Summary
Burada sığ derinlikte hem yüksek çözünürlüklü hem de in vivo aynı numunede düşük çözünürlüklü derin doku görüntülemeye muktedir anahtarlanabilir akustik çözünürlük (AR) ve optik çözünürlük (OR) fotoakustik mikroskopi (AR-OR-PAM) sistemi gösterilmiştir.
Abstract
Fotoakustik mikroskopi (PAM), yüksek çözünürlüklü optik ortalama serbest yolun (cildinde ~ 1 mm) ötesine penetrasyon sağlayan hem optik hem de ultrasonu bir araya getiren hızla büyüyen bir invivo görüntüleme yöntemidir. Optik absorpsiyon kontrastını, tek bir yöntemle ultrasonun yüksek uzaysal özünürlüğüyle birleştirerek, bu teknik derin dokulara nüfuz edebilir. Fotoakutik mikroskopi sistemleri, düşük akustik çözünürlüğe sahip olabilir ve derinlikli olarak problanabilir veya yüksek bir optik çözünürlüğü ve probu sığ derim. Tek bir sistemle yüksek mekansal çözünürlük ve geniş derinlik penetrasyonu elde etmek zor. Bu çalışma sığ derinliklerde hem yüksek çözünürlüklü hem de in vivo aynı numunenin düşük çözünürlüklü derin doku görüntüleme kapasitesine sahip bir AR-OR-PAM sistemi sunmaktadır. Optik odaklamayı kullanan 1,4 mm görüntü derinliğinde 4 μm'lik yanal çözünürlük ve akustik odaklamayı kullanarak 7.8 mm'lik görüntü derinliği ile 45 μm'lik bir yanal çözünürlük başarılıydıKombine sistemini kullanarak göstermiştir. Burada, biyolojik görüntüleme kabiliyetini göstermek için in vivo küçük hayvan kan damar sistemi görüntüleme yapılır.
Introduction
Optik koherens tomografi, konfokal mikroskopi ve çok ışıklı mikroskopi gibi yüksek çözünürlüklü optik görüntüleme yöntemleri çok sayıda avantaja sahiptir. Ancak görüntü derinliği arttıkça mekansal çözünürlük önemli ölçüde azalır. Yumuşak dokularda 1 , 2 hafif nakil dağınık doğası nedeniyle. Optik uyarılma ve ultrason algılama entegrasyonu, derin dokulardaki yüksek çözünürlüklü optik görüntülemenin üstesinden gelmek için bir çözüm sağlar. Fotoakustik mikroskopi (PAM), diğer optik görüntüleme yöntemlerinden daha derin görüntüleme sağlayabilen böyle bir yöntemdir. İn vivo yapısal, fonksiyonel, moleküler ve hücre görüntülemeye başarıyla uygulanmıştır. 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 çalışmaları, güçlü optik absorpsiyon kontrastını ultrasonografiden elde edilen yüksek uzaysal çözünürlük ile birleştirerek gerçekleştirmektedir.
PAM'de kısa bir lazer darbe doku / numuneyi ışınlar. Işıkların kromoforlarla ( örn., Melanin, hemoglobin, su vb. ) Emilmesi sıcaklık artışıyla sonuçlanır ve bu da akustik dalgalar (fotoakustik dalgalar) şeklinde basınç dalgalarının üretilmesine neden olur. Oluşturulan fotoakustik dalgalar, doku sınırının dışındaki bir geniş bant ultrasonik dönüştürücü ile tespit edilebilir. Zayıf optik ve dar akustik odaklanmayı kullanarak, derin doku görüntüleme, akustik çözünürlüklü fotoakustik mikroskopi (AR-PAM) 14 , 15 , 16'da başarılabilir. AR'de-PAM, 45 μm yanal çözünürlük ve 3 mm'ye kadar bir görüntüleme derinliği gösterilmiştir 15 . Akustik olarak tekli kılcal damarları (~ 5 μm) çözmek için,> 400 MHz merkezi frekanslarda çalışan ultrasonik transdüserler gereklidir. Bu yüksek frekanslarda penetrasyon derinliği 100 μm'den düşüktür. Sıkı akustik odaklanmanın yol açtığı sorun dar optik odaklama kullanılarak çözülebilir. Optik çözünürlüklü fotoakustik mikroskopi (OR-PAM), tekli kılcal damarları veya hatta tek bir hücreyi 17 çözebilmektedir ve 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 nolu yanal çözünürlük 0.5 μm'dir. Fotonik nanojet kullanımı, kırınımla sınırlı resolutio ötesinde bir çözünürlük elde etmeye yardımcı olabilirN 25 , 26 . OR-PAM'da, nüfuz derinliği ışık odaklama nedeniyle sınırlıdır ve biyolojik dokunun 23'ünde ~ 1.2 mm'ye kadar görüntü görüntüleyebilir. Bu nedenle, AR-PAM görüntü derinleştirebilir, ancak daha düşük özünürlükte ve OR-PAM çok yüksek çözünürlükte, ancak görüntüleme derinliği sınırlı görüntüleyebilir. AR ve OR-PAM sisteminin görüntüleme hızı çoğunlukla lazer kaynağının 27 atım tekrarlama oranına bağlıdır.
AR-PAM ve OR-PAM'ı birleştirmek hem yüksek çözünürlüklü hem de daha derin görüntüleme gerektiren uygulamalar için büyük fayda sağlayacaktır. Bu sistemleri bir araya getirmek için az çaba gösterildi. Genellikle, iki farklı görüntüleme tarayıcı görüntüleme için kullanılır, bu da, numunenin her iki sistem arasında hareket ettirilmesini ve dolayısıyla canlı görüntülemenin gerçekleştirilmesini zorlaştırır. Bununla birlikte hem AR hem de OR PAM ile hibrid görüntüleme, ölçeklenebilir çözünürlüklerle görüntülemeyi mümkün kılar.Derinlikler. Tek bir yaklaşımda hem AR hem de OR PAM için ışık iletmek için bir optik fiber demeti kullanılır. Bu yaklaşımda, iki ayrı lazer (AR için 570 nm'de yüksek enerjili lazer ve OR için 532 nm'de düşük enerjili, yüksek tekrarlama oranı lazer) kullanılmakta ve sistem uygunsuz ve pahalı hale getirilmektedir 28 . OR-PAM lazer dalga boyu sabittir ve bu kombine sistem kullanılarak oksijen doygunluğu gibi birçok çalışma mümkün değildir. AR ve OR PAM arasındaki karşılaştırmalı çalışmalar da AR ve OR arasındaki lazer dalga boylarındaki fark nedeniyle mümkün değildir. Dahası, AR-PAM parlak alan aydınlatması kullanır; Bu nedenle cilt yüzeyinden gelen güçlü fotoakustik sinyaller görüntü kalitesini sınırlar. Bu nedenle, sistem birçok biyolojik görüntüleme uygulaması için kullanılamaz. AR ve OR PAM gerçekleştirmek için başka bir yaklaşımda, optik ve ultrason odak kaydırılır, bu da ışık odak ve ultrason odak hatasız hale getirir. Böylece, görüntü kalitesi optimal değildir 30) . Bütün bu vakalarda, AR-PAM karanlık alan aydınlatması kullanmadı. Koyu alan aydınlatmasının kullanılması cilt yüzeyinden güçlü fotoakustik sinyaller üretilmesini azaltabilir. Bu nedenle, derin fotoakustik sinyallerinin algılama hassasiyeti parlak alan aydınlatmasına kıyasla daha yüksek olacağından, halka şeklinde aydınlatma kullanılarak derin doku görüntüleme yapılabilir.
Bu çalışma, her iki siste de aynı lazer ve tarayıcıyı kullanarak aynı numuneyi hem yüksek çözünürlüklü hem de düşük çözünürlüklü derin doku görüntüleme özelliğine sahip değiştirilebilir bir AR ve OR PAM (AR-OR-PAM) görüntüleme sistemi bildirmektedirems. AR-OR-PAM sisteminin performansı, fantom deneyler kullanılarak mekansal çözünürlüğü ve görüntüleme derinliğini belirleyerek karakterize edildi. Biyolojik görüntüleme kabiliyetini göstermek için bir fare kulakta canlı vasküler görüntüleme gerçekleştirildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri, Nanyang Technological University, Singapur'da (Hayvan Protokol Numarası ARF-SBS / NIE-A0263) Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesinin onaylanmış düzenlemelerine ve kılavuzlarına göre gerçekleştirildi.
1. AR-OR-PAM Sistemi ( Şekil 1 )
- Sistem konfigürasyonu: AR-PAM
- Diyot pompalı, katı hal Nd-YAG lazer (532 nm) ve optik ışın kaynağı olarak 559-576 nm ayarlanabilirlik aralığı olan bir boya lazerinden oluşan nanosaniye ayarlanabilir bir lazer sistemi kullanın. Harici bir denetleyici ve lazer yazılımını kullanarak lazer tekrarlama hızı 1 kHz kullanarak lazer dalga boyunu 570 nm'ye ayarlayın.
- Değişken bir nötr yoğunluk filtresi (NDF1; OD = 0-4.0) vasıtasıyla lazer gücünün% 5'ini bir fotodiyot'a yönlendirmek için, bir kiriş örnekleyiciyi lazerin önüne 45 ° açı yerleştirin.
- Lazer ışını kiriş örnekleyiciden sonra 90 ° 'deDik açılı bir prizma (RAP1).
- Kirişin değişken bir nötr yoğunluk filtresinden (NDF2; OD = 0-4.0) geçmesini sağlamak için bir başka dik açılı prizma (RAP2) kullanın ve bir fiber bağlayıcı (FC) -a üzerinden yönlendiren bir çok modlu fiberin (MMF) üzerine Amaçların kombinasyonu (numerical aperture (NA): 0.25) ve XY çevirmeni.
- Elyaf, bir XY çeviriciyi kullanarak tarama aşamasına sabitleyin. Kirişi elyafın dışına doğru izlemek için elyaf çıkış ucundan 25 mm uzakta bir düz dışbükey lens (L1) yerleştirin.
- Bir halka şeklinde kiriş oluşturmak için, paralelleştirilmiş ışını 130 ° 'lik bir tepe açısıyla konik bir mercekten geçirin. Koni açıları 70 ° ve 110 ° olan ev yapımı bir optik yoğunlaştırıcı (OC) ve ortada bir delik bulunan halka şeklindeki ışını konuya zayıf odaklayın.
- Ev yapımı kondenserin ortasına bir akustik mercekle (AL) 50 MHz'lik bir ultrason dönüştürücüyü (UST) yerleştirin.
- Sistem yapılandırması: OR-PAM
- KullanınDiyot pompalı, katı hal Nd-YAG lazerden (532 nm) ve optik ışın kaynağı olarak 559 - 576 nm arasında ayarlanabilirlik aralığı olan bir boya lazerinden oluşan nanosaniye ayarlanabilir lazer sistemi. Lazer dalga boyunu 570 nm'de harici bir denetleyici ve lazer yazılımını kullanarak 5 kHz'de tekrarlama oranı kullanarak ayarlayın.
- Lazer ışını yeniden şekillendirmek için iris üzerine yönlendirmek için bilgisayar kontrollü rotasyon aşamasını (RAP1'i tutarak) 90 ° döndürün.
- Işın üzerinde değişken nötr yoğunluk filtresi (OD: 0-4.0) yerleştiren lazer ışını azaltın ve kirişin yoğunlaştırıcı mercekle (CL) odaklanmasını sağlayın. Mekansal filtreleme için CL'den 75 mm uzaktaki bir iğne deliğinden (PH) geçirin.
- Işık demetini SMF'ye odaklamak için 0,1 NA'lık bir objektiften oluşan bir tek modlu fiber birleştirici (FC) kullanarak mekansal olarak filtrelenmiş ışını tek modlu bir fiber (SMF) üzerine başlatın.
- Maksimum bağlanma verimliliği elde etmek için fiber bağlayıcıyı ayarlayın.
- Elyafını tBir kayma plakası (SP) kullanarak sahne taraması yapar. Lazer ışını paralelleştirmek için SM elyafından 50 mm uzakta bir renksiz mercek (L2) yerleştirin.
- Bir başka benzer renksiz merceğin (L3) arka deliğini doldurmak için kinematik kontrol edilebilir eliptik ayna (M) kullanarak paralelleştirilmiş ışını 90 ° döndür. Odaklama yapmak için kullanılan renksiz mercek bir mercek borusu (LT) kullanarak bir çeviri makarasına (TM2) yerleştirin.
- Odaklanma kirişini, dik açılı bir prizmadan (RA) ve bir rhomboid prizma (RP) oluşan ev tipi bir optoakustik kiriş kombinezonundan geçirin ve arasında bir silikon yağı (SO) tabakası bulunuz.
NOT: Silikon yağ tabakası, optik olarak şeffaf ve akustik olarak yansıtıcı film olarak işlev görür. - Saptırma prizmasının alt kısmında akustik odaklamayı (odak uzaklığı: ~ 46 μm) sağlamak için bir akustik lens (AL) takın.
- Ultrasonik transdüseri, rhomboid prizmanın üzerine 50 MHz merkez frekansla yerleştirin; Etkin birleştirme için bir epoksi katmanı kullanın.
2. Sistem Anahtarlama ve Hizalama - Ev yapımı değiştirilebilir plakayı, bilgisayara bağlı 3 eksenli bir denetleyiciyle kontrol edilen 3 eksenli bir motorlu kademeye sabitleyin (sıkıca vidalayın).
- AR ve OR kafes sistemini, AR ve OR tarama kafaları arasında kolay geçiş yapabilmek için kafes montaj dirseklerini kullanarak ev yapımı plakaya tutturun. Tarama kafasını görüntüleme alanının üstünde kaydırın.
- Akustik kuplaj için AR-OR-PAM tarayıcı kafasının alt kısmını su dolu akrilik bir tanka (13 cm x 30 cm x 3 cm) daldırmak için Z-aşamasını kullanın.
- Deponun alt plakasında 7 cm çapında bir görüntüleme penceresi açın ve optik ve akustik yayın için bir polietilen membran ile kapatın.
- Odaklanacak ultrason dönüştürücüsünü hizalamak için bir darbe-yankı amplifikatörü ve bir osiloskop kullanın.
- İletim / alım modunda, puls yankı amplifikatöründeki kazanımı 24 dB'e ayarlayın.
- Eşzamanlama sinyalini fr kullanınPul-eko amplifikatörünü tetikleyici olarak kullanın ve bir osiloskop kullanarak bir cam slayttan (su deposunun tabanından sokulmuş olarak) geri yansıyan sinyali algılayın.
NOT: Slaytta siyah bant sıkışmış olmalıdır. - Darbe-yankı sinyalinin genliğini en yüksek düzeye çıkarmak için Z-eksenini hareket ettirin (osiloskopta görüntülenir).
NOT: Cam plaka odaklandığı zaman, yankı maksimum amplitüdüne sahip olacaktır.
- Lazeri açın ve UST'yi her biri 24 dB sabit kazançlı BNC kablolar kullanarak iki yükselticiye bağlayın.
NOT: Amplifikatörlerin çıkışları veri toplama kartına (DAQ) bağlıdır. - Lazerin önüne yerleştirilen fotodiyodun (PD) sinyalini, veri toplama sisteminin tetikleyicisi olarak kullanın.
- AR-PAM'da, test nesnesinden üretilen foto-akustik sinyalin amplifikasyonunu en üst düzeye çıkarmak için konik lens (kon.L) ile optik yoğunlaştırıcı (OC) arasındaki mesafeyi değiştirin (bir cam slaytta sıkışmış siyah bant).Optimum akustik (PA) sinyal amplitüdünü belirleyerek optik ve akustik odaklamaların konfokal olmasına dikkat edin.
- Maksimum PA sinyallerinin gecikmesine dikkat edin; Daha sonra veri toplama yazılımındaki odağı kontrol etmek için kullanın.
- Tarama kafasının vidasını gevşetin ve elle tarama kafasını AR-PAM'dan OR-PAM'a çevirin. Daha sonra vidaları sıkıştırın.
- OR-PAM'de, osiloskopda gösterilen PA sinyal amplitüdünü en üst düzeye çıkarmak için odaklama akromatik ikili (lens tüpünün (LT) içinde) ile optoakustik birleştirici arasındaki mesafeyi değiştirin.
- Maksimum PA sinyallerinin gecikmesine dikkat edin.
NOT: Konfokal düzenlemeyi belirlemek için finetuning gereklidir.
- Maksimum PA sinyallerinin gecikmesine dikkat edin.
- Yanal çözünürlük ve görüntüleme derinliği niceliklemesi
- AR'nın yanal çözünürlüğünü belirlemek için çap olarak 100 nm altın nanopartikül kullanın.D OR sistemi.
- 0.1 mL nanopartikül çözeltisini eşit miktarda su ile seyreltin. 0.1 mL seyreltilmiş solüsyonu bir kapak kaymasına dağıtın ve tankın altındaki polietilen membran ile temas halinde yerleştirin.
- Taramadan önce AR-PAM ve OR-PAM'ın veri toplama yazılımında odaklandığından emin olun (bkz. Malzeme Tablosu) (2.8 ve 2.10 adımlar).
NOT: Adım 2.9 ve 2.10'dan gelen maksimum PA sinyallerinin mikrosaniye gecikmesini, örnekleme hızı (250 MS / s) ile çarpılarak bilerek, görüntü veri edinme yazılımında odaklanır. Veri edinimi sırasında ihmal edilmesi gereken gecikme, yalnızca post-processing için gerekli veri noktalarını kaydedecek şekilde yazılımda belirlenebilir. - AR-PAM için tarama parametrelerini ayarlayın ve raster taramayı başlatmak için "tarama" düğmesine basın.
- "4" mm / s tarama hızında veri toplama yazılımındaki AR-PAM tarama parametrelerini "hız"; Sekmesinde, "pulse tekrarlama oranı" sekmesinde "1" kHz, "Y-tarama aralığı" sekmesinde "0.5" mm ve "X-tarama aralığı" sekmesinde "0.5" mm'dir. "Dx" sekmesinde adım boyutunu x yönünde "4" μm olarak ayarlayın.
NOT: Y yönündeki basamak boyutu, sahne tarama hızı hızından ve pals tekrarlama hızından (bu durumda, 4.000 μm / 1.000 Hz = 4 μm) belirlenir.
- "4" mm / s tarama hızında veri toplama yazılımındaki AR-PAM tarama parametrelerini "hız"; Sekmesinde, "pulse tekrarlama oranı" sekmesinde "1" kHz, "Y-tarama aralığı" sekmesinde "0.5" mm ve "X-tarama aralığı" sekmesinde "0.5" mm'dir. "Dx" sekmesinde adım boyutunu x yönünde "4" μm olarak ayarlayın.
- OR-PAM için tarama parametrelerini ayarlayın ve raster taramayı başlatmak için "tarama" düğmesine basın.
- Veri toplama yazılımında, "hız" sekmesinde "2.5" mm / s tarama hızı, "darbe tekrarlama oranı" sekmesinde "5" kHz, "Y-tarama aralığı" nda "0.5" mm olan tarama parametrelerini ayarlayın Ve "X Tarama aralığı" sekmesinde "0.5" mm'dir. "Dx" sekmesinde adım boyutunu x yönünde "0.5" μm olarak ayarlayın.
NOT:Tepe boyutu y-yönünde otomatik olarak sahne tarama hızı hızından ve darbe tekrarlama hızından (bu durumda, 2,500 μm / 5,000 Hz = 0,5 μm) belirlenir.
- Veri toplama yazılımında, "hız" sekmesinde "2.5" mm / s tarama hızı, "darbe tekrarlama oranı" sekmesinde "5" kHz, "Y-tarama aralığı" nda "0.5" mm olan tarama parametrelerini ayarlayın Ve "X Tarama aralığı" sekmesinde "0.5" mm'dir. "Dx" sekmesinde adım boyutunu x yönünde "0.5" μm olarak ayarlayın.
- Tarama işlemi sırasında verilerin sürekli yakalanıp bilgisayarda depolandığından emin olun
NOT: Veriler sadece Y-kademesinin bir hareket yönünde yakalanacaktır. - Görüntü işleme yazılımını kullanarak maksimum genlik projeksiyonu (MAP) görüntülerini almak için bilgisayarda depolanan çoklu B-tarama verilerini kullanın (Bkz . Malzeme Tablosu ).
- Gauss eğrisi benzeri bir nokta yayılım fonksiyonu elde etmek için manuel olarak nanoparçacık görüntüsünün merkez bölgesi boyunca bir çizgi çizerek yanal çözünürlüğü belirlemek için taramadan tek bir nanopartikül görüntüsü (birden fazla görüntünün dışında) kullanın. Bkz. Şekil 2 .
- Bir Gau kullanarak tek bir nanoparçacık görüntüsünden elde edilen nokta yayılım fonksiyonunu uydurunGörüntü işleme yazılımını kullanarak yarı genişlikte tam genişliği (FWHM) ölçün ( Tabloya bakın). Bunu yanal çözünürlük olarak kullanın. Bkz. Şekil 2 .
- Derinlik görüntüleme için hedef nesne olarak dilimlenmiş bir tavuk dokusuna eğimli bir siyah bant parçası yerleştirin. Kasedi bantla birlikte su haznesine yerleştirin.
NOT: Siyah bant, şeridi dokuya yapıştırmaya yardımcı olan keskin bir uca sahip metal bir plakaya yapıştırılmıştır. - AR-PAM için tarama parametrelerini veri toplama yazılımına yerleştirin ve ardından maksimum tarama derinliğini belirlemek için tek bir B-tarama görüntüsü çekmek için "tarama" düğmesine basın.
- "Tarama hızı" sekmesinde "hız" sekmesinde "15" mm / s tarama hızı, "darbe tekrarlama oranı" sekmesinde "1" kHz, "Y-tarama aralığı" sekmesinde "5" cm ve "0.1" "Mm" X-scan range "sekmesinde. T ayarla"Dx" sekmesinde x-yönünde "0.1" mm'de adım büyüklüğü.
- OR-PAM için tarama parametrelerini ayarlayın ve maksimum görüntüleme bölümünü belirlemek için tek bir B-tarama görüntüsü çekmek için "tarama" düğmesine basın.
- Veri toplama yazılımında tarama parametrelerini "hız" sekmesinde "15" mm / s tarama hızı, "darbe tekrarlama oranı" sekmesinde "5" kHz, "Y-tarama aralığı" nda "2" cm olarak ayarlayın Sekmesini ve "X-tarama aralığı" sekmesinde "0.1" mm'dir. Adım boyutunu x yönünde "dx" sekmesinde "0.1" mm olarak ayarlayın.
NOT: X-tarama aralığı ve dx aynı olduğundan, yalnızca bir B-taraması yakalanacaktır. Zamanla çözümlenen PA sinyallerinin yumuşak dokudaki (1,540 m / s) ses hızı ile çarpımı, bir A-çizgi görüntüsü verecektir. Bir B-taraması üretmek için Y-aşamasının kesintisiz hareketi sırasında birden fazla A-satırı yakalanır.
- Veri toplama yazılımında tarama parametrelerini "hız" sekmesinde "15" mm / s tarama hızı, "darbe tekrarlama oranı" sekmesinde "5" kHz, "Y-tarama aralığı" nda "2" cm olarak ayarlayın Sekmesini ve "X-tarama aralığı" sekmesinde "0.1" mm'dir. Adım boyutunu x yönünde "dx" sekmesinde "0.1" mm olarak ayarlayın.
- In vivo </ Em> Fare kulak kan vaskülatürünün görüntülenmesi
- 25 g vücut ağırlığı ve 4 haftalık yaşlı dişi fareyi kullanın.
- Hayvanlar intraperitoneal olarak enjekte edilen ketamin (120 mg / kg) ve xylazine (16 mg / kg) içeren bir kokteyl (0.1 mL / 10 g dozaj) kullanarak anestezi uygulayın.
- Saç kremini kullanarak hayvan kulağından saçları alın. Alanı temiz olarak silin. Dağınık lazer ışınının gözlerin üzerine düşmesini önlemek için hayvanın gözünü steril bir merhem ile kapatın.
- Hayvanı, aynı zamanda, kulağı konumlandırmak için minyatür bir plaka bulunan bir sahneye yerleştirin.
- Görüntüleme süresince inhale izofluran ile (1 L / dakika oksijenle% 0.75) anestezi uygulayın.
- Fare bacağına veya kuyruğuna bir nabız oksimetresi sıkıştırın ve fizyolojik durumu izleyin. Ultrason jel kullanarak görüntüleme bölgesinin polietilen membran ile temas etmesine izin verin.
- AR-PAM için tarama parametrelerini ayarlayın ve tarama taramasını başlatmak için "tarama" düğmesine basıning.
- "Hız" sekmesinde "15" mm / s tarama hızında veri toplama yazılımında AR-PAM için tarama parametrelerini ayarlayın, "darbe tekrarlama oranı" sekmesinde "1" kHz, "darbe tekrarlama oranı" sekmesinde "10 mm" Y-tarama aralığı "sekmesini ve" X-tarama aralığı "sekmesinde" 6 "mm'yi seçin. "Dx" sekmesinde adım boyutunu x yönünde "30" μm olarak ayarlayın.
NOT: y yönündeki adım boyutu, sahnedeki tarama hızı hızından ve darbe tekrarlama hızından (bu durumda, 15.000 μm / 1,000 Hz = 15 μm) belirlenir.
- "Hız" sekmesinde "15" mm / s tarama hızında veri toplama yazılımında AR-PAM için tarama parametrelerini ayarlayın, "darbe tekrarlama oranı" sekmesinde "1" kHz, "darbe tekrarlama oranı" sekmesinde "10 mm" Y-tarama aralığı "sekmesini ve" X-tarama aralığı "sekmesinde" 6 "mm'yi seçin. "Dx" sekmesinde adım boyutunu x yönünde "30" μm olarak ayarlayın.
- AR-PAM taramasını tamamladıktan sonra, görüntüleme kafası konumunu AR-PAM'dan OR-PAM'a (bölüm 2'de açıklandığı gibi) değiştirin.
- OR-PAM için tarama parametrelerini ayarlayın ve raster taramayı başlatmak için "tarama" düğmesine basın.
- "15" mm / s tarama hızında veri toplama yazılımındaki OR-PAM tarama parametrelerini "velocit"Y-tarama aralığı" sekmesinde "10" mm ve "X-tarama aralığı" sekmesinde "6" mm'dir. Adım boyutunu ayarlayın. X-doğrultusunda "dx" sekmesinde "6" μm'dir.
NOT: y yönündeki adım boyutu, sahnedeki tarama hızı hızından ve darbe tekrarlama hızından (bu durumda, 15.000 μm / 5.000 Hz = 2 μm) belirlenir.
- "15" mm / s tarama hızında veri toplama yazılımındaki OR-PAM tarama parametrelerini "velocit"Y-tarama aralığı" sekmesinde "10" mm ve "X-tarama aralığı" sekmesinde "6" mm'dir. Adım boyutunu ayarlayın. X-doğrultusunda "dx" sekmesinde "6" μm'dir.
- Görüntü işleme yazılımı kullanarak MAP görüntülerini almak için bilgisayarda depolanan çoklu B-tarama verilerini kullanın.
- Tüm görüntüleme döneminde hayvana dikkat edin.
3. Deneysel Adımlar
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
AR-OR-PAM sisteminin şeması Şekil 1'de gösterilmektedir. Bu kurulumda tüm bileşenler bir optik kafes kurulumunda bütünleştirildi ve monte edildi. Bir kafes sisteminin kullanılması, AR-OR-PAM tarama kafasını kompakt yapar ve kolayca monte edilir, hizalanır ve tek bir tarama aşamasına entegre olur.
Görüntü yakalama işlemi sırasında görüntü kafasının iki boyutlu sürekli raster taraması kullanılmıştır. Zamana bağlı PA sinyalleri, bir A hattı elde etmek için ses hızı (1,540 m / s) ile çarpıldı. Y-aşamasının kesintisiz hareketi sırasında yakalanan çoklu A-çizgileri, iki boyutlu B-taramayı üretti. Görüntüleme alanının çoklu B-taramaları yakalandı ve bilgisayarda saklandı ve MAP fotakustik görüntüleri işlemek ve üretmek için kullanıldı.
Değiştirilebilir sistemin çözünürlüğünü belirlemek için, Tek bir nanopartikülün MAP görüntüsü kullanıldı 31 . Görüntünün merkezi yanal doğrultusu boyunca fotoakustiksel genlik çizildi ve bir Gauss fonksiyonuna uyduruldu. Gauss fitinin FWHM'si yanal çözünürlük olarak düşünülmüştür. AR-PAM için ölçülen yanal çözünürlük, Şekil 2a'da gösterildiği gibi 45 um idi. Benzer şekilde, OR-PAM kullanılarak elde edilen tek bir nanopartikül görüntü, Şekil 2b'de gösterildiği gibi OR-PAM'nin çözünürlüğünü belirlemek için merkezi yanal doğrultu boyunca yerleştirildi. Ölçülen yanal çözünürlük FWHM'den belirlenen 4 μm idi. Şeklin altına, altın nanopartikülünün karşılık gelen MAP görüntüsü gösterilmektedir. Teorik olarak, AR-PAM için optik kırınımla sınırlı yanal çözünürlük 45 μm olup, aşağıdaki denklem kullanılarak saptanmıştır: 0.72λ / NA, burada λ merkezi ses dalgabildir ve NA sayısaldırUltrasonik transdüserin diyafram açıklığı. Teorik çözünürlük, deneysel verilerle iyi uyuşmaktadır. Benzer şekilde OR-PAM için teorik yanal özünürlük 2.6 μm'dir, aşağıdaki denklemle hesaplanır: 0.51λ / NA, burada λ lazer dalga boyu ve NA objektifin sayısal açıklığıdır. OR-PAM için deneysel olarak ölçülen yanal çözünürlük, dalga yansımaları nedeniyle oluşabilecek kırınım-limit tahminden zayıftı. Hem AR hem de OR, benzer bir dönüştürücü ve akustik lens kullandığı için teorik eksenel çözünürlük 0.88 c / Δ f'ye göre 30 μm olacaktır, burada c yumuşak dokuda ses hızı ve Δ f ultrasonik transdüserin frekans bant genişliği . Ek olarak, yanal çözünürlük hem OR-PAM 20 hem de AR-PAM 32 için eksenel doğrultuda değişecektir. Burada bildirilen yanal çözünürlükler odak düzlemindedir.
Şekil 3a, tavuk dokusunda siyah bantın fotoğrafını göstermektedir. Hem AR-PAM hem de OR-PAM kullanılarak tek bir B-tarama görüntüsü elde edildi. Şekil 3b ve Şekil 3c sırasıyla AR-PAM ve OR-PAM'ın tek B-tarama PA görüntüsünü göstermektedir. Şekil 3b'den anlaşılacağı gibi, AR-PAM sisteminin siyah bantı doku yüzeyinin altına ~ 7.8 mm'ye kadar net olarak görüntüleyebileceği açıktır. Benzer şekilde, OR-PAM sistemini kullanarak, siyah bantın doku yüzeyinin altında ~ 1.4 mm'ye kadar net bir şekilde görüntülendiği mümkündür ( Şekil 3 c ). Sinyal-gürültü oranı (SNR) de görüntülerden tespit edildi. SNR, V / n olarak tanımlanır, burada <Em> V, zirve-pik PA sinyal genliği ve n , arka plan gürültüsünün standart sapmasıdır. 4.6 mm ve 7.8 mm görüntüleme derinliklerinde ölçülen SNR sırasıyla 2.6 ve 1.4'tür. OR-PAM için 1.4 mm görüntüleme derinliğindeki SNR 1.4'tür. Değiştirilebilir AR-OR PAM sisteminin biyolojik görüntüleme kabiliyetini göstermek için, in vivo kan vaskülatür görüntüleme, bir fare kulağı üzerinde gerçekleştirildi. Görüntüleme için kullanılan yaşayan fare kulağının vasküler anatomisini gösteren bir fotoğraf Şekil 4a'da gösterilmektedir. AR-PAM kullanılarak, 10 mm x 6 mm'lik bir tarama bölgesi görüntülendi; Y-yönünde 15 μm ve X-yönünde 30 μm'lik bir adım boyutu vardı. Görüntüleme işlemi 10 dakika sürdü. Günümüzde, görüntüleme sistemi veri tek yönlü olarak elde edilmektedir; Programın iki yönlü bir veri edinme kabiliyetine sahip olmasını sağlayarak edinme zamanı neredeyse yarıya düşürülebilir. AR-PAM'nin HARİP görüntüsü Şekil 4'te gösterilmektedir.B. İlgilenilen bölgenin yakın çekimi Şekil 4 c'de gösterilmiştir. Y-yönünde 3 μm ve X-yönünde 6 μm'lik bir adım boyutu ile OR-PAM kullanılarak taranan benzer bir alan Şekil 4 d' de gösterilmektedir. Görüntüleme işlemi 46 dakika sürdü. İlgi alanının yakınlaşması Şekil 4 e'de gösterilmektedir. OR-PAM, AR-PAM'ın çözemediği tek kılcal damarları açık bir şekilde çözebilir. AR-PAM, 45 μm'den daha kalın kapları çözebilir.
Özetle, sıkı optik odaklama ve yüksek çözünürlüklü görüntü elde edebilen, ayrıca akustik odaklama kullanan derin doku görüntüleme gerçekleştirebilen değiştirilebilir bir AR-OR-PAM sistemi geliştirildi. Değiştirilebilir AR-OR-PAM sisteminin performansı, yanal çözünürlük ve görüntüleme derinlik ölçümleri kullanılarak nicelleştirildi. In vivo studBiyolojik görüntüleme kabiliyetini göstermek için de yapılmıştır. Bu değiştirilebilir fotakuroskopik mikroskopi sistemi, tek damar damarlarının ve derin vasküllerin görüntülenmesinin önemli olduğu anjiyogenez, ilaç yanıtı, vb görüntüleme dahil olmak üzere, sistemin önemli hale getirilmesi için yüksek zamansal ve mekansal çözünürlük sağlayabilir. Evde yapılan değiştirilebilir plakayı 10 cm'lik bir hareketli motorlu kademe (y ekseni) ile değiştirerek sisteme başka değişiklikler veya iyileştirme yapılabilir. OR-PAM'ın yanal çözünürlüğü, wavefront sapmalarının düzeltilmesi ile daha da geliştirilebilir. AR-PAM'ye daha yüksek bir darbe enerjisi sağlamak SNR'yi ve görüntüleme derinliklerini de geliştirecektir.
OR-PAM durumunda, optik odaklama, in vivo görüntüleme için cilt yüzeyinin 150 μm altındaysa, yüzey spot boyutu 22.5 μm çapındaydı. 90 nJ'den oluşan tek bir lazer darbesi,Ximum darbe enerjisi 20.4 mJ / cm2. AR-PAM için lazer odak noktası 2 mm çapındaydı. 50 μJ'lik tek bir lazer palsı sunmak, 1,6 mJ / cm2'lik odak noktasında 20 mJ / cm2 , 33'lük ANSI güvenlik limiti dahilinde maksimum darbe enerjisi sağlar.
Şekil 1 : AR-OR-PAM Görüntüleme Sisteminin Şeması. ( A ) BS: Işın örnekleyicisi, NDF: nötr yoğunluk filtresi, RAP - Sağ açılı prizma, PD: fotodiyot, CL: yoğunlaştırıcı lens, PH: iğne deliği, FC: fiber bağlayıcı, UST: ultrason transdüseri, MMF: çok modlu fiber, SMF: Tek modlu elyaf, DAQ: veri toplama kartı, TS: Çevirme kademesi, ConL.: konik mercek, L1: konveks lens, L2 ve L3: renksiz mercek, RA: dik açılı prizma, RP: rhomboid prizma, OC: optik Yoğunlaştırıcı, M: mIrror, SP: kayma plakası, LT: lens tüpü, TM: çevirme aparatı, KMM: kinematik ayna aparatı ve AL: akustik lens. ( B ) Prototip AR-OR-PAM sisteminin fotoğrafı. ( C ) Optoakustik ışın kombinasyonunun yakın çekimi. ( D ) Optik kondenserin merkezinde UST bulunan yakın çekim. Referans 34'ün izniyle basıldı. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2 : AR-OR-PAM Sisteminin Yanal Çözünürlük Testi: Yaklaşık 100 nm çapında altın nanopartiküllerinin görüntülenmesiyle hesaplanan yanal çözünürlük. Siyah (*) noktalar: fotoakustik sinyal; Mavi çizgi: ( a ) AR-PAM ve ( b ) için Gauss eğimli eğriYA-PAM. Ek, tek altın nanopartikülünün (b) 'deki (a) ve OR-PAM görüntüsündeki temsilci AR-PAM görüntüsünü göstermektedir. Referans 34'ün izniyle basıldı. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 3 : Görüntüleme Derinliği Ölçümleri: Tavuk dokusuna eğik olarak yerleştirilen siyah bir bantın tek B-tarama PA görüntüsü. ( A ) Şematik diyagram. ( B ) AR-PAM görüntüsü. ( C ) OR-PAM görüntüsü. Referans 34'ün izniyle basıldı. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 4 : Bir Fare Kulağının In Vivo Fotoakustik Görüntüsü: ( a ) Fare kulak vaskülatürünün fotoğrafı. (B) AR-PAM görüntüsü. ( C ) Beyaz çizik çizgiyle gösterildiği gibi, ( b ) 'de ilgi alanının yakın çevresinde (ROI). ( D ) OR-PAM görüntüsü. ( E ) ( d ) 'de yer alan ilgi alanı (ROI), beyaz noktalı çizgi ile gösterilmektedir. ( F ) (e) 'de ROI beyaz çizginin yakın plan görüntüsünde tek bir kılcal görüntü. Referans 34'ün izniyle basıldı. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sonuç olarak, daha düşük görüntüleme derinliklerinde hem yüksek çözünürlüklü görüntüleme hem de daha yüksek görüntüleme derinliklerinde daha düşük çözünürlüklü görüntü elde edebilen değiştirilebilir bir AR ve OR PAM sistemi geliştirilmiştir. Değiştirilebilir sistemin yanal çözünürlüğü ve görüntü derinliği belirlendi. Bu değiştirilebilir PAM sisteminin avantajları şunları içerir: (1) sıkı optik odaklamayı kullanan yüksek çözünürlüklü görüntüleme; (2) akustik odaklamayı kullanan derin doku görüntüleme; 3) güçlü PA sinyallerinin cilt yüzeyinde görünmesini önleyen AR-PAM için koyu alan aydınlatması; 4) numuneyi farklı sistemler arasında hareket ettirmeden numuneyi tek bir yerde tutma kabiliyeti; 5) çoklu lazer ve tarama aşamalarını kullanmaktan kaçınma imkanı; Ve 6) ev yapımı bileşenlerin az kullanımı. Bu, OR-PAM ve karanlık alan AR-PAM'ın ilk rapor edilen kombinasyonudur; örnek / ob hareketi taşımadan aynı numunenin yüksek çözünürlüklü, sığ derinlik görüntüleri ve düşük çözünürlüklü, derin doku görüntüleri sağlargeçebilirler. Aynı tarama kademesinin ve lazerin kullanılması, sistemi etkin ve maliyet etkin hale getirir. Birleşik sistem 4 mm'lik yanal çözünürlük ile 1.4 mm'lik bir görüntüleme derinliği ve aynı zamanda 7.8 mm görüntü derinliği ile 45 μm'lik bir yanal çözünürlüğe sahiptir. Sistem, asgari ev yapımı bileşenlere sahip bir optik kafes sisteminden oluşur ve böylece AR ve OR PAM'leri birleştirmeyi, hizalamanızı ve değiştirmeyi kolaylaştırır. Birleşik tarama kafası kompakttır ve tek bir tarama aşamasında kolayca monte edilebilir. Birleştirilmiş sistemi kullanarak, in vivo görüntüleme başarıyla gösterildi.
Geliştirilen sistem, klinik öncesi görüntüleme için kullanılabilir. Önceden klinik öncesi uygulamalar anjiogenezis, tümör mikro ortamları, mikrosirkülasyon, ilaç tepkisi, beyin fonksiyonları, biyolojik belirteçler ve gen aktivitelerinin görüntülenmesini içerir. Sistemin sınırlamaları tarama zamanını içermektedir. Şu anda uzun bir tarama zamanı gerekiyor, ancak botta veri edinerek azaltılabilir.Saat yönergeleri. Şu an OR-PAM ve AR-PAM arasında eşzamanlı görüntü elde etmek mümkün değildir. Halen, OR-PAM ve AR-PAM arasında manuel anahtarlama gereklidir, bu da en az 10 cm Y-yönlü hareketi olan bir çeviri aşamasını kullanarak önlenebilir. Protokoldeki kritik adımlar, optik ve akustik odağın konfokal belirlenmesini; OR-PAM için optik spot boyutlarının 5 μm'den küçük boyutlara ulaşması, tekli kılcal damarların görüntüsüne kavuşturulması; Ve OR-PAM için optoakustik kiriş birleştiricisinin tasarımı ve AR-PAM için optik kondansatör tasarımı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Tüm hayvan deneyleri, Nanyang Technological University, Singapur'daki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesinin (Hayvan Protokol Numarası ARF-SBS / NIE-A0263) onaylanmış yönergelerine ve düzenlemelerine göre gerçekleştirildi. Yazarların el yazmasıyla ilgili herhangi bir mali çıkarları yoktur ve açığa çıkacak diğer olası çıkar çatışmaları yoktur.
Acknowledgments
Yazarlar, Singapur'da Eğitim Bakanlığınca finanse edilen 2. Aşamalı bir hibe tarafından sağlanan maddi desteği ARC2 / 15: M4020238 olarak kabul etmek istiyorlar. Yazarlar ayrıca, makine mağazası yardımı için Bay Chow Wai Hoong Bobby'ye teşekkür etmek istiyorlardı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Q-switched Nd:YAG laser | Edgewave | BX80-2-L | Pump laser |
| Credo-High Repetition Rate Dye Laser | Spectra physics | CREDO-DYE-N | Dye laser |
| Precision Linear Stage | Physik Instrumente | PLS 85 | XY raster scanning stage |
| Translation stage | Physik Instrumente | VT 80 | Confocal determine |
| Mounted Silicon photodiode | Thorlabs | SM05PD1A | Triggering/Pulse variation |
| Motorized continuous Rotational stage | Thorlabs | CR1/M-Z7 | Diverting laser beam |
| Mounted Continuously Variable ND Filter | Thorlabs | NDC-50C-4M | Intensity variable |
| Fiber Patch Cable | Thorlabs | M29L01 | Multimode fiber |
| Microscope objective | Newport | M-10X | Objective |
| XY translating mount | Thorlabs | CXY1 | Translating mount |
| Plano convex lens | Thorlabs | LA1951 | Collimating lens |
| Conical lens | Altechna | APX-2-B254 | Ring shape beam |
| Translation stage | Thorlabs | CT1 | Translating stage |
| Optical condenser | Home made | ||
| Ultrasonic transducer | Olympus-NDT | V214-BB-RM | 50MHz transducer |
| Plano concave lens | Thorlabs | LC4573 | Acoustic lens |
| Pulser/Receiver | Olympus-NDT | 5073PR | Pulse echo amplifier |
| Mounted standard iris | Thorlabs | ID12/M | Beam shaping |
| Plano convex lens | Thorlabs | LA4327 | Condenser lens |
| Mounted precision pinhole | Thorlabs | P50S | Spatial filtering |
| Single mode fiber patch cable | Thorlabs | P1-460B-FC-1 | Single mode fiber |
| Fiber coupler | Newport | F-91-C1 | Single mode coupling |
| Achromatic doublet lens | Edmund Optics | 32-317 | Achromatic doublet |
| Protected silver elliptical mirror | Thorlabs | PFE10-P01 | Mirror |
| Right angle kinematic mirror mount | Thorlabs | KCB1 | Mirror mount |
| Z-Axis Translation Mount | Thorlabs | SM1Z | z translator |
| Lens tube | Thorlabs | SM05L10 | |
| UV Fused Silica Right-Angle Prism | Thorlabs | PS615 | Right angle prism |
| Rhomboid prism | Edmund Optics | 47-214 | Shear wave |
| Dimethylpolysiloxane | Sigma Aldrich | DMPS1M | Silicon oil |
| Amplifier | Mini Circuits | ZFL-500LN | Amplifier |
| 16 bit high speed digitizer | Spectrum | M4i.4420 | Data acquisition card |
| Oscilloscope | Agilent Technologies | DS06014A | |
| Mice | InVivos Pte.Ltd | ICR | Animal model |
| Ultrasound gel | Progress/parker acquasonic gel | PA-GEL-CLEA-5000 | Acoustic coupling |
| Water tank | Home made | ||
| Translation stage | Homemade | Switching AR-OR | |
| Gold nanoparticles | Sigma Aldrich | 742031 | Lateral resolution |
| Sterile ocular ointment | Alcon | Duratears | Animal imaging |
| 1951 USAF resolution test target | Edmund Optics | 38257 | Confocal alignment |
| Data acquisition software | National Instrument | Labview | Home made software using Labview |
| Image Processing software | Mathworks | Matlab | Home made program using Matlab |
References
- Hu, S., Wang, L. V. Photoacoustic imaging and characterization of the microvasculature. J Biomed Opt. 15, 011101-01-011101-15 (2010).
- Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nat Methods. 7 (8), 603-614 (2010).
- Wang, L. V., Yao, J. A practical guide to photoacoustic tomography in the life sciences. Nat Methods. 13, 627-638 (2016).
- Zhou, Y., Yao, J., Wang, L. V. Tutorial on photoacoustic tomography. J Biomed Opt. 21 (6), 061007 (2016).
- Upputuri, P. K., Sivasubramanian, K., Mark, C. S. K., Pramanik, M. Recent Developments in Vascular Imaging Techniques in Tissue Engineering and Regenerative Medicine. BioMed Res Intl. 2015, (2015).
- Yao, J., Wang, L. V. Photoacoustic Brain Imaging: from Microscopic to Macroscopic Scales. Neurophotonics. 1 (1), 011003-1-011003-13 (2014).
- Wang, L. V., Hu, S. Photoacoustic Tomography: In Vivo Imaging from Organelles to Organs. Science. 335 (6075), 1458-1462 (2012).
- Beard, P. Biomedical photoacoustic imaging. Interface Focus. 1 (4), 602-631 (2011).
- Pan, D. Molecular photoacoustic imaging of angiogenesis with integrin-targeted gold nanobeacons. FASEB J. 25 (3), 875-882 (2011).
- Cai, X., Kim, C., Pramanik, M., Wang, L. V. Photoacoustic tomography of foreign bodies in soft biological tissue. J Biomed Opt. 16 (4), 046017 (2011).
- Pan, D. Near infrared photoacoustic detection of sentinel lymph nodes with gold nanobeacons. Biomaterials. 31 (14), 4088-4093 (2010).
- Wang, L. V. Multiscale photoacoustic microscopy and computed tomography. Nat. Photon. 3 (9), 503-509 (2009).
- Zhang, E. Z., Laufer, J. G., Pedley, R. B., Beard, P. C. In vivo high-resolution 3D photoacoustic imaging of superficial vascular anatomy. Phys. Med. Biol. 54 (4), 1035-1046 (2009).
- Park, S., Lee, C., Kim, J., Kim, C. Acoustic resolution photoacoustic microscopy. Biomed.l Eng. Lett. 4 (3), 213-222 (2014).
- Zhang, H. F., Maslov, K., Stoica, G., Wang, L. V. Functional photoacoustic microscopy for high-resolution and noninvasive in vivo imaging. Nat. Biotechnol. 24 (7), 848-851 (2006).
- Maslov, K., Stoica, G., Wang, L. V. In vivo dark-field reflection-mode photoacoustic microscopy. Opt Lett. 30 (6), 625-627 (2005).
- Strohm, E. M., Moore, M. J., Kolios, M. C. Single Cell Photoacoustic Microscopy: A Review. IEEE J Sel Top Quantum Electron. 22 (3), 6801215 (2016).
- Kim, J. Y., Lee, C., Park, K., Lim, G., Kim, C. Fast optical-resolution photoacoustic microscopy using a 2-axis water-proofing MEMS scanner. Sci Rep. 5, 07932 (2015).
- Matthews, T. P., Zhang, C., Yao, D. K., Maslov, K., Wang, L. V. Label-free photoacoustic microscopy of peripheral nerves. J Biomed Opt. 19 (1), 016004 (2014).
- Hai, P., Yao, J., Maslov, K. I., Zhou, Y., Wang, L. V. Near-infrared optical-resolution photoacoustic microscopy. Opt Lett. 39 (17), 5192-5195 (2014).
- Danielli, A. Label-free photoacoustic nanoscopy. J Biomed Opt. 19 (8), 086006 (2014).
- Zhang, C. Reflection-mode submicron-resolution in vivo photoacoustic microscopy. J Biomed Opt. 17 (2), 020501 (2012).
- Hu, S., Maslov, K., Wang, L. V. Second-generation optical-resolution photoacoustic microscopy with improved sensitivity and speed. Opt Lett. 36 (7), 1134-1136 (2011).
- Maslov, K., Zhang, H. F., Hu, S., Wang, L. V. Optical-resolution photoacoustic microscopy for in vivo imaging of single capillaries. Opt Lett. 33 (9), 929-931 (2008).
- Upputuri, P. K., Krishnan, M., Pramanik, M. Microsphere enabled sub-diffraction limited optical resolution photoacoustic microscopy: a simulation study. J Biomed Opt. 22, 045001 (2017).
- Upputuri, P. K., Wen, Z. B., Wu, Z., Pramanik, M. Super-resolution photoacoustic microscopy using photonic nanojets: a simulation study. J Biomed Opt. 19 (11), 116003 (2014).
- Allen, T. J. Novel fibre lasers as excitation sources for photoacoustic tomography and microscopy et al. Proc SPIE. , 97080W (2016).
- Xing, W., Wang, L., Maslov, K., Wang, L. V. Integrated optical-and acoustic-resolution photoacoustic microscopy based on an optical fiber bundle. Opt Lett. 38 (1), 52-54 (2013).
- Estrada, H., Turner, J., Kneipp, M., Razansky, D. Real-time optoacoustic brain microscopy with hybrid optical and acoustic resolution. Laser Phys Lett. 11 (4), 045601 (2014).
- Jeon, S., Kim, J., Kim, C. In vivo switchable optica- and acoustic - resolution photoacoustic microscopy. Proc SPIE. , 970845 (2016).
- Song, W. Fully integrated reflection-mode photoacoustic, two-photon, and second harmonic generation microscopy in vivo. Sci Rep. 6, 32240 (2016).
- Park, J., et al. Delay-multiply-and-sum-based synthetic aperture focusing in Photoacoustic microscopy. J Biomed Opt. 21 (3), 036010-10 (2016).
- ANSI Standard Z136.1-2000. American National Standard for Safe Use of Lasers. , NY. (2000).
- Moothanchery, M., Pramanik, M. Performance Characterization of a Switchable Acoustic Resolution and Optical Resolution Photoacoustic Microscopy System. Sensors. 17 (2), 357 (2017).
