Summary
Hızlı algılama özellikle patojenik bakterilerin manyetik gevşeme ve floresan emisyon modaliteleri kombinasyonu ile hedef ve bu protokol genel amacı, düşük maliyetli, taşınabilir için fonksiyonel nanosensors sentez etmektir.
Abstract
Enterohemorrhagic Escherichia coli O157: H7-var bağlı su bazlı hem de ve gıda kaynaklı hastalıklar ve bir tehdit rağmen gıda ve su filtreleme yöntemleri kullanılan şu anda kalır. Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) ve enzim bağlı immunosorbent deneyleri (ELISA) özellikle patojenik kirleticiler, algılayabilir gibi konvansiyonel bakteri algılama yöntemleri, bunlar geniş numune hazırlama ve uzun bekleme süreleri gerektirir. Ayrıca, bu uygulamaları talep gelişmiş Laboratuvar Cihazları ve ayarları ve eğitimli profesyoneller tarafından yürütülmelidir. Burada, bir protokol manyetik ve floresan parametreleri nanoparçacık tabanlı bir platform, eşsiz kombinasyonu özellikleri basit bir tanı tekniği için önerilmiştir. Önerilen multiparametric Manyeto-floresan nanosensors (MFnS) E. coli O157: H7 kirlenme olduğu kadar az 1 adet az 1 h çözümünüzde mevcut koloni oluşturan ile algılayabilir. Ayrıca, MFnS gibi karmaşık medyada son derece işlevsel kalır yeteneği süt ve göl su doğrulanmadı. Ek özgüllük deneyleri de MFnS yalnızca belirli hedef bakteri, hatta huzurunda benzer bakteriyel tür algılama yeteneğini göstermek için kullanılmıştır. Manyetik ve floresan yöntemleri eşleştirme algılama ve patojen bulaşma her iki erken ve geç-aşamalı kirlenme algılama içinde yüksek performans sergileyen konsantrasyonları, geniş bir alanda miktar sağlar. Etkinliği, uygun fiyatta ve MFnS taşınabilirliği için bakım noktası tarama bakteriyel kirletici için ideal bir aday ayarları, geniş bir ticari olarak paketlenmiş gıda su depoları dan onları.
Introduction
Bakteriyel kontaminasyon hem de kalıcı geçtiği ticari gıda üretilen ve su kaynaklarının giderek hızlı ve spesifik tanı platformları için bir ihtiyaç yarattı. 1 , 2 , Salmonella, Staphylococcus, Listeria, Vibrio, Shigella, Bacillus ve Escherichia cins daha yaygın bakteriyel kirletici için yiyecek ve su kirlenmesi sorumlu bazılarıdır. 3 , 4 kez bakteriyel kontaminasyon Bu patojenler tarafından ateş, kolera, gastroenterit ve ishal gibi belirtiler olur. 4 su kaynaklarının kirlenme kez yeterince filtrelenmiş su erişimi olmayan topluluklar üzerinde ciddi ve olumsuz etkileri vardır ve gıda kontaminasyonu hastalıklar ve ürün geri çekme çabaları çok sayıda için açmıştır. 5 , 6
Bakteriyel kirlenme tarafından neden olduğu hastalıkların oluşumunu azaltmak için bir dizi hangi su ve yiyecek verimli satış veya tüketim önce taranabilir yöntemleri geliştirmek için çaba olmuştur. PCR,1,7,8,9,10 ELISA,11,12 döngü-aracılı izotermal amplifikasyon () gibi 3 teknikleri LAMBA),13,14 diğerleri arasında15,16,17,18,19,20,21, 22,23,24 son zamanlarda çeşitli patojenler tespiti için kullanılır. Geleneksel bakteriyel kültür yöntemleri ile karşılaştırıldığında, bu tekniklerin özgüllük ve zaman açısından çok daha verimli. Ancak, bu teknikler hala yanlış pozitif ve negatif, karmaşık prosedürleri ve maliyet ile mücadele. 1 , 3 , 25 multiparametric Manyeto-floresan nanosensors (MFnS) bakteriyel algılama için alternatif bir yöntem olarak önerilen bu nedenle içindir.
Bu nanosensors benzersiz olarak birlikte manyetik gevşeme ve floresan yöntemleri, hızlı ve doğru bir çift-algılama platformu için izin eşleyin. E. coli O157: H7 örnek kirletici kullanarak, MFnS dakika içinde olduğu kadar az 1 CFU algılama yeteneğini gösterilmiştir. Patojen özel antikorlar özgüllüğü artırmak için kullanılır ve algılama ve miktar her iki düşük ve yüksek kirlilik aralıklardaki bakteriyel kirletici için manyetik ve floresan modaliteleri kombinasyonu sağlar. 16 bakteriyel kontaminasyon durumunda patojen özgü antikorların hedefleme yetenekleri nedeniyle bakteri çevresinde nanosensors swarm. Manyetik nanosensors ile bakteri arasındaki manyetik demir çekirdekli ve çevresindeki su proton arasındaki etkileşimi sınırlar. Bu artış T2 gevşeme zamanlarda manyetik bir relaxometer tarafından kaydedildiği şekilde neden olur. Çözüm bakterilerde konsantrasyon yükselir gibi bakteri, alt T2 değerleri kaynaklanan artan sayıda nanosensors dağıtmak. Tersine, Floresans emisyon nanosensors patojen için doğrudan bağlı artan sayıda nedeniyle bakteri konsantrasyonu ile orantılı artar. Santrifüjü örnekleri ve bakteriyel Pelet yalıtım sadece doğrudan herhangi bir serbest yüzer nanosensors kaldırılması ve doğrudan Floresans emisyon sayısı ile korele bakteri iliştirilmiş nano tanecikleri tasarruf etmek bakteri içinde çözüm sunuyoruz. Bu mekanizma şematik gösterimi şekil 1' de temsil edilir.
Bu MFnS platform bakım noktası tarama unutmayın, düşük maliyetli ve taşınabilir özellikleri kaynaklanan ile dizayn edilmiştir. MFnS oda sıcaklığında kararlı olduğunu ve sadece doğru algılama bakteriyel kirletici için çok düşük konsantrasyonlarda gerekmektedir. Ayrıca, sentez sonra MFnS kullanımı basittir ve alanında eğitimli uzmanları kullanımı gerektirmez. Son olarak, bu tanı platform, bu tarafından bir platformda her türlü patojenler birçok farklı ortamlarda algılamak için kullanılan bir araç sağlayarak son derece özelleştirilebilir hedefleme için sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. sentez ve çok parametrik Manyeto-floresan Nanosensors (MFnS) Functionalization.
- Superparamagnetic demir oksit sentezi nano tanecikleri (IONPs)
- IONP sentezi için hazırlamak için aşağıdaki 3 çözümleri hazırlamak: çözüm 1: FeCl 3 (0.70 g) ve FeCl 2 H 2 O içinde (2 mL), çözüm 2: NH 4 OH (2.0 mL, 13.4 M) H 2 O (15 mL) ve çözüm 3: polyacrylic asit (0.855 g) H 2 O (5 mL).
- 2 M hidroklorik asit (HCl) 90 µL çözüm 1'e ve daha sonra hemen vortexing 875 devirde iken çözüm 2 ile karıştırın. O zaman çözüm 3 ekleyin. Vortexing 60 dakika süreyle devam
- Santrifüj için 1,620 x g., 20 dk santrifüj kapasitesi süpernatant 2.880 x g., 20 dk
- Son süpernatant ile diyaliz arındırmak. Süpernatant bir Diyaliz Ekle (MWCO 6 − 8 K) ve fosfat tamponlu tuz (PBS) içeren bir ölçek yerleştirin (pH 7.4 =) ve spin bar. Her 2-3 h. ile taze tampon yerine 12 h için emmek izin
- IONPs yüzey için hedef özgü antikorların konjugasyon
- Aşağıdaki dört çözümleri hazırlamak: çözüm A: 5 mg 1-etil - 3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hidroklorid (EDC) 250 µL MES [2-(N- morpholino) ethanesulfonic asit] arabellek (0.1 M, pH 6.8 =), çözüm B: 3 mg, N-Hydroxysuccinimide (NHS) 250 µL MES arabelleği (0.1 M, pH 6.8 =), Igg1, E. coli mAb fosfat tamponlu tuz (PBS) (pH 7,4) 225 µL içinde çözüm C: 5 µg ve IONP çözüm D: 4 mL (5.0 mmol) PBS (pH 7,4) 1 ml.
- Ekleyin 2-(N-Morpholino) ethanesulfonic asit (MES) arabellek eriyik-e doğru A, o zaman hemen çözüm eklemek A çözüm D 15 içinde küçük artışlarla s, çözüm karıştırma için her eklenmesinden sonra ters çevirme.
- Hemen çözüm B çözüm D için küçük aralıklarla üç dakikalık bir süre içinde eklemek için başlayın. Her eklenmesinden sonra çözüm ters çevirme tarafından Mix.
- 5 µL artırımlarıyla çözüm çözüm C eklemek çözüm karıştırma için her eklenmesinden sonra ters çevirme.
- Oda sıcaklığında 3 h için devam etmek ve o zaman kuluçka gecede 4 ° C'de devam etmek tepki izin.
- Arındırmak manyetik sütun PBS kullanma yolu ile elde edilen Ab Birleşik IONPs (pH 7.4, final [Fe] = = 3,5 mmol) herhangi bir çekimsiz antikorlar kaldırmak için.
- Yıkama manyetik sütun PBS (1 mL) ile. Sütun için manyetik plaka ekleyin ve IONP çözüm ekleyin.
- Manyetik sütun PBS (1 mL) ile tekrar yıkayın. Manyetik sütun Manyetik plaka kaldırın. PBS sütununu ekleyin ve çözüm toplamak. Mağaza 4 ° C'de
- Floresan 1,1 kapsülleme ' - Dioctadecyl - 3,3,3 ', 3 '-Tetramethylindocarbocyanine perklorat (dıı) boya kullanarak antikor Birleşik IONPs polyacrylic asit (PAA) kaplama içine bir Solvent Difüzyon yöntemi.
- IONPs 4 mL için dropwise 2.0 ekleyin dıı boya (2 mmol) 100 µL DMSO, sürekli 1100 devir / dakikada karıştırma ile µL.
- [Fe] son demir konsantrasyonu ile son bir MFnS çözüm oluşturma PBS karşı elde edilen çözüm (MWCO 6-8 KDa, 12 h) diyaliz 2 mmol =.
- MFnS karakterizasyonu
- spektrofotometrik analiz için bir plaka okuyucu ile floresan emisyon 595, kapsüllenmiş dıı boya algılamak için kullanın nM.
- Dinamik ışık saçılma
- ortalama boyutu ve MFnS yüzey ücret belirlemek için zetasizer MFnS çözüm örneği yerleştirin.
Not: Burada, ortalama boyutu ve fonksiyonel MFnS yüzey ücret 77.09 bulundu nm ve-22.3 mV, sırasıyla.
- ortalama boyutu ve MFnS yüzey ücret belirlemek için zetasizer MFnS çözüm örneği yerleştirin.
2. Bakteriyel Culturing ve hisse senedi çözüm hazırlık
- bakteri kültürü
- besin suyu 1 ml dondurularak Pelet (E. coli O157: H7) hidrat ve bir ek 5 mL suyu ekleyin.
- Bu çözümün bir agar plaka ve çizgi uygulamak 100 µL kuluçka için 24 h 37 ° C'de ve ardından bir steril aşılama döngü kullanarak
- Sonra 24 h, izole bir koloni agar plaka seçin ve bir 15 mL kültür suyu ekleyin. Süre optik yoğunluk değeri izleme için 4-6 h, 37 ° C'de kuluçkaya (600 Absorbans nm).
- Bir optik yoğunluk değerini 0.1 alındıktan sonra kültür durdurmak ve seri dilutions gerçekleştirmek.
- Seri dilutions
- ekleyin 900 µL sekiz steril microcentrifuge tüpler için besin suyu.
- Ekle 100 µL bakteriyel süspansiyon ilk tüp (seyreltme 10 -1).
- Al 100 µL ilk tüp ve ikinci 10 -2 seyreltme elde etmek için ekleyin. Bu model 10 -8 son bir seyreltme ile biten kalan tüpler için devam.
- Transfer 100 µL Ağar kaplamalar ayrı ve 37 24 h için kuluçkaya her tüp ° C.
- Ertesi gün, her tabağa birimleri (CFUs) oluşturan colony saymak. ~ 100 CFUs ile kalıbı seçin. Karşılık gelen dilutions daha fazla deneyler için kullanın (100 µL ~ 100 CFUs =).
Not: Burada ~ 100 CFUs sonuçlanan 10 -6 seyreltme oldu.
3. MFnS kullanarak hızlı algılama E. coli O157: H7
- 1-100 arasında değişmektedir CFU sonuçlanan 10 -6 bakteriyel hisse senedi, miktarda artan çeşitli PBS Çözümleri (1 X, pH 7.4, 300 µL) Spike. MFnS tutarlı bir miktar eklemek (100 µL) Bu çözümler için.
- Sadece PBS (1 X, pH 7.4, 300 µL) içeren bir temel çözüm oluşturmak ve MFnS (100 µL).
- 37 ° C'de 30 dk için çözümler kuluçkaya ve sonra oda sıcaklığında soğumaya izin.
- Manyetik relaxometer (0,47 Tesla) ve kayıt değişiklikleri gevşeme zamanlarda (T2) her çözümde CFUs göre transfer bireysel çözümler.
- T2 değerlerde değişiklikleri kaydetmek, sadece PBS ve MFnS içeren temel çözüm T2 değerini ölçerek başlamak için
- .
- Yer manyetik çözümde relaxometer. İlgili yazılım açık, seçin " T2 gevşeme " ayarı ve basın " ölçü birimi. "
- temel T2, topluluğu takip çeşitli ile çivili ek çözümler T2 değerini ölçmek bakteri konsantrasyonları.
Not: Taban çizgisi çivili T2 düşülen T2 T2 değişiklik eşdeğerdir.
- .
- Manyetik relaxometer örnekleri kaldırmak ve 10 dakika süreyle 2880 x g de tüpler santrifüj kapasitesi
- Süpernatant dikkatle boşaltmak ve PBS (1 X, pH 7,4) 100 µL içinde bakteri granül resuspend.
- Eklemek 80 µL, her resuspension bir 96-şey plaka ve kayıt Floresans Koyulukları 595 nM.
Not: Test sonuçları bölümünde açıklandığı gibi göl su, süt ve diğerleri dahil olmak üzere farklı çözücüler kullanılarak tekrar edilebilir
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MFnS etki mekanizması şekil 1' de temsil edilir. MFnS bakteriyel kirletici yüzeyi kümeleme MFnS magnetic cores ve çevresindeki hidrojen çekirdekleri arasındaki etkileşimler etkilemektedir. Bu kümeleme, manyetik gevşeme sonucu olarak değerlerini artırmak. Bakteriyel kirletici konsantrasyonu arttıkça, kümeleme azaltır ve T2 değerleri değişikliği azalır. Bu nedenle, bir floresan modality eklenmesi önemlidir. Bakteri konsantrasyonu arttıkça, her iki düşük ve yüksek konsantrasyon aralıklardaki bakteriyel kirletici hassas tespiti için izin MFnS tarafından üretilen floresan sinyal gücünü artırır.
İletişim kuralı16 MFnS sentezlenen ve ilk PBS (1 X, pH 7,4) çözümlerinde test. Tespiti için manyetik gevşeme, kullanılan ilk modalite T2 değerlerde değişiklikleri kaydetmek için kullanıldı. Protokol uyarınca örnekleri sonra centrifuged, granül resuspended ve floresan veri toplanmıştır. Karşılık gelen ΔT2 ve floresan emisyon değerleri Şekil 2' de sunulmuştur. Görüldüğü gibi ΔT2 değer bakteriyel kontaminasyon düşük konsantrasyonlarda en büyük ve kabaca 20 CFUs, doygunluk ulaştı. Floresans emisyon, öte yandan, daha doğru oldu > 20 CFUs, bu iki modalities birleştirerek önemini gösteren. Bu birincil deneyleri Gölü su ve süt de dahil olmak üzere karmaşık medyada benzer testleri yapılmıştır. Bu nanosensors hala daha karmaşık medyada etkili olması için yapıldı. Bu deneyleri toplanan veriler şekil 3 ' te sunulan ve PBS içinde yürütülen deneyleri çok benzerdir. Bu bu nanosensors karmaşık medyada etkili kalmasını doğrular.
MFnS hem basit hem de karmaşık medyada bakteriyel kirletici varlığı tespit olabilir onayladıktan sonra testleri bir dizi sonra nanosensors tarafından tutulan özgüllük düzeyini belirlemek için yapılmıştır. Bu amaçla, MFnS hedef bakteri, ısı öldürdü hedef bakteri, hedef bakteri (patojen olmayan E. coli ve S. typhimurium) ve bir karışımı içeren çözümlerinde inkübe. Bu sadece bir özgüllüğü tahlil olduğu gibi verilerin toplanmasını manyetik gevşeme tek başına yeterli ve karşılık gelen veri şekil 4' te sunulmuştur. Görüldüğü gibi E. coli O157: H7, yaşamak isteyip MFnS bağlı ve diğer ısı öldü ya da hedef olmayan bakteriler için değil. Özgüllüğü bu düzeyde konjuge hedefleme antikorlar atfedilen ve daha fazla MFnS bile varlığında patojenik olmayan bakteriyel türler zaman belirli patojen kirletici maddeleri tespit etkili olacaktır onaylar.
Resim 1 : Manyeto-floresan algılama mekanizması. MFnS sentezi ve bakteriyel algılama çift kalıcı mekanizmasının şematik gösterimi. Bir kısa kuluçka süre sonrasında (30 dk), MFnS hassas bir arada manyetik rezonans ve floresan emisyon yoluyla hedef bakteri tespit edebiliyoruz. Bakteriyel kirletici yüzeyi MFnS kümeleme değişiklikleri bir manyetik relaxometer tarafından algılanabilir manyetik gevşeme değerleri neden olur. Buna ek olarak, floresan sinyallerini doğrudan bağlı bakteriyel kirletici için MFnS toplanan. Bu her iki düşük ve yüksek konsantrasyon aralıklardaki bakteriyel kirletici algılama yeteneğine sahip bir çift kalıcı algılama platformu sağlar. 16 bu rakam izni ile değiştirildi. 16
Resim 2 : Prototip. A) manyetik gevşeme veri (ΔT2) ilk PBS solvent olarak E. coli O157: H7 (1-100 CFU) dilutions üzerinden toplanan (1 X, pH 7.4 =). Bay algılama bakterilerin daha düşük CFU sayar son derece hassas (iç metin: 1-20 CFU arasında değişen). Ancak, ΔT2 okuma daha yüksek bakteri konsantrasyonu doymuş oldu (> 20 CFU), Bay algılama ve miktar aşamasındaki bakteriyel kirlenme için daha değerli olduğunu belirten. B) floresan emisyon verileri aynı çivili PBS Çözümleri (iç metin: doğrusallık arsa). Sonuçları bu duyarlılığı düşük CFU örnekleri için eksik olduğu süre Floresans algılama yöntemi daha yüksek CFU sayar daha duyarlı olduğunu gösterdi. Birlikte, bu veriler yeteneğini algılamak ve bakteriyel kontaminasyon içinde erken - ve geç-aşamaları bakteriyel kirlenme ölçmek için manyetik ve floresan yöntemleri göstermek. 16 ortalama üç ölçümleri görülen ± standart hata değerleri. Bu rakam izni ile değiştirildi. 16
Şekil 3 : Karmaşık medya bakteriyel algılama. Manyetik gevşeme ΔT2 veri toplanan A) Gölü de dahil olmak üzere daha karmaşık ortamdan su ve süt B). Benzer önceki PBS çözümlerinden toplanan bilgiler, bu algılama bakteriyel kirletici 1-20 CFU (insets) aralığında daha duyarlı belirtilmişti. Karşılık gelen Floresans emisyon verileri C için toplanan) Gölü su ve D) süt örnekleri (insets: doğrusallık araziler), hangi CFU sayıları artan ile daha yüksek hassasiyet gösterdi. Bir kez daha, bu veriler ile diğer her modalite tamamlar etkinliğini göstermek ve karmaşık medyada işlevsel kalır yeteneğini doğrulamak. 16 ortalama üç ölçümleri görülen ± standart hata değerleri. Bu rakam izni ile değiştirildi. 16
Şekil 4 : MFnS özgüllüğü. MFnS özgüllük bakteriyel çapraz-kirleticileri ve bir karışım ve B) ısı ihracı A) bir dizi içeren besin suyu çözümlerinde Bay analizi ile test edildi E. coli O157: H7. Görüldüğü gibi nanosensors ile sigara hedefli bakteri ve are hedef bakteri varlığında diğer kirletici maddeleri tespit hala yetenekli küçük hiçbir bağlama bu formu tarama yolu ile olacak sağlamak olduğu açık görülüyorble sigara patojen bakteri türlerinin sayısı içeren karmaşık ortamlarda kullanım için. C) daha fazla özgüllük test MFnS bir izotip antikor ile sentezleme tarafından gerçekleştirilmiştir (kırmızı daireler: Anti -E. coli O111), hangi sonuçlandı (siyah kareler) antikor Birleşik O157: H7 MFnS için karşılaştırıldığında hiçbir bağlama için çok az. Bu veri MFnS sadece daha fazla bakım noktası tanılama platformu olarak onların etkinliğini doğrulama uygun hedef bakteri ile tepki göstermektedir. 16 ortalama üç ölçümleri görülen ± standart hata değerleri. Bu rakam izni ile değiştirildi. 16
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu iletişim kuralı basit tamamen işlevsel MFnS üretmek için tasarlanmış mümkün olduğunca. Ancak, değişiklik Protokolü'nün kullanıcının nihai hedef bağlı olarak yararlı olabilecek çok önemli noktalar vardır. Örneğin, farklı antikor kullanımı birçok diğer patojenleri hedefleme için izin verecek. Ayrıca, bu iletişim kuralını molekülleri hedefleme olarak antikor kullanımı sınırlı değildir. Konak hücre reseptörleri gibi hedef patojenler için özel bağlayıcı ilgi olan herhangi bir molekül molekülleri hedefleme olarak da kullanılabilir. Hedefleme molekül bir birincil Amin veya alkol grubu vardır, ya da -si olmak bir için functionalized sürece, demir oksit nano tanecikleri iletişim kuralında listelenmiş EDC/NHS konjugasyon kimya göre yüzeyine Birleşik. İkinci olarak, MFnS her algılama çözümünde kullanılan miktarı farklı. Temel değer 100 ise daha sonra T2 değerleri değişimler daha az duyarlı olacak T2 değeri (yalnızca solvent ve hedef patojen olmadan nanosensor içeren) temel çözüm için 100-250 Bayan aralığında olması yeterli kullanılması önemlidir , nanosensor bir overabundance nedeniyle. Temel T2 değeri yükseltmek, nanosensor çözümünde miktarını azaltmak. Ancak, temel 250 ise, aşırı duyarlı hale gelir ve yanlış pozitif daha olası hale gelebilir. Bu nedenlerden dolayı bu temel çözüm T2 değeri 100-250 ms arasında amaç için önerilmektedir.
Geçerli bir bakım noktası tanı olarak kullanılmasını göz önünde bulundurarak bu Protokolü'nün geçerli benchtop manyetik relaxometer güvenilmesi sınırlamalardır. Etkili ve kararlı iken, bu manyetik gevşeme platformu kendi taşınabilirlik artırmak için boyutu azaltılabilir. Bu hangi ile bu platform farklı ortamlarda, gibi su kaynakları veya bakkal pazarlarda, etkili yerinde bakteriyel tarama için kullanılan olabilir kolaylığı artış olacaktır. Bu aynı zamanda daha uygun bakım noktası patojen algılama için yapım bu makine maliyetini azaltmak olabilir.
Hastalık tanı ve patojen tespiti ile ilgili olarak düşük kaynak ayarları'nda, bu platformu PCR ve ELISA da dahil olmak üzere bugün kullanılan geçerli patojen tanı yöntemleri daha etkili olma potansiyeline sahiptir. Bu geleneksel teknikleri büyük ölçüde etkili olduğu kanıtlanmıştır, onlar son derece pahalı, karmaşık ve yavaş vardır. Bu nedenle, düşük kaynak ayarları patojenler ve hastalık tanı Bakımı nokta tespiti için geliştirilen bir doğru tanı platformu için bir ihtiyaç vardır. Bu nispeten basit bir kullanımı, uygun maliyetli ve hızlı platformdur. Kenara ilk start-up ücreti gerekli makineleri (relaxometer ve plaka okuyucu) fiili MFnS nispeten ucuz ve çok kararlı. Buna ek olarak, T2 değerleri topluluğu basit ve profesyonel bir laborant gerektirmez.
Gelecekte, kimyasal ve biyolojik mühendisleri ile işbirliği her iki manyetik ve floresan tespiti MFnS kullanarak bakteriyel kontaminasyon için kullanılabilir daha taşınabilir, el cihazı tasarlamak için takip edilecektir. Daha küçük bir cihaz geliştirilmesi daha da bu algılama platformla ilgili maliyetleri azaltmak ve alanında etkinliğini artırmak için yardımcı olacaktır. Ayrıca, bu platform koruyucu ajanlar geliştirme etkinliğini çözümlemek için kullanılan potansiyeline sahiptir. Bizim verilerde gösterildiği gibi bizim MFnS sadece yaşamak hedefli bakteri ile bağlamak başardık ve üretilen ısı öldürdü bakteri ile inkübe zaman küçük hiçbir sinyal. Bunun üzerine dayalı, platformumuz koruyucu adayların etkinliğini test etmek için kullanılabilir, ve bu daha da ileride keşfetmeyi planlıyoruz.
Bu iletişim kuralı kritik adımlarda MFnS ilk sentezi ve T2 veri toplama içerir. Düzgün yüzen antikorlar T2 veri toplama ile müdahale değil emin olmak için MFnS arındırmak önemlidir. Ayrıca, değişiklikleri MFnS konsantrasyon T2 değerleri, yanlış pozitif/negatif riske değiştirecek gibi her test örneğinde yerleştirilen MFnS miktarı tutarlı, olması gerekir.
Sonuç olarak, MFnS bakteriyel kontaminasyon karşı mücadelede yeni bir adım vardır ve ek patojenler hedefleme elde daha da geliştirilecek ve tasarım daha taşınabilir makine takip etti. Düşük maliyetli ve düşük karmaşıklık MFnS kullanımı ile ilgili onları bakteriyel kontaminasyon yerinde tespiti için kullanılacak uygun bir aday yapar. Bu nanosensors sentezi dikkatli hazırlık gerektirir iken, gerçek bunların kullanımı oldukça kolaydır ve onlara gıda kaynaklı ve su kaynaklı hastalıklar azaltmak potansiyeline verir. Daha da geliştirilmesi, bu nanosensors uygulanması su depoları tarama görülebilir ve ticari olarak üretilen gıdaların ambalaj siteleri, Satılık ve belki de evleri noktaları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Bu nanoteknoloji gösterdiği uygulama henüz FDA tarafından onaylanmış değil.
Acknowledgments
Bu eser K-INBRE P20GM103418, Kansas soya Komisyonu (KSC/PSU 1663), ACS PRF 56629-UNI7 ve PSU polimer kimya başlangıç Fonu, tüm SS tarafından desteklenmektedir. Biz Üniversitesi videoları çekiyor, Bay Jacob Anselmi, video ile onun en iyi çalışma için teşekkür ederim. Biz de Bay Roger Heckert ve Bayan Katha Heckert cömert destekleri araştırma için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ferrous Chloride Tetrahydrate | Fisher Scientific | I90-500 | |
| Ferric Chloride Hexahydrate | Fisher Scientific | I88-500 | |
| Ammonium Hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Polyacryllic Acid | Sigma-Aldrich | 323667-100G | |
| EDC | Thermofisher Scientific | 22980 | |
| NHS | Fisher Scientific | AC157270250 | |
| Anti-E. coli O111 antibody | sera care | 5310-0352 | |
| Anti-E. coli O157:H7 antibody [P3C6] | Abcam | ab75244 | |
| DiI Stain | Fisher Scientific | D282 | |
| Nutrient Broth | Difco | 233000 | |
| Freeze-dried E. coli O157:H7 pellet | ATCC | 700728 | |
| Magnetic Relaxomteter | Bruker | mq20 | |
| Zetasizer | Malvern | NANO-ZS90 | |
| Plate Reader | Tecan | Infinite M200 PRO | |
| Magnetic Column | QuadroMACS | 130-090-976 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 Series | |
| Centrifuge (accuSpin Micro 17) | Fisher Scientific | 13-100-676 | |
| Floor Model Shaking Incubator | SHEL LAB | SSI5 | |
| Analytical Balance | Metler Toledo | ME104E | |
| Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| Open-Air Rocking Shaker | Fisher Scientific | 02-217-765 |
References
- Law, J. W., Ab Mutalib, N. S., Chan, K. G., Lee, L. H. Rapid methods for the detection of foodborne bacterial pathogens: principles, applications, advantages and limitations. Front Microbiol. 5, 770 (2014).
- Pandey, P. K., Kass, P. H., Soupir, M. L., Biswas, S., Singh, V. P. Contamination of water resources by pathogenic bacteria. AMB Express. 4, 51 (2014).
- Zhao, X., Lin, C. W., Wang, J., Oh, D. H. Advances in rapid detection methods for foodborne pathogens. J Microbiol Biotechnol. 24 (3), 297-312 (2014).
- Heithoff, D. M., et al. Intraspecies variation in the emergence of hyperinfectious bacterial strains in nature. PLoS Pathog. 8 (4), e1002647 (2012).
- Ishii, S., Sadowsky, M. J. Escherichia coli in the Environment: Implications for Water Quality and Human Health. Microbes Environ. 23 (2), 101-108 (2008).
- Chiou, C. S., Hsu, S. Y., Chiu, S. I., Wang, T. K., Chao, C. S. Vibrio parahaemolyticus serovar O3:K6 as cause of unusually high incidence of food-borne disease outbreaks in Taiwan from 1996 to 1999. J Clin Microbiol. 38 (12), 4621-4625 (2000).
- Zhou, G., et al. PCR methods for the rapid detection and identification of four pathogenic Legionella spp. and two Legionella pneumophila subspecies based on the gene amplification of gyrB. Appl Microbiol Biotechnol. 91 (3), 777-787 (2011).
- Chen, J., Tang, J., Liu, J., Cai, Z., Bai, X. Development and evaluation of a multiplex PCR for simultaneous detection of five foodborne pathogens. J Appl Microbiol. 112 (4), 823-830 (2012).
- LeBlanc, J. J., et al. Switching gears for an influenza pandemic: validation of a duplex reverse transcriptase PCR assay for simultaneous detection and confirmatory identification of pandemic (H1N1) 2009 influenza virus. J Clin Microbiol. 47 (12), 3805-3813 (2009).
- Mahony, J. B., Chong, S., Luinstra, K., Petrich, A., Smieja, M. Development of a novel bead-based multiplex PCR assay for combined subtyping and oseltamivir resistance genotyping (H275Y) of seasonal and pandemic H1N1 influenza A viruses. J Clin Virol. 49 (4), 277-282 (2010).
- Alvarez, M. M., et al. Specific recognition of influenza A/H1N1/2009 antibodies in human serum: a simple virus-free ELISA method. PLoS One. 5 (4), e10176 (2010).
- Huang, C. J., Dostalek, J., Sessitsch, A., Knoll, W. Long-range surface plasmon-enhanced fluorescence spectroscopy biosensor for ultrasensitive detection of E. coli O157:H7. Anal Chem. 83 (3), 674-677 (2011).
- Zhang, J., et al. Rapid visual detection of highly pathogenic Streptococcus suis serotype 2 isolates by use of loop-mediated isothermal amplification. J Clin Microbiol. 51 (10), 3250-3256 (2013).
- Han, F., Wang, F., Ge, B. Detecting potentially virulent Vibrio vulnificus strains in raw oysters by quantitative loop-mediated isothermal amplification. Appl Environ Microbiol. 77 (8), 2589-2595 (2011).
- Wang, J., et al. Rapid detection of pathogenic bacteria and screening of phage-derived peptides using microcantilevers. Anal Chem. 86 (3), 1671-1678 (2014).
- Banerjee, T., et al. Multiparametric Magneto-fluorescent Nanosensors for the Ultrasensitive Detection of Escherichia coli O157:H7. ACS Infect Dis. 2 (10), 667-673 (2016).
- Shelby, T., et al. Novel magnetic relaxation nanosensors: an unparalleled "spin" on influenza diagnosis. Nanoscale. 8, 19605-19613 (2016).
- Bui, M. P., Ahmed, S., Abbas, A. Single-Digit Pathogen and Attomolar Detection with the Naked Eye Using Liposome-Amplified Plasmonic Immunoassay. Nano Lett. 15 (9), 6239-6246 (2015).
- Farnleitner, A. H., et al. Rapid enzymatic detection of Escherichia coli contamination in polluted river water. Lett Appl Microbiol. 33 (3), 246-250 (2001).
- Huh, Y. S., Lowe, A. J., Strickland, A. D., Batt, C. A., Erickson, D. Surface-enhanced Raman scattering based ligase detection reaction. J Am Chem Soc. 131 (6), 2208-2213 (2009).
- Jayamohan, H., et al. Highly sensitive bacteria quantification using immunomagnetic separation and electrochemical detection of guanine-labeled secondary beads. Sensors (Basel). 15 (5), 12034-12052 (2015).
- Kaittanis, C., Naser, S. A., Perez, J. M. One-step, nanoparticle-mediated bacterial detection with magnetic relaxation. Nano Lett. 7 (2), 380-383 (2007).
- Meeker, D. G., et al. Synergistic Photothermal and Antibiotic Killing of Biofilm-Associated Staphylococcus aureus Using Targeted Antibiotic-Loaded Gold Nanoconstructs. ACS Infect Dis. 2 (4), 241-250 (2016).
- Wang, Y., Ye, Z., Si, C., Ying, Y. Subtractive inhibition assay for the detection of E. coli O157:H7 using surface plasmon resonance. Sensors (Basel). 11 (3), 2728-2739 (2011).
- Zhao, X., et al. A rapid bioassay for single bacterial cell quantitation using bioconjugated nanoparticles. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (42), 15027-15032 (2004).
