Summary
Verschiedene Methoden zu manipulieren, dreidimensionalen Architektur in Protein-basierte Hydrogele werden hier in Bezug auf die Materialeigenschaften ausgewertet. Die makroporöse Netze sind mit einer Zelle-Klebstoff-Peptid funktionalisiert und deren Umsetzbarkeit in der Zellkultur wird ausgewertet, mit zwei verschiedenen Modell-Zelllinien.
Abstract
Hydrogele sind anerkannte vielversprechende Materialien für Zelle Kultur Anwendungen aufgrund ihrer Fähigkeit, stark hydratisiert Zelle Umgebungen bereitzustellen. Bereich der 3D Vorlagen steigt wegen der möglichen Ähnlichkeit dieser Materialien, die natürliche extrazelluläre Matrix. Protein-basierte Hydrogele sind besonders Erfolg versprechend, weil sie leicht funktionalisiert können und definierte Strukturen mit einstellbaren physikalisch-chemischen Eigenschaften erreichen können. Allerdings ist die Produktion von makroporösen 3D Vorlagen für die Zelle Kultur Anwendungen mit natürlichen Materialien oft durch ihre schwächeren mechanische Eigenschaften im Vergleich zu synthetischen Materialien begrenzt. Hier wurden verschiedene Methoden ausgewertet, um makroporöse Rinderserumalbumin (BSA) produzieren-basierte Hydrogel-Systeme mit einstellbare Porengrößen im Bereich von 10 bis 70 µm im Umkreis. Darüber hinaus wurde eine Methode zur Erzeugung Kanäle in diesem Protein-basierten Material, das mehrere hundert Mikrometer lang sind. Die verschiedenen Methoden, Poren, sowie den Einfluss der Porengröße auf Materialeigenschaften wie Schwellungen, Verhältnis, pH-Wert, Temperaturstabilität und enzymatischen Abbau Verhalten, produzieren wurden analysiert. Porengrößen wurden im native, geschwollene Bundesstaat die Hydrogele mit konfokale Laser-scanning-Mikroskopie untersucht. Die Machbarkeit für Zelle Kultur Anwendungen wurde eine Zelle-Klebstoff RGD Peptid Modifikation des Systems der Protein und zwei Modell-Zelllinien bewertet: menschlichen Brustkrebszellen (A549) und adenocarcinomic menschlichen alveoläre basalen Epithelzellen (MCF7).
Introduction
Hydrogele sind Materialien, die bilden unlösliche 3D Netzwerke in der Lage, große Mengen an Wasser zu binden. Solche Materialien bieten hervorragende Bedingungen für lebende Zellen. Derzeit, steigt es Interesse bei der Erzeugung von dreidimensionalen Hydrogel Strukturen und der Entwicklung von Prozessen, deren chemischen und physikalischen Eigenschaften anzupassen. Sobald dies erreicht ist, kann eine Vorlage für das Wachstum von Zellen und die Manipulation von zellulären Verhalten generierte1,2,3,4. Diese 3D Strukturen schaffen nicht nur eine natürlichere und realistische Umgebung als herkömmlichen zweidimensionalen Ansätze, aber sie auch zeigen neue Möglichkeiten für das Wachstum von Stammzellen oder Tumor Modelle5. Unterschiedliche Materialien besitzen eine Reihe von Eigenschaften, die vor allem von der Porengröße des Gel6abhängen. Die Poren spielen eine entscheidende Rolle in Zelle Kultur Anwendungen, Gewebe-Engineering und das gerichtete Wachstum von Stammzellen. Beispielsweise mit Sauerstoff und Nährstoffen durch die Matrix diffundieren und ausreichende Mengen müssen möglicherweise die Zellen7zu erreichen. Auf der anderen Seite schädliche Stoffwechselprodukte müssen so schnell wie möglich entfernt werden, und ausreichend Platz für das Zellwachstum muss7verfügbar sein. Daher beeinflussen die Eigenschaften des Materials und somit die Porengröße stark nutzen und mögliche Einsatzmöglichkeiten der Matrix. Abhängig von den Eigenschaften des Materials, können verschiedene Zellwachstum Prozesse in 3D Zellkultur, einschließlich der Bildung von neuronalen Strukturen auftreten; das Wachstum und die Differenzierung von Zellen der Haut oder Knochen; und das gerichtete Wachstum der spezielle Zelllinien, wie Hepatozyten oder Fibroblasten2,3,8,9,10,11. Ein weiterer entscheidender Punkt Einfluss auf die mögliche Anwendung eines Materials ist seine Stabilität gegen äußere Reize12. Zum Beispiel muss das Hydrogel seine mechanische Integrität in Zellkulturmedien oder den menschlichen Körper pflegen.
In den letzten Jahren auf 3D Zelle Kultur Hydrogele intensiviert Forschung und zahlreiche Studien wurden durchgeführt, um die 3D Architekturen der Systeme13zu beheben. Hydrogele bestehend aus chemisch synthetisierten Komponenten sind am häufigsten untersucht, weil sie leicht synthetisiert und chemisch modifiziert werden können und sie hohen Stabilität weisen (siehe Zhu Et Al., 2011 eine Überprüfung)5. Proteine haben jedoch viele positive Eigenschaften: als so genannte "Präzision Polymere," sie sind biokompatible; Sie haben eine definierte Länge; Sie sind relativ leicht zu ändern; und sie haben eine große Anzahl von Ziel-Websites14,15. In diesem Zusammenhang können hochspezifische, innovative Strukturen für den Einsatz in vielen Bereichen generiert werden. In dieser Studie wurde ein Protein-basierten Hydrogel-16 verwendet, zu zeigen, die Fähigkeit der etablierten Methoden 3D-Architektur des Materials zu beeinflussen. Darüber hinaus wurde die Fähigkeit und die Anwendbarkeit zu Pore Generation auch untersucht.
Viele verschiedene Techniken stehen zur Verfügung, 3D Strukturen, einschließlich einfache Methoden und anspruchsvolle, hochspezialisierte Techniken aus verschiedenen Bereichen der materiellen Wissenschaft zu ändern. Eine weit verbreitete Technik ist die Verwendung von Elektrospinnen, klar definierte Strukturen17zu generieren. Geladene Fasern werden aus einer Lösung durch ein elektrisches Feld gezogen und dann nach Einwirkung von Sauerstoff zu festigen. Auf diese Weise können Fasern im Bereich von einigen Nanometern bis zu mehreren Mikrometern hergestellt werden. Zusätzliche Techniken, um die Größe, Struktur und Verteilung der Poren innerhalb der Matrix zu optimieren sind weiche Lithographie, Photolithographie, hydrodynamische Fokussierung, Elektro-Spritzen und Bio-Druck18,19,20. Ein erheblicher Nachteil dieser Techniken ist ihre Abhängigkeit von bestimmten, teure Ausrüstung und spezielle Chemikalien oder Materialien. Darüber hinaus Erfahrung mit diesen Techniken ist oft nicht direkt übertragbar auf Protein-basierten Materialien, und viele der Chemikalien und Methoden sind nicht kompatibel.
Auf der anderen Seite verlassen viele Techniken sich nicht auf spezielle Ausrüstung, so dass sie einfacher und billiger zu bewerben und zu reproduzieren. Eine weit verbreitete Methode zur Struktur Manipulation ist solvent Casting21,22,23. Partikel werden vor der Polymerisationsreaktion hinzugefügt und sind homogen verteilt, um die Lösung zu sättigen. Nach der Polymerisation führt eine Änderung der Bedingungen, wie eine Verdünnung oder eine pH-Wert-Änderung zu der Solvatation der Teilchen, während die Poren im Material bleiben. Die in diesen Techniken, wie Salz, Zucker, Paraffin, Gelatine und Kreide, verwendeten Chemikalien sind billig und überall verfügbar. Gefriertrocknung, sind geschwollene Hydrogele eingefroren. Die nachfolgenden Sublimierung der flüssigen Phasen unter Vakuum wird dann23,24,25durchgeführt. Wasser Sublimation aus dem Netzwerk ist sanft genug, um die spezifische 3D Strukturen des Materials beibehalten. Im Gas Schäumen ist eine Lösung mit einem Gas strömte, während die Polymerisation erfolgt, Poren im Gel21verlassen. Umfang und Verteilung der Poren können je nach dem Gasstrom eingestellt werden.
Um die Protein-Hydrogel zu bilden, wird BSA mit Tetrakis (Hydroxymethyl) Phosphonium-Chlorid (THPC) in einer Mannich-Typ-Reaktion ermöglicht die Bildung von kovalenten Bindungen zwischen primären Aminen und die Hydroxygruppen der vierarmigen Linker Molekül26reagiert. Mögliche schädliche Zwischenprodukte werden durch übermäßiges Waschen des Materials entfernt, nachdem die Reaktion auftritt.
Diese Studie zeigt die Möglichkeit der Behandlung von einem BSA-basierte Material mit verschiedenen Techniken zu manipulieren und passen Sie die Größe der Poren. Jede der Techniken kann verwendet werden in jedem Labor weltweit, da keine besondere Ausrüstung notwendig ist. Darüber hinaus respektieren wie Schwellung Verhältnis, enzymatische Abbaubarkeit, pH-Stabilität und Temperaturempfindlichkeit, wurden untersucht und im Vergleich zu anderen, verschiedene Parameter, vor allem auf den Einfluss der verschiedenen Techniken auf die Erzeugung von 3D-Architekturen. Zu guter Letzt wurden die Materialien mit Zelle-Klebstoff Peptide zu untersuchen, die mögliche Anwendung der Materialien auf Zellkultur funktionalisiert. Zwei verschiedene Modell-Zell-Linien wurden verwendet: A549 und MCF7.
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Protocol
(1) Hydrogel-Vorbereitung
- Mischen Sie 200 mg von BSA mit 1 mL entionisiertem H2O um 20 % (w/V) BSA Lager (Stammlösung) zu erstellen.
- Mix-165 µL THPC Lösung (134 mg/mL) mit 4,835 mL entionisiertem Wasser erstelle ich THPC Lösung (Stammlösung B) auf Lager.
- Wiegen Sie 1 mg KCSSGKSRGDS (1,111.1 g/Mol) Peptid (oder eine gleichwertige Zelle-Klebstoff-Peptid) und verdünnen Sie es in 100 µL steriler H2O, 10 mg/mL Lösung (Stammlösung C) zu erhalten.
Hinweis: Dieser Schritt ist optional und muss nur angegeben werden, wenn das Hydrogel für Zelle Kultur Anwendung gemeint ist. - Entfernen Sie das Unterteil einer 96-Well-Platte und ersetzen Sie es mit abnehmbaren Plastikfolie.
Hinweis: Bei den hier verwendeten Platten, kann unten leicht entfernt werden durch Druck auf der Unterseite jedes gut; der dünne Kunststoff-Unterseite fällt einfach heraus. - Mix 100 µL der Stammlösung BSA (A) und 100 µL der THPC Lager Lösung (B) (optional: 4 µL der Stammlösung C für funktionalisierten, Zelle-Klebstoff Hydrogele) in 96-Well-Platte, 200 µL Hydrogel zu erhalten. Mischen Sie die Komponenten durch Pipettieren oben und unten mindestens 5 Mal um eine einheitliche Hydrogel nach der Polymerisation zu garantieren.
- Legen Sie die 96-Well-Platte bei Raumtemperatur (RT) für ca. 10 min, bis alle Hydrogele richtig polymerisiert werden.
- Vorsichtig und langsam entfernen Sie die Plastikfolie von der Unterseite der Platte.
- Drücken Sie die Hydrogele aus der 96-Well-Platte mit einer kleinen Stempel und übertragen Sie sie auf 1,5 mL Röhrchen mit sterilen PBS, pH 7.4.
Hinweis: Die Hydrogele haben eine zylindrische Form mit einem Durchmesser von ca. 4 mm und einer Höhe von 8 mm. - Speichern Sie die Hydrogele in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) bei 4 ° C für bis zu mehreren Monaten.
2. Gefriertrocknung die Hydrogele
- 1,5 mL Röhrchen mit 500 µL steriler entionisiertem H2O füllen und die Kappe entfernen. Übertragen Sie die Hydrogele in die Reaktionsgefäße 1,5 mL mit einem Spatel.
- Wickeln Sie die 1,5 mL Röhrchen mit Paraffin Film in mindestens drei Schichten für jedes Fläschchen fest. Verwenden Sie eine Nadel, um kleine Löcher in dem Film ermöglichen Gas Release aus der Tube zu durchbohren.
- Gehen Sie an einen der folgenden Schritte aus:
- Übertragen Sie das Fläschchen auf Flüssigstickstoff Lösung für 5 min zu gewährleisten, dass das Wasser und Hydrogel komplett einfrieren. Sofort nach der Entnahme aus dem flüssigen Stickstoff übertragen Sie die Fläschchen auf Gefriertrockner Auftauen des Materials zu verhindern.
Hinweis: Dieses Verfahren führt zu Poren über 10-15 µm im Umkreis. - Halten Sie die Fläschchen bei-20 ° C über Nacht langsam die Hydrogele einzufrieren. Sofort nach der Entnahme aus-20 ° C übertragen Sie die Fläschchen auf Gefriertrockner Auftauen des Materials zu verhindern.
Hinweis: Dieses Verfahren führt zu Poren über 50-60 µm im Umkreis.
- Übertragen Sie das Fläschchen auf Flüssigstickstoff Lösung für 5 min zu gewährleisten, dass das Wasser und Hydrogel komplett einfrieren. Sofort nach der Entnahme aus dem flüssigen Stickstoff übertragen Sie die Fläschchen auf Gefriertrockner Auftauen des Materials zu verhindern.
- Tauen Sie nach 24 h (und die vollständige Verdampfung des Wassers im und um das Hydrogel) das Material durch Herausnahme aus der Gefriertrocknungsanlage.
Hinweis: Die Porengrößen können mit konfokale Laser-scanning-Mikroskopie (Schritt 5, "Hydrogel Visualisierung") analysiert werden.
(3) Partikel auswaschen
- Bereiten Sie das Hydrogel wie 1.1-1.5 beschrieben.
- Fügen Sie direkt nach dem Mischen der Komponenten hinzu, NaCl bis Sättigung eintritt (36 mg/mL). Fügen Sie Salz, bis ein Salzkristall in der Lösung als einen weißen Niederschlag angesehen werden kann.
- Übertragen der 96-Well-Platte in einen Shaker geben und schütteln bis Polymerisation stattfindet (ca. 10 min). Entfernen Sie die Hydrogele aus der Platte, wie 1,7-1,8 beschrieben.
- Inkubieren Sie die Hydrogele für mindestens 24 h bei RT in sterilem Wasser auf einen Shaker (20 u/min), alle Salz aus der Hydrogel-Vorlage eluieren. Speichern Sie die Hydrogele bei 4 ° C mit PBS-Puffer für bis zu mehreren Monaten.
4. Kanal Bildung
- Bereiten Sie Hydrogele, wie in Schritt 1 beschrieben. Entfernen Sie ein Hydrogel aus Lösung mit Hilfe einer Zange, entfernen Sie das überschüssige Wasser mit sehr saugfähigem Papier und legen Sie sie auf einen Block von Trockeneis.
- Einfrieren der Hydrogel für 30 s und entfernen Sie es vorsichtig aus dem Block. Beschädigen Sie nicht das Hydrogel; vorsichtig mit einem Spatel es den Block abkratzen. Übertragen Sie das Hydrogel auf einen 1,5 mL-Tube und trocknen Sie es über Nacht bei 37 ° C.
5. Hydrogel Visualisierung
- Bereiten Sie eine Stammlösung Rhodamin B 1 mg Rhodamin B in 10 mL PBS verdünnen. Bereiten Sie eine serielle Verdünnung von Rhodamin Vorratslösung in PBS verdünnen, bis eine Konzentration von 0,001 mg/mL erreicht ist (Verdünnungsfaktor: 100)
- Die Storage-Lösung (z. B. aus Schritt 2.4.) das Hydrogel entnehmen und auf ein 1,5 mL Röhrchen mit 1 mL 0,01 mg/mL Rhodamin B Lösung übertragen. Fleck das Hydrogel Übernachtung in Rhodamin B Lösung bei RT
- Übertragen Sie am nächsten Tag das Hydrogel, die bis 10 mL PBS (pH 7,4) und Wäsche für mindestens 3 h visualisiert werden.
- Übertragen Sie das Hydrogel auf eine µ-Folie 8 gut und bedecken Sie es mit PBS.
- Schneiden Sie kleine Scheiben aus Hydrogel (ca. 0,5 mm in der Höhe) mit einer Klinge.
- Mit einem konfokalen Laser-scanning-Mikroskop, visualisieren die Hydrogel bei einer Wellenlänge von 514 nm (Ziel: EC Plan-Neofluar 40 X / 1,30 Öl DIC M27, Flugzeug-Scan-Modus: 514 nm und Zoom: 1 X).
6. Zelle Kultur Machbarkeit
- Steril-Filter alle Lösungen (A, B und C) mit einem 0,45 µm-Filter auf Lager.
- Bereiten Sie das Hydrogel wie 1.1-1.4, einschließlich der Zelle-Klebstoff-Peptid vor Hydrogel Polymerisation beschrieben.
- Nach dem Mischen der Komponenten sofort pipette die Mischung in eine µ-Folie 8 gut, bis der Boden vollständig bedeckt ist.
Hinweis: Dieser Schritt muss schnell und direkt ausgeführt werden nach dem Mischen der Komponenten wie Polymerisation innerhalb von Minuten in der Folie erfolgt. - Adhäsion Zellkulturen und Passage, eine einzellige Suspension mit Standardzellen-Kultur-Techniken zu erhalten. Übertragen Sie die Zellen in vorgewärmte, sterile DMEM Zellkulturmedium ergänzt mit fetalen bovine Serum (FBS, 10 % (w/V)), Penicillin-Streptomycin (1 % (w/V)) und nicht benötigte Aminosäurelösung (MEM, 1 % (w/V)).
- Zählen Sie die Zellen mit einem Neubauer zählen Industrie- und sorgfältig Pipette 200 µL die gewünschte Anzahl von Zellen (2 x 105 Zellen/cm2) auf die Hydrogel-Oberfläche.
- Die µ-Folie 8 gut mit dem Deckel abdecken und in einen Inkubator (37 ° C, 5 % CO2) übertragen. Mindestens 4 h bei 37 ° c inkubieren
- Waschen Sie nach mindestens 4 h der zellulären Anlage die Zellen zweimal mit 200 µL steriler Zellkultur PBS.
- Befestigen Sie die Zellen mit 200 µL von 3,7 % (V/V) Formaldehyd für 10 min bei RT und zweimal mit PBS waschen (~ 200 µL).
Hinweis: Tragen Sie geeigneten persönlichen Schutzausrüstung beim Umgang mit Formaldehyd. - Permeabilize der Zellen mit 200 µL von 0,1 % Triton X 5 min. Waschen zweimal mit PBS.
- Färben Sie die Zellen mit Phalloidin-Rhodamin von 5 µL Methanollösung Lager mit 195 µL PBS zu mischen und hinzufügen zu den Zellen RT. Fleck für 20 min die Zellen im Dunkeln. Zweimal mit PBS waschen.
- Untersuchen Sie die Zelle Haftungseigenschaften mit einem konfokalen Mikroskop bei 514 nm (Ziel: EC Plan-Neofluar 40 X / 1,30 Öl DIC M27, Flugzeug-Scan-Modus: 514 nm und Zoom: 1 X). Die Bilder, die mittels geeigneter Software zu analysieren (siehe die Tabelle der Materialien).
(7) Hydrogel-Eigenschaften
- Schwellung-Verhältnis.
- Trocknen Sie vollständig die Hydrogele bei 37 ° C für mindestens einen Tag.
- Wiegen Sie jedes Hydrogel und beachten Sie das exakte Gewicht.
- 1,5 mL PBS eine 2 mL Reaktionsgefäß einfüllen.
- Das Hydrogel in diese 2 mL Reaktionsgefäß übertragen und komplett mit PBS-Puffer zu halten.
- Lassen Sie das Hydrogel für mindestens zwei Tage in PBS bei RT, Gleichgewicht mit der PBS zu erreichen.
- Entfernen Sie nach drei Tagen das Hydrogel aus der Projektmappe und trocknen Sie sie mit einem Papiertaschentuch, überschüssiges Wasser aus der Hydrogel-Oberfläche zu entfernen.
- Wiegen Sie das Hydrogel.
- Berechnen Sie die Schwellung Verhältnis mit folgender Formel:
wo ist Wd das Gewicht des getrockneten Gels (Schritt 7.1.2.) und Ws das Gewicht des nassen Gels (Schritt 7.1.7). Multipliziert mit 100, um die Schwellung Verhältnis Prozent erhalten.
- pH-Wert und Temperatur-Stabilität.
- Übertragen Sie 5 mL PBS auf eine 15 mL Reaktionsgefäß.
- Passen Sie die Lösung für den entsprechenden pH-Wert (z.B., pH 2, 7 oder 10) mit NaOH und HCl. bringen die Lösung auf die entsprechende Temperatur (z.B. RT, 37 ° C oder 80 ° C).
- Übertragen Sie das Hydrogel, das für seine Stabilität in die entsprechende Lösung untersucht werden soll. Nachjustieren des pH-Werts.
Hinweis: Alle Hydrogele sollte komplett an dieser Stelle (siehe die Schwellung Ratio) geschwollen sein um die falsche Auslegung des Gewichts durch die Schwellung des Materials zu verhindern. - Entfernen Sie nach bestimmten Zeitintervallen Hydrogel aus der Projektmappe (z. B. jede Stunde für bis zu 2 Tage), trocknen Sie ihn mit sehr saugfähigem Zellstoff um überschüssiges Wasser zu entfernen, und wiegen es.
- Enzymatischen Abbau.
- Bereiten Sie ein Lager Enzymlösung von 300 U Trypsin und Pepsin, gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Übertragen Sie das Hydrogel (z. B. aus Schritt 1,8) auf die passende Lösung.
Hinweis: Alle Hydrogele sollte komplett an dieser Stelle geschwollen sein um die falsche Auslegung des Gewichts zu verhindern. - Entfernen Sie nach bestimmten Zeitintervallen Hydrogel aus der Projektmappe (z. B. stündlich), trocknen Sie ihn mit sehr saugfähigem Zellstoff um überschüssiges Wasser zu entfernen, und wiegen es.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Die Autoren möchten Baden-Württemberg Stiftung danken für ihre finanzielle Unterstützung im Rahmen "Muskelmodelle Material Synthese" (BioMatS-14).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (high glucose) | Life Technologies / Thermo Fisher | 11140-050 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies / Thermo Fisher | 10270-106 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies / Thermo Fisher | 15140122 | |
| MEM Nonessential Amino Acid Solution | Sigma Aldrich | M7145-100ML | |
| Trypsin EDTA 0.05% Phenol Red | Thermo Fisher Scientific | 25300062 | |
| Ethanol 99.8%, vergällt | Ölfabrik Schmidt | 2133 | |
| NaCl | Carl Roth | 9265.1 | |
| Albumin Fraction V | Carl Roth | 3854.2 | |
| THPC | Sigma Aldrich | 404861-100ML | Toxic |
| 0.1% Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | Slightly toxic |
| Phalloidin-rhodamine | Life Technologies / Thermo Fisher | R415 | |
| 3.7% Formaldehyde | Life Technologies / Thermo Fisher | F8775-25ML | Toxic |
| Rhodamine B | Sigma Aldrich | 81-88-9 | |
| Filtropur S 0.2 | Sarsted Ag und Co. | 2 83.1826.001 | |
| µ slide 8 well | Ibidi GmbH | 80826 | |
| KCSSGKSRGDS peptide | UPEP Ulm | Custom sysnthesis | |
| Ethanol 99.8%, vergällt | Carl Roth | K928.5 | |
| Falcon 5 ml Polysterene Round-Bottom Tube | Sarsted Ag und Co. | 62.547.254 | |
| Tubes 50 ml | Sarsted Ag und Co. | 62.547.254 | |
| Tubes 1.5 ml | Sarsted Ag und Co. | 72,690,001 | |
| Tubes 2 ml | Sarsted Ag und Co. | 72,691 | |
| CELL CULTURE MICROPLATE, 96 WELL, PS, F-BOTTOM | Greiner | 655073 | |
| FreezeDryer Epsilon 1-6D, | Christ, Osterode am Harz, Germany | ||
| Confocal Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany | ||
| Zen Software Version 2012 Sp1, black edition, 407 version 8,1,0,484 | Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany | ||
| GSA Imaga Analyzer Software, GSA Image Analyzer, GSA, Version 419 3.8.7 | GSA GmbH |
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