Summary
Qui viene dimostrato un sistema di microscopia fotoacustica (AR-OR-PAM) di risoluzione acustica (AR) e di risoluzione ottica (AR) in grado di ottenere immagini ad alta risoluzione a profondità poca e immagini a tessuto profondo a bassa risoluzione sullo stesso campione in vivo .
Abstract
La microscopia Photoacoustic (PAM) è una modalità di imaging invivo in rapida crescita che unisce sia l'ottica che l'ultrasuono, fornendo una penetrazione oltre il percorso libero medio ottico (~ 1 mm nella pelle) ad alta risoluzione. Combinando il contrasto di assorbimento ottico con l'alta risoluzione spaziale dell'ecografia in un'unica modalità, questa tecnica può penetrare nei tessuti profondi. I sistemi di microscopia Photoacoustic possono avere una risoluzione acustica bassa e una sonda profondamente o un'alta risoluzione ottica e una sonda poco profonda. È difficile ottenere un'elevata risoluzione spaziale e una grande penetrazione di profondità con un singolo sistema. Questo lavoro presenta un sistema AR-OR-PAM capace sia di immagini ad alta risoluzione che a profondità basse e di imaging a tessuto profondo a bassa risoluzione dello stesso campione in vivo . Una risoluzione laterale di 4 μm con profondità di imaging da 1,4 mm con messa a fuoco ottica e una risoluzione laterale di 45 μm con profondità di immagine di 7,8 mm con focus acustico sono riuscitiDimostrato utilizzando il sistema combinato. Qui viene eseguita un'immagine vascolare in piccole animali in vivo per dimostrare la sua capacità biologica di imaging.
Introduction
Le modalità di imaging ottico ad alta risoluzione, come tomografia di coerenza ottica, microscopia confocale e microscopia multifotonica, hanno numerosi vantaggi. Tuttavia, la risoluzione spaziale diminuisce in modo significativo aumentando la profondità dell'immagine. Ciò è dovuto alla diffusa natura del trasporto leggero nei tessuti molli 1 , 2 . L'integrazione dell'eccitazione ottica e del rilevamento ad ultrasuoni fornisce una soluzione per superare la sfida dell'immagine ottica ad alta risoluzione nei tessuti profondi. La microscopia fotoacustica (PAM) è una tale modalità che può fornire un'immagine più profonda rispetto ad altre modalità di imaging ottico. È stato applicato con successo alla struttura, funzionale, molecolare e immagini in vivo 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , combinando il forte contrasto di assorbimento ottico con l'alta risoluzione spaziale da ultrasuoni.
In PAM, un breve impulso laser irradia il tessuto / campione. L'assorbimento della luce dai cromofori ( es. Melanina, emoglobina, acqua, ecc. ) Provoca un aumento della temperatura, che a sua volta produce la produzione di onde di pressione sotto forma di onde acustiche (onde fotoacustiche). Le onde fotoacustiche generate possono essere rilevate da un trasduttore ultrasonico a banda larga al di fuori del confine del tessuto. Utilizzando la debole ottica e la messa a fuoco acustica stretta, l'imaging in tessuto profondo può essere raggiunto in microscopia fotoacustica (AR-PAM) 14 , 15 e 16 di risoluzione acustica. In AR-PAM, è stata dimostrata una risoluzione laterale di 45 μm e una profondità di imaging fino a 3 mm 15 . Al fine di risolvere acusticamente singoli capillari (~ 5 μm), sono necessari trasduttori ad ultrasuoni a frequenza centrale> 400 MHz. A tali frequenze elevate, la profondità di penetrazione è inferiore a 100 μm. Il problema causato dalla messa a fuoco acustica stretta può essere risolto usando la messa a fuoco ottica stretta. La microscopia fotoacustica (OR-PAM) di risoluzione ottica è in grado di risolvere singoli capillari o persino una singola cellula 17 e una risoluzione laterale di 0,5 μm è stata raggiunta 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 . L'uso di un nanojet fotonico può aiutare a raggiungere una risoluzione al di là della risoluzione di diffrazione limitataN 25 , 26 . In OR-PAM, la profondità di penetrazione è limitata a causa della messa a fuoco leggera e può raggiungere fino a 1,2 mm all'interno del tessuto biologico 23 . Pertanto AR-PAM può acquisire un'immagine più profonda, ma con una risoluzione inferiore e l'immagine OR-PAM può avere un'immagine molto elevata, ma con una profondità di imaging limitata. La velocità di imaging del sistema AR e OR-PAM dipende principalmente dalla frequenza di ripetizione impulso della sorgente laser 27 .
La combinazione di AR-PAM e OR-PAM sarà di grande utilità per applicazioni che richiedono sia un'immagine ad alta risoluzione che un'immagine più profonda. Sono stati fatti pochi sforzi per combinare questi sistemi insieme. Di solito, vengono utilizzati due scanner di imaging diversi per l'imaging, che richiede che il campione venga spostato tra i due sistemi, rendendo così difficile l'esecuzione di immagini in vivo . Tuttavia, l'imaging ibrido con AR e OR PAM consente di acquisire immagini con risoluzioni scalabili aProfondità. In un approccio, un fascio di fibre ottiche viene utilizzato per fornire la luce sia per l'AR che per l'OR PAM. In questo approccio vengono utilizzati due laser separati (un laser ad alta energia a 570 nm per l'AR e un laser ad alta velocità di ripetizione a 532 nm per l'OR), rendendo il sistema scomodo e costoso 28 . La lunghezza d'onda del laser OR-PAM è fisso e molti studi, come la saturazione dell'ossigeno, non sono possibili utilizzando questo sistema combinato. Studi comparativi tra AR e OR PAM non sono inoltre possibili a causa della differenza tra le lunghezze d'onda laser tra AR e OR. Inoltre, AR-PAM utilizza l'illuminazione a campo luminoso; Quindi, i segnali fotoacustici forti dalla superficie della pelle limitano la qualità dell'immagine. Per questo motivo, il sistema non può essere utilizzato per molte applicazioni di bioimaging. In un altro approccio per eseguire AR e OR PAM, viene spostato l'obiettivo ottico e ultrasonico, che rende non focalizzati la messa a fuoco della luce e l'ultrasuono. Pertanto, la qualità dell'immagine non è ottimale 30 . In tutti questi casi, AR-PAM non ha utilizzato l'illuminazione a campo scuro. L'utilizzo dell'illuminazione a campo scuro può ridurre la generazione di segnali fotoacoustici forti dalla superficie della pelle. Pertanto, l'imaging a tessuto profondo può essere eseguito usando l'illuminazione a forma di anello, in quanto la sensibilità di rilevazione dei segnali fotoacoustici profondi sarà maggiore rispetto a quella dell'illuminazione a campo luminoso.
Questo lavoro riporta un sistema di imaging AR e OR PAM (AR-OR-PAM) in grado di acquisire sia immagini ad alta risoluzione che imaging a tessuto profondo a bassa risoluzione dello stesso campione, utilizzando lo stesso laser e scanner per entrambi i sistemiems. Le prestazioni del sistema AR-OR-PAM sono state caratterizzate dalla determinazione della risoluzione spaziale e della profondità dell'immagine utilizzando esperimenti fantasma. La vascolarizzazione in vivo di sangue è stata eseguita su un orecchio del mouse per dimostrare la sua capacità biologica di imaging.
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Protocol
Tutti gli esperimenti su animali sono stati eseguiti secondo le norme e le linee guida approvate del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Nanyang Technological University, Singapore (numero di protocollo animali ARF-SBS / NIE-A0263).
1. Sistema AR-OR-PAM ( Figura 1 )
- Configurazione del sistema: AR-PAM
- Utilizzare un sistema laser sintonizzabile nanosecondi composto da un laser Nd-YAG (532 nm) pompato a diodo e da un laser a colori con intervallo di sintonizzazione di 559-576 nm come sorgente di irraggiamento ottico. Impostare la lunghezza d'onda laser a 570 nm utilizzando un controller esterno e la frequenza di ripetizione del laser a 1 kHz utilizzando il software laser.
- Posizionare un campionatore a fascio ad un angolo di 45 ° davanti al laser per deviare il 5% della potenza laser su un fotodiodo attraverso un filtro a densità neutra variabile (NDF1; OD = 0-4.0).
- Spostare il raggio laser dopo il campionatore a fascio a 90 ° utilizzandoUn prisma ad angolo retto (RAP1).
- Utilizzare un altro prisma ad angolo retto (RAP2) per consentire al fascio di passare attraverso un filtro di densità neutrale variabile (NDF2; OD = 0-4.0) e su una fibra multimodale (MMF), dirigendola attraverso un accoppiatore di fibre (FC) -a Combinazione di obiettivi (apertura numerica (NA): 0,25) e un traduttore XY.
- Fissare la fibra sulla fase di scansione usando un traduttore XY. Posizionare un obiettivo plano-convesso (L1) a 25 mm dalla estremità di uscita della fibra per collimare il fascio dalla fibra.
- Passare il fascio collimato attraverso una lente conica con un angolo di apice di 130 ° per generare un fascio anulare. Sottolineare debolmente la trave a forma di anello sul soggetto utilizzando un condensatore ottico fatti in casa (OC) con angoli di cono di 70 ° e 110 ° e con un foro al centro.
- Inserire un trasduttore ultrasonico da 50 MHz (UST) con un obiettivo acustico (AL) al centro del condensatore fatto in casa.
- Configurazione del sistema: OR-PAM
- Usare unUn sistema laser sintonizzabile nanosecondato costituito da un laser Nd-YAG (532 nm) pompato a diodo e da un laser a colori con intervallo di sintonizzazione di 559-576 nm come sorgente di irraggiamento ottico. Impostare la lunghezza d'onda laser a 570 nm utilizzando un controller esterno e la frequenza di ripetizione del laser a 5 kHz utilizzando il software laser.
- Ruotare la fase di rotazione controllata dal computer (tenendo premuto il RAP1) di 90 ° per deviare il raggio laser su un'iride per riformare.
- Attenuare il fascio laser posizionando un filtro di densità neutra variabile (OD: 0-4,0) lungo la trave e quindi concentrare la trave con un obiettivo condensatore (CL). Passare attraverso un foro (PH) di 75 mm dal CL per il filtraggio spaziale.
- Lanciare il raggio filtrato spalmato su una fibra monomodale (SMF) usando un accoppiatore a fibre monocomponenti (FC) costituito da un obiettivo di 0,1 NA per mettere a fuoco il fascio luminoso sul SMF.
- Regolare l'accoppiatore di fibre per ottenere la massima efficienza di accoppiamento.
- Fissare la fibra su tScansione di fase utilizzando una piastra di scorrimento (SP). Posizionare una lente acromatica (L2) di 50 mm dalla fibra SM per collimare il fascio laser.
- Spostare il fascio collimato per 90 ° utilizzando un specchio ellittico (M) controllabile cinematico per riempire l'apertura posteriore di un'altra lente acromatica identica (L3). Posizionare l'obiettivo acromatico usato per mettere a fuoco su un supporto di traduzione (TM2) usando un tubo dell'obiettivo (LT).
- Passare il fascio di messa a fuoco attraverso un combinatore fascio opto-acustico casalingo costituito da un prisma a destra (RA) e un prisma romboide (RP), con uno strato di olio di silicio (SO) in mezzo.
NOTA: lo strato di olio di silicio agirà come un film ottico trasparente e acustico. - Attaccare un obiettivo acustico (AL) per fornire una messa a fuoco acustica (diametro focale: ~ 46 μm) nella parte inferiore del prisma romboide.
- Posizionare il trasduttore a ultrasuoni con una frequenza centrale di 50 MHz sulla parte superiore del prisma romboide; Utilizzare uno strato epossidico per un efficace accoppiamento.
2. Commutazione e allineamento del sistema - Fissare (avvitando a fondo) la piastra commutabile in casa su una fase motorizzata a 3 assi controllata da un controllore a 3 assi collegato al computer.
- Fissare il sistema di gabbia AR e OR alla piastra casalinga utilizzando le staffe di fissaggio gabbie per consentire una facile commutazione tra le testine AR e OR. Far scorrere la testina di scansione in cima all'area di imaging.
- Utilizzare la fase Z per immergere la parte inferiore della testina di scansione AR-OR-PAM in un serbatoio acrilico pieno d'acqua (13 cm x 30 cm x 3 cm) per l'accoppiamento acustico.
- Aprire una finestra di imaging con un diametro di 7 cm sulla piastra inferiore del serbatoio e sigillarlo con una membrana in polietilene per la trasmissione ottica e acustica.
- Utilizzare un amplificatore a impulsi e un oscilloscopio per allineare il trasduttore ad ultrasuoni in messa a fuoco.
- Impostare il guadagno nell'amplificatore di eco a impulsi a 24 db nel modo trasmissione / ricezione.
- Utilizzare il segnale di sincronizzazione frOm l'amplificatore di impulso-eco come trigger e rilevare il segnale backscattered da una diapositiva di vetro (inserita dal fondo del serbatoio dell'acqua) usando un oscilloscopio.
NOTA: la diapositiva dovrebbe avere nastro nero attaccato ad esso. - Spostare l'asse Z per ottimizzare l'ampiezza del segnale di impulso (visto sull'oscilloscopio).
NOTA: Quando la lastra di vetro è a fuoco, l'eco avrà la sua ampiezza massima.
- Accendere il laser e collegare l'UST a due amplificatori, ciascuno con guadagno fisso 24 dB, utilizzando i cavi BNC.
NOTA: Le uscite degli amplificatori sono collegate alla scheda di acquisizione dati (DAQ). - Utilizzare il segnale del fotodiodo (PD) posto davanti al laser come trigger per il sistema di acquisizione dati.
- In AR-PAM, variare la distanza tra l'obiettivo conico (con.L) e il condensatore ottico (OC) per massimizzare l'ampiezza del segnale fotoacustico generato dall'oggetto di prova (nastro nero bloccato su una lastra di vetro).Assicurarsi che i punti ottici e acustici siano confocali determinando l'ampiezza del segnale fotoacoustico massimo (PA).
- Notare il ritardo dei segnali PA massimi; Utilizzalo questo più avanti per controllare l'attenzione nel software di acquisizione dati.
- Allentare la vite della testina di scansione e passare manualmente la testa di scansione da AR-PAM a OR-PAM. Quindi, serrare le viti.
- In OR-PAM, variare la distanza tra il doppio acromatico di messa a fuoco (all'interno del tubo dell'obiettivo (LT) e il combinatore optocutico per massimizzare l'ampiezza del segnale PA mostrato sull'oscilloscopio.
- Notare il ritardo dei segnali PA massimi.
NOTA: è necessario definire la finitura per determinare la disposizione confocale.
- Notare il ritardo dei segnali PA massimi.
- Quantificazione della risoluzione laterale e della profondità dell'immagine
- Utilizzare nanoparticelle d'oro di diametro di 100 nm per determinare la risoluzione laterale dell'AR anD OR sistema.
- Diluire 0,1 ml di soluzione di nanoparticelle con una quantità uguale di acqua. Distribuire 0,1 ml di soluzione diluita su una sfoglia di copertura e collocarla a contatto con la membrana in polietilene sotto il serbatoio.
- Assicurarsi che l'AR-PAM e l'OR-PAM siano concentrati nel software di acquisizione dati (vedere la tabella dei materiali) prima della scansione (passaggi 2.8 e 2.10).
NOTA: Conoscendo il ritardo microsettano dei segnali PA massimi provenienti dalle fasi 2.9 e 2.10, moltiplicato per la frequenza di campionamento (250 ms / s), l'immagine sarà a fuoco nel software di acquisizione dati. Il ritardo che deve essere omesso durante l'acquisizione dei dati può essere determinato nel software in modo da salvare solo i punti dati necessari per l'elaborazione post-elaborazione. - Impostare i parametri di scansione per AR-PAM e premere il pulsante "scansione" per avviare la scansione raster.
- Impostare i parametri di scansione per AR-PAM nel software di acquisizione dati a velocità di scansione "4" mm / s nella "velocità"; Tab "1" kHz nella linguetta "frequenza di ripetizione impulsi", "0.5" mm nella scheda "Y-scan range" e "0.5" mm nella scheda "Scansione X". Impostare la dimensione del passo nella x-direzione a "4" μm nella linguetta "dx".
NOTA: La dimensione del passo nella direzione y viene determinata automaticamente dalla velocità di scansione della fase e dalla frequenza di ripetizione dell'impulso (in questo caso, 4.000 μm / 1.000 Hz = 4 μm)
- Impostare i parametri di scansione per AR-PAM nel software di acquisizione dati a velocità di scansione "4" mm / s nella "velocità"; Tab "1" kHz nella linguetta "frequenza di ripetizione impulsi", "0.5" mm nella scheda "Y-scan range" e "0.5" mm nella scheda "Scansione X". Impostare la dimensione del passo nella x-direzione a "4" μm nella linguetta "dx".
- Impostare i parametri di scansione per l'OR-PAM e premere il pulsante "scansione" per avviare la scansione raster.
- Impostare i parametri di scansione nel software di acquisizione dati con la velocità di scansione "2,5" mm / s nella linguetta "velocità", "5" kHz nella scheda "frequenza di ripetizione impulsi", "0,5" mm nella "gamma di scansione Y" E "0.5" mm nella scheda "Scansione X". Impostare la dimensione del passo nella x-direzione una "0.5" μm nella linguetta "dx".
NOTA: la funzione sLa dimensione tep nella direzione y viene determinata automaticamente dalla velocità di scansione della fase e dalla frequenza di ripetizione dell'impulso (in questo caso, 2.500 μm / 5.000 Hz = 0.5 μm).
- Impostare i parametri di scansione nel software di acquisizione dati con la velocità di scansione "2,5" mm / s nella linguetta "velocità", "5" kHz nella scheda "frequenza di ripetizione impulsi", "0,5" mm nella "gamma di scansione Y" E "0.5" mm nella scheda "Scansione X". Impostare la dimensione del passo nella x-direzione una "0.5" μm nella linguetta "dx".
- Assicurarsi che durante il processo di scansione i dati vengono acquisiti e memorizzati nel computer
NOTA: i dati verranno catturati solo in una direzione di movimento della fase Y. - Utilizzare i dati multipli di B-Scan memorizzati nel computer per recuperare le immagini di massima ampiezza (MAP) usando il software di elaborazione delle immagini (vedere la tabella dei materiali ).
- Utilizza una singola immagine di nanoparticelle (da più immagini) dalla scansione per determinare la risoluzione laterale tracciando manualmente una linea attraverso la regione centrale dell'immagine di nanoparticelle per ottenere una funzione di diffusione dei punti, simile a quella della curva gaussiana. Vedere la Figura 2 .
- Adatta la funzione di diffusione di punti ottenuta da un'unica immagine di nanoparticelle usando un GauSsian fit e misura la larghezza massima a metà massimo (FWHM) utilizzando il software di elaborazione delle immagini (vedere la tabella dei materiali ). Usalo come risoluzione laterale. Vedere la Figura 2 .
- Inserire un pezzo di nastro nero obliquamente su un pezzo di tessuto di pollo a fette come oggetto di destinazione per l'imaging in profondità. Posizionare il tessuto con il nastro nel serbatoio dell'acqua.
NOTA: Il nastro nero è bloccato su una piastra metallica con punta tagliente, che aiuta a fissare il nastro al tessuto. - Impostare i parametri di scansione per AR-PAM nel software di acquisizione dati e quindi premere il pulsante "scansione" per catturare un'unica immagine B-scan per determinare la profondità massima di imaging.
- Impostare i parametri di scansione con la velocità di scansione "15" mm / s nella linguetta "velocità", "1" kHz nella scheda "Frequenza di ripetizione impulsi", "5" cm nella scheda "Scansione Y" e "0,1 "Mm nella scheda" Scansione X ". Impostare tEgli misura il passo nella x-direzione a "0.1" mm nella linguetta "dx".
- Impostare i parametri di scansione per l'OR-PAM e premere il pulsante "scansione" per catturare un'unica immagine B-scan per determinare la dimensione massima di imaging.
- Impostare i parametri di scansione nel software di acquisizione dati come velocità di scansione "15" mm / s nella linguetta "velocità", "5" kHz nella scheda "frequenza di ripetizione impulsi", "2" cm nella "gamma di scansione Y" Tab e "0.1" mm nella scheda "Scansione X". Impostare la dimensione del passo nella x-direzione a "0.1" mm nella linguetta "dx".
NOTA: poiché l'intervallo di scansione X e dx sono uguali, verrà acquisita una sola scansione B. I segnali PA risolti in tempo moltiplicati per la velocità del suono in tessuti molli (1.540 m / s) daranno un'immagine a linea. Più linee A vengono catturate durante il movimento continuo della fase Y per produrre una scansione B.
- Impostare i parametri di scansione nel software di acquisizione dati come velocità di scansione "15" mm / s nella linguetta "velocità", "5" kHz nella scheda "frequenza di ripetizione impulsi", "2" cm nella "gamma di scansione Y" Tab e "0.1" mm nella scheda "Scansione X". Impostare la dimensione del passo nella x-direzione a "0.1" mm nella linguetta "dx".
- In vivo </ Em> della vascolarità del sangue dell'orecchio del mouse
- Usa un topo femminile con un peso corporeo di 25 g ed un'età di 4 settimane.
- Anestetizzare l'animale utilizzando un cocktail di ketamina (120 mg / kg) e xilazina (16 mg / kg) iniettato intraperitonealmente (dosaggio di 0,1 mL / 10 g).
- Rimuovi i capelli dall'orecchio animale usando la crema di rimozione dei capelli. Pulire l'area pulita. Coprire l'occhio dell'animale con un unguento oculare sterile per evitare che ogni raggio laser sparso cadesse sugli occhi.
- Posizionare l'animale su un palco che ha anche una piastra in miniatura per posizionare l'orecchio.
- Mantenere l'anestesia con isoflurano inalato (0,75% in 1 L / min di ossigeno) durante il periodo di imaging.
- Bloccare un oximetro di impulso alla gamba o alla coda del mouse e controllare lo stato fisiologico. Lasciare che la regione di imaging sia in contatto con la membrana di polietilene usando il gel ad ultrasuoni.
- Impostare i parametri di scansione per AR-PAM e premere il pulsante "scansione" per avviare la scansione rastering.
- Impostare i parametri di scansione per AR-PAM nel software di acquisizione dati con la velocità di scansione "15" mm / s nella linguetta "velocità", "1" kHz nella scheda "frequenza di ripetizione impulsi", "10 mm" Y-scansione "e" 6 "mm nella scheda" Scansione X ". Impostare la dimensione del passo nella x-direzione come "30" μm nella linguetta "dx".
NOTA: la dimensione del passo nella direzione y viene determinata automaticamente dalla velocità di scansione della fase e dalla frequenza di ripetizione dell'impulso (in questo caso, 15.000 μm / 1.000 Hz = 15 μm).
- Impostare i parametri di scansione per AR-PAM nel software di acquisizione dati con la velocità di scansione "15" mm / s nella linguetta "velocità", "1" kHz nella scheda "frequenza di ripetizione impulsi", "10 mm" Y-scansione "e" 6 "mm nella scheda" Scansione X ". Impostare la dimensione del passo nella x-direzione come "30" μm nella linguetta "dx".
- Dopo aver terminato la scansione AR-PAM, passare dalla posizione di testa dell'immagine da AR-PAM a OR-PAM (come descritto nella sezione 2).
- Impostare i parametri di scansione per l'OR-PAM e premere il pulsante "scansione" per avviare la scansione raster.
- Impostare i parametri di scansione per l'OR-PAM nel software di acquisizione dati a velocità di scansione "15" mm / s nella "velocità"Y "," 5 "kHz nella linguetta" Frequenza di ripetizione impulsi "," 10 "mm nella scheda" Y-scansione "e" 6 "mm nella scheda" Scansione X ". Nella x-direzione come "6" μm nella linguetta "dx".
NOTA: La dimensione del passo nella direzione y viene determinata automaticamente dalla velocità di scansione della fase e dalla frequenza di ripetizione dell'impulso (in questo caso, 15.000 μm / 5.000 Hz = 2 μm).
- Impostare i parametri di scansione per l'OR-PAM nel software di acquisizione dati a velocità di scansione "15" mm / s nella "velocità"Y "," 5 "kHz nella linguetta" Frequenza di ripetizione impulsi "," 10 "mm nella scheda" Y-scansione "e" 6 "mm nella scheda" Scansione X ". Nella x-direzione come "6" μm nella linguetta "dx".
- Utilizzare i dati multipli di B-Scan memorizzati nel computer per recuperare le immagini MAP utilizzando software di elaborazione immagini.
- Osservare l'animale durante l'intero periodo di imaging.
3. Fasi sperimentali
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Representative Results
Lo schema del sistema AR-OR-PAM è mostrato in Figura 1 . In questa configurazione, tutti i componenti sono stati integrati e assemblati in una configurazione di gabbia ottica. L'utilizzo di un sistema di gabbia rende la testa di scansione AR-OR-PAM compatta e facilmente assemblata, allineata e integrata su una singola fase di scansione.
La scansione continua bidimensionale raster della testa di imaging è stata utilizzata durante l'acquisizione di immagini. I segnali PA risolti in tempo sono stati moltiplicati per la velocità del suono (1.540 m / s) per ottenere una linea A. Le linee multiple A acquisite durante il movimento continuo della fase Y hanno prodotto la scansione bidimensionale di B. Le scansioni multiple B dell'area di imaging sono state catturate e memorizzate nel computer e sono state utilizzate per elaborare e produrre le immagini photoacoustic MAP.
Per determinare la risoluzione del sistema commutabile, L'immagine MAP di una singola nanoparticella è stata utilizzata 31 . L'ampiezza fotoacustica lungo la direzione laterale centrale dell'immagine è stata plottata e adattata ad una funzione gaussiana. La FWHM della misura Gaussiana è stata considerata la risoluzione laterale. La risoluzione laterale misurata per l'AR-PAM è stata di 45 μm, come mostrato nella Figura 2a . Allo stesso modo, una sola immagine di nanoparticelle acquisita usando OR-PAM è stata montata lungo la direzione laterale centrale per determinare la risoluzione dell'ORPAM, come mostrato in Figura 2b . La risoluzione laterale misurata era di 4 μm, determinata dalla FWHM. L'inserto della figura mostra l'immagine MAP corrispondente della nanoparticella d'oro. Teoricamente, la risoluzione laterale di AR-PAM è limitata a 45 μm, determinata usando la seguente equazione: 0.72λ / NA, dove λ è la lunghezza d'onda acustica centrale e NA è il valore numericoApertura del trasduttore ultrasonico. La risoluzione teorica concorda bene con i dati sperimentali. Allo stesso modo, la risoluzione laterale teorica per OR-PAM è 2,6 μm, calcolata con la seguente equazione: 0.51λ / NA, dove λ è la lunghezza d'onda laser e NA è l'apertura numerica dell'obiettivo. La risoluzione laterale misurata sperimentalmente per OR-PAM era inferiore alla stima del limite di diffrazione, che potrebbe essere dovuta a delle aberrazioni del fronte d'onda. Poiché entrambi AR e OR utilizzano un trasduttore e un obiettivo acustico simili, la risoluzione assiale teorica sarà di 30 μm a 0,88 c / Δ f , dove c è la velocità del suono nel tessuto molle e Δ f è la larghezza di banda di frequenza del trasduttore ultrasonico . Inoltre, la risoluzione laterale varia lungo la direzione assiale sia per OR-PAM 20 che AR-PAM 32 . Le risoluzioni laterali riportate qui sono sul piano focale.
La figura 3 a mostra la fotografia del nastro nero sul tessuto di pollo. È stata acquisita un'unica immagine B-scan usando sia AR-PAM che OR-PAM. La figura 3b e la figura 3c rappresentano rispettivamente la singola immagine B-scan PA di AR-PAM e OR-PAM. È evidente dalla Figura 3b che il sistema AR-PAM può chiaramente riprodurre il nastro nero fino a ~ 7,8 mm sotto la superficie del tessuto. Allo stesso modo, utilizzando il sistema OR-PAM, è stato possibile chiarire chiaramente il nastro nero fino a ~ 1,4 mm sotto la superficie del tessuto ( Figura 3 c ). Il rapporto segnale-rumore (SNR) è stato determinato anche dalle immagini. SNR è definito come V / n , dove <Em> V è l'ampiezza del segnale PA a picco-picco e n è la deviazione standard del rumore di fondo. La SNR misurata a 4,6 e 7,8 mm è stata rispettivamente di 2,6 e 1,4. Per OR-PAM, l'SNR ad una profondità di imaging da 1,4 mm era 1,4. Per dimostrare la capacità di imaging biologico del sistema AR-OR PAM commutabile, l'imaging in vivo di vascolarizzazione del sangue è stato eseguito su un orecchio del topo. Una figura che mostra l'anatomia vascolare dell'orecchio del topo vivo utilizzata per l'imaging è mostrata nella Figura 4 a . Utilizzando AR-PAM, è stata imaging una regione di scansione da 10 mm x 6 mm, con un passo di 15 μm nella direzione Y e 30 μm nella direzione X. L'imaging ha avuto 10 minuti per completare. Attualmente, il sistema di acquisizione acquisisce dati solo in una direzione; Il tempo di acquisizione può essere ridotto a quasi metà modificando il programma per avere una capacità bidirezionale di acquisizione dati. Un'immagine MAP di AR-PAM è mostrata in Figura 4B. Il primo piano della regione di interesse è mostrato in Figura 4 c . Un'area simile scansionata usando OR-PAM, con una dimensione di passo di 3 μm nella direzione Y e 6 μm nella direzione X, è mostrata in Figura 4 d . L'imaging ha preso 46 minuti per completare. Il primo piano della regione di interesse è mostrato in Figura 4 e . L'OR-PAM può chiaramente risolvere singoli capillari, che AR-PAM non può risolvere. AR-PAM può risolvere le navi più spesse di 45 μm.
In sintesi, è stato sviluppato un sistema AR-OR-PAM intercambiabile che consente di ottenere immagini ad alta risoluzione usando una focalizzazione ottica stretta, nonché un'immagine a tessuto profondo con messa a fuoco acustica. La prestazione del sistema AR-OR-PAM commutabile è stata quantificata utilizzando misure di risoluzione laterale e profondità di imaging. In prigione in vivoSono state anche eseguite per mostrare la sua capacità di imaging biologico. Questo sistema di microscopia fotoacustico commutabile può fornire una elevata risoluzione temporale e spaziale, rendendo il sistema importante per le applicazioni, tra cui l'immagine dell'angiogenesi, la risposta farmacologica, ecc. , In cui è importante importare singole capillari e vasculature profonde. Ulteriori modifiche o miglioramenti al sistema possono essere effettuati sostituendo la piastra commutabile in casa con uno stadio motorizzato da 10 cm (asse y). La risoluzione laterale dell'ORPAM può essere ulteriormente migliorata correggendo le aberrazioni del fronte d'onda. La fornitura di un'alimentazione di impulso superiore all'AR-PAM migliorerà anche le profondità di SNR e dell'immagine.
Nel caso di OR-PAM, supponendo che la messa a fuoco ottica sia di 150 μm sotto la superficie cutanea per l' imaging in vivo , la dimensione del punto di superficie è di 22,5 μm di diametro. La fornitura di un singolo impulso laser di 90 nJ dà una maEnergia di impulso ximum di 20,4 mJ / cm 2 . Per AR-PAM, l'obiettivo laser era di 2 mm di diametro. L'erogazione di un singolo impulso laser di 50 μJ fornisce un'energia di impulso massima al punto focale di 1,6 mJ / cm 2 , ben entro il limite di sicurezza ANSI di 20 mJ / cm 2 , 33 .
Figura 1 : Schema del sistema di imaging AR-OR-PAM. (A) BS: fascio di campionamento, NDF: filtro a densità neutra, RAP - prisma ad angolo retto, PD: fotodiodo, CL: lente a condensatore, PH: pinhole, FC: accoppiatore di fibre, UST: trasduttore ad ultrasuoni, MMF: Fibra monocromatica, DAQ: scheda di acquisizione dati, TS: fase di traduzione, Con.L: obiettivo conico, L1: obiettivo convesso, L2 & L3: obiettivo acromatico, RA: prisma ad angolo retto, RP: prisma romboide, OC: ottico Condensatore, M: mIrroratore, SP: piastra di scorrimento, tubo LT: tubo a lente, TM: supporto di traduzione, KMM: supporto a specchio cinematico e AL: obiettivo acustico. B ) Fotografia del sistema prototipo AR-OR-PAM. ( C ) Primo piano del combinatore del fascio optoacustico. ( D ) Close-up del condensatore ottico con un UST al centro. Ristampato dal riferimento 34 con l'autorizzazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Test di risoluzione laterale del sistema AR-OR-PAM: risoluzione laterale stimata da nanoparticelle d'oro di imaging ~ 100 nm di diametro. Punti neri (*): segnale fotoacustico; Linea blu: curva Gaussian-fitted per ( a ) AR-PAM e ( b )O-PAM. L'insetto mostra l'immagine rappresentativa AR-PAM in (a) e l'immagine OR-PAM in (b) della nanoparticola singola d'oro. Ristampato dal riferimento 34 con l'autorizzazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Misura di profondità di imaging: un'immagine a singola B-scan di un nastro nero inserito obliquamente sul tessuto di pollo. A) Schema schematico. ( B ) Immagine AR-PAM. ( C ) immagine OR-PAM. Ristampato dal riferimento 34 con l'autorizzazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Immagine inacqua Photoacoustic di un orecchio del mouse: ( a ) Fotografia della vasculatura dell'orecchio del mouse. (B) Immagine AR-PAM. ( C ) Close-up della regione di interesse (ROI) in ( b ), come mostrato da una linea bianca tratteggiata. ( D ) immagine OR-PAM. ( E ) Regione di interesse (ROI) di cui alla lettera d ), come mostrato da una linea tratteggiata bianca. ( F ) Immagine di Close-up della linea bianca ROI in (e) che mostra un singolo capillare. Ristampato dal riferimento 34 con l'autorizzazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In conclusione, è stato sviluppato un sistema AR e OR PAM intercambiabile che consente di ottenere sia l'immagine ad alta risoluzione sia le profondità di imaging più basse e l'imaging a bassa risoluzione ad una profondità di imaging più elevata. È stata determinata la risoluzione laterale e la profondità dell'immagine del sistema commutabile. I vantaggi di questo sistema PAM commutabile includono: (1) l'imaging ad alta risoluzione con focus ottico stretto; (2) l'imaging del tessuto profondo con messa a fuoco acustica; 3) l'illuminazione a campo oscuro per AR-PAM, che impedisce la presenza di forti segnali PA sulla superficie della pelle; 4) la capacità di mantenere il campione in un unico posto, senza spostarlo tra diversi sistemi; 5) la possibilità di evitare l'utilizzo di più laser e scansioni; E 6) l'utilizzo minimo di componenti fatti in casa. Questa è la prima combinazione riportata di AR-PAM di OR-PAM e di campo scuro che fornisce immagini ad alta risoluzione e profondità e immagini a bassa risoluzione e tessuti profondi dello stesso campione senza spostare il campione / obJect. L'utilizzo della stessa fase di scansione e laser rende il sistema efficiente e conveniente. Il sistema combinato ha una risoluzione laterale di 4 μm con una profondità di imaging da 1,4 mm, nonché una risoluzione laterale di 45 μm con una profondità di immagine di 7,8 mm. Il sistema è costituito da un sistema di gabbia ottica con componenti in casa minimi, facilitando l'assemblaggio, l'allineamento e il passaggio tra l'AR e l'OR PAM. La testa di scansione combinata è compatta e può essere facilmente assemblata su una singola scansione. Utilizzando il sistema combinato, l' imaging in vivo è stato dimostrato con successo.
Il sistema sviluppato può essere utilizzato per l'imaging pre-clinico. Le principali applicazioni precliniche includono l'imaging di angiogenesi, microambienti tumorali, microcircolazione, risposta dei farmaci, funzioni cerebrali, biomarcatori e attività genetiche. Le limitazioni del sistema includono il tempo di scansione. Al momento è necessario un lungo periodo di scansione, ma può essere ridotto mediante l'acquisizione di dati in botH direzioni. L'acquisizione simultanea di immagini tra OR-PAM e AR-PAM non è attualmente possibile. Attualmente è necessaria la commutazione manuale tra OR-PAM e AR-PAM, che può essere evitata utilizzando uno stadio di traduzione che ha almeno 10 cm di movimento Y-direzionale. I passi critici del protocollo comprendono la determinazione confocale dell'attivo ottico e acustico; Il raggiungimento di una dimensione ottica inferiore a 5 μm per OR-PAM, a capillari singoli di immagine; E la progettazione del combinatore di fascio optoacustico per l'OR-PAM e del condensatore ottico per l'AR-PAM.
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Disclosures
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida e le norme approvate del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Nanyang Technological University, Singapore (numero di protocollo animali ARF-SBS / NIE-A0263). Gli autori non hanno alcun interesse finanziario rilevante nel manoscritto e nessun altro potenziale conflitto di interessi da divulgare.
Acknowledgments
Gli autori vorrebbero riconoscere il sostegno finanziario di una borsa di Tier 2 finanziata dal Ministero dell'Istruzione a Singapore (ARC2 / 15: M4020238). Gli autori ringraziano anche il signor Chow Wai Hoong Bobby per l'aiuto della macchina.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Q-switched Nd:YAG laser | Edgewave | BX80-2-L | Pump laser |
| Credo-High Repetition Rate Dye Laser | Spectra physics | CREDO-DYE-N | Dye laser |
| Precision Linear Stage | Physik Instrumente | PLS 85 | XY raster scanning stage |
| Translation stage | Physik Instrumente | VT 80 | Confocal determine |
| Mounted Silicon photodiode | Thorlabs | SM05PD1A | Triggering/Pulse variation |
| Motorized continuous Rotational stage | Thorlabs | CR1/M-Z7 | Diverting laser beam |
| Mounted Continuously Variable ND Filter | Thorlabs | NDC-50C-4M | Intensity variable |
| Fiber Patch Cable | Thorlabs | M29L01 | Multimode fiber |
| Microscope objective | Newport | M-10X | Objective |
| XY translating mount | Thorlabs | CXY1 | Translating mount |
| Plano convex lens | Thorlabs | LA1951 | Collimating lens |
| Conical lens | Altechna | APX-2-B254 | Ring shape beam |
| Translation stage | Thorlabs | CT1 | Translating stage |
| Optical condenser | Home made | ||
| Ultrasonic transducer | Olympus-NDT | V214-BB-RM | 50MHz transducer |
| Plano concave lens | Thorlabs | LC4573 | Acoustic lens |
| Pulser/Receiver | Olympus-NDT | 5073PR | Pulse echo amplifier |
| Mounted standard iris | Thorlabs | ID12/M | Beam shaping |
| Plano convex lens | Thorlabs | LA4327 | Condenser lens |
| Mounted precision pinhole | Thorlabs | P50S | Spatial filtering |
| Single mode fiber patch cable | Thorlabs | P1-460B-FC-1 | Single mode fiber |
| Fiber coupler | Newport | F-91-C1 | Single mode coupling |
| Achromatic doublet lens | Edmund Optics | 32-317 | Achromatic doublet |
| Protected silver elliptical mirror | Thorlabs | PFE10-P01 | Mirror |
| Right angle kinematic mirror mount | Thorlabs | KCB1 | Mirror mount |
| Z-Axis Translation Mount | Thorlabs | SM1Z | z translator |
| Lens tube | Thorlabs | SM05L10 | |
| UV Fused Silica Right-Angle Prism | Thorlabs | PS615 | Right angle prism |
| Rhomboid prism | Edmund Optics | 47-214 | Shear wave |
| Dimethylpolysiloxane | Sigma Aldrich | DMPS1M | Silicon oil |
| Amplifier | Mini Circuits | ZFL-500LN | Amplifier |
| 16 bit high speed digitizer | Spectrum | M4i.4420 | Data acquisition card |
| Oscilloscope | Agilent Technologies | DS06014A | |
| Mice | InVivos Pte.Ltd | ICR | Animal model |
| Ultrasound gel | Progress/parker acquasonic gel | PA-GEL-CLEA-5000 | Acoustic coupling |
| Water tank | Home made | ||
| Translation stage | Homemade | Switching AR-OR | |
| Gold nanoparticles | Sigma Aldrich | 742031 | Lateral resolution |
| Sterile ocular ointment | Alcon | Duratears | Animal imaging |
| 1951 USAF resolution test target | Edmund Optics | 38257 | Confocal alignment |
| Data acquisition software | National Instrument | Labview | Home made software using Labview |
| Image Processing software | Mathworks | Matlab | Home made program using Matlab |
References
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