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Biochemistry

Fácil manipulação das arquiteturas em hidrogel à base de proteínas para aplicações de cultura de células

Published: August 4, 2017 doi: 10.3791/55813
Automatic Translation
1, 1, 1
1Center for Peptide Pharmaceuticals, Faculty of Natural Science, Ulm University

Summary

Diferentes métodos para manipular a arquitetura tridimensional em hidrogel à base de proteínas são avaliados aqui com respeito a propriedades do material. As redes se são acrescidas com um peptídeo de célula-adesivo, e sua viabilidade na cultura de pilha é avaliada usando duas linhas de células de modelo diferente.

Abstract

Hidrogel é reconhecidos como materiais promissores para aplicações de cultura de células devido à sua capacidade para fornecer ambientes de célula altamente hidratado. O campo de modelos 3D está a aumentar devido à semelhança potencial desses materiais para a matriz extracelular natural. Hidrogel à base de proteínas é particularmente promissor, porque pode facilmente ser acrescidas e pode atingir estruturas definidas com propriedades físico-químicas ajustáveis. No entanto, a produção de modelos 3D de se para aplicações de cultura de células utilizando materiais naturais é muitas vezes limitada pela suas propriedades mecânicas mais fracas em comparação com as de materiais sintéticos. Aqui, diferentes métodos foram avaliados para produzir se albumina de soro bovino (BSA)-com base em sistemas de hidrogel, com tamanhos de poros ajustável na faixa de 10 a 70 µm no raio. Além disso, estabeleceu-se um método para gerar canais neste material à base de proteínas que são vários cem mícrons longos. Os diferentes métodos para produzir os poros, bem como a influência do tamanho dos poros em propriedades materiais, tais como inchaço ratio, pH, estabilidade de temperatura e comportamento de degradação enzimática, foram analisados. Tamanho dos poros foram investigado no estado nativo, inchado do hidrogel usando laser confocal, microscopia eletrônica de varredura. A viabilidade para aplicações de cultura de células foi avaliada com célula-adesivo RGD peptídeo modificação do sistema de proteína e duas linhas de célula modelo: células de câncer de mama humano (A549) e adenocarcinomic alveolares basais epiteliais células humanas (MCF7).

Introduction

Hidrogel é materiais que formam redes 3D insolúveis capaz de ligação a grandes quantidades de água. Tais materiais podem fornecer excelentes condições ambientais para as células vivas. Atualmente, existe uma crescente interesse na geração de estruturas tridimensionais de hidrogel e no desenvolvimento de processos para adequar suas propriedades químicas e físicas. Uma vez que este é alcançado, um modelo para o crescimento das células e a manipulação do comportamento celular pode ser gerado1,2,3,4. Estas estruturas 3D não só criam um ambiente mais natural e realista do que abordagens convencionais bidimensionais, mas eles também revelar novas possibilidades para o crescimento de células-tronco ou tumor modelos5. Diferentes materiais possuem uma gama de características que principalmente depende do tamanho dos poros do gel de6. Os poros desempenham um papel crucial em aplicações de cultura de células, a engenharia de tecidos e o crescimento direcionado de células-tronco. Por exemplo, oxigênio e nutrientes difundem pela matrix, e quantidades adequadas devem ser capazes de atingir as células7. Por outro lado, metabólitos prejudiciais devem ser removidos logo que possível, e espaço suficiente para o crescimento da célula deve ser disponível7. Consequentemente, as propriedades do material e, portanto, o tamanho dos poros, influenciam severamente os potencial benefício e possível aplicações da matriz. Dependendo as propriedades do material, processos de crescimento de células diferentes podem ocorrer em cultura de células 3D, incluindo a formação de estruturas neuronais; o crescimento e diferenciação das células da pele ou osso; e o crescimento direcionado de linhas de células-tronco especiais, como hepatócitos ou fibroblastos2,3,8,9,10,11. Outro ponto crucial, influenciando a possível aplicação de um material é a sua estabilidade no sentido de estímulos externos12. Por exemplo, o hidrogel deve manter sua integridade mecânica em meios de cultura celular ou o corpo humano.

Nos últimos anos, pesquisas sobre cultura de células 3D hidrogel intensificou-se, e muitos estudos foram realizados para resolver as arquiteturas 3D dos sistemas13. Hidrogel composto por componentes quimicamente sintetizados mais comumente é investigados, porque podem ser facilmente sintetizados e quimicamente modificados e eles apresentam alta estabilidade (veja Zhu et al, 2011 para uma revisão)5. No entanto, as proteínas têm muitas propriedades benéficas: tão chamados "polímeros de precisão", eles são biocompatíveis; Eles têm um comprimento definido; Eles são relativamente fáceis de modificar; e eles têm um grande número de sites de destino14,15. A este respeito, estruturas inovadoras, altamente específicas podem ser geradas para aplicação em muitos campos. Neste estudo, um hidrogel à base de proteína de16 foi usado para demonstrar a capacidade de bem estabelecidos métodos para influenciar a arquitetura 3D do material. Além disso, a capacidade de e aplicabilidade para geração de poros também foi investigada.

Muitas técnicas diferentes estão disponíveis para modificar estruturas 3D, incluindo ambos os métodos simples e técnicas sofisticadas, altamente especializadas de diferentes áreas da ciência de materiais. Uma técnica comum é o uso de eletrofiação para gerar estruturas bem definidas17. Carregada de fibras são puxadas a partir de uma solução por um campo elétrico e em seguida solidificam após a exposição ao oxigênio. Desta forma, podem ser produzidas fibras no intervalo de vários nanômetros até alguns mícrons. Técnicas adicionais para ajustar o tamanho, estrutura e distribuição dos poros dentro da matriz são macia litografia, fotolitografia, focalização hidrodinâmica, electro-pulverização e bio-imprimir18,19,20. Uma desvantagem significativa dessas técnicas é sua dependência específico, caros equipamentos e produtos químicos especiais ou materiais. Além disso, a experiência com estas técnicas, muitas vezes não é diretamente transferível para materiais à base de proteínas, e muitos dos produtos químicos e métodos não são celulares compatíveis.

Por outro lado, muitas técnicas não se baseará equipamento especial, tornando-os mais fácil e mais barato para aplicar e reproduzir. Um método generalizado para manipulação de estrutura é solvente fundição21,22,23. As partículas são adicionadas antes da reação de polimerização e são distribuídas homogênea até para saturar a solução. Após a polimerização, uma mudança de condições, tais como uma diluição ou uma alteração de pH, leva para a solvatação das partículas, enquanto os poros permanecem dentro do material. Os produtos químicos utilizados nestas técnicas, tais como sal, açúcar, parafina, gelatina e giz, são baratas e prontamente disponíveis. Na liofilização, hidrogel inchadas está congelados. A sublimação subsequente das fases líquidas sob um vácuo é então realizada23,24,25. Sublimação da água da rede é suficientemente suave para manter as estruturas 3D específicas do material. Em gás de espuma, uma solução é transmitida com um gás durante a polimerização ocorre, deixando os poros dentro do gel de21. O tamanho e a distribuição dos poros podem ser ajustadas dependendo do fluxo de gás.

Para formar a proteína hidrogel, BSA é reagido com cloreto de tetrakis (hidroximetil) do phosphonium (THPC) em uma reação de Mannich-tipo para permitir a formação de ligações covalentes entre aminas primárias e os grupos hidroxi de 4 braços vinculador molécula26. Possíveis intermediários prejudiciais são removidos por lavagem excessiva do material, depois que a reação ocorre.

Este estudo demonstra a possibilidade de tratar de um material à base de BSA com diferentes técnicas para manipular e ajustar o tamanho dos poros. Cada uma das técnicas pode ser usada em qualquer laboratório em todo o mundo, como nenhum equipamento especial é necessário. Além disso, diferentes parâmetros, tais como inchaço ratio, degradabilidade enzimática, estabilidade do pH e sensibilidade à temperatura, foram examinados e comparados uns aos outros, especialmente respeitam à influência das diferentes técnicas na geração de arquiteturas 3D. Finalmente, os materiais foram acrescidos com peptídeos de célula-adesivo para investigar a possível aplicação dos materiais para cultura de células. Utilizaram-se duas linhas de célula diferente modelo: A549 e MCF7.

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Protocol

1. hidrogel preparação

  1. Misture 200 mg de BSA com 1 mL de deionizada H2O para criar ações de BSA de 20% (p/v) (solução estoque A).
  2. Mix de 165 µ l da solução THPC (134 mg/mL) com 4,835 mL de água deionizada para criar THPC solução (solução B).
  3. Pesar 1 mg de peptídeo (1,111.1 g/mol) de KCSSGKSRGDS (ou um equivalente do celular-adesivo peptide) e diluí-la em 100 µ l de estéril H2O para obter uma solução de 10 mg/mL (solução C).
    Nota: Este passo é opcional e só precisa ser incluído se o hidrogel destina-se a aplicação de cultura de células.
  4. Remova a parte inferior de uma placa de 96 poços e substituí-lo com o envoltório plástico removível.
    Nota: Para as placas usadas aqui, o fundo pode ser facilmente removido, aplicando pressão no fundo de cada poço; o fundo de plástico fino vai simplesmente cair.
  5. Solução (B) o estoque Mix 100 µ l de solução-mãe de BSA (A) e 100 µ l de THPC (opcional: 4 µ l de solução-mãe C para funcionalizados, célula-adesivo de hidrogel) da placa de 96 poços para obter 200 µ l de hidrogel. Misture os componentes pipetando acima e para baixo pelo menos 5 vezes a garantia de um hidrogel uniforme após a polimerização.
  6. Coloque a placa de 96 poços à temperatura ambiente (RT) por cerca de 10 min até hidrogel todos corretamente é polimerizadas.
  7. Lentamente e com cuidado Retire o plástico da parte inferior da placa.
  8. Pressione o hidrogel fora a placa de 96 poços, usando um pequeno selo e transferi-los para tubos de 1,5 mL com PBS estéril, pH 7,4.
    Nota: O hidrogel tem uma forma cilíndrica, com um diâmetro de aproximadamente 4 mm e uma altura de 8 mm.
  9. Armazene o hidrogel em tampão fosfato salino (PBS) a 4 ° C por até diversos meses.

2. o hidrogel de liofilização

  1. Encher tubos de 1,5 mL com 500 µ l de deionizada estéril H2O e retire a tampa. Transferi o hidrogel aos tubos de reação de 1,5 mL, usando uma espátula.
  2. Envolva os tubos de 1,5 mL firmemente com parafina filme-pelo menos três camadas para cada frasco. Use uma agulha para perfurar furos pequenos no filme para permitir a liberação de gás do tubo.
  3. Proceda de uma das seguintes etapas:
    1. Transferi o frasco para solução de nitrogênio líquido por 5 min garantir que a água e hidrogel congelam completamente. Imediatamente após a remoção do nitrogênio líquido, transferi os frascos para o secador para evitar que o material de descongelamento de gelo.
      Nota: Este procedimento resulta em poros sobre 10-15 µm no raio.
    2. Manter os frascos a-20 ° C durante a noite para congelar lentamente o hidrogel. Imediatamente após a remoção de-20 ° C, transferi os frascos para o secador para evitar que o material de descongelamento de gelo.
      Nota: Este procedimento resulta em poros sobre 50-60 µm no raio.
  4. Após 24h (e a evaporação completa da água e em torno do hidrogel), descongelar o material por retirando-o secador de gelo.
    Nota: O tamanho dos poros pode ser analisado com laser confocal, microscopia (etapa 5, "Visualização de hidrogel").

3. partícula lixiviação

  1. Prepare o hidrogel como descrito nos passos 1.1-1.5.
  2. Diretamente após a mistura dos componentes, adicione NaCl até que ocorra a saturação (36 mg/mL). Adicione sal até um cristal de sal pode ser visto na solução como um precipitado branco.
  3. Transferir a placa de 96 poços para uma coqueteleira e agite bem até polimerização ocorre (cerca de 10 min). Remova o hidrogel da placa, conforme descrito nas etapas 1.7-1.8.
  4. Incube o hidrogel pelo menos 24 h a RT em água estéril num agitador (20 rpm) para eluir todo sal a partir do modelo de hidrogel. Armazene o hidrogel a 4 ° C em PBS por até vários meses.

4. formação do canal

  1. Prepare o hidrogel conforme descrito na etapa 1. Remover um hidrogel de solução usando uma pinça, remova o excesso de água com papel altamente absorvente e colocá-lo em cima de um bloco de gelo seco.
  2. Congelar o hidrogel por 30 s e remova-a cuidadosamente do bloco. Não danifique o hidrogel; cuidadosamente com uma espátula para raspar o bloco. Transfira o hidrogel para um tubo de 1,5 mL e secá-lo durante a noite a 37 ° C.

5. hidrogel visualização

  1. Prepare uma solução stock de rodamina B diluindo-se 1 mg de rodamina B em 10 mL de PBS. Preparar uma diluição serial diluindo a solução-mãe de rodamina em PBS até atingir uma concentração de 0,001 mg/mL (factor de diluição: 100)
  2. Remover o hidrogel da solução de armazenamento (por exemplo, da etapa 2.4.) e transferir para um tubo de 1,5 mL com 1 mL de solução de rodamina B 0,01 mg/mL. Mancha o hidrogel durante a noite em solução de rodamina B a RT
  3. No dia seguinte, transferi o hidrogel que é para ser visualizado a 10 mL de PBS (pH 7,4) e lavagem pelo menos 3 h.
  4. Transferir o hidrogel numa µ-lâmina 8 bem e cubra com PBS.
  5. Pequenas fatias para fora o hidrogel (cerca de 0,5 mm em altura), usando uma lâmina de corte.
  6. Usando um laser confocal microscópio, Visualizar o hidrogel no comprimento de onda de 514 nm (objectivo: CE plano-Neofluar 40 x / 1,30 óleo DIC M27, modo de varredura de avião: 514 nm e zoom: 1 X).

6. viabilidade de cultura de célula

  1. Estéril-filtro todos estoque de soluções (A, B e C) com um filtro de 0,45 µm.
  2. Prepare o hidrogel como descrito nos passos 1.1-1.4, incluindo o peptídeo de célula-adesivo antes da polimerização de hidrogel.
  3. Após a mistura dos componentes, pipete imediatamente a mistura para um µ-slide 8 bem até que o fundo é completamente coberto.
    Nota: Esta etapa deve ser executada rapidamente e diretamente após a mistura dos componentes, como polimerização ocorre dentro de minutos no slide.
  4. Células de adesão de cultura e passagem para obter uma suspensão de célula única, utilizando técnicas de cultura de célula padrão. Transferi as células previamente aquecido, estéril DMEM celular cultura suplementado com soro fetal bovino (FBS, 10% (p/v)), penicilina-estreptomicina (1% (p/v)) e solução de aminoácido não essencial (MEM, 1% (p/v)).
  5. Conte as células com um Neubauer contando câmara e cuidadosamente Pipetar 200 µ l do número desejado de células (2 x 105 células/cm2) sobre a superfície de hidrogel.
  6. Cobrir o µ-slide 8 bem com a tampa e transferi-lo para uma incubadora (37 ° C, 5% CO2). Incubar durante pelo menos 4 h a 37 ° C.
  7. Após pelo menos 4 h de ligação celular, lave as células duas vezes com 200 µ l de cultura de células estéreis PBS.
  8. Consertar as células com 200 µ l de formaldeído de 3,7% (v/v) durante 10 minutos a RT e lave duas vezes com PBS (~ 200 µ l).
    Nota: Usar equipamento de protecção adequado ao manusear o formaldeído.
  9. Permeabilize as células com 200 µ l de 0.1% Triton X 5 min. Lave duas vezes com PBS.
  10. Manche as células com rodamina-faloidina misturando 5 µ l de estoque metanólica com 195 µ l de PBS e adicioná-lo às células para RT. mancha as células por 20 min no escuro. Lave duas vezes com PBS.
  11. Investigar as propriedades de aderência de célula usando um microscópio confocal em 514 nm (objectivo: CE plano-Neofluar 40 x / 1,30 óleo DIC M27, modo de varredura de avião: 514 nm e zoom: 1 X). Analisar as imagens usando o software apropriado (consulte a Tabela de materiais).

7. hidrogel Propriedades

  1. Relação de inchaço.
    1. Seque completamente o hidrogel a 37 ° C pelo menos um dia.
    2. Pesar cada hidrogel e anotar o peso exato.
    3. Encha um tubo de reação de 2 mL com 1,5 mL de PBS.
    4. Transferir o hidrogel neste tubo de reação de 2ml e mergulhe-a completamente em PBS.
    5. Deixe o hidrogel para pelo menos dois dias em PBS em RT para atingir o equilíbrio com a PBS.
    6. Depois de três dias, retire o hidrogel da solução e seque-o com um lenço de papel para remover o excesso de água da superfície de hidrogel.
    7. Pese o hidrogel.
    8. Calcule a relação inchaço usando a seguinte fórmula:
      Equation
      onde Wd é o peso do gel seco (etapa 7.1.2.) e Ws é o peso do gel molhado (etapa 7.1.7). Multiplica com 100 para obter a porcentagem de relação a inchaço.
  2. estabilidade de pH e temperatura.
    1. Transfira 5 mL de PBS para um tubo de reação de 15 mL.
    2. Ajuste a solução ao pH adequado (por exemplo, pH 2, 7 ou 10) com NaOH e HCl. Bring a solução à temperatura adequada (por exemplo, RT 37 ° C e 80 ° C).
    3. Transferi o hidrogel que está a ser investigado por sua estabilidade para a solução adequada. Se necessário, reajuste o pH.
      Nota: Todos hidrogel deve ser completamente inchados neste ponto (veja a relação de inchaço) para evitar a interpretação incorreta do peso devido ao inchaço do material.
    4. Após determinados intervalos de tempo, retire o hidrogel da solução (por exemplo, cada hora durante 2 dias), seque-o com um lenço de papel altamente absorvente para remover o excesso de água e pesá-lo.
  3. Degradação enzimática.
    1. Prepare uma solução de enzima de estoque de 300 tripsina U e pepsina, conforme as instruções do fabricante.
    2. Transferi o hidrogel (por exemplo, da etapa 1.8) para a solução adequada.
      Nota: Todos os hidrogel deve ser completamente inchados neste momento para evitar a interpretação incorreta do peso.
    3. Após determinados intervalos de tempo, retire o hidrogel da solução (por exemplo, cada hora), seque-o com um lenço de papel altamente absorvente para remover o excesso de água e pesá-lo.

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Disclosures

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Acknowledgments

Os autores gostaria de agradecer seu apoio financeiro no quadro "Síntese de Material Bioinspirada" (BioMatS-14) Stiftung Baden-Württemberg.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate Buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010023
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (high glucose) Life Technologies / Thermo Fisher  11140-050
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies / Thermo Fisher  10270-106
Penicillin-Streptomycin Life Technologies / Thermo Fisher  15140122
MEM Nonessential Amino Acid Solution Sigma Aldrich M7145-100ML
Trypsin EDTA 0.05% Phenol Red Thermo Fisher Scientific 25300062
Ethanol 99.8%, vergällt Ölfabrik Schmidt 2133
NaCl  Carl Roth  9265.1
Albumin Fraction V Carl Roth  3854.2
THPC Sigma Aldrich 404861-100ML Toxic
0.1% Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ML Slightly toxic
Phalloidin-rhodamine  Life Technologies / Thermo Fisher  R415
3.7% Formaldehyde  Life Technologies / Thermo Fisher  F8775-25ML Toxic
Rhodamine B Sigma Aldrich 81-88-9
Filtropur S 0.2  Sarsted Ag und Co. 2 83.1826.001   
µ slide 8 well Ibidi GmbH 80826
KCSSGKSRGDS peptide UPEP Ulm Custom sysnthesis
Ethanol 99.8%, vergällt Carl Roth  K928.5
Falcon 5 ml Polysterene Round-Bottom Tube  Sarsted Ag und Co. 62.547.254    
Tubes 50 ml  Sarsted Ag und Co. 62.547.254    
Tubes 1.5 ml   Sarsted Ag und Co. 72,690,001
Tubes 2 ml   Sarsted Ag und Co. 72,691
CELL CULTURE MICROPLATE, 96 WELL, PS, F-BOTTOM Greiner 655073
FreezeDryer Epsilon 1-6D,  Christ, Osterode am Harz, Germany
Confocal Laser Scanning Microscope  Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany
Zen Software Version 2012 Sp1, black edition, 407 version 8,1,0,484 Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany
GSA Imaga Analyzer Software, GSA Image Analyzer, GSA, Version 419 3.8.7 GSA GmbH

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Bodenberger, N., Kubiczek, D., Rosenau, F. Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications. J. Vis. Exp. (126), e55813, doi:10.3791/55813 (2017).

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