Summary
Ici, on démontre un système de résolution acoustique (AR) et un système de microscopie photoacoustique à résolution optique (OR) (AR-OR-PAM) capable à la fois d'imagerie haute résolution à faible profondeur et d'imagerie tissulaire profonde à faible résolution sur le même échantillon in vivo .
Abstract
La microscopie photoacoustique (PAM) est une modalité d'imagerie invivo à croissance rapide qui combine à la fois l'optique et l'échographie, offrant une pénétration au-delà du chemin libre moyen optique (~ 1 mm de peau) à haute résolution. En combinant le contraste d'absorption optique avec la résolution spatiale élevée de l'échographie en une seule modalité, cette technique peut pénétrer les tissus profonds. Les systèmes de microscopie photoacoustique peuvent avoir une faible résolution acoustique et une sonde profonde ou une résolution optique élevée et une sonde peu profonde. Il est difficile de réaliser une résolution spatiale élevée et une pénétration de grande profondeur avec un système unique. Ce travail présente un système AR-OR-PAM capable à la fois d'imagerie à haute résolution à des profondeurs peu profondes et l'imagerie en tissu profond à faible résolution du même échantillon in vivo . Une résolution latérale de 4 μm avec une profondeur d'image de 1,4 mm utilisant une focalisation optique et une résolution latérale de 45 μm avec une profondeur d'image de 7,8 mm en utilisant la focalisation acoustique ont été couronnées de succèsA démontré l'utilisation du système combiné. Ici, l'imagerie vasculaire de sang de petit animal in vivo est réalisée pour démontrer sa capacité d'imagerie biologique.
Introduction
Les modalités d'imagerie optique haute résolution, telles que la tomographie par cohérence optique, la microscopie confocale et la microscopie multiphotonique, présentent de nombreux avantages. Cependant, la résolution spatiale diminue de manière significative à mesure que la profondeur d'imagerie augmente. Ceci est dû à la nature diffuse du transport de lumière dans les tissus mous 1 , 2 . L'intégration de l'excitation optique et de la détection par ultrasons fournit une solution pour surmonter le défi de l'imagerie optique haute résolution dans les tissus profonds. La microscopie photoacoustique (PAM) est une telle modalité qui peut fournir une image plus profonde que d'autres modalités d'imagerie optique. Il a été appliqué avec succès à des images structurales, fonctionnelles, moléculaires et cellulaires in vivo 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 en combinant le contraste d'absorption optique fort avec la résolution spatiale élevée des ultrasons.
Dans PAM, une impulsion laser courte irradie le tissu / échantillon. L'absorption de la lumière par les chromophores ( par exemple, la mélanine, l'hémoglobine, l'eau, etc. ) entraîne une augmentation de la température, ce qui entraîne la production d'ondes de pression sous forme d'ondes acoustiques (ondes photoacoustiques). Les ondes photoacoustiques générées peuvent être détectées par un transducteur à ultrasons large bande à l'extérieur de la limite tissulaire. En utilisant une faible focalisation acoustique optique et étanche, l'imagerie des tissus profonds peut être obtenue dans la microscopie photoacoustique à résolution acoustique (AR-PAM) 14 , 15 , 16 . En AR-PAM, une résolution latérale de 45 μm et une profondeur d'imagerie jusqu'à 3 mm ont été démontrées 15 . Afin de résoudre des capillaires individuels (~ 5 μm) acoustiquement, des transducteurs à ultrasons fonctionnant à des fréquences centrales de 400 MHz sont requis. À de telles fréquences élevées, la profondeur de pénétration est inférieure à 100 μm. Le problème causé par la mise au point acoustique étroite peut être résolu en utilisant une focalisation optique étanche. La microscopie photoacoustique à résolution optique (OR-PAM) est capable de résoudre des capillaires simples, ou même une seule cellule 17 , et une résolution latérale de 0,5 μm a été réalisée 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 . L'utilisation d'un nanojet photonique peut aider à obtenir une résolution au-delà de la résolution limitée par diffractionN 25 , 26 . Dans OR-PAM, la profondeur de pénétration est limitée en raison de la focalisation de la lumière, et elle peut image jusqu'à ~ 1,2 mm à l'intérieur du tissu biologique 23 . Par conséquent, AR-PAM peut l'image plus profonde, mais avec une résolution plus basse, et OR-PAM peut image avec une très haute résolution, mais avec une profondeur d'imagerie limitée. La vitesse d'imagerie du système AR et OR-PAM dépend principalement du taux de répétition des impulsions de la source laser 27 .
La combinaison de AR-PAM et de OR-PAM sera d'un grand bénéfice pour les applications nécessitant à la fois une image haute résolution et une image plus profonde. De petits efforts ont été faits pour combiner ces systèmes ensemble. Habituellement, deux scanners d'imagerie différents sont utilisés pour l'imagerie, ce qui nécessite que l'échantillon soit déplacé entre les deux systèmes, ce qui rend difficile l'exécution de l' imagerie in vivo . Cependant, l'imagerie hybride avec AR et OR PAM permet l'imagerie avec des résolutions évolutives aNd profondeur. Dans une approche, un faisceau de fibres optiques est utilisé pour délivrer de la lumière pour les AR et OR PAM. Dans cette approche, deux lasers séparés (un laser à haute énergie à 570 nm pour l'AR et un laser à faible intensité et à répétition élevée à 532 nm pour l'OR) sont utilisés, rendant le système incommode et coûteux 28 . La longueur d'onde laser OR-PAM est fixe, et de nombreuses études, par exemple sur la saturation en oxygène, ne sont pas possibles en utilisant ce système combiné. Des études comparatives entre AR et OR PAM ne sont également pas possibles en raison de la différence de longueur d'onde laser entre l'AR et l'OR. En outre, AR-PAM utilise l'éclairage de champ lumineux; Par conséquent, les signaux photoacoustiques forts de la surface de la peau limitent la qualité de l'image. Pour cette raison, le système ne peut pas être utilisé pour de nombreuses applications de bioimagerie. Dans une autre approche pour exécuter AR et OR PAM, la mise au point optique et ultrason est décalée, ce qui rend la mise au point de la lumière et la focalisation ultrasonore non alignées. Ainsi, la qualité de l'image n'est pas optimale 30 . Dans tous ces cas, AR-PAM n'a pas utilisé d'éclairage de champ sombre. L'utilisation de l'illumination en champ sombre peut réduire la génération de signaux photoacoustiques forts de la surface de la peau. Par conséquent, l'imagerie des tissus profonds peut être réalisée à l'aide d'un éclairage en forme d'anneau, car la sensibilité de détection des signaux photoacoustiques profonds sera plus élevée que celle de l'éclairage de champ lumineux.
Ce travail rapporte un système d'imagerie AR et OR PAM (AR-OR-PAM) commutable capable à la fois d'imagerie haute résolution et d'imagerie en profondeur de faible résolution du même échantillon, en utilisant le même laser et scanner pour les deux systèmesEms. La performance du système AR-OR-PAM a été caractérisée par la détermination de la résolution spatiale et de la profondeur d'imagerie en utilisant des expériences fantômes. L' imagerie vasculaire sanguine in vivo a été effectuée sur une oreille de souris pour démontrer sa capacité d'imagerie biologique.
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Protocol
Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées conformément aux règlements et aux lignes directrices approuvés par le Comité institutionnel pour les soins et l'utilisation des animaux de l'Université technologique de Nanyang, Singapour (Numéro de protocole animal ARF-SBS / NIE-A0263).
1. Système AR-OR-PAM ( Figure 1 )
- Configuration du système: AR-PAM
- Utilisez un système laser accordable à la nanoseconde composé d'un laser Nd-YAG à l'état solide pompé à diodes (532 nm) et d'un laser à colorant avec une plage d'accessibilité de 559-576 nm en tant que source d'irradiation optique. Réglez la longueur d'onde du laser à 570 nm en utilisant un contrôleur externe et le taux de répétition du laser à 1 kHz en utilisant le logiciel laser.
- Placez un échantillonneur de faisceau à un angle de 45 ° devant le laser pour dévier 5% de la puissance du laser vers une photodiode à travers un filtre de densité neutre variable (NDF1; OD = 0-4.0).
- Retirer le faisceau laser après l'échantillonneur du faisceau à 90 ° en utilisantUn prisme à angle droit (RAP1).
- Utilisez un autre prisme à angle droit (RAP2) pour permettre au faisceau de passer à travers un filtre de densité neutre variable (NDF2; OD = 0-4.0) et sur une fibre multimode (MMF), en le dirigeant à travers un coupleur de fibre (FC) -a Combinaison d'objectifs (ouverture numérique (NA): 0,25) et un traducteur XY.
- Fixez la fibre au stade de la numérisation à l'aide d'un traducteur XY. Placez une lentille plan-convexe (L1) à 25 mm de l'extrémité de sortie de la fibre pour colimater le faisceau hors de la fibre.
- Passer le faisceau collimaté à travers une lentille conique avec un angle de sommet de 130 ° pour générer un faisceau en forme d'anneau. Concentrez-vous faiblement le faisceau en forme d'anneau sur le sujet en utilisant un condenseur optique fait maison (OC) avec des angles de cône de 70 ° et 110 ° et avec un trou au centre.
- Placez un transducteur ultrasonique de 50 MHz (UST) avec une lentille acoustique (AL) au centre du condenseur fait maison.
- Configuration du système: OR-PAM
- Utiliser unSystème laser accordable à la nanoseconde composé d'un laser Nd-YAG à l'état solide pompé à diodes (532 nm) et d'un laser colorant avec une plage d'accessibilité de 559 à 576 nm en tant que source d'irradiation optique. Réglez la longueur d'onde laser à 570 nm à l'aide d'un contrôleur externe et du taux de répétition du laser à 5 kHz à l'aide du logiciel laser.
- Faites pivoter le niveau de rotation contrôlé par ordinateur (en tenant le RAP1) de 90 ° pour dévier le faisceau laser sur un iris pour le remodeler.
- Atténuez le faisceau laser en plaçant un filtre de densité neutre variable (OD: 0-4.0) le long du faisceau, puis concentrez le faisceau avec une lentille de condensateur (CL). Passer à travers un sténopé (PH) à 75 mm du CL pour le filtrage spatial.
- Lancez le faisceau filtré spatialement sur une fibre mono-mode (SMF) à l'aide d'un coupleur fibre optique (FC) constitué d'un objectif de 0,1 NA pour focaliser le faisceau lumineux sur le SMF.
- Ajustez le coupleur de fibres pour obtenir une efficacité maximale de couplage.
- Fixez la fibre sur tIl a balayé l'étape en utilisant une plaque de glissement (SP). Placez une lentille achromatique (L2) à 50 mm de la fibre SM pour colimater le faisceau laser.
- Dévier le faisceau collimaté de 90 ° en utilisant un miroir elliptique contrôlable cinématique (M) pour remplir l'ouverture arrière d'une autre lentille achromatique identique (L3). Placez la lentille achromatique utilisée pour la mise au point sur un support de traduction (TM2) à l'aide d'un tube à lentille (LT).
- Passez le faisceau de focalisation à travers un combineur de faisceau opto-acoustique fait maison comprenant un prisme à angle droit (RA) et un prisme rhomboïdal (RP), avec une couche d'huile de silicium (SO) entre les deux.
REMARQUE: La couche d'huile de silicium agira comme un film optiquement transparent et acoustiquement réfléchissant. - Fixez une lentille acoustique (AL) pour fournir une focalisation acoustique (diamètre focal: ~ 46 μm) au bas du prisme rhomboïde.
- Placez le transducteur à ultrasons avec une fréquence centrale de 50 MHz sur le prisme rhomboïdal; Utiliser une couche époxy pour un couplage efficace.
2. Commutation et alignement du système - Fixer (en vissant fermement) la plaque commutable maison à un étage motorisé à 3 axes contrôlé par un contrôleur 3 axes connecté à l'ordinateur.
- Fixez le système de cage AR et OR à la plaque maison en utilisant des supports de fixation en cage pour faciliter la commutation entre les têtes de balayage AR et OR. Faites glisser la tête de balayage en haut de la zone d'imagerie.
- Utilisez le stade Z pour immerger la partie inférieure de la tête de scanner AR-OR-PAM dans un réservoir acrylique rempli d'eau (13 cm x 30 cm x 3 cm) pour un couplage acoustique.
- Ouvrez une fenêtre d'imagerie avec un diamètre de 7 cm sur la plaque inférieure du réservoir et scellez-la avec une membrane en polyéthylène pour la transmission optique et acoustique.
- Utilisez un amplificateur impulsionnel et un oscilloscope pour aligner le transducteur ultrason.
- Réglez le gain dans l'amplificateur d'écho de impulsions à 24 db en mode transmission / réception.
- Utilisez le signal de synchronisation frOm l'amplificateur impulsionnel comme déclencheur et détecter le signal rétrodiffusé d'une glissière en verre (inséré dans le fond du réservoir d'eau) à l'aide d'un oscilloscope.
REMARQUE: la diapositive devrait avoir une bande noire collée à elle. - Déplacez l'axe Z pour maximiser l'amplitude du signal impulsionnel (vu sur l'oscilloscope).
REMARQUE: Lorsque la plaque de verre est en mise au point, l'écho aura son amplitude maximale.
- Allumez le laser et connectez l'UST à deux amplificateurs, chacun avec un gain fixe de 24 dB, en utilisant des câbles BNC.
REMARQUE: les sorties des amplificateurs sont connectées à la carte d'acquisition de données (DAQ). - Utilisez le signal de la photodiode (PD) placé devant le laser comme un déclencheur pour le système d'acquisition de données.
- Dans AR-PAM, modifiez la distance entre la lentille conique (con.L) et le condensateur optique (OC) pour maximiser l'amplitude du signal photoacoustique généré à partir de l'objet de test (bande noire collée sur une glissière en verre).Assurez-vous que les foces optiques et acoustiques sont confocales en déterminant l'amplitude maximale du signal photoacoustique (PA).
- Notez le délai des signaux PA maximum; Utilisez-le plus tard pour vérifier l'accent sur le logiciel d'acquisition de données.
- Desserrez la vis de la tête de balayage et basculez manuellement la tête de balayage depuis AR-PAM vers OR-PAM. Ensuite, serrez les vis.
- Dans OR-PAM, modifiez la distance entre le doublet achromatique de focalisation (à l'intérieur du tube d'objectif (LT)) et le combineur opto-acoustique pour maximiser l'amplitude du signal PA indiquée sur l'oscilloscope.
- Notez le délai des signaux PA maximum.
REMARQUE: le Finetuning est nécessaire pour déterminer l'arrangement confocal.
- Notez le délai des signaux PA maximum.
- Résolution latérale et quantification de profondeur d'imagerie
- Utilisez des nanoparticules d'or de 100 nm de diamètre pour déterminer la résolution latérale de l'AR etD OU système.
- Diluer 0,1 ml de solution de nanoparticules avec une quantité égale d'eau. Distribuer 0,1 ml de solution diluée sur un patin de recouvrement et le mettre en contact avec la membrane en polyéthylène sous le réservoir.
- Assurez-vous que l'AR-PAM et le OR-PAM sont mis au point dans le logiciel d'acquisition de données (voir la Table des matériaux) avant la numérisation (étapes 2.8 et 2.10).
REMARQUE: en connaissant le délai de microseconde des signaux PA maximum des étapes 2.9 et 2.10, multiplié par le taux d'échantillonnage (250 MS / s), l'image sera mise au point dans le logiciel d'acquisition de données. Le délai qui doit être omis pendant l'acquisition de données peut être déterminé dans le logiciel afin d'enregistrer uniquement les points de données nécessaires pour le post-traitement. - Réglez les paramètres de balayage pour l'AR-PAM et appuyez sur le bouton "balayage" pour lancer la numérisation raster.
- Définissez les paramètres d'analyse pour l'AR-PAM dans le logiciel d'acquisition de données à une vitesse de balayage de "4" mm / s dans la "vitesse"; Onglet "1" kHz dans l'onglet "taux de répétition d'impulsion", "0,5" mm dans l'onglet "Balayage Y" et "0,5" mm dans l'onglet "plage de balayage X". Réglez la taille des étapes dans la direction x à "4" μm dans l'onglet "dx".
REMARQUE: la taille de l'étape dans la direction y est déterminée automatiquement à partir de la vitesse de la vitesse de balayage de l'étage et du taux de répétition des impulsions (dans ce cas, 4,000 μm / 1000 Hz = 4 μm)
- Définissez les paramètres d'analyse pour l'AR-PAM dans le logiciel d'acquisition de données à une vitesse de balayage de "4" mm / s dans la "vitesse"; Onglet "1" kHz dans l'onglet "taux de répétition d'impulsion", "0,5" mm dans l'onglet "Balayage Y" et "0,5" mm dans l'onglet "plage de balayage X". Réglez la taille des étapes dans la direction x à "4" μm dans l'onglet "dx".
- Réglez les paramètres de balayage pour le OR-PAM et appuyez sur le bouton "scan" pour lancer la numérisation raster.
- Définissez les paramètres de balayage dans le logiciel d'acquisition de données à une vitesse de balayage de "2,5" mm / s dans l'onglet "vitesse", "5" kHz dans l'onglet "taux de répétition d'impulsion", "0,5" mm dans la "plage de balayage Y" Onglet et "0,5" mm dans l'onglet "plage de balayage X". Réglez la taille de l'étape dans la direction x en "0,5" μm dans l'onglet "dx".
NOTE: le sLa taille de la taille dans la direction y est automatiquement déterminée à partir de la vitesse de la vitesse de balayage de l'étage et du taux de répétition des impulsions (dans ce cas, 2,500 μm / 5 000 Hz = 0,5 μm).
- Définissez les paramètres de balayage dans le logiciel d'acquisition de données à une vitesse de balayage de "2,5" mm / s dans l'onglet "vitesse", "5" kHz dans l'onglet "taux de répétition d'impulsion", "0,5" mm dans la "plage de balayage Y" Onglet et "0,5" mm dans l'onglet "plage de balayage X". Réglez la taille de l'étape dans la direction x en "0,5" μm dans l'onglet "dx".
- Assurez-vous que pendant la procédure de numérisation, les données sont continuellement capturées et stockées sur l'ordinateur
REMARQUE: Les données ne seront capturées que dans une direction de mouvement du stade Y. - Utilisez les multiples données de B-scan stockées dans l'ordinateur pour récupérer les images de projection d'amplitude maximale (MAP) à l'aide d'un logiciel de traitement d'image (voir la Table des matériaux ).
- Utilisez une seule image de nanoparticules (hors images multiples) à partir de la numérisation pour déterminer la résolution latérale en traçant manuellement une ligne dans la région centrale de l'image de nanoparticule pour obtenir une fonction à répartition ponctuelle qui ressemble à une courbe gaussienne. Voir la figure 2 .
- Ajuster la fonction de propagation de points obtenue à partir d'une seule image de nanoparticules à l'aide d'un GauSsian et mesurer la largeur totale à moitié maximum (FWHM) à l'aide du logiciel de traitement d'image (voir la table des matières ). Utilisez ceci comme la résolution latérale. Voir la figure 2 .
- Insérez un morceau de ruban noir obliquement sur un morceau de papier de poulet en tranches comme objet cible pour l'imagerie en profondeur. Placez le tissu avec le ruban dans le réservoir d'eau.
REMARQUE: Le ruban noir est collé sur une plaque métallique avec une extrémité pointue, ce qui aide à attacher le ruban sur le tissu. - Réglez les paramètres de balayage de l'AR-PAM dans le logiciel d'acquisition de données, puis appuyez sur le bouton "balayage" pour capturer une seule image B-scan pour déterminer la profondeur d'imagerie maximale.
- Réglez les paramètres de balayage à une vitesse de balayage de "15" mm / s dans l'onglet "vitesse", "1" kHz dans l'onglet "taux de répétition d'impulsion", "5" cm dans l'onglet "Balayage Y" et "0.1 "Mm dans l'onglet" plage de balayage X ". Set tIl mesure la taille dans la direction x à "0,1" mm dans l'onglet "dx".
- Réglez les paramètres de numérisation pour le OR-PAM et appuyez sur le bouton "balayage" pour capturer une seule image B-scan pour déterminer le département d'imagerie maximum.
- Définissez les paramètres de balayage dans le logiciel d'acquisition de données sous la forme de "15" mm / s de vitesse de balayage dans l'onglet "vitesse", "5" kHz dans l'onglet "taux de répétition d'impulsion", "2" cm dans la "plage de balayage Y" Onglet et "0,1" mm dans l'onglet "plage de balayage X". Réglez la taille des pas dans la direction x à "0,1" mm dans l'onglet "dx".
NOTE: Étant donné que la gamme X-scan et dx sont identiques, un seul balayage B sera capturé. Les signaux PA résolus dans le temps multipliés par la vitesse du son dans les tissus mous (1,540 m / s) donneront une image en ligne. Les lignes A multiples sont capturées pendant le mouvement continu de l'étage Y pour produire un B-scan.
- Définissez les paramètres de balayage dans le logiciel d'acquisition de données sous la forme de "15" mm / s de vitesse de balayage dans l'onglet "vitesse", "5" kHz dans l'onglet "taux de répétition d'impulsion", "2" cm dans la "plage de balayage Y" Onglet et "0,1" mm dans l'onglet "plage de balayage X". Réglez la taille des pas dans la direction x à "0,1" mm dans l'onglet "dx".
- In vivo </ Em> image de la vasculature du sang de l'oreille de la souris
- Utilisez une souris femelle avec un poids corporel de 25 g et un âge de 4 semaines.
- Anesthésier l'animal en utilisant un cocktail de kétamine (120 mg / kg) et de xylazine (16 mg / kg) injecté par voie intrapéritonéale (dosage de 0,1 mL / 10 g).
- Retirer les cheveux de l'oreille de l'animal en utilisant une crème anti-épilation. Essuyez la zone propre. Couvrir l'œil de l'animal avec une pommade oculaire stérile pour éviter tout rayon laser dispersé tombant sur les yeux.
- Placez l'animal sur une scène qui a également une plaque miniature pour positionner l'oreille.
- Maintenir l'anesthésie avec de l'isoflurane inhalé (0,75% dans 1 L / min d'oxygène) pendant la période d'imagerie.
- Fixez un oxymètre de pouls à la jambe ou à la queue de la souris et surveillez le statut physiologique. Permettre à la région d'imagerie d'être en contact avec la membrane de polyéthylène à l'aide d'un gel à ultrasons.
- Définissez les paramètres d'analyse pour l'AR-PAM et appuyez sur le bouton "balayage" pour lancer le scannage rasterIng.
- Définissez les paramètres de balayage de l'AR-PAM dans le logiciel d'acquisition de données à une vitesse de balayage de "15" mm / s dans l'onglet "vitesse", "1" kHz dans l'onglet "taux de répétition d'impulsion", "10 mm" dans le " Onglet de la gamme Y-scan "et" 6 "mm dans l'onglet" plage de balayage X ". Réglez la taille des étapes dans la direction x comme "30" μm dans l'onglet "dx".
REMARQUE: la taille de l'étape dans la direction y est déterminée automatiquement à partir de la vitesse de la vitesse de balayage de l'étage et du taux de répétition des impulsions (15 000 μm / 1 000 Hz = 15 μm).
- Définissez les paramètres de balayage de l'AR-PAM dans le logiciel d'acquisition de données à une vitesse de balayage de "15" mm / s dans l'onglet "vitesse", "1" kHz dans l'onglet "taux de répétition d'impulsion", "10 mm" dans le " Onglet de la gamme Y-scan "et" 6 "mm dans l'onglet" plage de balayage X ". Réglez la taille des étapes dans la direction x comme "30" μm dans l'onglet "dx".
- Après avoir terminé le balayage AR-PAM, passez la position de la tête d'imagerie de AR-PAM à OR-PAM (comme décrit dans la section 2).
- Réglez les paramètres de balayage pour le OR-PAM et appuyez sur le bouton "scan" pour lancer la numérisation raster.
- Définissez les paramètres d'analyse pour le OR-PAM dans le logiciel d'acquisition de données à une vitesse de balayage de "15" mm / s dans le "velocit"Y "," 5 "kHz dans l'onglet" taux de répétition d'impulsion "," 10 "mm dans l'onglet" Balayage Y "et" 6 "mm dans l'onglet" Plage de balayage X ". Définissez la taille de l'étape Dans la direction x en tant que "6" μm dans l'onglet "dx".
REMARQUE: La taille de l'étape dans la direction y est déterminée automatiquement à partir de la vitesse de la vitesse de balayage de l'étage et du taux de répétition des impulsions (dans ce cas, 15 000 μm / 5 000 Hz = 2 μm).
- Définissez les paramètres d'analyse pour le OR-PAM dans le logiciel d'acquisition de données à une vitesse de balayage de "15" mm / s dans le "velocit"Y "," 5 "kHz dans l'onglet" taux de répétition d'impulsion "," 10 "mm dans l'onglet" Balayage Y "et" 6 "mm dans l'onglet" Plage de balayage X ". Définissez la taille de l'étape Dans la direction x en tant que "6" μm dans l'onglet "dx".
- Utilisez les multiples données B-scan stockées dans l'ordinateur pour récupérer les images MAP en utilisant un logiciel de traitement d'image.
- Observez l'animal pendant toute la durée de l'imagerie.
3. Étapes expérimentales
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Representative Results
Le schéma du système AR-OR-PAM est illustré à la figure 1 . Dans cette configuration, tous les composants ont été intégrés et assemblés dans une configuration de cage optique. L'utilisation d'un système de cage rend la tête de balayage AR-OR-PAM compacte et facilement assemblée, alignée et intégrée sur une seule étape de balayage.
Le balayage en trame continu bidimensionnel de la tête d'imagerie a été utilisé pendant l'acquisition de l'image. Les signaux PA réglés dans le temps ont été multipliés par la vitesse du son (1,540 m / s) pour obtenir une ligne A. Les lignes A multiples capturées pendant le mouvement continu du stade Y ont produit le B-scan bidimensionnel. Plusieurs scans B de la zone d'imagerie ont été capturés et stockés dans l'ordinateur et ont été utilisés pour traiter et produire les images photoacoustiques MAP.
Pour déterminer la résolution du système commutable, L'image MAP d'une nanoparticule unique a été utilisée 31 . L'amplitude photoacoustique le long de la direction latérale centrale de l'image a été tracée et ajustée à une fonction gaussienne. La FWHM de la forme gaussienne était considérée comme la résolution latérale. La résolution latérale mesurée pour l'AR-PAM était de 45 μm, comme le montre la figure 2 a . De même, une seule image de nanoparticules acquise en utilisant OR-PAM a été ajustée le long de la direction latérale centrale pour déterminer la résolution de l'OR-PAM, comme le montre la figure 2b . La résolution latérale mesurée était de 4 μm, déterminée à partir du FWHM. L'encart de la figure montre l'image MAP correspondante de la nanoparticule d'or. Théoriquement, la résolution latérale limitée par diffraction optique pour AR-PAM est de 45 μm, déterminée en utilisant l'équation suivante: 0.72λ / NA, où λ est la longueur d'onde acoustique centrale et NA est le numériqueOuverture du transducteur ultrasonore. La résolution théorique correspond bien aux données expérimentales. De même, la résolution latérale théorique pour OR-PAM est de 2,6 μm, calculée avec l'équation suivante: 0,51λ / NA, où λ est la longueur d'onde laser et NA est l'ouverture numérique de l'objectif. La résolution latérale mesurée expérimentalement pour OR-PAM était plus faible que l'estimation de la limite de diffraction, qui pourrait être due à des aberrations de front d'onde. Puisque AR et OR utilisent un transducteur similaire et une lentille acoustique, la résolution axiale théorique sera de 30 μm selon 0.88 c / Δf, où c est la vitesse du son dans les tissus mous et Δ f est la bande passante de fréquence du transducteur ultrasonore . En outre, la résolution latérale varie selon la direction axiale pour OR-PAM 20 et AR-PAM 32 . Les résolutions latérales signalées ici sont sur le plan focal.
La figure 3 a montre la photographie du ruban noir sur le tissu de poulet. Une seule image B-scan a été capturée en utilisant AR-PAM et OR-PAM. La figure 3b et la figure 3 c montrent l'image individuelle B-scan PA de AR-PAM et OR-PAM, respectivement. Il ressort de la figure 3b que le système AR-PAM peut clairement image du ruban noir jusqu'à ~ 7,8 mm sous la surface du tissu. De même, en utilisant le système OR-PAM, il était possible d'imbriquer clairement le ruban noir jusqu'à ~ 1,4 mm sous la surface du tissu ( Figure 3 c ). Le rapport signal sur bruit (SNR) a également été déterminé à partir des images. SNR est défini comme V / n , où <Em> V est l'amplitude du signal PA de crête à pointe et n est l'écart type du bruit de fond. La SNR mesurée à des profondeurs d'image de 4,6 mm et 7,8 mm était respectivement de 2,6 et 1,4. Pour OR-PAM, le SNR à une profondeur d'image de 1,4 mm était de 1,4. Pour démontrer la capacité d'imagerie biologique du système AR-OR PAM commutable, une imagerie de vascularisation sanguine in vivo a été réalisée sur une oreille de souris. Une photographie montrant l'anatomie vasculaire de l'oreille de souris vivante utilisée pour l'imagerie est montrée à la figure 4 a . En utilisant AR-PAM, une région de balayage de 10 mm x 6 mm a été imagée, avec une taille de 15 μm dans la direction Y et 30 μm dans la direction X. L'imagerie a pris 10 minutes pour terminer. Actuellement, le système d'imagerie n'acquiert les données que dans une seule direction; Le temps d'acquisition peut être réduit à près de la moitié en modifiant le programme pour avoir une capacité bidirectionnelle d'acquisition de données. Une image MAP de AR-PAM est montrée à la figure 4B. Le gros plan de la région d'intérêt est illustré à la figure 4 c . Une zone similaire analysée en utilisant OR-PAM, avec une taille de pas de 3 μm dans la direction Y et 6 μm dans la direction X, est représentée sur la Figure 4 d . L'imagerie a pris 46 minutes pour terminer. Le gros plan de la région d'intérêt est illustré à la figure 4 e . OR-PAM peut résoudre clairement les capillaires individuels, que AR-PAM ne peut pas résoudre. AR-PAM peut résoudre des vaisseaux de plus de 45 μm.
En résumé, un système AR-OR-PAM commutable qui permet d'obtenir une image haute résolution utilisant une mise au point optique étroite, ainsi qu'une imagerie en profondeur utilisant une focalisation acoustique, a été développé. La performance du système AR-OR-PAM commutable a été quantifiée à l'aide de mesures de résolution latérale et de profondeur d'image. Stud in vivoOnt également été réalisées pour montrer leur capacité d'imagerie biologique. Ce système de microscopie photoacoustique commutable peut fournir une résolution temporelle et spatiale élevée, rendant le système important pour les applications, y compris l'imagerie de l'angiogenèse, la réponse aux médicaments, etc. , où l'imagerie des capillaires simples ainsi que des vasculatures profondes est importante. D'autres modifications ou améliorations apportées au système peuvent être effectuées en remplaçant la plaque commutable maison par une platine motorisée mobile de 10 cm (axe Y). La résolution latérale de l'OR-PAM peut encore être améliorée en corrigeant les aberrations du front d'onde. La fourniture d'une énergie de pouls plus élevée à l'AR-PAM améliorera également le SNR et les profondeurs d'imagerie.
Dans le cas de OR-PAM, en supposant que la focalisation optique est de 150 μm en dessous de la surface de la peau pour l'imagerie in vivo , la taille du spot de surface était de 22,5 μm de diamètre. La délivrance d'une seule impulsion laser de 90 nJ donne une maÉnergie d'impulsion maximale de 20,4 mJ / cm 2 . Pour AR-PAM, la mise au point laser était de 2 mm de diamètre. La délivrance d'une impulsion laser unique de 50 μJ donne une énergie d'impulsion maximale au point focal de 1,6 mJ / cm 2 , bien dans la limite de sécurité ANSI de 20 mJ / cm 2 , 33 .
Figure 1 : schéma du système d'imagerie AR-OR-PAM. (A) BS: échantillonneur de faisceau, NDF: filtre de densité neutre, RAP - Prisme à angle droit, PD: photodiode, CL: lentille de condensateur, PH: sténopé, FC: coupleur de fibre, UST: transducteur à ultrasons, MMF: fibre multimode, SMF: Fibre mono-mode, DAQ: carte d'acquisition de données, TS: étage de traduction, Con.L: lentille conique, L1: lentille convexe, L2 et L3: lentille achromatique, RA: prisme à angle droit, RP: prisme rhomboïde, OC: optique Condenseur, M: mIrror, SP: plaque de glissement, LT: tube d'objectif, TM: montage de translation, KMM: miroir cinématique et AL: lentille acoustique. ( B ) Photographie du prototype du système AR-OR-PAM. ( C ) Gros plan du combineur de faisceau opto-acoustique. ( D ) Gros plan du condenseur optique avec un UST au centre. Reproduit de la référence 34 avec autorisation. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Test de résolution latérale du système AR-OR-PAM: résolution latérale estimée par imagerie de nanoparticules d'or de 100 nm de diamètre. Noir (*) points: signal photoacoustique; Ligne bleue: courbe gaussienne pour ( a ) AR-PAM et ( b )OR-PAM. L'encart montre l'image AR-PAM représentative dans (a) et l'image OR-PAM dans (b) de la nanoparticule d'or unique. Reproduit de la référence 34 avec autorisation. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Mesures de profondeur d'imagerie: image B individuelle de B-scan d'un ruban noir inséré obliquement sur le tissu de poulet. (A) Schéma de principe. ( B ) image AR-PAM. ( C ) image OR-PAM. Reproduit de la référence 34 avec autorisation. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Image photoacoustique in vivo d'une oreille de souris: ( a ) Photographie du système vasculaire de l'oreille de la souris. (B) image AR-PAM. ( C ) Gros plan de la région d'intérêt (ROI) dans ( b ), comme le montre une ligne en pointillés blancs. ( D ) image OR-PAM. ( E ) Région d'intérêt (ROI) en ( d ), comme indiqué par une ligne en pointillé blanc. ( F ) Gros plan de l'image de la ligne ROI en ligne dans (e) montrant un capillaire unique. Reproduit de la référence 34 avec autorisation. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
En conclusion, un système commutable AR et OR PAM qui permet d'obtenir à la fois une image haute résolution à des profondeurs d'imagerie inférieures et une imagerie basse résolution à des profondeurs d'imagerie plus élevées a été développé. La résolution latérale et la profondeur d'imagerie du système commutable ont été déterminées. Les avantages de ce système PAM commutable comprennent: (1) l'imagerie haute résolution à l'aide d'une focalisation optique étanche; (2) l'imagerie des tissus profonds utilisant la mise au point acoustique; 3) l'illumination en champ sombre pour AR-PAM, qui empêche les signaux PA forts d'apparaître sur la surface de la peau; 4) la capacité de garder l'échantillon dans un endroit, sans le déplacer entre différents systèmes; 5) la possibilité d'éviter d'utiliser plusieurs lasers et étapes de balayage; Et 6) l'utilisation minimale de composants maison. Il s'agit de la première combinaison rapportée de OR-PAM et AR-PAM de champ sombre qui fournit des images haute résolution, peu profondes et des images en profondeur de faible résolution, du même échantillon sans déplacer l'échantillon / obJect. L'utilisation du même stade de balayage et du laser rend le système efficace et rentable. Le système combiné a une résolution latérale de 4 μm avec une profondeur d'image de 1,4 mm, ainsi qu'une résolution latérale de 45 μm avec une profondeur d'image de 7,8 mm. Le système est constitué d'un système de cage optique avec des composants maison minimaux, ce qui facilite l'assemblage, l'alignement et le passage entre AR et OR PAM. La tête de balayage combinée est compacte et peut être facilement assemblée sur une seule étape de balayage. En utilisant le système combiné, l'imagerie in vivo a été démontrée avec succès.
Le système développé peut être utilisé pour l'imagerie préclinique. Les principales applications précliniques comprennent l'imagerie de l'angiogenèse, les micro-ondes tumorales, la microcirculation, la réponse aux médicaments, les fonctions du cerveau, les biomarqueurs et les activités génétiques. Les limitations du système incluent le temps de balayage. Un long temps de balayage est actuellement nécessaire, mais il peut être réduit en acquérant des données en botH directions. L'acquisition simultanée d'image entre OR-PAM et AR-PAM n'est pas possible à l'heure actuelle. Actuellement, la commutation manuelle entre OR-PAM et AR-PAM est nécessaire, ce qui peut être évité en utilisant un étage de traduction qui a au moins 10 cm de mouvement directionnel Y. Les étapes critiques du protocole incluent la détermination confocale de la focalisation optique et acoustique; La réalisation d'une tache optique inférieure à 5 μm pour OR-PAM, pour l'image de capillaires simples; Et la conception du combinateur de faisceau opto-acoustique pour l'OR-PAM et du condensateur optique pour l'AR-PAM.
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Disclosures
Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées conformément aux directives et aux règlements approuvés du Comité institutionnel pour les soins et l'utilisation des animaux de l'Université technologique de Nanyang, Singapour (Numéro de protocole animal ARF-SBS / NIE-A0263). Les auteurs n'ont pas d'intérêt financier pertinent dans le manuscrit et aucun autre conflit d'intérêt potentiel à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs souhaitent reconnaître le soutien financier d'une subvention de niveau 2 financée par le ministère de l'Éducation à Singapour (ARC2 / 15: M4020238). Les auteurs souhaiteraient également remercier M. Chow Wai Hoong Bobby pour l'aide de l'atelier de mécanique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Q-switched Nd:YAG laser | Edgewave | BX80-2-L | Pump laser |
| Credo-High Repetition Rate Dye Laser | Spectra physics | CREDO-DYE-N | Dye laser |
| Precision Linear Stage | Physik Instrumente | PLS 85 | XY raster scanning stage |
| Translation stage | Physik Instrumente | VT 80 | Confocal determine |
| Mounted Silicon photodiode | Thorlabs | SM05PD1A | Triggering/Pulse variation |
| Motorized continuous Rotational stage | Thorlabs | CR1/M-Z7 | Diverting laser beam |
| Mounted Continuously Variable ND Filter | Thorlabs | NDC-50C-4M | Intensity variable |
| Fiber Patch Cable | Thorlabs | M29L01 | Multimode fiber |
| Microscope objective | Newport | M-10X | Objective |
| XY translating mount | Thorlabs | CXY1 | Translating mount |
| Plano convex lens | Thorlabs | LA1951 | Collimating lens |
| Conical lens | Altechna | APX-2-B254 | Ring shape beam |
| Translation stage | Thorlabs | CT1 | Translating stage |
| Optical condenser | Home made | ||
| Ultrasonic transducer | Olympus-NDT | V214-BB-RM | 50MHz transducer |
| Plano concave lens | Thorlabs | LC4573 | Acoustic lens |
| Pulser/Receiver | Olympus-NDT | 5073PR | Pulse echo amplifier |
| Mounted standard iris | Thorlabs | ID12/M | Beam shaping |
| Plano convex lens | Thorlabs | LA4327 | Condenser lens |
| Mounted precision pinhole | Thorlabs | P50S | Spatial filtering |
| Single mode fiber patch cable | Thorlabs | P1-460B-FC-1 | Single mode fiber |
| Fiber coupler | Newport | F-91-C1 | Single mode coupling |
| Achromatic doublet lens | Edmund Optics | 32-317 | Achromatic doublet |
| Protected silver elliptical mirror | Thorlabs | PFE10-P01 | Mirror |
| Right angle kinematic mirror mount | Thorlabs | KCB1 | Mirror mount |
| Z-Axis Translation Mount | Thorlabs | SM1Z | z translator |
| Lens tube | Thorlabs | SM05L10 | |
| UV Fused Silica Right-Angle Prism | Thorlabs | PS615 | Right angle prism |
| Rhomboid prism | Edmund Optics | 47-214 | Shear wave |
| Dimethylpolysiloxane | Sigma Aldrich | DMPS1M | Silicon oil |
| Amplifier | Mini Circuits | ZFL-500LN | Amplifier |
| 16 bit high speed digitizer | Spectrum | M4i.4420 | Data acquisition card |
| Oscilloscope | Agilent Technologies | DS06014A | |
| Mice | InVivos Pte.Ltd | ICR | Animal model |
| Ultrasound gel | Progress/parker acquasonic gel | PA-GEL-CLEA-5000 | Acoustic coupling |
| Water tank | Home made | ||
| Translation stage | Homemade | Switching AR-OR | |
| Gold nanoparticles | Sigma Aldrich | 742031 | Lateral resolution |
| Sterile ocular ointment | Alcon | Duratears | Animal imaging |
| 1951 USAF resolution test target | Edmund Optics | 38257 | Confocal alignment |
| Data acquisition software | National Instrument | Labview | Home made software using Labview |
| Image Processing software | Mathworks | Matlab | Home made program using Matlab |
References
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