Summary
这里展示了可在体内在相同样品上进行浅层深度高分辨率成像和低分辨率深层组织成像的可切换声学分辨率（AR）和光学分辨率（OR）光声显微镜（AR-OR-PAM）系统。
Abstract
光声显微镜（PAM）是一种快速增长的invivo成像模式，结合光学和超声波，提供高分辨率穿透超过光学平均自由程（皮肤约1毫米）。通过将光学吸收对比度与单一模态中超声的高空间分辨率相结合，该技术可以穿透深层组织。光声显微镜系统可以具有较低的声学分辨率和探针深度或较高的光学分辨率和探针。通过单个系统实现高空间分辨率和大深度穿透是具有挑战性的。这项工作提出了一个AR-OR-PAM系统，能够在浅层深度进行高分辨率成像和体内相同样品的低分辨率深层组织成像。使用光学聚焦的1.4mm成像深度的横向分辨率为4μm，使用声学聚焦的具有7.8mm成像深度的45μm的横向分辨率成功利用组合系统进行演示。在这里， 进行体内小动物血液血管成像以证明其生物成像能力。
Introduction
高分辨率光学成像方式，如光学相干断层扫描，共聚焦显微镜和多光子显微镜，有许多好处。然而，随着成像深度的增加，空间分辨率显着降低。这是因为软组织中光传输的漫射性质1,2 。光激发和超声检测的集成提供了一种解决方案，以克服深层组织中高分辨率光学成像的挑战。光声显微镜（PAM）是一种可以提供比其他光学成像模式更深的成像的方式。已成功应用于体内结构，功能，分子和细胞成像3,4,5,6,7,8 ， 9，10，11，12，13研究结合强光学吸收对比度与超声波的高空间分辨率。
在PAM中，短的激光脉冲照射组织/样品。通过发色团（ 例如，黑色素，血红蛋白，水等 ）的光吸收导致温度升高，这又导致以声波（光声波）的形式产生压力波。产生的光声波可以由组织边界外的宽带超声换能器检测。利用弱光学和紧密的声学聚焦，可以在声分辨光声显微镜（AR-PAM） 14,15,16中实现深层组织成像。在AR-PAM，横向分辨率为45μm，成像深度高达3mm，已被证明15 。为了在声学上解析单个毛细管（约5μm），需要在> 400 MHz中心频率下运行的超声波换能器。在这样高的频率下，穿透深度小于100μm。使用紧密的光学聚焦可以解决紧密的聚焦造成的问题。光学分辨率光声显微镜（OR-PAM）能够分辨单个毛细管，甚至单个细胞17 ，并且已经实现了0.5μm的横向分辨率18,19,20,21,22,23,24 。使用光子纳米喷嘴可以帮助实现超出衍射极限分辨率的分辨率n 25，26 。在OR-PAM中，由于聚焦而使穿透深度受到限制，并且它可以在生物组织23内形象高达〜1.2mm 。因此，AR-PAM可以使图像更深，但分辨率更低，OR-PAM可以以非常高的分辨率进行成像，但成像深度有限。 AR和OR-PAM系统的成像速度主要取决于激光源27的脉冲重复率。
结合AR-PAM和OR-PAM将对需要高分辨率和深度成像的应用非常有利。将这些系统结合在一起已经做了很少的努力。通常，使用两种不同的成像扫描仪进行成像，这要求样品在两个系统之间移动，因此难以进行体内成像。然而，使用AR和OR PAM的混合成像可实现具有可扩展分辨率a的成像深度。在一种方法中，使用光纤束来传送用于AR和OR PAM的光。在这种方法中，使用两个单独的激光器（对于AR为570nm的高能激光器，对于OR为532nm的低能量，高重复率激光器），使得系统不方便和昂贵28 。 OR-PAM激光波长是固定的，并且使用该组合系统不可能进行许多研究，例如氧饱和度。 AR和OR PAM之间的比较研究也是不可能的，因为AR和OR之间的激光波长不同。此外，AR-PAM使用明场照明;因此，来自皮肤表面的强光电信号限制了图像质量。因此，该系统不能用于许多生物成像应用。在另一种执行AR和OR PAM的方法中，光学和超声波聚焦被移动，这使得光焦点和超声波聚焦不对齐。因此，图像质量不是最佳的 这项工作报告了一个可切换的AR和OR PAM（AR-OR-PAM）成像系统，能够对相同样品进行高分辨率成像和低分辨率深层组织成像，使用相同的激光和扫描仪进行两个系统EMS。 AR-OR-PAM系统的性能通过使用幻影实验确定空间分辨率和成像深度来表征。 在小鼠耳朵上进行体内血液血管成像以证明其生物成像能力。
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Protocol
所有动物实验均按照新加坡南洋理工大学机构动物保护和使用委员会（动物标本编号ARF-SBS / NIE-A0263）的批准规定和指导方针进行。
AR-OR-PAM系统（ 图1 ）
- 系统配置：AR-PAM
- 使用由二极管泵浦的固态Nd-YAG激光器（532nm）和可调谐范围为559-576nm的染料激光器组成的纳秒可调谐激光器系统作为光学照射源。使用外部控制器将激光波长设置为570 nm，使用激光软件将激光重复率设置为1 kHz。
- 在激光前面放置45°角的光束采样器，通过可变中性密度滤光片（NDF1; OD = 0-4.0）将5％的激光功率转移到光电二极管。
- 使用光束采样器将激光束转向90°直角棱镜（RAP1）。
- 使用另一个直角棱镜（RAP2）允许光束通过可变中性密度滤光片（NDF2; OD = 0-4.0）并通过多模光纤（MMF），将其引导通过光纤耦合器（FC）目标组合（数值孔径（NA）：0.25）和XY平移器。
- 使用XY转换器将光纤固定到扫描台上。将距离光纤输出端25毫米的平凸透镜（L1）放置在光纤以外的位置。
- 将准直光束通过顶角为130°的锥形透镜，以产生环形光束。使用自旋式光学冷凝器（OC），锥形角度为70°和110°并在中心有一个孔，将环形光束轻微聚焦到被摄体上。
- 在自制冷凝器的中心放置一个带有声透镜（AL）的50 MHz超声波换能器（UST）。
- 系统配置：OR-PAM
- 用一个由二极管泵浦的固态Nd-YAG激光器（532nm）和可调谐范围为559-576nm的染料激光器组成的纳秒可调谐激光器系统作为光学照射源。使用外部控制器将激光波长设置为570 nm，使用激光软件将激光重复率设置为5 kHz。
- 将计算机控制的旋转台（保持RAP1）旋转90°，将激光束转移到光圈上进行重新整形。
- 沿着光束使激光束放置一个可变的中性密度滤光片（OD：0-4.0），然后用聚光透镜（CL）对光束进行聚焦。将其穿过距离CL 75 mm的针孔（PH），进行空间过滤。
- 使用由0.1 NA物镜组成的单模光纤耦合器（FC）将空间滤波光束发射到单模光纤（SMF）上，以将光束聚焦到SMF上。
- 调整光纤耦合器以实现最大耦合效率。
- 将光纤固定到t上他使用滑板（SP）扫描舞台。放置距离SM光纤50 mm的消色差透镜（L2），以准直激光束。
- 使用运动学可控椭圆镜（M）将准直光束转向90°，以填充另一个相同的消色差透镜（L3）的后孔。使用透镜管（LT）将用于聚焦的消色差透镜放置在平移支架（TM2）上。
- 将聚焦光束通过由直角棱镜（RA）和菱形棱镜（RP）组成的自制光声光束组合器，其间具有一层硅油（SO）。
注意：硅油层将作为光学透明和声反射膜。 - 安装声透镜（AL），以提供菱形棱镜底部的声聚焦（焦距：〜46μm）。
- 将超声波换能器的中心频率为50 MHz放置在菱形棱镜的顶部;使用环氧树脂层进行有效耦合。
2.系统切换和对准 - 将自制的可切换板固定（通过拧紧）到由连接到计算机的3轴控制器控制的3轴电动平台。
- 使用保持架安装支架将AR和OR笼系统连接到自制板上，以便在AR和OR扫描头之间轻松切换。将扫描头滑动到成像区域的顶部。
- 使用Z级将AR-OR-PAM扫描仪头部的底部淹没在充满水的丙烯酸罐（13 cm x 30 cm x 3 cm）中，进行声耦合。
- 打开容器底板上直径为7厘米的成像窗口，并用聚乙烯膜密封以进行光学和声学传播。
- 使用脉冲回波放大器和示波器将超声波换能器对准。
- 在发送/接收模式下，将脉冲回波放大器的增益设置为24db。
- 使用同步信号fr使用脉冲回波放大器作为触发，并使用示波器检测来自玻璃滑块（从水箱底部插入）的背散射信号。
注意：幻灯片应该粘在黑色的胶带上。 - 移动Z轴以最大化脉冲回波信号的幅度（在示波器上查看）。
注意：当玻璃板对焦时，回波将具有最大幅度。
- 使用BNC电缆打开激光器并将UST连接到两个放大器，每个放大器具有24 dB固定增益。
注意：放大器的输出端连接到数据采集卡（DAQ）。 - 使用位于激光器前面的光电二极管（PD）的信号作为数据采集系统的触发器。
- 在AR-PAM中，改变锥形透镜（con.L）和光学聚光器（OC）之间的距离，以使从测试对象产生的光声信号（黑带粘贴在载玻片上）的振幅最大化。通过确定最大光声（PA）信号幅度，确保光和声聚焦是共焦的。
- 注意最大PA信号的延迟;请稍后再查看数据采集软件的重点。
- 松开扫描头的螺丝，并将扫描头从AR-PAM手动切换到OR-PAM。然后拧紧螺丝。
- 在OR-PAM中，改变聚焦消色差双重（透镜管（LT）内）和光声组合器之间的距离，以最大化示波器上显示的PA信号幅度。
- 注意最大PA信号的延迟。
注意：Finetuning是确定共焦排列的必要条件。
- 注意最大PA信号的延迟。
- 横向分辨率和成像深度量化
- 使用直径为100纳米的金纳米颗粒来确定AR a的横向分辨率d OR系统。
- 用等量的水稀释0.1mL的纳米颗粒溶液。将0.1 mL稀释的溶液分布在盖板上，并将其与罐下方的聚乙烯膜接触。
- 在扫描之前，确保AR-PAM和OR-PAM在数据采集软件（参见材料表）中保持对焦（步骤2.8和2.10）。
注意：通过了解步骤2.9和2.10中最大PA信号的微秒延迟乘以采样率（250 MS / s），图像将在数据采集软件中处于焦点。可以在软件中确定在数据采集期间必须省略的延迟，以便仅保存用于后处理的必要数据点。 - 设置AR-PAM的扫描参数，然后按“扫描”按钮开始光栅扫描。
- 在数据采集软件中以“4”mm / s的扫描速度在“速度”中设置AR-PAM的扫描参数;选项卡，“脉冲重复率”选项卡中的“1”kHz，“Y扫描范围”选项卡中的“0.5”mm，“X扫描范围”选项卡中的“0.5”mm。在“dx”选项卡中将x方向的步长设置为“4”μm。
注意：从方向的扫描速度速度和脉冲重复率（在这种情况下为4,000μm/ 1,000 Hz = 4μm）自动确定y方向的步长，
- 在数据采集软件中以“4”mm / s的扫描速度在“速度”中设置AR-PAM的扫描参数;选项卡，“脉冲重复率”选项卡中的“1”kHz，“Y扫描范围”选项卡中的“0.5”mm，“X扫描范围”选项卡中的“0.5”mm。在“dx”选项卡中将x方向的步长设置为“4”μm。
- 设置OR-PAM的扫描参数，然后按“扫描”按钮开始光栅扫描。
- 在“速度”选项卡中，将扫描参数设置为“2.5”mm / s的扫描速度，“脉冲重复率”选项卡中的“5”kHz，“Y扫描范围”为0.5“mm，选项卡，“X扫描范围”选项卡中为“0.5”mm。在“dx”选项卡中将x方向的步长设为“0.5”μm。
注意：从台阶的扫描速度和脉冲重复率（在这种情况下，2500μm/ 5000Hz =0.5μm）自动确定y方向的尺寸。
- 在“速度”选项卡中，将扫描参数设置为“2.5”mm / s的扫描速度，“脉冲重复率”选项卡中的“5”kHz，“Y扫描范围”为0.5“mm，选项卡，“X扫描范围”选项卡中为“0.5”mm。在“dx”选项卡中将x方向的步长设为“0.5”μm。
- 确保在扫描过程中，数据被连续捕获并存储在计算机上
注意：数据将仅在Y级的一个运动方向上捕获。 - 使用存储在计算机中的多个B扫描数据使用图像处理软件检索最大幅度投影（MAP）图像（参见材料表 ）。
- 使用来自扫描的单个纳米颗粒图像（多个图像中的多个图像）通过手动绘制通过纳米颗粒图像的中心区域的线来确定横向分辨率，以获得看起来像高斯曲线的点扩展函数。参见图2 。
- 使用Gau适应从单个纳米颗粒图像获得的点扩散函数ssian拟合函数，并使用图像处理软件测量半高宽（FWHM）（见材料表 ）。使用它作为横向分辨率。参见图2 。
- 将一块黑色胶带倾斜地放在一块切片的鸡肉组织上作为目标物体进行深度成像。将纸带放在水箱中。
注意：黑色胶带卡在具有尖锐尖端的金属板上，这有助于将胶带粘贴到纸巾上。 - 将AR-PAM的扫描参数设置到数据采集软件中，然后按“扫描”按钮捕获单个B扫描图像，以确定最大成像深度。
- 在“速度”标签中将扫描参数设置为“15”mm / s，“脉冲重复率”选项卡中为“1”kHz，“Y扫描范围”选项卡中为“5”cm，“0.1” “mm”在“X扫描范围”选项卡。设定t在“dx”选项卡中，在x方向上的步长为“0.1”mm。
- 设置OR-PAM的扫描参数，然后按“扫描”按钮捕获单个B扫描图像，以确定最大成像部分。
- 将数据采集软件中的扫描参数设置为“速度”选项卡中的“15”mm / s扫描速度，“脉冲重复率”选项卡中的“5”kHz，“Y扫描范围”中的“2”选项卡，“X扫描范围”选项卡中为“0.1”mm。在“dx”选项卡中，将x方向的步长设置为“0.1”mm。
注意：由于X扫描范围和dx相同，因此只能捕获一次B扫描。时间分辨的PA信号乘以软组织中的声速（1,540m / s）将产生A线图像。在Y级的连续运动期间捕获多条A线以产生B扫描。
- 将数据采集软件中的扫描参数设置为“速度”选项卡中的“15”mm / s扫描速度，“脉冲重复率”选项卡中的“5”kHz，“Y扫描范围”中的“2”选项卡，“X扫描范围”选项卡中为“0.1”mm。在“dx”选项卡中，将x方向的步长设置为“0.1”mm。
- 体内</ em>成像的小鼠耳血管血管
- 使用体重25克，年龄4周的雌鼠。
- 使用氯胺酮（120mg / kg）和西咪嗪（16mg / kg）腹腔注射（剂量为0.1mL / 10g）麻醉动物。
- 使用脱毛霜从动物耳朵上取下头发。擦拭区域清洁。用无菌眼软膏覆盖动物的眼睛，以避免任何分散的激光束落在眼睛上。
- 将动物放在还有一个微型板的台上定位耳朵。
- 在成像期间，用吸入的异氟烷（0.75L，1L / min氧气）维持麻醉。
- 将脉搏血氧计固定到鼠标腿或尾部并监测生理状态。使用超声波凝胶使成像区域与聚乙烯膜接触。
- 设置AR-PAM的扫描参数，然后按“扫描”按钮启动光栅扫描ING。
- 在“速度”选项卡中，在数据采集软件中以“15”mm / s扫描速度设置AR-PAM的扫描参数，“脉冲重复率”选项卡中的“1”kHz，“ Y扫描范围“选项卡，”X扫描范围“选项卡中为”6“mm。在“dx”选项卡中将x方向的步长设置为“30”μm。
注意：从方向的扫描速度和脉冲重复率（在这种情况下，为15,000μm/ 1,000 Hz = 15μm）自动确定y方向的步长。
- 在“速度”选项卡中，在数据采集软件中以“15”mm / s扫描速度设置AR-PAM的扫描参数，“脉冲重复率”选项卡中的“1”kHz，“ Y扫描范围“选项卡，”X扫描范围“选项卡中为”6“mm。在“dx”选项卡中将x方向的步长设置为“30”μm。
- 完成AR-PAM扫描后，将成像头位置从AR-PAM切换到OR-PAM（如第2节所述）。
- 设置OR-PAM的扫描参数，然后按“扫描”按钮开始光栅扫描。
- 在数据采集软件中以“15”mm / s扫描速度在“速度”中设置OR-PAM的扫描参数y“选项卡，”脉冲重复率“选项卡中的”5“kHz，”Y扫描范围“选项卡中的”10“mm，”X扫描范围“选项卡中的”6“mm，设置步长在“dx”标签中的x方向为“6”μm。
注意：沿着方向的扫描速度和脉冲重复率（在这种情况下为15,000μm/ 5,000 Hz = 2μm），自动确定y方向的步长。
- 在数据采集软件中以“15”mm / s扫描速度在“速度”中设置OR-PAM的扫描参数y“选项卡，”脉冲重复率“选项卡中的”5“kHz，”Y扫描范围“选项卡中的”10“mm，”X扫描范围“选项卡中的”6“mm，设置步长在“dx”标签中的x方向为“6”μm。
- 使用计算机中存储的多个B扫描数据，使用图像处理软件检索MAP图像。
- 在整个成像期间观察动物。
实验步骤
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Representative Results
AR-OR-PAM系统的原理图如图1所示。在这种设置中，所有组件都集成在一起，并组装在一个光学保持架中。使用笼式系统可使AR-OR-PAM扫描头紧凑，易于组装，对齐和集成到单个扫描台上。
在图像采集期间使用成像头的二维连续光栅扫描。时间分辨的PA信号乘以声速（1,540m / s）以获得A线。在Y阶段的连续运动期间捕获的多条A线产生二维B扫描。拍摄成像区域的多次B扫描并存储在计算机中，并用于处理和产生MAP光声图像。
确定可切换系统的分辨率，使用单个纳米颗粒的MAP图像31 。绘制沿图像中心横向方向的光声振幅，拟合为高斯函数。高斯拟合的FWHM被认为是横向分辨率。测量的AR-PAM横向分辨率为45μm，如图2a所示。类似地，使用OR-PAM获得的单个纳米颗粒图像沿中心横向拟合以确定OR-PAM的分辨率， 如图 2b所示。测量的横向分辨率为4μm，由FWHM确定。该图的插图显示了金纳米颗粒的相应的MAP图像。理论上，AR-PAM的光学衍射限制横向分辨率为45μm，使用以下公式确定：0.72λ/ NA，其中λ是中心声波长，NA是数值超声波换能器的孔径。理论分析与实验数据一致。类似地，OR-PAM的理论横向分辨率为2.6μm，如下式计算：0.51λ/ NA，其中λ是激光波长，NA是物镜的数值孔径。 OR-PAM的实验测量横向分辨率比衍射极限估计差，这可能是由于波前像差。由于AR和OR都使用类似的换能器和声透镜，因此根据0.88 c / Δf ，理论轴向分辨率为30μm，其中c为软组织中的声速， Δf为超声波换能器的频率带宽。另外，对于OR-PAM 20和AR-PAM 32 ，横向分辨率将沿着轴向方向变化。报道的横向分辨率在焦平面上。
图3a显示了鸡蛋组织上黑带的照片。使用AR-PAM和OR-PAM捕获单个B扫描图像。 图 3b和图 3c分别示出了AR-PAM和OR-PAM的单个B扫描PA图像。从图 3b可以看出，AR-PAM系统可以将黑色胶带清晰地图像到组织表面下方〜7.8 mm。类似地，使用OR-PAM系统，可以将黑带清晰地图像到组织表面下方〜1.4mm（ 图 3c ）。信噪比（SNR）也由图像确定。 SNR定义为V / n ，其中<em> V是峰峰值PA信号幅度， n是背景噪声的标准偏差。在4.6mm和7.8mm成像深度处测得的SNR分别为2.6和1.4。对于OR-PAM，1.4mm成像深度处的SNR为1.4。为了证明可切换AR-OR PAM系统的生物成像能力， 在小鼠耳朵上进行体内血液血管成像。显示用于成像的活的鼠标耳朵的血管解剖结构的照片如图4a所示。使用AR-PAM，将10mm×6mm扫描区域成像，在Y方向上具有15μm的步长，在X方向上成为30μm的步长。成像需要10分钟才能完成。目前，成像系统仅在一个方向获取数据;通过修改程序以获得双向数据采集能力，可以将采集时间缩短到几乎一半。 AR-PAM的MAP图像如图4所示b 。感兴趣区域的特写如图4 c所示。使用OR-PAM扫描的类似区域，在Y方向上步长为3μm，在X方向上为6μm， 如图 4d所示。成像花费46分钟完成。感兴趣区域的特写如图4 e所示。 OR-PAM可以清楚地解决单个毛细血管，AR-PAM无法解决。 AR-PAM可以解析厚度超过45μm的血管。
总之，已经开发了可以使用紧密光学聚焦实现高分辨率成像的可切换AR-OR-PAM系统以及使用声学聚焦的深层组织成像。可切换AR-OR-PAM系统的性能使用横向分辨率和成像深度测量进行了量化。 体内螺柱还进行了显示其生物成像能力。 这种可切换的光声显微镜系统可以提供高的时间和空间分辨率，使系统对于包括血管生成，药物反应等成像在内的应用非常重要，其中成像单个毛细血管和深脉管系统是重要的。可以通过用10cm行驶电动平台（y轴）替换自制的可切换板来进行系统的进一步修改或改进。通过校正波前像差可以进一步提高OR-PAM的横向分辨率。为AR-PAM提供更高的脉冲能量也将提高SNR和成像深度。
在OR-PAM的情况下，假设光学对焦在体外成像的皮肤表面以下为150μm，则表面光斑尺寸为22.5μm。提供90 nJ的单个激光脉冲给出一个ma最大脉冲能量为20.4 mJ / cm 2 。对于AR-PAM，激光焦点直径为2mm。提供50μJ的单个激光脉冲在焦点为1.6 mJ / cm 2时提供最大的脉冲能量，良好的ANSI安全极限为20 mJ / cm 2，33 。
图1 ：AR-OR-PAM成像系统的示意图。 （ a ）BS：光束取样器，NDF：中性密度滤光片，RAP - 直角棱镜，PD：光电二极管，CL：聚光透镜，PH：针孔，FC：光纤耦合器，UST：超声波传感器，MMF：多模光纤，SMF：单模光纤，DAQ：数据采集卡，TS：平台，Con.L：锥形透镜，L1：凸透镜，L2＆L3：消色差透镜，RA：直角棱镜，RP：菱形棱镜，OC：光冷凝器，M：m透镜，SP：滑板，LT：透镜管，TM：平移安装座，KMM：运动镜安装座，AL：声透镜。 （ b ）原型AR-OR-PAM系统的照片。 （ c ）光声组合器的特写。 （ d ）在中心用UST的光学冷凝器的特写镜头。经许可转载自参考文献34 。 请点击此处查看此图的较大版本。
图2 ：AR-OR-PAM系统的横向分辨率测试：通过成像直径为100nm的金纳米颗粒估计的横向分辨率。黑色（*）点：光声信号;蓝线：（ a ）AR-PAM和（ b ）的高斯拟合曲线OR-PAM。插图显示（a）中的代表性AR-PAM图像和单金纳米颗粒（b）中的OR-PAM图像。经许可转载自参考文献34 。 请点击此处查看此图的较大版本。
图3 ：成像深度测量：将黑色胶带的单B扫描PA图像倾斜插入到鸡肉组织上。 （ a ）原理图。 （ b ）AR-PAM图像。 （ c ）OR-PAM图像。经许可转载自参考文献34 。 请点击此处查看此图的较大版本。
图4 ： 小鼠耳朵的 体内 光声图像： （ a ）小鼠耳朵脉管系统的照片。 （b）AR-PAM图像。 （ c ）（ b ）中的感兴趣区域（ROI）的特写，如白色虚线所示。 （ d ）OR-PAM图像。 （ e ）（ d ）中的感兴趣区域（ROI），如白色虚线所示。 （ f ）（e）中的ROI白线的特写图像，显示单个毛细管。 经许可转载自参考文献34 。 请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
总而言之，已经开发出可切换的AR和OR PAM系统，其可以在更低的成像深度处实现高分辨率成像并且在较高的成像深度处实现较低分辨率的成像。确定可切换系统的横向分辨率和成像深度。该可切换PAM系统的优点包括：（1）使用紧密光学聚焦的高分辨率成像; （2）使用声学聚焦的深层组织成像; 3）AR-PAM的暗场照明，防止强烈的PA信号出现在皮肤表面; 4）将样品保持在一个地方，而不是在不同系统之间移动的能力; 5）避免使用多个激光和扫描阶段的可能性;和6）最少使用自制组件。这是OR-PAM和暗场AR-PAM的第一个报告组合，可以提供相同样品的高分辨率，浅深度图像和低分辨率深层组织图像，而无需移动样品/ obJECT。使用相同的扫描级和激光器使系统效率高，成本效益高。组合系统具有4μm横向分辨率，成像深度为1.4mm，以及具有7.8mm成像深度的45μm横向分辨率。该系统由具有最小自制组件的光学笼系统制成，使得更容易在AR和OR PAM之间组装，对齐和切换。组合的扫描头是紧凑的，并且可以容易地组装在单个扫描台上。使用组合系统， 体内成像成功证明。
开发的系统可用于临床前成像。主要临床前应用包括血管生成，肿瘤微环境，微循环，药物反应，脑功能，生物标志物和基因活动的成像。系统的局限性包括扫描时间。目前需要长时间的扫描时间，但可以通过在机器人中获取数据来减少扫描时间h方向。目前无法在OR-PAM和AR-PAM之间进行同步图像采集。目前，需要在OR-PAM和AR-PAM之间进行手动切换，这可以通过使用具有至少10cm Y方向运动的平移台来避免。协议中的关键步骤包括光学和声学焦点的共焦确定;对于OR-PAM，实现小于5μm的光斑的成像，成像单个毛细管;以及用于OR-PAM的光声波束组合器和用于AR-PAM的光学冷凝器的设计。
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Disclosures
所有动物实验均按照新加坡南洋理工大学机构动物保护和使用委员会（动物协议号ARF-SBS / NIE-A0263）批准的准则和条例进行。作者对手稿没有相关的经济利益，也没有其他潜在的利益冲突披露。
Acknowledgments
作者要感谢新加坡教育部（ARC2 / 15：M4020238）资助的二级拨款的财政支持。作者还要感谢周伟荣博比机车店的帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Q-switched Nd:YAG laser | Edgewave | BX80-2-L | Pump laser |
| Credo-High Repetition Rate Dye Laser | Spectra physics | CREDO-DYE-N | Dye laser |
| Precision Linear Stage | Physik Instrumente | PLS 85 | XY raster scanning stage |
| Translation stage | Physik Instrumente | VT 80 | Confocal determine |
| Mounted Silicon photodiode | Thorlabs | SM05PD1A | Triggering/Pulse variation |
| Motorized continuous Rotational stage | Thorlabs | CR1/M-Z7 | Diverting laser beam |
| Mounted Continuously Variable ND Filter | Thorlabs | NDC-50C-4M | Intensity variable |
| Fiber Patch Cable | Thorlabs | M29L01 | Multimode fiber |
| Microscope objective | Newport | M-10X | Objective |
| XY translating mount | Thorlabs | CXY1 | Translating mount |
| Plano convex lens | Thorlabs | LA1951 | Collimating lens |
| Conical lens | Altechna | APX-2-B254 | Ring shape beam |
| Translation stage | Thorlabs | CT1 | Translating stage |
| Optical condenser | Home made | ||
| Ultrasonic transducer | Olympus-NDT | V214-BB-RM | 50MHz transducer |
| Plano concave lens | Thorlabs | LC4573 | Acoustic lens |
| Pulser/Receiver | Olympus-NDT | 5073PR | Pulse echo amplifier |
| Mounted standard iris | Thorlabs | ID12/M | Beam shaping |
| Plano convex lens | Thorlabs | LA4327 | Condenser lens |
| Mounted precision pinhole | Thorlabs | P50S | Spatial filtering |
| Single mode fiber patch cable | Thorlabs | P1-460B-FC-1 | Single mode fiber |
| Fiber coupler | Newport | F-91-C1 | Single mode coupling |
| Achromatic doublet lens | Edmund Optics | 32-317 | Achromatic doublet |
| Protected silver elliptical mirror | Thorlabs | PFE10-P01 | Mirror |
| Right angle kinematic mirror mount | Thorlabs | KCB1 | Mirror mount |
| Z-Axis Translation Mount | Thorlabs | SM1Z | z translator |
| Lens tube | Thorlabs | SM05L10 | |
| UV Fused Silica Right-Angle Prism | Thorlabs | PS615 | Right angle prism |
| Rhomboid prism | Edmund Optics | 47-214 | Shear wave |
| Dimethylpolysiloxane | Sigma Aldrich | DMPS1M | Silicon oil |
| Amplifier | Mini Circuits | ZFL-500LN | Amplifier |
| 16 bit high speed digitizer | Spectrum | M4i.4420 | Data acquisition card |
| Oscilloscope | Agilent Technologies | DS06014A | |
| Mice | InVivos Pte.Ltd | ICR | Animal model |
| Ultrasound gel | Progress/parker acquasonic gel | PA-GEL-CLEA-5000 | Acoustic coupling |
| Water tank | Home made | ||
| Translation stage | Homemade | Switching AR-OR | |
| Gold nanoparticles | Sigma Aldrich | 742031 | Lateral resolution |
| Sterile ocular ointment | Alcon | Duratears | Animal imaging |
| 1951 USAF resolution test target | Edmund Optics | 38257 | Confocal alignment |
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