Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

प्रोटीन-आधारित Hydrogels में आर्किटेक्चर का आसान हेरफेर सेल संस्कृति अनुप्रयोगों के लिए

Published: August 4, 2017 doi: 10.3791/55813
Automatic Translation
1, 1, 1
1Center for Peptide Pharmaceuticals, Faculty of Natural Science, Ulm University

Summary

प्रोटीन-आधारित hydrogels में तीन आयामी वास्तुकला में हेरफेर करने के लिए विभिन्न विधियों यहाँ भौतिक गुणों के संबंध में मूल्यांकन कर रहे हैं। Macroporous नेटवर्क के साथ एक सेल-चिपकने वाला पेप्टाइड पी रहे हैं, और उनकी व्यवहार्यता सेल संस्कृति में दो अलग अलग मॉडल सेल लाइनों का उपयोग कर मूल्यांकित किया जाता है।

Abstract

Hydrogels अत्यधिक हाइड्रेटेड सेल वातावरण प्रदान करने के लिए अपनी क्षमता के कारण सेल कल्चर एप्लीकेशनों के लिए आशाजनक सामग्री के रूप में मान्यता प्राप्त कर रहे हैं। 3 डी टेम्पलेट्स के क्षेत्र प्राकृतिक extracellular मैट्रिक्स के लिए उन सामग्रियों का संभावित सादृश्य के कारण बढ़ रहा है। प्रोटीन-आधारित hydrogels विशेष रूप से आशाजनक हैं, क्योंकि वे आसानी से पी जा सकते हैं और समायोज्य भौतिक गुणों के साथ परिभाषित संरचनाओं को प्राप्त कर सकते हैं। हालांकि, सेल संस्कृति प्राकृतिक सामग्री का उपयोग कर अनुप्रयोगों के लिए macroporous 3 डी टेम्पलेट्स का उत्पादन अक्सर सिंथेटिक सामग्री के उन लोगों की तुलना में उनके कमजोर यांत्रिक गुणों द्वारा सीमित है। यहाँ, अलग अलग तरीके macroporous गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) का उत्पादन करने के लिए मूल्यांकन किया गया-आधारित hydrogel प्रणालियों, त्रिज्या में 10 से 70 माइक्रोन की श्रेणी में समायोज्य ताकना आकार के साथ। इसके अलावा, कई सौ माइक्रोन लंबे हैं इस प्रोटीन-आधारित सामग्री में चैनल उत्पन्न करने के लिए एक पद्धति स्थापित किया गया था। Pores, के रूप में अच्छी तरह से अनुपात, पीएच, तापमान स्थिरता और enzymatic गिरावट व्यवहार, सूजन जैसे भौतिक गुण पर प्रभाव ताकना आकार के उत्पादन के लिए विभिन्न विधियों का विश्लेषण किया गया। ताकना आकार confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग लेजर का उपयोग hydrogels के मूल निवासी, सूजन राज्य में जांच की गई। सेल कल्चर एप्लीकेशनों के लिए व्यवहार्यता प्रोटीन सिस्टम और दो मॉडल सेल लाइनों के एक सेल-चिपकने वाला RGD पेप्टाइड संशोधन का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था: मानव स्तन कैंसर की कोशिकाओं (A549) और adenocarcinomic मानव वायुकोशीय बेसल उपकला कोशिकाओं (MCF7)।

Introduction

Hydrogels सामग्री है कि अघुलनशील 3 डी नेटवर्क बाइंडिंग पानी की बड़ी मात्रा के लिए सक्षम बनाते हैं। ऐसी सामग्री उत्कृष्ट पर्यावरण शर्तों जीवित कोशिकाओं के लिए प्रदान कर सकते हैं। वर्तमान में, वहाँ ब्याज तीन आयामी hydrogel संरचनाओं की पीढ़ी में और उनके रासायनिक और भौतिक गुणों के दर्जी करने के लिए प्रक्रियाओं के विकास में बढ़ रही है। एक बार जब यह हासिल की है, कोशिकाओं के विकास और सेलुलर व्यवहार के हेरफेर के लिए एक टेम्पलेट उत्पन्न1,2,3,4हो सकता है। इन 3 डी संरचनाओं न केवल एक और अधिक प्राकृतिक और यथार्थवादी वातावरण से पारंपरिक द्वि-आयामी दृष्टिकोण है, लेकिन वे भी पता चलता है स्टेम कोशिकाओं के विकास के लिए नई संभावनाएं बना या ट्यूमर5मॉडल। विभिन्न सामग्री अधिकारी विशेषताओं है कि मुख्य रूप से जेल6के ध्यान में लीन होना आकार पर निर्भर करता है की एक श्रृंखला है। Pores सेल कल्चर एप्लीकेशनों, ऊतक अभियांत्रिकी, और स्टेम कोशिकाओं के निर्देश विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। उदाहरण के लिए, ऑक्सीजन और पोषक तत्वों के माध्यम से मैट्रिक्स बिखरा हुआ है, और पर्याप्त मात्रा7कोशिकाओं तक पहुँचने में सक्षम होना चाहिए। दूसरे हाथ पर, के रूप में जल्दी संभव के रूप में हानिकारक चयापचयों हटा दिया जाना चाहिए, और सेल के विकास के लिए पर्याप्त स्थान उपलब्ध7होना चाहिए। नतीजतन, सामग्री, और इस प्रकार ध्यान में लीन होना आकार के गुण बुरी तरह मैट्रिक्स के संभावित लाभ और संभव अनुप्रयोगों को प्रभावित। सामग्री के गुणों पर निर्भर करते हुए, 3D सेल संस्कृति, neuronal संरचनाओं के गठन सहित विभिन्न सेल विकास प्रक्रियाओं हो सकता है; विकास और त्वचा या अस्थि कोशिकाओं के भेदभाव; और विशेष स्टेम सेल लाइनों, hepatocytes या fibroblasts2,3,8,9,10,11तरह के निर्देश विकास। एक अन्य महत्वपूर्ण बिंदु एक सामग्री के संभावित अनुप्रयोग को प्रभावित बाह्य उत्तेजनाओं12की ओर अपनी स्थिरता है। उदाहरण के लिए, सेल संस्कृति मीडिया या मानव शरीर में इसके यांत्रिक वफ़ादारी hydrogel बनाए रखना चाहिए।

हाल के वर्षों में, तेज 3 डी सेल संस्कृति hydrogels पर अनुसंधान, और 3D आर्किटेक्चर सिस्टम13के लिए को हल करने के लिए कई अध्ययन किए गए। Hydrogels का रासायनिक संश्लेषित घटकों से बना जांच सबसे अधिक कर रहे हैं क्योंकि वे आसानी से संश्लेषित किया जा सकता है और रासायनिक बदलाव हुआ और वे उच्च स्थिरता प्रदर्शन (देखें झू एट अल., 2011 एक समीक्षा के लिए)5। हालांकि, प्रोटीन कई फायदेमंद गुण है: रूप में तथाकथित "सटीक पॉलिमर," वे कर रहे हैं biocompatible; वे एक निर्धारित लम्बाई है; वे अपेक्षाकृत को संशोधित करने के लिए आसान कर रहे हैं; और वे लक्षित साइटों14,15की एक बड़ी संख्या है। इस संबंध में, कई क्षेत्रों में आवेदन के लिए अत्यधिक विशिष्ट, नवीन संरचनाओं उत्पन्न किया जा सकता। इस अध्ययन में, एक प्रोटीन आधारित hydrogel16 सामग्री के 3 डी वास्तुकला को प्रभावित करने के लिए सुस्थापित तरीकों की क्षमता का प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इसके अलावा, की क्षमता और ध्यान में लीन होना पीढ़ी के लिए प्रयोज्यता था भी जांच की।

कई विभिन्न तकनीकों 3D संरचना सरल विधियों और भौतिक विज्ञान के विभिन्न क्षेत्रों से परिष्कृत, अति विशिष्ट तकनीकों सहित, को संशोधित करने के लिए उपलब्ध हैं। एक व्यापक तकनीक अच्छी तरह से परिभाषित संरचनाओं17जनरेट करने के लिए electrospinning का उपयोग है। आरोप लगाया फाइबर एक समाधान से एक बिजली के क्षेत्र से खींच रहे हैं और फिर ऑक्सीजन के लिए जोखिम पर जमना। इस तरह, फाइबर कई nanometers कई माइक्रोन तक की रेंज में उत्पादित किया जा सकता। आकार, संरचना, और मैट्रिक्स के भीतर pores के वितरण की धुन के लिए अतिरिक्त तकनीकों हैं नरम लिथोग्राफी, photolithography, hydrodynamic ध्यान केंद्रित, इलेक्ट्रो-छिड़काव, और जैव-मुद्रण18,19,20। एक महत्वपूर्ण दोष यह है कि इन तकनीकों के विशिष्ट, महंगे उपकरण और विशेष रसायन या सामग्री पर अपनी निर्भरता है। इसके अलावा, अनुभव इन तकनीकों के साथ प्रोटीन-आधारित सामग्री के लिए सीधे transferrable अक्सर नहीं है, और कई रसायनों और विधियों की संगत कक्ष नहीं हैं।

दूसरी ओर, कई तकनीकों विशेष उपकरणों, उन्हें लागू करने के लिए और को पुन: उत्पन्न करने के लिए सस्ता और आसान बनाने पर भरोसा नहीं करते हैं। संरचना हेरफेर के लिए एक व्यापक विधि विलायक कास्टिंग21,22,23है। कण बहुलकीकरण प्रतिक्रिया करने से पहले जोड़े जाते हैं और homogenously तर समाधान करने के लिए वितरित कर रहे हैं। Pores के भीतर सामग्री रहते हैं, जबकि बहुलकीकरण करने के बाद, कणों के solvation के लिए एक परिवर्तन की स्थिति, एक कमजोर पड़ने या पीएच परिवर्तन, जैसे की ओर जाता है। इन तकनीकों, जैसे नमक, चीनी, पैराफिन, जिलेटिन और चाक, में प्रयुक्त रसायनों सस्ते और आसानी से उपलब्ध हैं। स्थिर-सुखाने में, सूजन hydrogels जमे हुए हैं। उसके बाद एक वैक्यूम के अंतर्गत तरल चरणों का क्रमिक उच्च बनाने की क्रिया है23,24,25प्रदर्शन किया। पानी उच्च बनाने की क्रिया नेटवर्क से सामग्री की विशिष्ट 3 डी संरचनाओं को बनाए रखने के लिए काफी विनम्र होता है। बहुलकीकरण pores21जेल के भीतर छोड़ने, जाता है, जब फोमिंग गैस में, एक समाधान के साथ एक गैस प्रवाहित है। आकार और वितरण pores के गैस धारा पर निर्भर करता है समायोजित किया जा सकता।

प्रोटीन hydrogel फार्म करने के लिए, BSA सहसंयोजी बंधन प्राथमिक मीट और linker चार सशस्त्र अणु26के hydroxy समूहों के बीच के गठन के लिए अनुमति देने के लिए एक Mannich प्रतिक्रिया में tetrakis (hydroxymethyl) phosphonium क्लोराइड (THPC) के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की है। प्रतिक्रिया होती है के बाद संभावित हानिकारक मध्यवर्तियों सामग्री का अत्यधिक धोने से निकाल दिए जाते हैं।

यह अध्ययन एक BSA-आधारित सामग्री में हेरफेर और दर्जी pores के आकार करने के लिए विभिन्न तकनीकों के साथ इलाज की संभावना को दर्शाता है। कोई विशेष उपकरण आवश्यक है के रूप में तकनीकों में से प्रत्येक किसी भी प्रयोगशाला में दुनिया भर में इस्तेमाल किया जा सकता। जैसे सूजन अनुपात, एंजाइमी नमन्कर््यता, पीएच स्थिरता और तापमान संवेदनशीलता, थे की जांच की और एक दूसरे के लिए की तुलना में इसके अलावा, विभिन्न मापदंडों, विशेष रूप से विभिन्न तकनीकों के प्रभाव के लिए 3D आर्किटेक्चर की पीढ़ी पर सम्मान करते हैं। अंत में, सामग्री के संभावित अनुप्रयोग सामग्री का सेल संस्कृति करने के लिए जांच करने के लिए सेल-चिपकने वाला पेप्टाइड्स के साथ पी रहे थे। दो अलग अलग मॉडल सेल लाइनों का उपयोग किया गया: A549 और MCF7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Hydrogel तैयारी

  1. BSA के 200 मिलीग्राम का 20% (w/v) BSA शेयर (स्टॉक समाधान A) बनाने के लिए आसुत विआयनीकृत H2O 1 मिलीलीटर के साथ मिश्रण।
  2. THPC बनाने के लिए आसुत विआयनीकृत पानी की 4.835 मिलीलीटर के साथ मिश्रण 165 µL THPC समाधान (134 मिलीग्राम/एमएल) के शेयर (स्टॉक समाधान B) समाधान।
  3. KCSSGKSRGDS (1,111.1 जी/mol) पेप्टाइड (या एक बराबर सेल-चिपकने वाला पेप्टाइड) के 1 मिलीग्राम वजन और यह 10 मिलीग्राम/एमएल (स्टॉक समाधान C) प्राप्त करने के लिए बाँझ H2O के 100 µL में पतला।
    नोट: यह चरण वैकल्पिक है और केवल अगर hydrogel सेल संस्कृति अनुप्रयोग के लिए का मतलब है शामिल होना चाहिए।
  4. एक 96-अच्छी तरह से प्लेट के नीचे स्थित निकालें और इसे हटाने योग्य प्लास्टिक लपेटो के साथ बदलें।
    नोट: यहां इस्तेमाल प्लेटों के लिए, नीचे आसानी से हर तरह से के नीचे करने के लिए दबाव लागू करने के द्वारा हटाया जा सकता है; पतली प्लास्टिक के नीचे बस गिर जाएगी।
  5. BSA स्टॉक समाधान का मिश्रण 100 µL (A) और THPC के 100 µL समाधान (B) शेयर (वैकल्पिक: 4 µL मामलों, सेल-चिपकने वाला hydrogels के लिए शेयर समाधान C) hydrogel की 200 µL प्राप्त करने के लिए 96-अच्छी तरह से थाली में। घटक मिश्रण एक वर्दी hydrogel बाद बहुलकीकरण गारंटी करने के लिए कम से कम 5 बार pipetting द्वारा ऊपर और नीचे।
  6. जब तक सभी hydrogels पॉलीमराइज्ड ठीक से कर रहे हैं के बारे में 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आर टी) पर 96-अच्छी तरह से थाली रखें।
  7. ध्यान से और धीरे धीरे थाली के नीचे से प्लास्टिक रैप निकालें।
  8. 96-अच्छी तरह से एक छोटे स्टाम्प का उपयोग कर प्लेट से बाहर hydrogels दबाएँ और उन्हें बाँझ PBS, पीएच 7.4 के साथ 1.5 mL ट्यूबों के लिए स्थानांतरण।
    नोट:: लगभग 4 मिमी की एक व्यास और 8 मिमी की ऊंचाई के साथ एक बेलनाकार आकार hydrogels है।
  9. Hydrogels फॉस्फेट-बफ़र्ड नमकीन (PBS) कई महीनों तक के लिए 4 ° C पर में संग्रहीत।

2. Hydrogels स्थिर-सुखाने

  1. 1.5 मिलि ट्यूब बाँझ आसुत विआयनीकृत H2O के 500 µL के साथ भरें और टोपी निकालें। Hydrogels एक रंग का उपयोग कर 1.5 मिली प्रतिक्रिया ट्यूबों के लिए स्थानांतरण।
  2. 1.5 मिलि ट्यूबों पैराफिन प्रत्येक शीशी के लिए फिल्म में कम से कम तीन परतों के साथ कसकर लपेट। ट्यूब से गैस की रिहाई को सक्षम करने के लिए इस फिल्म में छोटे छेद बेध करने के लिए एक सुई का उपयोग करें।
  3. निम्न चरणों में से एक करने के लिए आगे बढ़ें:
    1. शीशी तरल नाइट्रोजन समाधान पानी hydrogel पूरी तरह से स्थिर और कि यह गारंटी दे करने के लिए 5 मिनट के लिए करने के लिए स्थानांतरण। तरल नाइट्रोजन से तुरंत हटाने के बाद, शीशियों विगलन से सामग्री को रोकने के लिए सुखाने की मशीन फ्रीज करने के लिए स्थानांतरण।
      नोट: इस प्रक्रिया में pores के बारे में परिणामों के दायरे में 10-15 सुक्ष्ममापी।
    2. शीशियों-20 ° C पर धीरे धीरे hydrogels फ़्रीज करने के लिए रात भर रखें। -20 ° C से तुरंत हटाने के बाद, शीशियों विगलन से सामग्री को रोकने के लिए सुखाने की मशीन फ्रीज करने के लिए स्थानांतरण।
      नोट: इस प्रक्रिया में pores के बारे में परिणामों के दायरे में 50-60 सुक्ष्ममापी।
  4. 24 एच (और पूरा पानी का वाष्पीकरण के में और hydrogel भर बाद), सामग्री सुखाने की मशीन फ्रीज से निकालकर गल।
    नोट: ध्यान में लीन होना आकार confocal माइक्रोस्कोपी (चरण 5, "Hydrogel विज़ुअलाइज़ेशन") स्कैनिंग लेजर के साथ विश्लेषण किया जा सकता।

3. कण Leaching

  1. Hydrogel 1.1-1.5 चरणों में वर्णित के रूप में तैयार करते हैं।
  2. सीधे घटक मिश्रण करने के बाद, NaCl संतृप्ति (36 मिलीग्राम/एमएल) होती है जब तक जोड़ें। नमक जोड़ें जब तक एक नमक क्रिस्टल समाधान में एक सफेद वेग के रूप में देखा जा सकता है।
  3. 96-अच्छी तरह से प्लेट स्थानांतरित करने के लिए एक प्रकार के बरतन और हिला तक बहुलकीकरण होता है (लगभग 10 मिनट)। Hydrogels से थाली, 1.7-1.8 चरणों में वर्णित के रूप में निकालें।
  4. कम से कम 24 घंटे पहले elute hydrogel टेम्पलेट से सभी नमक बाँझ पानी पर एक प्रकार के बरतन (20 आरपीएम) में आर टी के लिए hydrogels सेते हैं। 4 ° C पर hydrogels कई महीनों तक PBS के लिए में संग्रहीत।

4. चैनल गठन

  1. Hydrogels चरण 1 में वर्णित के रूप में तैयार करते हैं। एक pincer दौरा का उपयोग कर समाधान से एक hydrogel निकालें, अत्यधिक शोषक कागज के साथ अतिरिक्त पानी निकालने और उसे सूखी बर्फ का एक ब्लॉक के शीर्ष पर रखें।
  2. 30 के लिए hydrogel फ्रीज s और ध्यान से यह ब्लॉक से निकालें। Hydrogel नुकसान नहीं करते हैं; ध्यान से यह बंद ब्लॉक परिमार्जन करने के लिए एक रंग का उपयोग करें। Hydrogel एक 1.5 mL ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण और यह रात भर में 37 ° c. सूखी

5. Hydrogel दृश्यावलोकन

  1. PBS के 10 मिलीलीटर में rhodamine B की 1 मिलीग्राम गिराए द्वारा एक rhodamine बी शेयर समाधान तैयार करें। एक सीरियल कमजोर पड़ने एक एकाग्रता के 0.001 मिलीग्राम/एमएल तक पहुँच गया है जब तक कि rhodamine स्टॉक समाधान PBS में गिराए द्वारा तैयार (कमजोर पड़ने का पहलू: 100)
  2. Hydrogel भंडारण समाधान (उदाहरण के लिए, चरण 2.4 से.) से निकालें और यह एक 1.5 mL ट्यूब 1 मिलीलीटर 0.01 मिलीग्राम/एमएल rhodamine B समाधान के साथ करने के लिए स्थानांतरण। आरटी पर rhodamine B समाधान में रात भर hydrogel दाग
  3. अगले दिन, 10 मिलीलीटर PBS (पीएच 7.4) और कम से कम 3 एच के लिए धोने के लिए visualized किया जा करने के लिए है hydrogel स्थानांतरण।
  4. अच्छी तरह से एक μ-स्लाइड 8 पर hydrogel स्थानांतरण और यह PBS के साथ कवर।
  5. एक ब्लेड का उपयोग hydrogel (0.5 मिमी में ऊँचाई) के बारे में से बाहर छोटे स्लाइस काट लें।
  6. एक confocal माइक्रोस्कोप, स्कैनिंग लेजर का उपयोग कल्पना 514 की एक तरंग दैर्ध्य पर hydrogel एनएम (उद्देश्य: चुनाव आयोग की योजना-Neofluar 40 x / 1.30 तेल डीआइसी M27, विमान स्कैन मोड: 514 nm, और ज़ूम: 1 X)।

6. सेल संस्कृति व्यवहार्यता

  1. बाँझ-फ़िल्टर सभी एक 0.45 माइक्रोन फ़िल्टर के साथ समाधान (A, B, और C) स्टॉक।
  2. Hydrogel चरणों 1.1-1.4 सहित सेल-चिपकने वाला पेप्टाइड hydrogel बहुलकीकरण करने से पहले, में वर्णित के रूप में तैयार करते हैं।
  3. अच्छी तरह से नीचे पूरी तरह से कवर किया जाता है जब तक कि घटक मिश्रण करने के बाद, तुरंत मिश्रण एक μ-स्लाइड में 8 pipette.
    नोट: बहुलकीकरण स्लाइड में मिनटों के भीतर जगह ले जाता है के रूप में इस चरण को जल्दी और सीधे घटकों, मिश्रण के बाद किया जाना चाहिए।
  4. संस्कृति आसंजन कोशिकाओं और पारित होने के एक एकल-कक्ष निलंबन मानक सेल संस्कृति तकनीक का उपयोग कर प्राप्त करने के लिए। कक्षों में पूर्व गर्म हस्तांतरण, बाँझ DMEM सेल संस्कृति मध्यम भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS, 10% (w/वी)), के साथ पूरक पेनिसिलिन-streptomycin (1% (w/वी)), और अनावश् यक अमीनो एसिड समाधान (MEM, 1% (w/v))।
  5. कक्षों की एक Neubauer चैंबर और ध्यान से पिपेट 200 µL hydrogel सतह पर (2 x 105 कोशिकाओं/सेमी2) कक्षों की इच्छित संख्या की गिनती के साथ गणना।
  6. Μ-स्लाइड 8 ढक्कन के साथ कवर और यह एक इनक्यूबेटर (37 ° C, 5% CO2) करने के लिए स्थानांतरण। कम से कम 4 घंटे पहले 37 डिग्री सेल्सियस के लिए सेते हैं
  7. के बाद कम से कम 4 एच के सेलुलर अनुलग्नक, कोशिकाओं के 200 µL बाँझ सेल संस्कृति PBS के साथ दो बार धो लें।
  8. RT पर 10 मिनट के लिए 3.7% (v/v) formaldehyde के 200 µL के साथ कोशिकाओं को ठीक और PBS के साथ दो बार धो लें (~ 200 µL)।
    नोट: उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनते हैं जब formaldehyde से निपटने।
  9. 0.1% के ट्राइटन X 5 मि. धोने के लिए दो बार PBS के साथ 200 µL के साथ कोशिकाओं permeabilize.
  10. Phalloidin-rhodamine के साथ कोशिकाओं methanolic स्टॉक के 5 µL PBS के 195 µL के साथ मिश्रण है और यह उन कक्षों के लिए आरटी दाग पर 20 मिनट के लिए कोशिकाओं अंधेरे में जोड़ने से दाग। PBS के साथ दो बार धो लें।
  11. 514 पर एक confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग कोशिका आसंजन गुण की जांच एनएम (उद्देश्य: चुनाव आयोग की योजना-Neofluar 40 x / 1.30 तेल डीआइसी M27, विमान स्कैन मोड: 514 nm, और ज़ूम: 1 X)। उचित सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवियों का विश्लेषण ( सामग्री की तालिकादेखें)।

7. Hydrogel गुण

  1. अनुपात में सूजन।
    1. पूरी तरह से 37 ° C पर hydrogels कम से कम एक दिन के लिए सूखी।
    2. प्रत्येक hydrogel वजन और सटीक वजन ध्यान दें।
    3. एक 2 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब PBS के 1.5 मिलीलीटर के साथ भरें।
    4. इस 2 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब में hydrogel स्थानांतरण और पूरी तरह से यह PBS में विसर्जित कर दिया।
    5. Hydrogel PBS के साथ संतुलन तक पहुँचने के लिए RT पर PBS में कम से कम दो दिनों के लिए छोड़ दें।
    6. तीन दिनों के बाद hydrogel समाधान से निकालें और यह hydrogel सतह से अतिरिक्त पानी को निकालने के लिए एक कागज ऊतक के साथ सूखी।
    7. Hydrogel तौलना।
    8. सूजन अनुपात निम्न सूत्र का उपयोग कर की गणना:
      Equation
      जहां सूखे जेल (चरण 7.1.2.) के वजन और Ws Wd है गीला जेल (चरण 7.1.7) का वजन है। सूजन अनुपात प्रतिशत प्राप्त करने के लिए 100 से गुणा करें।
  2. पीएच और तापमान स्थिरता।
    1. 5 मिलीलीटर PBS की एक 15 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण।
    2. समाधान करने के लिए उचित पीएच (उदाहरण के लिए, पीएच 2, 7 या 10) NaOH और HCl. लाओ समाधान करने के लिए उपयुक्त तापमान (उदाहरण के लिए, प्रारंभ, 37 ° C, या 80 ° C) के साथ समायोजित करें।
    3. स्थानांतरण hydrogel उपयुक्त समाधान में अपनी स्थिरता के लिए जांच की जा करने के लिए है। पीएच यदि आवश्यक मरम्मत करना।
      नोट: सभी hydrogels पूरी तरह से इस बिंदु पर (सूजन अनुपात देखें) सामग्री की सूजन के कारण वजन की गलत व्याख्या से बचने के लिए सूजन हो जाना चाहिए।
    4. कुछ समय अंतराल बाद hydrogel (उदाहरण के लिए, प्रत्येक घंटे 2 दिनों के लिए) समाधान से निकालने के लिए, यह अतिरिक्त पानी को निकालने, और यह वजन करने के लिए एक अत्यधिक शोषक कागज ऊतक के साथ सूखी।
  3. Enzymatic गिरावट।
    1. एक स्टॉक एंजाइम समाधान के 300 U trypsin और pepsin, निर्माता के निर्देशों के अनुसार तैयार करते हैं।
    2. (उदाहरण के लिए, चरण 1.8 से) hydrogel उचित समाधान करने के लिए स्थानांतरण।
      नोट: सभी hydrogels पूरी तरह से इस बिंदु पर वजन की गलत व्याख्या से बचने के लिए सूजन हो जाना चाहिए।
    3. कुछ समय अंतराल बाद hydrogel (उदाहरण के लिए, प्रत्येक घंटे) समाधान से निकालने के लिए, यह अतिरिक्त पानी को निकालने, और यह वजन करने के लिए एक अत्यधिक शोषक कागज ऊतक के साथ सूखी।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की घोषणा।

Acknowledgments

लेखक बाडेन-वुर्टेमबर्ग Stiftung "Bioinspired सामग्री संश्लेषण" फ्रेमवर्क (BioMatS-14) में अपने वित्तीय समर्थन के लिए शुक्रिया अदा करना चाहूँगा।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate Buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010023
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (high glucose) Life Technologies / Thermo Fisher  11140-050
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies / Thermo Fisher  10270-106
Penicillin-Streptomycin Life Technologies / Thermo Fisher  15140122
MEM Nonessential Amino Acid Solution Sigma Aldrich M7145-100ML
Trypsin EDTA 0.05% Phenol Red Thermo Fisher Scientific 25300062
Ethanol 99.8%, vergällt Ölfabrik Schmidt 2133
NaCl  Carl Roth  9265.1
Albumin Fraction V Carl Roth  3854.2
THPC Sigma Aldrich 404861-100ML Toxic
0.1% Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ML Slightly toxic
Phalloidin-rhodamine  Life Technologies / Thermo Fisher  R415
3.7% Formaldehyde  Life Technologies / Thermo Fisher  F8775-25ML Toxic
Rhodamine B Sigma Aldrich 81-88-9
Filtropur S 0.2  Sarsted Ag und Co. 2 83.1826.001   
µ slide 8 well Ibidi GmbH 80826
KCSSGKSRGDS peptide UPEP Ulm Custom sysnthesis
Ethanol 99.8%, vergällt Carl Roth  K928.5
Falcon 5 ml Polysterene Round-Bottom Tube  Sarsted Ag und Co. 62.547.254    
Tubes 50 ml  Sarsted Ag und Co. 62.547.254    
Tubes 1.5 ml   Sarsted Ag und Co. 72,690,001
Tubes 2 ml   Sarsted Ag und Co. 72,691
CELL CULTURE MICROPLATE, 96 WELL, PS, F-BOTTOM Greiner 655073
FreezeDryer Epsilon 1-6D,  Christ, Osterode am Harz, Germany
Confocal Laser Scanning Microscope  Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany
Zen Software Version 2012 Sp1, black edition, 407 version 8,1,0,484 Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany
GSA Imaga Analyzer Software, GSA Image Analyzer, GSA, Version 419 3.8.7 GSA GmbH

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Geckil, H., Xu, F., Zhang, X., Moon, S., Demirki, U. Engineering hydrogels as extracellular matrix mimics. Nanomedicine. 5 (3), 469-484 (2011).
  2. Liu, Y., Chan-Park, M. B. A biomimetic hydrogel based on methacrylated dextran-graft-lysine and gelatin for 3D smooth muscle cell culture. Biomaterials. 31 (6), 1158-1170 (2010).
  3. Raic, A., Rödling, L., Kalbacher, H., Lee-Thedieck, C. Biomimetic macroporous PEG hydrogels as 3D scaffolds for the multiplication of human hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 35 (3), 929-940 (2014).
  4. Wong Po Foo, C. T. S., Lee, J. S., Mulyasasmita, W., Parisi-Amon, A., Heilshorn, S. C. Two-component protein-engineered physical hydrogels for cell encapsulation. Proc Nat Acad Sci USA. 106 (52), 22067-22072 (2009).
  5. Zhu, J., Marchant, R. E. Design properties of hydrogel tissue-engineering scaffolds. Expert Rev Med Devic. 8 (5), 607-626 (2011).
  6. Samaryk, V., et al. Versatile Approach to Develop Porous Hydrogels with a Regular Pore Distribution and Investigation of their Physicomechanical Properties. J Appl Polym Sci. 114 (4), 2204-2212 (2009).
  7. Li, X. J., Valadez, A. V., Zuo, P., Nie, Z. Microfluidic 3D cell culture: potential application for tissue-based bioassays. Bioanalysis. 4 (12), 1509-1525 (2012).
  8. Park, H., Guo, X., et al. Effect of Swelling Ratio of Injectable Hydrogel Composites on Chondrogenic Differentiation of Encapsulated Rabbit Marrow Mesenchymal Stem Cells In Vitro. Biomacromolecules. 10 (3), 541-546 (2010).
  9. Stokols, S., Tuszynski, M. H. The fabrication and characterization of linearly oriented nerve guidance scaffolds for spinal cord injury. Biomaterials. 25 (27), 5839-5846 (2004).
  10. Sung, K. E., et al. Understanding the Impact of 2D and 3D Fibroblast Cultures on In Vitro Breast Cancer Models. PLoS One. 8 (10), 1-13 (2013).
  11. Tsai, E. C., Dalton, P. D., Shoichet, M. S., Tator, C. H. Synthetic hydrogel guidance channels facilitate regeneration of adult rat brainstem motor axons after complete spinal cord transection. J Neurotrauma. 21 (6), 789-804 (2004).
  12. Shoichet, M. S., Li, R. H., White, M. L., Winn, S. R. Stability of hydrogels used in cell encapsulation: An in vitro comparison of alginate and agarose. Biotechnol Bioeng. 50 (4), 374-381 (1996).
  13. Chiu, Y. -C., Kocagöz, S., Larson, J. C., Brey, E. M. Evaluation of physical and mechanical properties of porous poly (ethylene glycol)-co-(L-lactic acid) hydrogels during degradation. PloS One. 8 (4), e60728 (2013).
  14. Jonker, A. M., Löwik, D. W. P. M., van Hest, J. C. M. Peptide- and Protein-Based Hydrogels. Chem Mater. 24 (5), 759-766 (2012).
  15. Bodenberger, N., et al. Beyond bread and beer: whole cell protein extracts from baker's yeast as a bulk source for 3D cell culture matrices. Appl Microbiol Biot. 101 (5), 1-11 (2016).
  16. Bodenberger, N., Paul, P., Kubiczek, D., Walther, P., Gottschalk, K. E., Rosenau, F. A novel cheap and easy to handle protein hydrogel for 3D cell culture applications a high stability matrix with tunable elasticity and cell adhesion properties. Chem Sel. 1 (7), 1353-1360 (2016).
  17. Agarwal, S., Wendorff, J. H., Greiner, A. Use of electrospinning technique for biomedical applications. Polymer. 49 (26), 5603-5621 (2008).
  18. Hong, J., deMello, A. J., Jayasinghe, S. N. Bio-electrospraying and droplet-based microfluidics: control of cell numbers within living residues. Biome Mater. 5 (2), 21001 (2010).
  19. Jayasinghe, S. N., Irvine, S., McEwan, J. R. Cell electrospinning highly concentrated cellular suspensions containing primary living organisms into cell-bearing threads and scaffolds. Nanomedicine. 2 (4), 555-567 (2007).
  20. Selimović, Š, Oh, J., Bae, H., Dokmeci, M., Khademhosseini, A. Microscale strategies for generating cell-encapsulating hydrogels. Polymers. 4 (3), 1554-1579 (2012).
  21. Annabi, N., Nichol, J. W., et al. Controlling the porosity and microarchitecture of hydrogels for tissue engineering. Tissue Eng Part B Rev. 16 (4), 371-383 (2010).
  22. Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. Tissue Eng Part B Rev. 14 (1), 61-86 (2008).
  23. Bodenberger, N., et al. Evaluation of methods for pore generation and their influence on physio-chemical properties of a protein based hydroge. Biotech Rep. 12, 6-12 (2016).
  24. Raja, S. T. K., Thiruselvi, T., Mandal, A. B., Gnanamani, A. pH and redox sensitive albumin hydrogel: A self-derived biomaterial. Sci Rep. 5, 15977 (2015).
  25. Hennink, W. E., van Nostrum, C. F. Novel crosslinking methods to design hydrogels. Adv Drug Deliver Rev. 64, 223-236 (2012).
  26. Chung, C., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Tetrakis(hydroxymethyl) phosphonium chloride as a covalent cross-linking agent for cell encapsulation within protein-based hydrogels. Biomacromolecules. 13 (12), 3912-3916 (2008).
  27. Caló, E., Khutoryanskiy, V. V. Biomedical applications of hydrogels: A review of patents and commercial products. Eur Polym J. 65, 252-267 (2015).
  28. Huang, H., Herrera, A. I., Luo, Z., Prakash, O., Sun, X. S. Structural transformation and physical properties of a hydrogel-forming peptide studied by NMR, transmission electron microscopy, and dynamic rheometer. Biophys J. 103 (5), 979-988 (2012).
  29. Draghi, L., Resta, S., Pirozzolo, M. G., Tanzi, M. C. Microspheres leaching for scaffold porosity control. J Mater Sci. 16 (12), 1093-1097 (2005).
  30. Whang, K., et al. Engineering Bone Regeneration with Bioabsorbable Scaffolds with Novel Microarchitecture. Tissue Eng. 5 (1), 35-51 (1999).
  31. Ziv, K., et al. A tunable silk-alginate hydrogel scaffold for stem cell culture and transplantation. Biomaterials. 35 (12), 3736-3743 (2014).
  32. Butruk-Raszeja, B. A., et al. Athrombogenic hydrogel coatings for medical devices--Examination of biological properties. Colloid Surface B. 130, 192-198 (2015).
  33. Lü, S., Li, B., Ni, B., Sun, Z., Liu, M., Wang, Q. Thermoresponsive injectable hydrogel for three-dimensional cell culture: chondroitin sulfate bioconjugated with poly(N-isopropylacrylamide) synthesized by RAFT polymerization. Soft Matter. 7 (22), 10763 (2011).
  34. Ruoslahti, E., Pierschbacher, M. D. New perspectives in cell adhesion: RGD and integrins. Science. 238 (4826), 491-497 (1987).

Tags

जैव रसायन समस्या 126 Hydrogel भौतिक गुण ताकना आकार सेल संस्कृति बायोपोलीमर्स 3 डी वास्तुकला
प्रोटीन-आधारित Hydrogels में आर्किटेक्चर का आसान हेरफेर सेल संस्कृति अनुप्रयोगों के लिए
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bodenberger, N., Kubiczek, D.,… More

Bodenberger, N., Kubiczek, D., Rosenau, F. Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications. J. Vis. Exp. (126), e55813, doi:10.3791/55813 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter