Utvikling av HiPSC-avlede serumfrie embryoidorganer for interrogasjon av 3-D stamcellerkulturer ved bruk av fysiologisk relevante analyser
Summary
Her rapporterer vi en protokoll for å utvikle et tredimensjonalt (3-D) system fra humane induserte pluripotente stamceller (hiPSCs) som kalles serumfri embryoidlegemet (SFEB). Denne 3-D modellen kan brukes som en organotypisk skivekultur for å modellere human kortikal utvikling og for fysiologisk undersøkelse av utvikling av nevrale kretser.
Abstract
Selv om en rekke in vitro sykdomsmodeller har blitt utviklet ved hjelp av hiPSCs, er en begrensning at disse todimensjonale (2-D) systemene ikke representerer den underliggende cytoarkitektur og funksjonelle kompleksitet av de berørte individer som bærer mistenkte sykdomsvarianter. Konvensjonelle 2-D-modeller forblir ufullstendige representasjoner av in vivo- lignende strukturer og tar ikke tilstrekkelig fange av hjernens kompleksitet. Dermed er det et voksende behov for flere 3-D hiPSC-baserte modeller som bedre kan rekapitulere de cellulære interaksjonene og funksjonene sett i et in vivo system.
Her rapporterer vi en protokoll for å utvikle et 3-D system fra utifferentierte hiPSCs basert på serumfri embryoid kroppen (SFEB). Denne 3-D modellen speiler aspekter av en utviklende ventralisert neocortex og tillater studier i funksjoner integrert i levende neurale celler og intakt vev som migrasjon, tilkobling, kommunikasjon og matteuration. Nærmere bestemt demonstrerer vi at SFEBene som bruker protokollen vår kan bli forhørt ved hjelp av fysiologisk relevante og høyinnholdige cellebaserte analyser som kalsiumbilding og multi-elektrode array (MEA) opptak uten krysoseksjonering. I tilfelle MEA-opptak viser vi at SFEBer øker både spikeaktivitet og nettverksnivåbarbaring under langvarig dyrking. Denne SFEB-protokollen gir et robust og skalerbart system for studier av utvikling av nettverksdannelse i en 3-D-modell som fanger aspekter av tidlig kortikal utvikling.
Introduction
Vi har tidligere rapportert et 3-D-modellsystem, generert fra pasient-avledede, menneskeskapte pluripotente stamceller (hiPSCs) som rekapitulerer noen aspekter av tidlig cortical network development 1 . Denne 3-D-modellen, en serumfri embryoidkropp (SFEB), forbedrer seg på tidligere enkle aggregering hiPSC-modeller 2 , 3 . En voksende arbeidsgruppe avslører at 3-D-strukturer som våre SFEBer, omtrentlige aspekter ved nevral utvikling som vanligvis observeres in vivo og på et tidligere tidspunkt enn observert i 2-D-dimensjonale (2-D) / monolayer hiPSC-modeller 4 , 5 . Første studier har vært fokusert på den selvorganiserende kompleksiteten til 3-D-legemer uten å demonstrere deres fysiologiske kompleksitet 2 .
Protokollen beskrevet her er blitt brukt på utifferentierte hiPSCer avledet fra fibroblaster og Peronale blodmononukleære celler (PBMCs). Disse cellene opprettholdes på y-bestrålede musembryonmatere (MEFer). Disse hiPSC koloniene rengjøres manuelt av spontant differentierte celler, enzymatisk høstet og resuspendert i medium inneholdende Rho-Kinase inhibitor Y-27632 (ROCKi). Uifferensierte hiPSCs blir utsatt for dissosiasjon og sentrifugering før de overføres til V-bunnplater med 96 brønner med lav vedheft. Etter plating, initieres nerveinduksjon ved bruk av dobbel SMAD-hemning (SB431542 og LDN193189 sammen med dickkopf 1 (DKK-1)) for å drive en anterior-frontal forebrain neuronal-fate lineage 6 . Etter 14 dager overføres SFEBene til cellekulturinnsatser i en 6-brønnplate. Når de overføres, begynner de runde SFEBene å spre og tynne, samtidig som de opprettholder lokale nettverksforbindelser som ofte observeres i hippocampale organotypiske skivekulturpreparater ved bruk av lignende cellekulturinnsatser 1 ,Ss = "xref"> 7.
Bruken av en SFEB-basert 3-D-plattform i dette formatet er egnet til effektiv produksjon av kortikale nettverk som kan bli forhørt ved bruk av cellebaserte fysiologiske analyser som kalsiumbilleddannelse eller elektrofysiologiske analyser som enkeltcelleopptak eller multielektrodearray (MEA ) 1 . Selv om 3-D-systemer bærer markørene for tidlig kortikal utvikling, har andre studier vist at disse 3-D-legemene kan kreve lengre inkubasjonstider for å tillate det iboende langsommere tempoet i menneskelig vevsutvikling 8 . Denne SFEB-protokollen genererer med held 3-D SFEBer fra utifferentierte hiPSCs som fanger aspekter av tidlig utvikling av cortex.
SFEBs mulighet til å modellere nettverksavvik i nevrologiske lidelser er en styrke i dette systemet. HiPSCene avledet fra pasientvev kan dyrkes til celler i nervesystemet som er utsatt for rumpaAys relatert til cellebiologi så vel som samtidig genuttrykk. Humane iPSCs blir brukt til å fastslå den genetiske profilen til store grupper av individer med varierende nevrologiske lidelser med komplekse etiologier som autismespektrumforstyrrelse (ASD), schizofreni 9 , Rett syndrom 10 og Alzheimers sykdom 11 , 12 . Inntil nylig var iPSC-modeller typisk monolagspreparater som, mens de var dyktige i evaluering av molekylære interaksjoner, var utilstrekkelige i dechifrering av de komplekse cellulære interaksjonene som ble sett in vivo . Dyrmodeller har vært standard erstatning for å gjenskape hele orgelplattformen. Disse dyremodellene plages av dårlig oversettelse av funn og har begrenset evne til å kopiere menneskelige genetiske profiler identifisert ved store genetiske screeningsstudier. Dermed legger utviklingen av 3-D-systemer fra iPSCs til et nødvendig lag av kompleksitet hos menneskerSykdomsmodellering 13 , 14 . Det neste trinnet for 3D hiPSC-plattformer er å imøtekomme kravene til stor skala ved høy gjennomputs screening ved hjelp av cellebaserte analyser 15 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen beskrevet her gir betingelsene for å differensiere en hiPSC-kilde til en 3-D-struktur som rekapitulerer et tidlig utviklingsstadium av den frontale cortex. Denne prosedyren gir strukturer som kan bli forhørt for elektrofysiologi mens de også er mottagelige for mikroskopi. Den endelige morfologien til SFEB ligner den av organotype hjerneskivekulturer og gir høy kvalitet detaljert konfokal bildebehandling. Denne protokollen kan vellykket generere SFEBer fra både fibroblast og perifert blodmononukleært ce…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Elizabeth Benevides for korrekturlesing av artikkelen. Vi takker Drs. John Hussman og Gene Blatt for deres nyttige diskusjoner og kommentarer.
Materials
| SFEB Neuronal Differentiation Cell culture Media. Reagents. Components | |||
| STEMdiff Neural Induction Medium (hiPSC Media) | STEMCELL Technologies | 0-5835 | 250ml |
| PluriQ ES-DMEM Medium (MEF Media) | GlobalStem | GSM-2001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM1 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1X), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 385ml |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | 20% 100ml |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5ml |
| Glutamax 200mM | Invitrogen | 35050061 | 5ml |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 10 mM (100X), liquid | Invitrogen | 11140050 | 5ml |
| 2-Mercaptoethanol (1,000X), liquid | Invitrogen | 21985023 | 900ul |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM2 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1X), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 500ml |
| Glutamax 200mM | Invitrogen | 35050061 | 5ml |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5ml |
| N-2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502048 | 10ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM3 Media Components | |||
| NEUROBASAL Medium (1X), liquid | Invitrogen | 21103049 | 500ml |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A (50X), liquid | Invitrogen | 12587010 | 10ml |
| Glutamax 200mM | Invitrogen | 35050061 | 5ml |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small Molecules | |||
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | 2uM |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010-10 | 1:1000 (10uM) |
| Dorsomorphin | Stemgent | 04-0024 | 1uM |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074-10 | 250nM |
| Y27632 (ROCKi) | Stemgent | 04-0012-10 | 10uM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Recombinant Protiens | |||
| DKK-1 | Peprotech | 120-30 | 200ng/ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Components/Materials | |||
| Cell Culture inserts 0.4uM, 30mm Diameter | Millicell | PICM0RG50 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | GlobalStem | GSC-6301G | |
| 96 well V bottom w/Lids | Evergreen | 222-8031-01V | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | ThermoFisher | A1110501 | |
| TritonX-100 | ThermoFisher | 85111 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | 500 mL |
| Normal Donkey Serum | Jackson Labs | 017-000-121 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | ThermoFisher | 11415114 | 500 mL |
| DRAQ5 (Nuclear Marker) | ThermoFisher | 65-0880-96 | |
| MEA Plates | Axion Biosystems | M768-GL1-30Pt200 | |
| 6 well flat bottom | Falcon | 353046 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Nestin | Millipore | MAB5326 | |
| Brn-2 | Protein tech | 14596-1-AP | |
| VGLUT1 | Synaptic Systems | 135 303 | |
| Pax6 | abcam | ab5790 | |
| Calretinin | abcam | ab702 | |
| Calbindin | abcam | ab11426 | |
| CoupTFII | R&D Systems | PPH714700 | |
| Nkx 2.1 | abcam | ab12650 | |
| Tuj1 | abcam | ab41489 | |
| Reelin | Millipore | MAB5364 | |
| Tbr1 | Millipore | MAB2261 | |
| NFH | Dako | M0762 |
References
- Nestor, M. W., et al. Differentiation of serum-free embryoid bodies from human induced pluripotent stem cells into networks. Stem Cell Res. 10 (3), 454-463 (2013).
- Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).
- Sasai, Y. Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture. Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).
- Song, S., Abbott, L. F. Cortical development and remapping through spike timing-dependent plasticity. Neuron. 3 (2), 339-350 (2001).
- Pre, D., et al. A time course analysis of the electrophysiological properties of neurons differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). PLoS One. 9 (7), e103418 (2014).
- Sproul, A. A., et al. Characterization and molecular profiling of PSEN1 familial Alzheimer’s disease iPSC-derived neural progenitors. PLoS One. 9 (1), e84547 (2014).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Nicholas, C. R., et al. Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development. Cell Stem Cell. 12 (5), 573-586 (2013).
- Cukier, H. N., et al. Exome sequencing of extended families with autism reveals genes shared across neurodevelopmental and neuropsychiatric disorders. Mol Autism. 5 (1), (2014).
- Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
- Choi, S. H., Tanzi, R. E. iPSCs to the rescue in Alzheimer’s research. Cell Stem Cell. 10 (3), 235-236 (2012).
- Yagi, T., et al. Modeling familial Alzheimer’s disease with induced pluripotent stem cells. Hum Mol Genet. 20 (23), 4530-4539 (2011).
- Mariani, J., et al. Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (31), 12770-12775 (2012).
- Quadrato, G., Brown, J., Arlotta, P. The promises and challenges of human brain organoids as models of neuropsychiatric disease. Nat Med. 22 (11), 1220-1228 (2016).
- Nestor, M. W., et al. Human Inducible Pluripotent Stem Cells and Autism Spectrum Disorder: Emerging Technologies. Autism Res. 9 (5), 513-535 (2016).
- Nestor, M. W., et al. Characterization of a subpopulation of developing cortical interneurons from human iPSCs within serum-free embryoid bodies. Am J Physiol Cell Physiol. 308 (3), C209-C219 (2015).
- Nestor, M. W., Hoffman, D. A. Differential cycling rates of Kv4.2 channels in proximal and distal dendrites of hippocampal CA1 pyramidal neurons. Hippocampus. 22 (5), 969-980 (2012).
- Nestor, M. W., Mok, L. P., Tulapurkar, M. E., Thompson, S. M. Plasticity of neuron-glial interactions mediated by astrocytic EphARs. J Neurosci. 27 (47), 12817-12828 (2007).
- Woodard, C. M., Campos, B. A., Kuo, S. H., Nirenberg, M. J., Nestor, M. W., Zimmer, M., Mosharov, E. V., Sulzer, D., Zhou, H., Paull, D., Clark, L., Schadt, E. E., Sardi, S. P., Rubin, L., Eggan, K., Brock, M., Lipnick, S., Rao, M., Chang, S., Li, A., Noggle, S. A. iPSC-Derived Dopamine Neurons Reveal Differences Between Monozygotic Twins Discordant for Parkinson’s Disease. Cell Rep. 9 (4), 1173-1182 (2014).
- Huang, S. M., et al. Tankyrase inhibition stabilizes axin and antagonizes Wnt signalling. Nature. 461 (7264), 614-620 (2009).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson’s disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
- Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).
- Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
- Yan, X., et al. iPS cells reprogrammed from human mesenchymal-like stem/progenitor cells of dental tissue origin. Stem Cells Dev. 19 (4), 469-480 (2010).
- Wang, J., et al. Generation of clinical-grade human induced pluripotent stem cells in Xeno-free conditions. Stem Cell Res Ther. 6, 223 (2015).
- Kwon, J., et al. Neuronal Differentiation of a Human Induced Pluripotent Stem Cell Line (FS-1) Derived from Newborn Foreskin Fibroblasts. Int J Stem Cells. 5 (2), 140-145 (2012).
- Li, X. J., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).
- Sheridan, S. D., Surampudi, V., Rao, R. R. Analysis of embryoid bodies derived from human induced pluripotent stem cells as a means to assess pluripotency. Stem Cells Int. , 738910 (2012).
- Smith, Q., Stukalin, E., Kusuma, S., Gerecht, S., Sun, S. X. Stochasticity and Spatial Interaction Govern Stem Cell Differentiation Dynamics. Sci Rep. 5, 12617 (2015).
