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Biochemistry

셀 문화 응용 프로그램에 대 한 단백질 기반 Hydrogels 아키텍처의 쉬운 조작

Published: August 4, 2017 doi: 10.3791/55813
Automatic Translation
1, 1, 1
1Center for Peptide Pharmaceuticals, Faculty of Natural Science, Ulm University

Summary

단백질 기반 hydrogels 3 차원 구조를 조작 하는 다른 메서드 여기 소재 속성에 대해 계산 됩니다. 세포 접착 펩 티 드와 함께 macroporous 네트워크는 공업화 하 고 두 개의 서로 다른 모델 셀 라인을 사용 하 여 세포 배양에서 그들의 타당성을 평가.

Abstract

Hydrogels 셀 문화 응용 프로그램 때문에 높은 수 화 셀 환경을 제공 하는 그들의 능력에 대 한 유망 자료로 인정 받고 있습니다. 3 차원 서식 파일의 필드는 자연적인 기질을 그 물질의 잠재적인 정체 때문 상승 이다. 단백질 기반 hydrogels가 있습니다 특히 유망한 functionalized 쉽게 수 있기 때문에 조정 가능한 물리 속성으로 정의 된 구조를 얻을 수 있습니다. 그러나, 천연 재료를 사용 하 여 셀 문화 응용 프로그램에 대 한 macroporous 3D 템플릿의 생산 종종 합성 물질의 그들과 비교 된 그들의 약한 기계적 성질에 의해 제한 됩니다. 여기, 다른 방법을 macroporous 소 혈 청 알 부 민 (BSA)를 생산 하기 위해 평가 했다-하이드로 겔 시스템, 반경에서 10 ~ 70 µ m의 범위에서 조정 가능한 기 공 크기를 기반으로. 또한, 몇 백 미크론 긴은이 단백질 기반 자료 채널을 생성 하는 방법 설치 되었다. 모 공, 기 공 크기의 영향 비율, pH, 온도 안정성, 그리고 효소 저하 행동, 붓기 등의 소재 속성에 생산 하는 여러 가지 방법은 분석 했다. 기 공 크기 hydrogels confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법을 사용 하 여 네이티브, 부푼 상태에서 조사 되었다. 셀 문화 응용 프로그램에 대 한 타당성 단백질 시스템 및 두 개의 모델 셀 라인의 세포 접착제 RGD 펩타이드 수정을 사용 하 여 평가 했다: 인간 유방암 세포 (A549)와 adenocarcinomic 인간의 치경 기저 상피 세포 (MCF7).

Introduction

Hydrogels는 많은 양의 물 바인딩 수 불용 성 3 차원 네트워크를 형성 하는 물자. 이러한 자료는 살아있는 세포에 대 한 우수한 환경 조건을 제공할 수 있습니다. 현재, 3 차원 하이드로 겔 구조의 세대에 그들의 화학 및 물리적 특성에 맞게 프로세스 개발에 관심이 증가 하고있다. 이 달성 되 면 세포의 성장 및 세포 행동의 조작에 대 한 템플릿이 생성된1,2,,34될 수 있습니다. 이러한 3 차원 구조 뿐만 아니라 기존의 2 차원 방법, 하지만 그들은 보다 더 자연스럽 고 현실적인 환경 또한 공개 새로운 가능성을 만들 줄기 세포의 성장에 대 한 또는 종양 모델5. 다른 재료는 젤6의 기 공 크기에 주로 의존 하는 특성의 범위를 소유한 다. 모 공 세포 문화 응용 프로그램, 조직 공학 및 줄기 세포의 감독된 성장에 중요 한 역할을 한다. 예를 들어, 매트릭스를 통해 확산 하는 산소와 영양분 그리고 충분 한 양의 세포7에 도달 할 수 있어야 합니다. 다른 한편으로, 유해한 대사 산물, 최대한 빨리 제거 되어야 한다 고 세포 성장 위한 충분 한 공간이 사용 가능한7수 있어야 합니다. 따라서, 재료의 기 공 크기, 속성 심각 하 게 영향을 미칠 행렬의 잠재적인 혜택 및 가능한 응용 프로그램. 재료의 특성에 따라, 다른 세포-성장 과정; 신경 구조의 형성을 포함 하 여 3 차원 세포 배양에서 발생할 수 있습니다. 성장과 분화의 피부 나 뼈 세포; 그리고 hepatocytes 또는 섬유 아 세포2,3,,89,10,11같은 특별 한 줄기 세포 라인의 감독된 성장. 또 다른 중요 한 포인트는 물질의 가능한 응용 프로그램에 영향을 미치는 외부 자극12쪽으로 그것의 안정성입니다. 예를 들어는 히드로 세포 배양 또는 인체에 기계적 무결성을 유지 해야 합니다.

최근 몇 년 동안, 강화, 3D 셀 문화 hydrogels에 연구와 많은 연구 시스템13의 3 차원 구조를 해결 하기 위해 실시 했다. 화학적 합성된 구성 요소 구성 Hydrogels 가장 일반적으로 쉽게 합성 및 화학적 수정 수 있고 그들은 높은 안정성을 전시 하기 때문에 조사 (주 외., 2011 리뷰 참조)5. 그러나, 단백질에는 많은 유익한 속성이:으로 소위 "정밀 고분자," 그들은 생체; 그들은 정의 길이; 그들은 상대적으로 쉽게 수정; 그리고 그들은 많은 수의 대상 사이트14,15. 이와 관련, 많은 분야에서 응용 프로그램에 대 한 매우 구체적인, 혁신적인 구조를 생성할 수 있습니다. 본이 연구에서는 단백질 기반 하이드로 겔16 자료의 3 차원 구조에 영향을 잘 설립 방법의 능력을 보여 주기 위해 사용 되었다. 또한, 능력과 기 공 세대에 적용도 조사 했다.

많은 다른 기술이 간단한 방법 및 재료 과학의 다른 분야에서 정교 하 고, 고도로 전문화 된 기술 모두를 포함 하 여 3 차원 구조를 수정할 수 있습니다. 광범위 한 기술을 잘 정의 된 구조17를 생성 하는 전기의 사용 이다. 충전된 섬유는 전기 분야에 의해 해결책에서 가져온 고 산소에 노출 시 응고. 이 방법에서는, 몇몇 미크론까지 여러 나노미터의 범위에서 섬유를 생산 수 있습니다. 추가 기술을 크기, 구조, 그리고 매트릭스 내의 숨 구멍의 배포를 조정 하는 소프트 리소 그래피, 사진 평판, 유체역학 초점, 전기 살포 바이오 인쇄18,,1920. 이러한 기술의 중요 한 결점은 특정, 비싼 장비 및 특수 화학 제품 또는 자료에 대 한 의존도. 또한, 이러한 기술을 경험 종종 단백질 기반 재료를 직접 양도 이며 화학 물질 및 방법의 많은 셀 호환 되지 않습니다.

다른 한편으로, 많은 기술을 쉽고 저렴 적용 하 고 재현 하 그들을 만드는 특별 한 장비에 의존 하지 마십시오. 구조 조작에 대 한 광범위 한 방법은 용 매 캐스팅21,,2223입니다. 입자 중 합 반응 전에 추가 되 고 솔루션 포화 homogenously 배포 됩니다. 중 합 후 희석 또는 pH 변화, 같은 조건의 변화를 모는 재료 내에서 유지 하는 동안 입자의 solvation에 지도 한다. 소금, 설탕, 파라핀, 젤라틴, 분필, 등이 기술에 사용 되는 화학 물질 저렴 하 고 쉽게 사용할 수 있다 동결에 부 어 hydrogels 동결 됩니다. 진공에서 액체 단계의 후속 승화는23,,2425수행. 네트워크에서 물 승화 만큼 부드러운 재료의 특정 3D 구조를 유지 하는. 가스 거품, 동안에 중 합, 젤21내 숨 구멍을 떠나는 해결책 가스와 스트리밍됩니다. 크기와 숨 구멍의 분포는 가스 흐름에 따라 조정할 수 있습니다.

형성 단백질 히드로, BSA는 tetrakis (hydroxymethyl) phosphonium 염화 물 (THPC) 1 차 아민 4 무장 링커 분자26의 hydroxy 그룹 사이 공유 결합의 형성에 대 한 있도록 Mannich 형 반응에서으로 반작용 했다. 반응 발생 가능한 유해한 중간체 물질의 과도 한 씻기에 의해 제거 됩니다.

이 연구에서는 조작 하 고 숨 구멍의 크기에 맞게 다른 기술로 BSA 기반 소재를 치료의 가능성을 보여 줍니다. 각 기술을 사용할 수 있습니다 어떤 실험실에 전세계, 특별 한 장비는 필요 하다. 또한, 다른 매개 변수를 같은 붓기 비율, 효소 분해성, pH 안정성, 온도 감도, 검사 그리고 서로에 비해 특히 존중 다른 기술의 영향에 3D 아키텍처의 생성에. 마지막으로, 자료 했다 기능성 세포 배양 물질의 가능한 응용 프로그램을 조사 하기 위해 셀 접착제 펩 티 드와 함께. 두 개의 서로 다른 모델 셀 라인 사용 되었다: A549 및 MCF7.

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Protocol

1. 하이드로 겔 준비

  1. BSA의 200 mg 이온된 H2O를 20% (w/v) BSA 주식 (재고 솔루션 A)을 만드는의 1 mL와 함께 믹스.
  2. THPC 솔루션 (134 mg/mL)의 이온된 수를 만드는 THPC의 4.835 mL와 혼합 165 µ L 재고 솔루션 (재고 솔루션 B).
  3. KCSSGKSRGDS (1,111.1 g/mol) 펩 티 드 (또는 동등한 세포 접착 펩 티 드)의 1 밀리 그램의 무게 그리고 살 균 H2O 10 mg/mL 해결책 (재고 솔루션 C)를 100 µ L에 희석.
    참고:이 단계는 선택 사항이 고만 경우는 히드로 셀 문화 응용 프로그램에 대 한 의미는 포함 되지 해야 합니다.
  4. 96 잘 접시의 바닥을 제거 하 고 이동식 플라스틱 랩으로 대체.
    참고: 여기에 사용 되는 번호판에 대 한 하단의 쉽게 제거할 수 있습니다 각 잘;의 하단에 압력을 적용 하 여 얇은 플라스틱 하단 단순히 밖으로 떨어질 것 이다.
  5. BSA 재고 솔루션의 믹스 100 µ L (A) 및 THPC의 100 µ L 재고 솔루션 (B) (선택 사항: 재고 솔루션 C 공업화, 세포 접착 hydrogels 4 µ L) 하이드로 겔의 200 µ L를 96 잘 접시에. 중 합 후 균일 한 하이드로 겔을 보장 하기 위해 5 번 이상 아래로 pipetting으로 구성 요소를 믹스.
  6. 모든 hydrogels는 제대로 생산 될 때까지 약 10 분 동안 실 온 (RT)에서 96 잘 접시를 놓습니다.
  7. 신중 하 고 천천히 접시의 아래쪽에서 플라스틱 포장을 제거 합니다.
  8. 작은 스탬프를 사용 하 여 96 잘 접시에서 hydrogels 누르고 살 균 PBS, pH 7.4와 1.5 mL 튜브에 그들을 전송.
    참고:는 hydrogels 약 4 mm의 직경 및 높이 8 m m의 원통형 모양이 있다.
  9. hydrogels 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 몇 개월까지 4 ° C에서 저장 합니다.

2. 동결 된 Hydrogels

  1. 살 균 이온된 H2O의 500 µ L와 1.5 mL 튜브와 뚜껑을 제거. 주걱을 사용 하 여 1.5 mL 반응 관에는 hydrogels 전송.
  2. 1.5 mL 튜브 단단히 파라핀 영화-에 적어도 3 층 각 유리병에 대 한 포장. 바늘을 사용 하 여 튜브에서 가스 릴리스 수 있도록 영화에 있는 작은 구멍을 뚫.
  3. 다음 단계 중 하나를 수행 하십시오.
    1. 액체 질소는 물과 히드로 완전히 고정 되도록 5 분 동안 솔루션에 유리병을 전송 합니다. 즉시 제거 후 액체 질소에서 녹고에서 물자를 방지 하기 위해 건조 기 동결에 튜브를 전송 합니다.
      참고:이 절차 결과 모 공에 대 한 10-15 µ m 반경에.
    2. 천천히는 hydrogels 동결 하룻밤-20 ° C에서 튜브를 유지. 즉시 제거 후-20 ° C에서, 녹고에서 물자를 방지 하기 위해 건조 기 동결에 튜브를 전송 합니다.
      참고:이 절차에 대 한 모에 결과 반지름 µ m 50-60.
  4. 24 h (와 후에 하이드로 겔 주위 물의 완전 한 증발), 동결 건조 기에서 그것을 제거 하 여 소재를 녹여.
    참고: 기 공 크기는 confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법 (단계 5, "하이드로 겔 시각화")와 함께 분석할 수 있습니다.

3. 입자 침

  1. 1.1-1.5 단계에 설명 된 대로 하이드로 겔을 준비 합니다.
  2. 직접 구성 요소를 혼합 후 추가 NaCl 포화 (36 mg/mL)이 발생할 때까지. 솔트 크리스탈 흰색 침전으로 솔루션에서 볼 수 있습니다 때까지 소금을 추가 합니다.
  3. 통에 96 잘 접시를 전송 하 고 중 합 일어난다 (약 10 분) 때까지 흔들어. 1.7-1.8 단계에 설명 된 대로 hydrogels는 접시에서 제거 합니다.
  4. 하이드로 겔 템플릿에서 모든 소금 elute 하 통 (20 rpm)에 살 균 물에 RT에서 적어도 24 h hydrogels 품 어. 몇 개월에 대 한 PBS에 4 ° C에서 hydrogels를 저장 합니다.

4. 채널 형성

  1. 1 단계에서 설명한 대로 hydrogels를 준비 합니다. 히드로 협공을 사용 하 여 솔루션에서 제거 하 고 높게 흡수 성 종이, 과잉의 물을 제거 드라이 아이스의 블록 위에 두십시오.
  2. 고정 30 하이드로 겔의 블록에서 조심 스럽게 분리. 하이드로 겔;를 손상 하지 않습니다 조심 스럽게 주걱을 사용 하 여 블록 다쳤어요. 1.5 mL 튜브에는 히드로 전송 하 고 37 ° c.에 하룻밤 건조

5. 하이드로 겔 시각화

  1. PBS의 10 ml에서 rhodamine B의 1 마그네슘을 diluting 하 여 rhodamine B 재고 솔루션을 준비 합니다. 0.001 mg/mL의 농도 도달할 때까지 PBS에서 rhodamine 재고 솔루션을 diluting 하 여 직렬 희석을 준비 (희석 비율: 100)
  2. 스토리지 솔루션 (예를 들어, 단계 2.4에서에서.)에서 하이드로 겔을 제거 하 고 0.01 mg/mL rhodamine B 해결책의 1 mL 1.5 mL 튜브에 그것을 전송. 실시간에서 rhodamine B 솔루션에 하룻밤 히드로 얼룩
  3. 다음 날, PBS (pH 7.4)와 적어도 3 h에 대 한 세척의 10 mL를 시각화 하는 히드로 전송.
  4. 잘 µ-슬라이드 8에 히드로 전송 및 PBS와 그것을 커버.
  5. 블레이드를 사용 하 여 (약 0.5 m m에 높이) 히드로에서 작은 조각을 잘라.
  6. Confocal 레이저 스캐닝 현미경를 사용 하 여 시각화 514의 파장에서 히드로 nm (목표: EC 계획-Neofluar 40 x / 1.30 오일 DIC M27, 비행기 스캔 모드: 514 nm, 및 확대/축소: 1 X).

6. 셀 문화 타당성

  1. 멸 균 필터 모두 0.45 μ m 필터 솔루션 (A, B 및 C) 재고.
  2. 1.1-1.4, 히드로 합 전에 셀 접착제 펩 티 드를 포함 하 여 단계에 설명 된 대로 하이드로 겔을 준비 합니다.
  3. 구성 요소를 혼합 한 후 즉시 플라스틱 혼합물 µ-슬라이드 8에 하단 완전히 덮여 때까지 잘.
    참고:이 단계 수행 되어야 합니다 신속 하 고 직접 부품, 후 중 합 슬라이드에 몇 분 안에 일어난다.
  4. 문화 접착 세포와 통로를 표준 세포 배양 기술을 사용 하 여 단일 셀 서 스 펜 션. 미리 데워 진, 무 균 DMEM 세포 배양 소 태아 혈 청 (FBS, 10% (w/v)), 페니실린-스 (1% (w/v)), 그리고 불필요 한 아미노산 솔루션 (MEM, 1% (w/v)) 보충으로 셀을 전송 합니다.
  5. Neubauer 챔버 및 신중 하 게 피 펫 200 µ L 셀 (2 x 105 셀/cm2) 하이드로 겔 표면에 원하는 수의 계산 된 셀 계산.
  6. Μ-슬라이드 8 뚜껑으로 잘 커버 하 고 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO2)에 그것을 전송. 적어도 4 h 37 ° c.에 품 어
  7. 세포 부착의 적어도 4 h, 후 셀 메 마른 세포 배양 PBS의 200 µ L 두 번 씻는 다.
  8. RT에서 10 분에 대 한 3.7% (v/v) 포름알데히드의 200 µ L로 셀을 수정 하 고 PBS로 두번 세척 (~ 200 µ L).
    참고: 포름알데히드를 처리할 때 적절 한 개인 보호 장비를 착용 하십시오.
  9. PBS로 두 번 5 분 세척에 대 한 0.1% 트리톤 X의 200 µ L 셀 permeabilize
  10. Phalloidin-rhodamine 셀 추가 하 여 PBS의 195 µ L methanolic 주식의 5 µ L 혼합 그것 셀에 실시간 얼룩에 20 분에 대 한 셀 어둠 속에 얼룩. PBS로 2 회 세척.
  11. 514에 confocal 현미경을 사용 하 여 셀 접착 속성 조사 nm (목표: EC 계획-Neofluar 40 x / 1.30 오일 DIC M27, 비행기 스캔 모드: 514 nm, 및 확대/축소: 1 X). 적절 한 소프트웨어를 사용 하 여 이미지 분석 ( 테이블의 자료를 참조).

7. 하이드로 겔 속성

  1. 붓기 비율입니다.
    1. 적어도 1 일 동안 37 ° C에서 hydrogels를 완전히 건조.
    2. 각 히드로 무게 하 고 정확한 무게 합니다.
    3. 1.5 mL의 PBS로 2 mL 반응 관을 채우십시오.
    4. 이 2 mL 반응 관에는 히드로 전송 및 완전히 PBS에 몰두.
    5. PBS와 평형에 도달 하는 RT에 PBS에 적어도 이틀 동안은 히드로 둡니다.
    6. 3 일 후, 솔루션에서는 하이드로 겔을 제거 하 고 히드로 표면에서 과잉의 물을 제거 하는 종이 티슈로 건조 합니다.
    7. 무게는 하이드로 겔.
    8. 다음 수식을 사용 하 여 붓기 비율 계산:
      Equation
      여기서 Wd 는 말린된 젤 (7.1.2 단계.)의 무게와 Ws 젖은 젤 (단계 7.1.7)의 무게입니다. 붓기 비율 %를 100으로 곱하면 됩니다.
  2. pH 및 온도 안정성입니다.
    1. 15 mL 반응 관에 PBS의 5 mL을 전송.
    2. NaOH와 HCl. 가져와 적절 한 온도 (예, RT, 37 ° C, 또는 80 ° C) 솔루션 솔루션 적절 한 산도 (예를 들어, : pH 2, 7, 또는 10)을 조정 합니다.
    3. 적절 한 솔루션으로 안정성에 대 한 조사 하는 히드로 전송. 필요한 경우 pH를 재조정 하 고
      참고: 모든 hydrogels 해야 합니다 수 완전히 불이 시점에서 (붓기 비율 참조) 재료의 붓기 때문에 무게의 잘못 된 해석을 방지 하기 위해.
    4. 특정 시간 간격 후는 하이드로 겔 (예를 들어, 최대 2 일 동안 각 시간) 솔루션에서 제거, 과잉의 물을 제거 하 고 그것의 무게를 매우 흡수 성 종이 휴지로 건조.
  3. 효소 저하입니다.
    1. 300 U 트립 신 펩 신, 제조업체의 지침에 의하여의 재고 효소 솔루션을 준비 합니다.
    2. 적절 한 솔루션을 (예를 들어, 단계 1.8에서에서) 히드로 전송.
      참고: 모든 hydrogels 해야 합니다 수 완전히 불이 시점에서 무게의 잘못 된 해석을 방지 하기 위해.
    3. 특정 시간 간격 후는 하이드로 겔 (예를 들어, 각 시간) 솔루션에서 제거, 과잉의 물을 제거 하 고 그것의 무게를 매우 흡수 성 종이 휴지로 건조.

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Disclosures

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

Acknowledgments

저자는 바 덴-뷔르템베르크 재단 "Bioinspired 소재 합성" 프레임 워크 (BioMatS-14)에 그들의 재정 지원에 대 한 감사 하 고 싶습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate Buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010023
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (high glucose) Life Technologies / Thermo Fisher  11140-050
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies / Thermo Fisher  10270-106
Penicillin-Streptomycin Life Technologies / Thermo Fisher  15140122
MEM Nonessential Amino Acid Solution Sigma Aldrich M7145-100ML
Trypsin EDTA 0.05% Phenol Red Thermo Fisher Scientific 25300062
Ethanol 99.8%, vergällt Ölfabrik Schmidt 2133
NaCl  Carl Roth  9265.1
Albumin Fraction V Carl Roth  3854.2
THPC Sigma Aldrich 404861-100ML Toxic
0.1% Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ML Slightly toxic
Phalloidin-rhodamine  Life Technologies / Thermo Fisher  R415
3.7% Formaldehyde  Life Technologies / Thermo Fisher  F8775-25ML Toxic
Rhodamine B Sigma Aldrich 81-88-9
Filtropur S 0.2  Sarsted Ag und Co. 2 83.1826.001   
µ slide 8 well Ibidi GmbH 80826
KCSSGKSRGDS peptide UPEP Ulm Custom sysnthesis
Ethanol 99.8%, vergällt Carl Roth  K928.5
Falcon 5 ml Polysterene Round-Bottom Tube  Sarsted Ag und Co. 62.547.254    
Tubes 50 ml  Sarsted Ag und Co. 62.547.254    
Tubes 1.5 ml   Sarsted Ag und Co. 72,690,001
Tubes 2 ml   Sarsted Ag und Co. 72,691
CELL CULTURE MICROPLATE, 96 WELL, PS, F-BOTTOM Greiner 655073
FreezeDryer Epsilon 1-6D,  Christ, Osterode am Harz, Germany
Confocal Laser Scanning Microscope  Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany
Zen Software Version 2012 Sp1, black edition, 407 version 8,1,0,484 Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany
GSA Imaga Analyzer Software, GSA Image Analyzer, GSA, Version 419 3.8.7 GSA GmbH

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Bodenberger, N., Kubiczek, D., Rosenau, F. Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications. J. Vis. Exp. (126), e55813, doi:10.3791/55813 (2017).

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