serieel om de benodigde invoerconcentraties in een 1,5 ml microtube te bereiken, zodat de uiteindelijke injectievolumes niet in totaal 15 μL bedragen. Voeg 0,1% Trypan blauw toe aan elke buis voor een betere contentvisualisatie tijdens transplantatie. Pipet grondig om te mengen. Bewaar de buizen op ijs tot aan het gebruik.
Opmerking: succesvol vaartuiggeneratie kan worden bereikt met minimaal 100 VESC's.
- Transplanteer de primaire EC's naar het vetpasta.
- Desinfecteer de chirurgische instrumenten en de bocht. Als u dezelfde instrumenten op meerdere dieren gebruikt, kan een sterilisator gebruikt worden voor desinfectie.
- Verdoof 3 week oude BALB / c naakt micE door gebruik te maken van het verdovingsprotocol dat door uw instituut dierenarts en IACUC wordt aanbevolen. Leg elke muis in de rugstand, met zijn rug op de operatietafel. Immobiliseer de ledematen met kleefband.
- Dompel een katoenen pootje in op jodium gebaseerde antiseptische oplossing. Veeg het hele buikgebied van de muis grondig om het huidoppervlak voor de operatie te steriliseren.
- Houd de muis van de buik op de buikhuid met de pincet. Gebruik een chirurgische scalpel om een kleine, 1 cm verticale snede te maken. Maak twee snijdingen ongeveer 0,5 - 1 cm lang, elk naar het achterbeen, om een ondersteboven, Y-vormige incisie te bereiken.
- Gebruik tang en een katoenen poot om de huid zachtjes van de buik af te scheiden en de huid zijwaarts te knijpen om de ingewanden van de ingewanden te openbaren. Plaats de muis onder een stereoscoop en zet de vergroting op 2.0X. Zorg ervoor dat de focus zo wordt aangepast dat het dikke vetpadscherm duidelijk zichtbaar en bediend kan worden.
- Plaats een 27G 1/2 "haakE op ijs om te chillen. Voer vooraf een 1 ml spuit met keldermembraanmatrixmengsel voor om eventuele luchtbellen in het naaldbevestigingsgebied te verwijderen. Pipette 15 μL gemengde oplossing op de kap van de microcentrifugebuis uit en haal vervolgens het volledige volume in de geperforeerde injectiespuit.
- Houd de dikke vetpoot voor het inguikale lymfeklieren vast, gebruik fijne pincetjes en lig het licht op om de injectie makkelijk te injecteren. Steek ongeveer 1/4 van de spuitnaald zachtjes in het vetpaneel.
- Laat de pincet los van de kussenslot om de spuitnaald vast te grijpen en te stabiliseren. Spuit de oplossing langzaam in om vloeistoflek te voorkomen. Houd een paar seconden vast om ervoor te zorgen dat het celmengsel stevig is om het lek te minimaliseren wanneer u de naald trekt.
- Sluit de huidklep met absorbeerbare hechtingen. Zuig de huidklep aan met behulp van een 5-0 non-reactieve monofilament hechting en sluit de wonden met een knoop van een chirurgische stijl, elke knoop benadering0,3 cm apart Alternatief, sluit de huid met wond nietjes.
- Plaats muizen in een aparte kooi voor herstel. Plaats een verwarmingslamp over de kooi om te voorkomen dat de verdovende muizen aan hypothermie lijden. Plaats zacht papier en katoen onderaan de kooi om de muizen warm na de operatie te houden.
- Let op de muizen zorgvuldig totdat alle ontvangers volledig wakker zijn. Voor de volgende paar dagen, gebruik de post-chirurgische pijnstillers voorop bij alle dieren of zoals aangegeven door de dierenarts. Breng antibiotica aan volgens het goedgekeurde dierprotocol indien wondinfectie optreedt. Als de chirurgische wond afgesloten was met wondklieren, verwijder de wondklemmen 10 dagen na de operatie, wanneer de wond volledig is gesloten.
3. Voorbereiding van de hele weefsel voor microscopische waarneming
- Weefsel oogst
- Na 2 tot 4 weken na implantatie bedanken de ontvanger BALB / cNaakte muizen met een intraperitoneale injectie van 2,5% verdovingsmiddel bij een dosering van 0,12 ml per 20 g lichaamsgewicht, zoals in stap 2.2.2.
Opmerking: Positieve vaartengroei kan 2 tot 4 weken na celtransplantatie worden gedetecteerd. - Benoem de ontvanger systeemcirculatie met een staart-ader injectie van isolectin-647 kleurstof bij een dosering van 50 μg / 25 g lichaamsgewicht, geresuspendeerd in 50 μL steriele PBS. Laat een rusttijd van 5 - 10 min. Offer de muizen met behulp van CO 2 .
- Dissecteer het gebied van mammierweefsel waar de cellen aanvankelijk geïnjecteerd werden na stap 2.2.4; Gebruik chirurgische scharen. Gebruik een chirurgisch mesje, knip het weefsel in ongeveer 3 tot 4 mm 3 kubussen in een 6 cm Petri-schotel.
- Na 2 tot 4 weken na implantatie bedanken de ontvanger BALB / cNaakte muizen met een intraperitoneale injectie van 2,5% verdovingsmiddel bij een dosering van 0,12 ml per 20 g lichaamsgewicht, zoals in stap 2.2.2.
- Weefselvertering en voorbereiding op antilichamenkleuring.
- Verdeel de weefselstukken in een 15 ml centrifugebuis gevuld met 10 ml voorverwarmd verteringsbasismedium (stap 1.1.2) aangevuld met collagenase III(300 U per 10 ml).
- Plaats de 15 ml centrifugebuis horizontaal op een schommelplatform met de snelheid ingesteld op 100 rpm en de temperatuur stelt ongeveer 1 uur op 37 ° C om de weefselstructuur op te lossen en overmatig adipocytweefsel te verwijderen.
Opmerking: Adipocyten hebben de neiging om auto-fluorescentie te produceren die kan leiden tot een luidruchtige fluorescerende achtergrond. Aan het einde van de spijsvertering moeten de weefselstukken een zachte, bewolkte uitstraling hebben. De optimale spijsverteringstijd hangt af van de grootte van de gehakte weefselstukken en moet daarom dienovereenkomstig worden aangepast om de beste resultaten te verkrijgen. Aangezien de weefselvasculatuur al is gemerkt met fluorescentie-gelabelde Isolectin, dienen alle volgende procedures te worden uitgevoerd beschermd tegen licht. - Was de weefselstukken met PBS bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Bevestig het gehele bodemweefsel door de stukken zorgvuldig in een 6 cm Petri-schotel halfvol met 4% PFA (pH 7,2 - 7,4) te plaatsen om de fluorescentie te behouden. Plaats de petrischotelOp een schommelplatform en roer het weefsel gedurende 30 minuten bij RT.
Opmerking: PFA is kankerverwekkend en moet met voorzichtigheid worden behandeld. - Verwijder de resterende PFA en doe het vaste weefsel drie keer met een volledige opbergwasbuffer (0,1% tween in PBS), met een interval van 10 minuten tussen elke was.
- Gehele bergweefsel antilichamen kleuring.
- Verdun het primaire antilichaam in antilichaamkleuringbuffer in een 2 ml centrifugebuis. Incubeer het weefsel met het primaire antilichaam 's nachts bij 4 ° C.
Opmerking: Rat anti-CD31 (concentratie: 10 μg / ml) of rat anti-VE-Cadherin (CD144 / Cdh5; concentratie: 2,5 μg / ml) werden gebruikt als de primaire antilichamen. Zowel CD31 als VE-Cadherin zijn celoppervlakmarkers gebruikt om endothelium te herkennen. 5x antilichaamkleuringbuffer wordt bereid met 500 mM maleïnezuur, pH 7,5; 750 mM NaCl; En 0,5% (v / v) tween oplossen in PBS. Voeg alleen een geschikt serumvolume (5%) toe bij het bereiden van verse 1x werkoplossing9 . - Verwijder de antilichaamkleuringbuffer en wasser het gehele vezelweefsel driemaal met wasbuffer, met een interval van 10 minuten. Incubeer het weefsel met secundair antilichaam (zie de Tabel van Materialen ) plus DAPI bij RT gedurende 4 uur op een schommelplatform of overnacht bij 4 ° C.
Opmerking: Gebruik DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindool) bij een uiteindelijke concentratie van 5 μg / ml om de kernen te visualiseren. - Was de hele bergweefsel met wasbuffer 3 keer per 10 minuten elk. Incubeer de weefselstukken in 80% glycerol of 80% sucrose gedurende de nacht om het weefsel te dehydreren voor een beter behoud.
- Plaats de afzonderlijke weefselstukken op een glazen glijbaan en verwijder de buitensporige uitdrogingsbuffer. Bedek het weefsel met montagemedium, plaats een deklaag en druk het weefsel zachtjes om het te plaatsen.
- Voer confocal microscopische beeldverwerving uit. Voor volledige bergkliere, koop beelden met een 40X met NA = 1.3 olie objectieve. Verkrijg de tegelschalen van Z-stapels bij een optische sectie resolutie van 1.024 x 1.024 en een laag scheiding van 1,0 - 1,2 μm.
Opmerking: Om het juiste fluorescentie-lichtsignaal vast te leggen, moet de filterbundel splitser worden ingesteld op triple dichroic (TD) 488/553/638, met de winstinstelling bij PMT Gain 600-800. De volgende excitatie- / emissiebronnen dienen te worden gebruikt: mGFP, met excitatie- / emissie maxima van 488/509 nm; MTomato met excitatie- / emissie maxima van 532/588 nm; Alexa-647, met excitatie- / emissie maxima van 594/665; En DAPI, met excitatie- / emissie maxima van 350/470.
- Verdun het primaire antilichaam in antilichaamkleuringbuffer in een 2 ml centrifugebuis. Incubeer het weefsel met het primaire antilichaam 's nachts bij 4 ° C.
4. Lineage Tracing met behulp van een genetisch gemodificeerd muis model
- Ontdek Procr + VESCs met behulp van het muismodel.
- Gebruik de Procr Creert2-IRES-tdTomato / + (aangeduid als Procr CreERT2 ) knock-in muisstam .
Opmerking: In dit muismodel, een Creert2-IRES-tdTomatocassette Procr 11 .- Cross Procr CreERT2 muizen met de Rosa26 mTtomatomGFP (aangeduid als R26 mTmG ) reporter stam om het lot van endogene Procr + EC's in vivo 11 te detecteren. Identificeer alle gelabelde endogene Procr + EC's en hun nakomelingen met behulp van GFP-expressie.
- Administreer tamoxifenoplossing 11 (10 mg tamoxifen opgelost in 1 ml pindaolie + 10% ethanol om een voorraadoplossing van 10 mg / ml op te leveren) intraperitoneaal met een dosis van 4 mg / 25 g lichaamsgewicht tijdens de pubertalentijd (5 weken Oud) om het ontwikkelingsgehalte van Procr + EC's te volgen.
- Analyseer de kloonvormende efficiëntie van gelabelde cellen door middel van immunotaining met volledige montage volgens de voorbereidingsstappen die zijn beschreven in stap 3. Verkrijg mammariumvetpadsjes van behandelde muizen, zowel na korte termijn (2 dagen) en verlengde tijdsperioden (tot 10 maanden). Zie figuur 3 .
- Gebruik de Procr Creert2-IRES-tdTomato / + (aangeduid als Procr CreERT2 ) knock-in muisstam .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mammary VESCs Isolatie:
Om de endotheelpopulatie te isoleren voor de daaropvolgende transplantatietest, volwassen (8 weken oud), werden maagklippen voor maagmuizen geoogst als donormateriaal. Endothelcellen werden geïsoleerd met behulp van een antilichaam gebaseerde cel sorteringstechniek. Representatieve grafieken van de FACS-analyse van de VESC bevolking in 8 weken oude C57BL / 6 borstklier EC worden getoond in Figuur 1 (Figuur aangepast van Yu et al. 8, met toestemming).
Mammary Fat Pad Transplantation:
Het dikke vetpadsysteem biedt een ideale plek voor de studie van angiogenese. Na FACS-gebaseerde isolatie werden Procr + EC's gemengd met 0,5% keldermembraanmatrix en 0,1% Trypan blue indicator en werden vervolgens transplanningTed aan het lege vetpaneel van 3 weken oude SCID ontvangers. Tijdens de puberteit creëert het dikke vetpadsje een angiogene omgeving, waardoor de remodeling van de vaatwervel wordt bevorderd in lijn met de uitbreiding van de epithelium van de borst. Als gevolg hiervan werden getransplanteerde Procr + EC's (GFP + ) in de grote vaten van de gastheer opgenomen ( Figuur 2B , pijlen) en ook gevormde secundaire en tertiaire GFP + -takken ( Figuur 2B , pijlpunten). Hoewel getransplanteerde Procr + EC's ook vaten kunnen genereren in een matrixstopassay (ingevoegd onder de flankhuid), zien de gevormde vaten alleen capillairachtig ( figuur 2A ; figuur aangepast van Yu et al. 8 , met toestemming).
Functionaliteit van de Vaartuigen gevormd door Procr + VESCs:
Om te onderzoeken of de GFP + vEssels in vetvetpadsjes maken deel uit van de functionele circulatoire vasculatuur. Isolectine is voor intraveneuze toediening toegediend via de intraveneuze injectie. De GFP + vaten waren isolectine +, wat aangeeft dat de gevormde vaten verlicht en verbonden zijn met de gastheervasculatuur ( Figuur 2B ; figuur aangepast van Yu et al. 8 , met toestemming).
Mammary VESC Lineage Tracing Met behulp van de Procr CreERT2 ; Rosa26 mTmG Muis Model:
Procr Creert2 ; Rosa26 mTmG- muizen werden gebruikt voor het traceren van Procr + VESC's in vivo ( Figuur 3A ). Om te onderzoeken hoe Procr + VESC's bijdragen tot de robuuste angiogenese en vasculaire remodeling tijdens de ontwikkeling van de borstkanker puberteit, Procr CreERT2 ; Rosa26 mTmG waren toedieningD met tamoxifen om GFP expressie in de Procr + endotheliale populatie te induceren. De dikke vetpads van geneesmiddelen behandeld Procr Creert2 ; Rosa26 mTmG- muizen werden zowel op korte termijn (2 dagen na injectie, Figuur 3B ) en op lange termijn geoogst (tot 10 maanden na injectie; Figuur 3C -F; figuur aangepast van Yu et al. 8 , met toestemming). De full-mount voorbereiding werd uitgevoerd om het tracing resultaat te visualiseren. De vasculaire endotheliumidentiteit kan worden gevalideerd door kleuring met endotheliale oppervlakte markering VE-Cadherin (Cdh5; Figuur 3B , rechts beeld).
Figuur 1: Analyse van VESC's in Mammary Mammary Gland. FACS analyse van Procr expressie in 8 weken oude C57BL / 6 borstkanker ECs. 8 weken oud vIrgin C67BL / 6 vrouwelijke muizen werden gebruikt voor het verzamelen van borstklieren. Nadat de celmonsters werden bereid, werden niet-gekleurde monsters en elke enkele kleurcontrole geanalyseerd om de spanning voor elke kleur te bepalen. De compensatieparameters werden berekend om automatische fluorescentie of achtergrondkleuring te vermijden. Een sjabloon werd opgericht voor een goede gating en voor de gewenste celpopulaties sorteren. Om de hiërarchie van FACS-sortering vast te stellen, werden afval uit alle gebeurtenissen geëlimineerd en werden doubletten of kleefcellenclusters weggegooid. Lineage-cellen werden uitgezet, en CD31 en CD105 werden gebruikt om de endotheelbevolkingen te definiëren. Procr + -cellen werden geïsoleerd uit CD31 + CD105 + EC's in vergelijking met FMO-controle. Dit cijfer is gewijzigd van Yu et al. 8 , met toestemming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: VESC Mammary Fat Pad Transplantation Assay. ( A ) Een vaartuig gevormd uit Procr + ECs binnen een kelder membraan matrix stekker subcutaan onder de flank huid. ( B ) Confocaal beeld van een ontvanger, mammary fat pad, dat de integratie en de bijdrage van getransplanteerde Procr + ECs (GFP +) vertoont om gastvasculatuur te hosten. EC's werden tegengesteld met CD31. ( C ) Intraveneuze injectie in ontvanger muizen met isolectine toonde aan dat de uitgroeiingen verlichte vaten vormden. Schaalbalk, 50 μm. Beelden werden verkregen met behulp van een 40X NA 1.3 olie doelstelling. Tegelschalen van Z-stapels werden verkregen bij een optische sectie resolutie van 1.024 x 1.024, en elke laag was 1,0-1,2 μm uit elkaar. Om het juiste fluorescentie-lichtsignaal op te vangen, werd de filterbundel splitter ingesteld op TD 488/553/638, waarbij de gAin instelling bij PMT Gain 600 - 800. De volgende excitatie / emissie bronnen werden gebruikt: mGFP, met excitatie / emissie maxima van 488/509 nm; MTomato, met excitatie- / emissie maxima van 532/588 nm; Alexa-647, met excitatie- / emissie maxima van 594/665; En DAPI, met excitatie- / emissie maxima van 350/470. Dit cijfer is gewijzigd van Yu et al. 8 , met toestemming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Lineage Tracing van Procr + ECs Demonstreert hun bijdrage aan EC Clonal Expansion tijdens de ontwikkeling. ( A ) Illustratie van de lineage tracing strategie met behulp van Procr CreERT2 ; Rosa26 mTmG lijn (linker paneel). experimenteelSetup gebruikt op korte termijn (2 dagen) en langdurig (7 dagen tot 10 maanden), zoals aangegeven (rechts paneel). ( BF ) Whole-mount confocal beeldvorming van de vasculatuur van de borstkanker na verschillende lengte van traceerperiodes, waarbij de initiële locatie van gelabelde Procr + EC's en hun bijdrage aan de bloedvasculatuur bij verschillende traceerstadia wordt aangegeven. Schaalbalk = 50 μm. Dit cijfer is gewijzigd van Yu et al. 8 , met toestemming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Angiogenese analyses vormen een goede experimentele benadering om vasculaire dynamiek te bestuderen. Muis-retinale vasculatuur, die postnataal ontwikkelt, blijkt een aantrekkelijk model te zijn om angiogenese 12 te bestuderen. Ondanks het feit dat het relatief toegankelijk is, is de feitelijke manipulatie binnen het retina-vaatstelsel nogal moeilijk. Tot nu toe is de best omschreven in vivo transplantatie de proefanalyse uitgevoerd, die cellen in een matrix van de basismembraan en chirurgische implantaten / injecties subcutaan in het flankgebied van een ontvangermuis omsluit. Deze angiogenese-analyse is effectief bij het testen van het regeneratieve potentieel en vaatvormend vermogen van ingebedde cellen. Aangezien de plaats van de geïmplanteerde matrixplug een relatief geïsoleerde omgeving voor de cellen creëert, biedt het echter geen optimale fysiologische niche. Onlangs is ook een nieuw long-angiogenese model ontwikkeld door een fibrin patch op de surfa aan te brengenCe plaats van de muis long 13 . De manipulaties vormen echter nog een ander risico, omdat deze techniek invasieve in de borstholte van de muis werkt, waardoor het moeilijk is om te gebruiken in een meer algemene analyse-instelling.
In de hierin beschreven angiogenese-analyse wordt een klein volume celmengsel getransplanteerd in het vetpaneel van de borstkanker, die ruimte, matrix en rijke angiogene stimuli gedurende de puberteit verschaft. Dit maakt het mogelijk dat de gegenereerde vaten voldoen aan en integreren in remodellerende gastvasculatuur, waardoor verdere functionele evaluatie mogelijk is, evenals een voordeel voorstellen boven de subcutane plug-analyse. Ook is het dikke vetpadsje buiten de peritoneale holte, waardoor het een zeer toegankelijke plaats is. De werking op het vetpasta van de mammoet introduceert beperkte nood aan het ontvanger dier, waarbij de invasieve chirurgische ingrepen die betrokken zijn bij retinale en longgebaseerde analyses vermijden.
Bloedvasculatuur witHindel een orgaan vaak tussen weefselcomponenten om de vasculaire dekking te maximaliseren, zodat de levering van bloedzuurstof en materiaaloverdracht geoptimaliseerd kan worden. Om deze reden onderscheidt de conventionele doorsnede van het weefsel de buisvormige structuur van zijn vaten. Analyse op vasculaire eigenschappen wordt het beste uitgevoerd wanneer de vaten kunnen worden behouden en blijven intact. De full-mount voorbereiding van een weefsel kan grotendeels het geheel van de vasculaire architectuur bewaren binnen. Deze methode laat niet alleen toezicht op de authentieke ruimtelijke verdeling van het bloedvat binnen een orgaan, maar ook de relatie met andere weefselcomponenten.
De homeostase van een stamcel bevattende weefsel wordt gehandhaafd door de generatie en verlies van celmassa te compenseren. Stamcellen binnen het specifieke bewooningsorgaan worden vaak beschut en in nauw contact met de omliggende weefselomgeving, aangeduid als de stamcel niche. Daarom, stuSterfanalyse van volwassen stamcellenweefsel dient bij voorkeur in een intacte fysiologische context te worden uitgevoerd. Transplantatie-analyses kunnen een middel bieden om het celpotentieel te beoordelen, terwijl de lijn-tracing-techniek de exploratie van echt celfate in de natuurlijke habitat mogelijk maakt. In de afgelopen jaren is in vivo lineage tracing een krachtige techniek geworden voor de experimentele evaluatie van stammeigenschappen. Deze strategie is gebruikt om stamcellen van weefselrest en hun nakomelingen in meerdere weefsels te identificeren, waaronder de darm 10 , 14 , haarzakjes 15 , maag 16 en buikpijn 17 . De lijnspoormethode berust grotendeels op de genetische markering van stamcellen en wordt geïnitieerd in bepaalde populaties. Daarom is het moeilijk om de mogelijkheid uit te sluiten dat de werkelijke stijfheid in een nog kleinere subpopulatie binnen de gelabelde cellen wordt gevonden. Het is daarom van essentieel belang om de cel-van-oorsprong van opgespoorde klonen nauwkeurig te plannen en de traceer efficiënties over de tijd te kwantitatief te meten. Op die manier kan de zelfvernieuwende capaciteit van de gemarkeerde populatie worden aangepakt.
De beschreven angiogenese-analyse kan worden aangepast voor specifieke onderzoeksdoeleinden: het kan niet alleen worden gebruikt om het vermogen van het vaartuiggeneratie van de endotheliale populaties van belang te testen, maar ook het effect van angiogene factoren op gelokaliseerde vatenherhodeling te evalueren. Aangezien de borstklier dynamische morfologische veranderingen ondergaan tijdens verschillende ontwikkelingsfasen ( bijv. Puberteit, estruscyclus en zwangerschap) moet men rekening houden met het effect van systemische veranderingen, zoals hormonale fluctuaties tijdens de interpretatie van de resultaten. De kritische stappen in deze analyse omvatten primaire endotheliale celisolatie. Om de levensvatbare cellen optimaal te verkrijgen voor transplantatie, moeten procedures voor FACS-isolatie bE voorzichtig uitgevoerd Voorzichtig zijn met het voorkomen van harde hantering tijdens de celpreparaten, zoals het verwijderen van cellen en het verwijderen van cellen. Een andere kritische stap is de injectie van de celmengsel in het vetpatroon. Tijdens het injecteren van de vetpoot is het belangrijk ervoor te zorgen dat het celmengsel precies in het vetpaneel wordt gedeponeerd. Dit kan lastig zijn als de naaldinvoeging te diep / ondiep is of als het totale volume de aanbevolen dosering overschrijdt.
Dit protocol bevat een reeks experimentele methodes die bijgedragen hebben bij de identificatie van een endotheliale stamcellenpopulatie. Door deze technieken was het mogelijk om stamcel eigenschappen door transplantatie te evalueren, evenals hun gedrag te volgen en in acht te nemen onder fysiologische processen in vivo . Deze benaderingen zijn efficiënte hulpmiddelen die kunnen worden toegepast op meerdere disciplines, waaronder studies van endotheel populaties in tumoromgevingen en veranderingen in hun celkracht. ikIn het bijzonder zijn de dikke padtransplantatie en de volledige bergpreparatie reproduceerbare en krachtige methoden die kunnen helpen bij toekomstige inspanningen om verschillende aspecten van vasculaire biologie te onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Nationale Natuurwetenschappenstichting van China (31530045 en 31371500 naar YAZ, 31401245 naar QCY), het ministerie van Wetenschap en Technologie van China (2014CB964800), de Chinese Academie van Wetenschappen (XDB19000000 tot YAZ) en de Chinese Samenleving van Celbiologie (Early Career Fellowship to QCY).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-Ethylene Diamine Tetraacetic Acid(EDTA) (1x) | Gibco (Life Technologies) | 25300-062 | 0.05% Trypsin |
| 0.22 µm Filter Unit | Merck Millipore Ltd. | SLGP033RB | 0.22 µm Filter |
| 2-Methylbutanol-2, ReagentPlus | Sigma-Aldrich | 24, 048-6 | Tert Amyl Alcohol |
| 222, Tribromethanol | Sigma-Aldrich | T48402-25g | 222, Tribromethanol |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI) | Invitrogen | D1306 | DAPI |
| 70 µm Cell Strainer | BD FAL | 352350 | 70 µm Cell Strainer |
| Adhesion Microscope Slides | CITOGLAS | 188105 | Glass slides |
| Anti-mouse CD105 APC | eBioscience | 17-1051-82, clone MJ7/18 | for FACS analusis use at 1 µg/mL |
| Anti-mouse CD201 Biotin | eBioscience | 13-2012-82 | for FACS analusis use at 2.5 µg/mL |
| Anti-mouse CD31 PE-Cyanine 7 | eBioscience | 25-0311-82, clone 390 | for FACS analusis use at 1 µg/mL |
| BD FACSJazz Cell Sorter | BD Biosciences | 655489 | FACS |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 100190332 | BSA |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Centrifuge |
| Collagenase type 3 | Worthington-Biochem | #LS004183 | Collagenase III |
| Confocal microscopy | Leica | sp8 | Confocal |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D2463-5VL | Dnase I |
| Donkey anti-Rat Cy3 | Jackson ImmunResearch | 712-165-150 | Secondary antibody, use at 0.5 µg/mL |
| Dumont Forceps | WPI | 500342 | Froceps |
| Dumont Forceps - Micro-Blunted Tips | FST | 11253-20 | Forceps |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | FBS |
| FITC Ms CD3/Gr1/CD11b/CD45R(B220)/Ter-119 | BioLegend | 78022 | Blood lineage cocktail for FACS analysis, use at 25 µL per test |
| Glycerol | Sigma | G6279 | Glycerol |
| Iscov's Modified Dulbecco's Medium | Gibco (Life Technologies) | 12440-053 | IMDM |
| Isolectin GS-IB4 from Griffonia Simplicifolia, Alexa Fluora 647 | Invitrogen | Z32450 | Isolectin-647 |
| Matrigel Matrix (growth factor reduced) | BD | 356231 | Matrigel |
| Mouse strain (Actin-GFP) | Jax Laboratories | 3773 | Actin-GFP |
| Mouse strain (C57BL/6) | SLAC | C57BL/6 | C57BL/6 |
| Mouse strain (BALB/c nude) | SLAC | BALB/c nude | Nude mice |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | PFA |
| Penicilin Streptomycin | Gibco (Life Technologies) | 5140-122 | Pen/Strep |
| Phosphate Buffered Saline (pH7.2) 1x | Gibco (Life Technologies) | c20012500BT | PBS |
| PRIM1640 | Gibco (Life Technologies) | c11875500CP | PRIM1640 |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | Mounting Medium |
| Rat anti CD144 | BD Biosciences | 550548 | for whole-mount analysis, anti-VE-Cadherin / Cdh5 antibdy for endothelial tight junction, use at 2.5 µg/mL |
| Rat anti CD31-biotin | BD Biosciences | 553371 | for whole-mount analusis, anti-CD31/PECAM1 antibody for endothelial surface adhesion molecule, use at 10 µg/mL |
| Red Cell Lysis Buffer | Sigma | R7767-100ML | Red blood cell lysing buffer |
| Straight/Sharp-Blunt/10cm | FST | 14028-10 | Fine Scissors |
| Streptavidin eFluor 450 | eBioscience | 48-4317-82 | for FACS analysis use at 0.5 µg/mL |
| Tamoxifen | Sigma | 101551374 | TAM |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-250ML | TritonX |
| Wax Coated Braided Silk (Size 5-0 USP (1 Metric), 18 inches (45 cm) BLACK on C-1 Needle) | COVIDIEN | S1173 | Suture |
| Sterile Disposable Scaplels | Swann Morton | #10 | Scalpel |
| Betadine | Yifeng Medical | 20160101 | Antiseptic solution |
References
- Thomas, E. D., Lochte, H. L., Lu, W. C., Ferrebee, J. W. Intravenous infusion of bone marrow in patients receiving radiation and chemotherapy. N Engl J Med. 257 (11), 491-496 (1957).
- Chao, M. P., Seita, J., Weissman, I. L. Establishment of a normal hematopoietic and leukemia stem cell hierarchy. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 73, 439-449 (2008).
- Bompais, H., et al. Human endothelial cells derived from circulating progenitors display specific functional properties compared with mature vessel wall endothelial cells. Blood. 103 (7), 2577-2584 (2004).
- Fang, S., Wei, J., Pentinmikko, N., Leinonen, H., Salven, P. Generation of functional blood vessels from a single c-kit+ adult vascular endothelial stem cell. PLoS Biol. 10 (10), e1001407 (2012).
- Naito, H., Kidoya, H., Sakimoto, S., Wakabayashi, T., Takakura, N. Identification and characterization of a resident vascular stem/progenitor cell population in preexisting blood vessels. EMBO J. 31 (4), 842-855 (2012).
- Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).
- Snippert, H. J., Clevers, H. Tracking adult stem cells. Embo Rep. 12 (2), 113-122 (2011).
- Yu, Q. C., Song, W., Wang, D., Zeng, Y. A. Identification of blood vascular endothelial stem cells by the expression of protein C receptor. Cell Res. 26 (10), 1079-1098 (2016).
- Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland. Nature. 506, 322-327 (2014).
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449, 1003-1007 (2007).
- Wang, D. S., et al. Identification of multipotent mammary stemcells by protein C receptor expression. Nature. 517, 81-U201 (2015).
- Stahl, A., et al. The Mouse Retina as an Angiogenesis Model. Invest Ophth Vis Sci. 51 (6), 2813-2826 (2010).
- Mammoto, T., Mammoto, A. Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis. J. Vis. Exp. (94), e52012 (2014).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21 (1), 70-71 (1999).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Solar, M., et al. Pancreatic exocrine duct cells give rise to insulin-producing beta cells during embryogenesis but not after birth. Dev Cell. 17 (6), 849-860 (2009).
