Summary
Различные методы обработки трехмерной архитектуры в гидрогели на основе белка здесь оцениваются в отношении свойств материала. Макропористые сетей функционализированных с пептидных клеток клей, и их возможности в клеточной культуре оценивается с помощью двух различных моделей клеточных линий.
Abstract
Гидрогели признаются в качестве перспективных материалов для приложений культуры клеток из-за их способности предоставлять сильно увлажненной клеток средах. Поле 3D шаблоны растет из-за потенциального сходство этих материалов естественной внеклеточного матрикса. Гидрогели на основе белка особенно перспективны, потому что они легко могут быть функционализированных и может достичь определенных структур с регулируемым физико-химических свойств. Однако производство Макропористые 3D шаблонов для приложений культуры клеток, с использованием натуральных материалов часто ограничивается их слабее механических свойств по сравнению с теми из синтетических материалов. Здесь различные методы были оценены производить Макропористые бычьим сывороточным альбумином (БСА)-на основе гидрогеля систем, с регулируемым порами размером в диапазоне от 10 до 70 мкм в радиусе. Кроме того был создан метод для создания каналов в этот материал на основе белков, которые являются несколько сотен микрон длиной. Были проанализированы различные методы для производства поры, а также влияние размера пор на материальных свойств, таких как отеки соотношение, рН, стабильность температуры и поведение энзимной деградации. Размеры пор были исследованы в родной, раздутый штат гидрогели, используя Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия. Возможности для приложений культуры клеток оценивалась с использованием клеток клей РСЗ пептид модификация белков системы и две модели клеточных линий: рак молочной железы человека клетки (A549) и adenocarcinomic альвеолярного базальной эпителиальных клеток человека (MCF7).
Introduction
Гидрогели являются материалы, которые образуют нерастворимые 3D сетей, способных привязки больших количеств воды. Такие материалы могут обеспечить отличные экологические условия для живых клеток. В настоящее время растет интерес в поколении трехмерной гидрогеля структур и в разработке процессов, адаптировать их химические и физические свойства. Как только это будет достигнуто, шаблон для роста клеток и манипуляции клеточного поведения может быть созданный1,2,3,4. Эти 3D структуры не только создать более естественный и реалистичный окружающей среды, чем обычные двухмерные подходы, но они также выявить новые возможности для роста стволовых клеток или опухоль модели5. Различные материалы имеют ряд характеристик, которые главным образом зависят от размера поры геля6. Поры играют решающую роль в клетки культуры приложениями, тканевой инженерии и режиссер роста стволовых клеток. Например кислород и питательные вещества диффузного через матрицу, и надлежащей суммы должны быть в состоянии достичь клетки7. С другой стороны вредные метаболиты необходимо удалить как можно быстрее, и достаточно места для роста клеток должны быть доступны7. Следовательно свойства материала и таким образом размер пор, серьезно влиять на потенциальные выгоды и возможности применения матрицы. В зависимости от свойств материала, различные роста клеток процессов может произойти в 3D клеточной культуры, включая формирование нейрональных структур; роста и дифференцировки клеток кожи или кости; и режиссер рост линий специальных стволовых клеток, как гепатоцитов или фибробластов2,3,8,9,10,11. Другой важный момент, влияющих на возможность применения материала является его стабильность на внешние раздражители12. К примеру гидрогеля должны поддерживать свою механическую целостность в СМИ культуры клеток или человеческого тела.
В последние годы, исследования по 3D клетки культуры гидрогели активизировались, и многие исследования были проведены для разрешения 3D архитектуры систем13. Гидрогели, состоящий из химически синтезированных компонентов исследованы наиболее часто потому, что они могут быть легко синтезируется и химически изменены, и они обладают высокой стабильностью (см. Чжу et al., 2011 для обзора)5. Однако белки имеют много полезных свойств: как так называемые «точность полимеров,» они биосовместимых; они имеют определенной длины; они являются относительно легко изменить; и они имеют большое количество целевых сайтов14,15. В этой связи весьма специфические, инновационные структуры могут быть созданы для применения во многих областях. В этом исследовании гидрогеля на основе белков16 был использован для демонстрации устоявшихся методов способность влиять на 3D архитектура материала. Кроме того возможность и применимости в поры поколения также было расследовано.
Многие различные методы доступны для изменения трехмерных структур, включая как простые методы, так и сложные, высоко специализированные методы из разных областей науки материала. Метод широко используется electrospinning для создания четко определенных структур17. Заряженные белки берутся из раствора путем электрического поля и затем затвердевают при воздействии кислорода. Таким образом могут быть изготовлены волокна в диапазоне нескольких нанометров до нескольких микрон. Дополнительные методы, чтобы настроить размер, структура и распределение поры в пределах матрицы являются мягкие литографии, фотолитографии, гидродинамические упором, электро напыления и био печать в18,19,20. Существенный недостаток этих методов является их зависимость от конкретных, дорого оборудования и специальных химических веществ или материалов. Кроме того опыт работы с этими методами часто не непосредственно передавать материалы на основе белков, и многие из химических веществ и методов не являются клетки совместимы.
С другой стороны многие методы не полагаться на специальное оборудование, что делает их легче и дешевле, чтобы применить и воспроизвести. Распространенным методом манипуляции структуры является растворителем литья21,,2223. Частицы добавляются до реакции полимеризации и содержанием однородно распределяются насытить решения. После полимеризации изменение условий, таких как ослабление или изменение рН, приводит к сольватации частиц, в то время как поры остаются в пределах материала. Химические вещества, используемые в этих методов, таких как соль, сахар, парафин, желатин и мела, дешевые и легко доступны. В для, опухшие гидрогели замораживаются. Последующее сублимации жидких фаз под вакуумом, затем выполняется23,24,25. Сублимация воды из сети достаточно мягкий, чтобы поддерживать конкретные 3D структуры материала. В Газе пенообразование решение передается с газом при полимеризации происходит, оставляя поры внутри гель21. Размер и распределение пор может корректироваться в зависимости от потока газа.
Для формирования белков гидрогеля, BSA реагирует с тетракис (гидроксиметил) фосфониевую хлорид (THPC) в реакция Манниха типа для формирования ковалентных связей между первичных аминов и гидрокси группы Четырёхрукий компоновщика молекулы26. Возможные вредные интермедиатов удаляются промывкой чрезмерным материала после того, как происходит реакция.
Это исследование демонстрирует возможность лечения с различные методы, чтобы управлять и настраивать размер поры материала, на основе BSA. Каждый из методов может использоваться в любой лаборатории во всем мире, как никакого специального оборудования является необходимым. Кроме того различные параметры, такие как отек соотношение, ферментативные разлагаемость, рН стабильность и чувствительность температуры, были рассмотрены и по сравнению друг с другом, особенно применительно к влияние различных методов на поколение 3D архитектуры. Наконец материалы были функционализированных с пептидами клеток клей для расследования возможного применения материалов для клеточной культуры. Были использованы две различных модели клеточные линии: A549 и MCF7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. гидрогеля подготовка
- Смешайте 200 мг БСА с 1 мл раствора дейонизированной H2O для создания 20% (w/v) BSA запаса (запасов решение A).
- Mix 165 мкл раствора (134 мг/мл) THPC с 4.835 мл обессоленной воды для создания THPC складе раствор (запасов B).
- Весят 1 мг KCSSGKSRGDS (1,111.1 г/моль) пептида (или эквивалентное пептидных клеток клей) и развести в 100 мкл стерильных H2O получить 10 мг/мл раствора (Стоковый раствор C).
Примечание: Этот шаг является необязательным и нужно только быть включены, если гидрогеля предназначен для приложения культуры клеток. - Удалить в нижней части пластины 96-луночных и заменить его с съемной пластиковой пленкой.
Примечание: Для пластин, используемых здесь, внизу могут быть легко удалены, применяя давление в нижней части каждой скважины; тонкие пластиковые нижний просто выпасть. - Смесь 100 мкл BSA Стоковый раствор (A) и 100 мкл THPC складе решение (B) (необязательно: 4 мкл раствора C запасов для функционализированных, клетки клей гидрогели) в 96-луночных пластину для получения 200 мкл гидрогеля. Смешайте компоненты, закупорить вверх и вниз по крайней мере 5 раз гарантировать единый гидрогеля после полимеризации.
- Место пластину 96-луночных при комнатной температуре (RT) около 10 мин, до тех пор, пока все гидрогели должным образом полимеризуется.
- Тщательно и медленно удалите полиэтиленовой пленкой с нижней пластины.
- Нажмите гидрогели из 96-луночных пластину, используя небольшой штамп и передавать их для 1.5 мл пробирок с стерильных PBS, рН 7,4.
Примечание: Гидрогели имеют цилиндрическую форму, с диаметром около 4 мм и 8 мм. - Храните гидрогели фосфат амортизированное saline (PBS) при 4 ° C до нескольких месяцев.
2. для гидрогели
- Заполните 1.5 мл пробирок с 500 мкл стерильных дейонизированной H2O и снять крышку. Передача гидрогели для 1.5 мл пробирок реакции, с помощью шпателя.
- Оберните 1.5 мл пробирок плотно с парафином фильм по крайней мере три слои для каждого флакона. Используйте иглы для прокалывания маленькие отверстия в фильме, чтобы позволить утечка газа из трубы.
- Перейти к одной из следующих шагов:
- Флакон передать решение жидкого азота для 5 минут гарантировать, что вода и гидрогелевые полностью замерзают. Сразу же после удаления из жидкого азота передачи флаконы для замораживания сушки для предотвращения материал от таяния.
Примечание: Данная процедура приводит к поры о 10-15 мкм в радиусе. - Держите флаконов при-20 ° C на ночь, чтобы медленно заморозить гидрогели. Сразу же после удаления от-20 ° C передачи флаконы для замораживания сушки для предотвращения материал от таяния.
Примечание: Данная процедура приводит к поры о 50-60 мкм в радиусе.
- Флакон передать решение жидкого азота для 5 минут гарантировать, что вода и гидрогелевые полностью замерзают. Сразу же после удаления из жидкого азота передачи флаконы для замораживания сушки для предотвращения материал от таяния.
- После 24 ч (и полного испарения воды в и вокруг Гидрогель) оттепель материал, удалив его из замораживания сушки.
Примечание: Размеры поры могут быть проанализированы с Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (шаг 5, «Гидрогель визуализации»).
3. частица выщелачивания
- Приготовить гидрогель, как описано в шагах 1.1-1.5.
- Непосредственно после смешивания компонентов, добавьте NaCl, пока происходит насыщение (36 мг/мл). Добавьте соль, пока кристалл соли можно увидеть в решении как Белый преципитат.
- Передача 96-луночных пластины в шейкере и трясти, пока полимеризации происходит (около 10 минут). Удалите из плиты, гидрогели, как описано в шагах 1,7-1,8.
- Инкубируйте гидрогели для по крайней мере 24 h на RT в стерильной воде на шейкере (20 мин) для элюировать все соли из гидрогеля шаблона. Храните гидрогели на 4 ° C в PBS для до нескольких месяцев.
4. канал формирование
- Подготовьте гидрогели, как описано в шаге 1. Удаление гидрогеля из решения с помощью клещей, удалить излишки воды с высоко абсорбирующий бумаги и поместите его на верхней части блока сухого льда.
- Заморозить Гидрогель для 30 s и тщательно удалить его из блока. Не повредите гидрогеля; осторожно используйте шпателем соскрести блок. Передать 1,5 мл гидрогеля и высушить его на ночь в 37 ° C.
5. гидрогеля визуализация
- Подготовьте раствор родамин B путем разбавления 1 мг родамин B 10 мл ФСБ. Подготовьте серийный разрежения путем разбавления родамин Стоковый раствор в PBS, до тех пор, пока концентрация 0,001 мг/мл достигается (коэффициент разбавления: 100)
- Удаление гидрогеля из решения хранения (например, от шаг 2.4.) и передать его на 1,5 мл с 1 мл раствора родамин B 0,01 мг/мл. Пятно гидрогеля на ночь в растворе родамин B на RT.
- Следующий день, передачи гидрогеля, который должен быть визуализированы на 10 мл PBS (рН 7,4) и мыть по крайней мере 3 часа.
- Передача гидрогеля на µ слайд 8 хорошо и покрыть ее с PBS.
- Вырежьте небольшие фрагменты из гидрогеля (около 0.5 мм в высоту) с помощью лезвия.
- С помощью конфокальный лазерный сканирующий микроскоп, визуализировать гидрогеля на длине волны 514 Нм (Цель: ЕС план-Neofluar 40 x / 1,30 масло ДВС M27, режим проверки плоскости: 514 Нм и зум: 1 X).
6. клетки культуры осуществимость
- Стерильными фильтр все складе решения (A, B и C) с 0,45 мкм фильтром.
- Приготовить гидрогель, как описано в шагах 1.1-1.4, включая пептидных клеток клей до полимеризации гидрогеля.
- После смешивания компонентов, немедленно Пипетка смесь в µ слайд 8 хорошо до тех пор, пока дно полностью покрыты.
Примечание: Этот шаг должен быть выполнен быстро и непосредственно после смешивания компонентов, как полимеризации происходит в течение нескольких минут в слайд. - Культура клетки адгезии и проход для получения одной ячейки подвеска, с использованием стандартной ячейки культуры методов. Перенесите клетки в подогретым, стерильные DMEM клетки культуры среднего дополнена плода бычьим сывороточным (ФБС, 10% (w/v)), пенициллин стрептомицином (1% (w/v)) и решение заменимая аминокислота (MEM, 1% (w/v)).
- Подсчет ячеек с Нойбауэр, считая камеры и тщательно пипеткой 200 мкл нужное количество клеток (2 x 105 клеток/см2) на поверхность гидрогеля.
- Обложка µ слайд 8 хорошо с крышкой и передача его в инкубатор (37 ° C, 5% CO2). Инкубируйте минимум 4 ч при 37 ° C.
- После по крайней мере 4 h клеточных вложения Вымойте клетки дважды с 200 мкл стерильных клеточной культуры PBS.
- Исправьте клетки с 200 мкл рабочего раствора формальдегида 3,7% (v/v) за 10 мин на RT и мыть дважды с PBS (~ 200 мкл).
Примечание: Носить соответствующие средства индивидуальной защиты при обработке формальдегида. - Разрушения клеток с 200 мкл 0,1% тритон X 5 мин мыть дважды с PBS.
- Пятно клетки с Фаллоидин родамин смешивания 5 мкл метанольного акций с 195 мкл PBS и добавив его в клетки на RT. пятно клетки для 20 мин в темноте. Мыть дважды с PBS.
- Исследовать свойства адгезии клеток, используя конфокального микроскопа в 514 Нм (Цель: ЕС план-Neofluar 40 x / 1,30 масло ДВС M27, режим проверки плоскости: 514 Нм и зум: 1 X). Анализ изображения с помощью соответствующего программного обеспечения (см. Таблицу материалов).
7. гидрогеля свойства
- Отек отношение.
- Полностью высушите гидрогели при 37 ° C для по крайней мере один день.
- Взвесить каждый гидрогеля и точный вес.
- Залейте 2-мл пробирку реакции 1,5 мл ФСБ.
- Передача Гидрогель в этой реакции 2-мл пробирку и полностью погрузиться в PBS.
- Оставьте по крайней мере два дня в PBS на RT достичь равновесия с PBS гидрогеля.
- После трех дней удалить из решения гидрогеля и насухо салфеткой, чтобы удалить излишки воды с поверхности гидрогеля.
- Весят гидрогеля.
- Вычислите коэффициент отек, с использованием следующей формулы:
где Wd вес сушеные геля (шаг 7.1.2.) и Ws является вес мокрой геля (шаг 7.1.7). Умножьте 100, чтобы получить отек % соотношение.
- стабильность температуры и рН.
- Передача 5 мл PBS реакции 15-мл пробирку.
- Настройте решение соответствующие рН (например, pH 2, 7 или 10) с NaOH и HCl. принести решение до соответствующей температуры (например, RT, 37 ° C или 80 ° C).
- Передача гидрогеля, должны расследоваться для его стабильность в соответствующее решение. При необходимости, скорректировать рН.
Примечание: Все гидрогели должны быть полностью опухшие на данный момент (см. отек соотношение) для предотвращения неправильной интерпретации веса вследствие набухания материала. - Через определенные интервалы времени удалите гидрогеля из решения (например, каждый час до 2 дней), высушить его с высоко абсорбирующий бумаги ткани, чтобы удалить лишнюю воду и взвесить его.
- Энзимной деградации.
- Приготовляют раствор акций фермента 300 U трипсина и пепсин, в соответствии с инструкциями производителя.
- Гидрогель (например, от шага 1.8) передать соответствующее решение.
Примечание: Все гидрогели должны быть полностью опухшие на данный момент для предотвращения неправильной интерпретации веса. - Через определенные интервалы времени удалите гидрогеля из решения (например, каждый час), высушить его с высоко абсорбирующий бумаги ткани, чтобы удалить лишнюю воду и взвесить его.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Баден-Вюртемберг Stiftung за их финансовую поддержку в рамках «Bioinspired материал синтез» (биотекстили-14).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (high glucose) | Life Technologies / Thermo Fisher | 11140-050 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies / Thermo Fisher | 10270-106 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies / Thermo Fisher | 15140122 | |
| MEM Nonessential Amino Acid Solution | Sigma Aldrich | M7145-100ML | |
| Trypsin EDTA 0.05% Phenol Red | Thermo Fisher Scientific | 25300062 | |
| Ethanol 99.8%, vergällt | Ölfabrik Schmidt | 2133 | |
| NaCl | Carl Roth | 9265.1 | |
| Albumin Fraction V | Carl Roth | 3854.2 | |
| THPC | Sigma Aldrich | 404861-100ML | Toxic |
| 0.1% Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | Slightly toxic |
| Phalloidin-rhodamine | Life Technologies / Thermo Fisher | R415 | |
| 3.7% Formaldehyde | Life Technologies / Thermo Fisher | F8775-25ML | Toxic |
| Rhodamine B | Sigma Aldrich | 81-88-9 | |
| Filtropur S 0.2 | Sarsted Ag und Co. | 2 83.1826.001 | |
| µ slide 8 well | Ibidi GmbH | 80826 | |
| KCSSGKSRGDS peptide | UPEP Ulm | Custom sysnthesis | |
| Ethanol 99.8%, vergällt | Carl Roth | K928.5 | |
| Falcon 5 ml Polysterene Round-Bottom Tube | Sarsted Ag und Co. | 62.547.254 | |
| Tubes 50 ml | Sarsted Ag und Co. | 62.547.254 | |
| Tubes 1.5 ml | Sarsted Ag und Co. | 72,690,001 | |
| Tubes 2 ml | Sarsted Ag und Co. | 72,691 | |
| CELL CULTURE MICROPLATE, 96 WELL, PS, F-BOTTOM | Greiner | 655073 | |
| FreezeDryer Epsilon 1-6D, | Christ, Osterode am Harz, Germany | ||
| Confocal Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany | ||
| Zen Software Version 2012 Sp1, black edition, 407 version 8,1,0,484 | Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany | ||
| GSA Imaga Analyzer Software, GSA Image Analyzer, GSA, Version 419 3.8.7 | GSA GmbH |
References
- Geckil, H., Xu, F., Zhang, X., Moon, S., Demirki, U. Engineering hydrogels as extracellular matrix mimics. Nanomedicine. 5 (3), 469-484 (2011).
- Liu, Y., Chan-Park, M. B. A biomimetic hydrogel based on methacrylated dextran-graft-lysine and gelatin for 3D smooth muscle cell culture. Biomaterials. 31 (6), 1158-1170 (2010).
- Raic, A., Rödling, L., Kalbacher, H., Lee-Thedieck, C. Biomimetic macroporous PEG hydrogels as 3D scaffolds for the multiplication of human hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 35 (3), 929-940 (2014).
- Wong Po Foo, C. T. S., Lee, J. S., Mulyasasmita, W., Parisi-Amon, A., Heilshorn, S. C. Two-component protein-engineered physical hydrogels for cell encapsulation. Proc Nat Acad Sci USA. 106 (52), 22067-22072 (2009).
- Zhu, J., Marchant, R. E. Design properties of hydrogel tissue-engineering scaffolds. Expert Rev Med Devic. 8 (5), 607-626 (2011).
- Samaryk, V., et al. Versatile Approach to Develop Porous Hydrogels with a Regular Pore Distribution and Investigation of their Physicomechanical Properties. J Appl Polym Sci. 114 (4), 2204-2212 (2009).
- Li, X. J., Valadez, A. V., Zuo, P., Nie, Z. Microfluidic 3D cell culture: potential application for tissue-based bioassays. Bioanalysis. 4 (12), 1509-1525 (2012).
- Park, H., Guo, X., et al. Effect of Swelling Ratio of Injectable Hydrogel Composites on Chondrogenic Differentiation of Encapsulated Rabbit Marrow Mesenchymal Stem Cells In Vitro. Biomacromolecules. 10 (3), 541-546 (2010).
- Stokols, S., Tuszynski, M. H. The fabrication and characterization of linearly oriented nerve guidance scaffolds for spinal cord injury. Biomaterials. 25 (27), 5839-5846 (2004).
- Sung, K. E., et al. Understanding the Impact of 2D and 3D Fibroblast Cultures on In Vitro Breast Cancer Models. PLoS One. 8 (10), 1-13 (2013).
- Tsai, E. C., Dalton, P. D., Shoichet, M. S., Tator, C. H. Synthetic hydrogel guidance channels facilitate regeneration of adult rat brainstem motor axons after complete spinal cord transection. J Neurotrauma. 21 (6), 789-804 (2004).
- Shoichet, M. S., Li, R. H., White, M. L., Winn, S. R. Stability of hydrogels used in cell encapsulation: An in vitro comparison of alginate and agarose. Biotechnol Bioeng. 50 (4), 374-381 (1996).
- Chiu, Y. -C., Kocagöz, S., Larson, J. C., Brey, E. M. Evaluation of physical and mechanical properties of porous poly (ethylene glycol)-co-(L-lactic acid) hydrogels during degradation. PloS One. 8 (4), e60728 (2013).
- Jonker, A. M., Löwik, D. W. P. M., van Hest, J. C. M. Peptide- and Protein-Based Hydrogels. Chem Mater. 24 (5), 759-766 (2012).
- Bodenberger, N., et al. Beyond bread and beer: whole cell protein extracts from baker's yeast as a bulk source for 3D cell culture matrices. Appl Microbiol Biot. 101 (5), 1-11 (2016).
- Bodenberger, N., Paul, P., Kubiczek, D., Walther, P., Gottschalk, K. E., Rosenau, F. A novel cheap and easy to handle protein hydrogel for 3D cell culture applications a high stability matrix with tunable elasticity and cell adhesion properties. Chem Sel. 1 (7), 1353-1360 (2016).
- Agarwal, S., Wendorff, J. H., Greiner, A. Use of electrospinning technique for biomedical applications. Polymer. 49 (26), 5603-5621 (2008).
- Hong, J., deMello, A. J., Jayasinghe, S. N. Bio-electrospraying and droplet-based microfluidics: control of cell numbers within living residues. Biome Mater. 5 (2), 21001 (2010).
- Jayasinghe, S. N., Irvine, S., McEwan, J. R. Cell electrospinning highly concentrated cellular suspensions containing primary living organisms into cell-bearing threads and scaffolds. Nanomedicine. 2 (4), 555-567 (2007).
- Selimović, Š, Oh, J., Bae, H., Dokmeci, M., Khademhosseini, A. Microscale strategies for generating cell-encapsulating hydrogels. Polymers. 4 (3), 1554-1579 (2012).
- Annabi, N., Nichol, J. W., et al. Controlling the porosity and microarchitecture of hydrogels for tissue engineering. Tissue Eng Part B Rev. 16 (4), 371-383 (2010).
- Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. Tissue Eng Part B Rev. 14 (1), 61-86 (2008).
- Bodenberger, N., et al. Evaluation of methods for pore generation and their influence on physio-chemical properties of a protein based hydroge. Biotech Rep. 12, 6-12 (2016).
- Raja, S. T. K., Thiruselvi, T., Mandal, A. B., Gnanamani, A. pH and redox sensitive albumin hydrogel: A self-derived biomaterial. Sci Rep. 5, 15977 (2015).
- Hennink, W. E., van Nostrum, C. F. Novel crosslinking methods to design hydrogels. Adv Drug Deliver Rev. 64, 223-236 (2012).
- Chung, C., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Tetrakis(hydroxymethyl) phosphonium chloride as a covalent cross-linking agent for cell encapsulation within protein-based hydrogels. Biomacromolecules. 13 (12), 3912-3916 (2008).
- Caló, E., Khutoryanskiy, V. V. Biomedical applications of hydrogels: A review of patents and commercial products. Eur Polym J. 65, 252-267 (2015).
- Huang, H., Herrera, A. I., Luo, Z., Prakash, O., Sun, X. S. Structural transformation and physical properties of a hydrogel-forming peptide studied by NMR, transmission electron microscopy, and dynamic rheometer. Biophys J. 103 (5), 979-988 (2012).
- Draghi, L., Resta, S., Pirozzolo, M. G., Tanzi, M. C. Microspheres leaching for scaffold porosity control. J Mater Sci. 16 (12), 1093-1097 (2005).
- Whang, K., et al. Engineering Bone Regeneration with Bioabsorbable Scaffolds with Novel Microarchitecture. Tissue Eng. 5 (1), 35-51 (1999).
- Ziv, K., et al. A tunable silk-alginate hydrogel scaffold for stem cell culture and transplantation. Biomaterials. 35 (12), 3736-3743 (2014).
- Butruk-Raszeja, B. A., et al. Athrombogenic hydrogel coatings for medical devices--Examination of biological properties. Colloid Surface B. 130, 192-198 (2015).
- Lü, S., Li, B., Ni, B., Sun, Z., Liu, M., Wang, Q. Thermoresponsive injectable hydrogel for three-dimensional cell culture: chondroitin sulfate bioconjugated with poly(N-isopropylacrylamide) synthesized by RAFT polymerization. Soft Matter. 7 (22), 10763 (2011).
- Ruoslahti, E., Pierschbacher, M. D. New perspectives in cell adhesion: RGD and integrins. Science. 238 (4826), 491-497 (1987).
