Summary
이 프로토콜은 세포 분화 및 Xenopus 배아 발달 동안 mitogen - 활성화 단백질 키니 아제 (MAPK) 활동을 조절하는 optogenetic 전략을 설명합니다. 이 방법은 포유류 세포 배양 및 높은 공간적 및 시간적 해상도를 갖는 Xenopus 태아와 같은 다세포 생균에서 MAPK 신호 전달 경로의 가역적 활성화를 허용한다.
Abstract
키나아제 활성은 세포 증식, 분화, 이동 및 세포 사멸을 비롯한 과다한 세포 기능에 결정적이다. 초기 배아 발달 동안, 키나아제 활성은 매우 동적이며 배아에 널리 퍼져있다. 약리학 적 및 유전 적 접근법은 일반적으로 키나제 활동을 조사하는데 사용됩니다. 불행하게도 이러한 전략을 사용하여 우수한 공간적 및 시간적 해결책을 얻는 것은 어렵습니다. 또한, 생세포 및 다세포 생물에서 가역적 인 방식으로 키나제 활성을 조절하는 것은 현실적이지 못하다. 이러한 제한은 발달 및 분화 과정에서 키나아제 활성의 정량적 이해를 달성하기위한 병목으로 남아있다. 이 연구는 광 활성화 단백질 인 Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2)와 cryptochrome-interacting basic-helix-loop-helix (CIBN)의 N- 말단 도메인을 포함하는 바이 시스 트론 시스템을 이용하는 광 생성 전략을 제시한다. 리버시mitogen-activated protein kinase (MAPK) 신호 전달 경로의 활성화는 살아있는 세포에서 빛을 매개로하는 단백질 전좌를 통해 이루어진다. 이 접근법은 포유류 세포 배양 및 살아있는 척추 배아에 적용될 수 있습니다. 이 bicistronic 시스템은 유사한 활성화 메커니즘을 가진 다른 키나제의 활성을 조절하기 위해 일반화 될 수 있으며 다른 모델 시스템에도 적용될 수 있습니다.
Introduction
성장 인자는 증식, 분화, 이동 및 세포 사멸을 포함하여 다양한 세포 기능에 관여하며 배아 발달, 노화 및 정신 상태 조절을 비롯한 많은 생물학적 사건에서 중추적 인 역할을한다 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . 많은 성장 인자가 복잡한 세포 내 신호 전달 계통을 통해 신호를 보냅니다. 이러한 신호 전달 사건은 가끔 정교하게 조절 된 방식으로 가역성 단백질 인산화에 의해 작동된다. 따라서 단백질 인산화에 관여하는 단백질 키나아제의 신호 결과에 대한 이해는 근본적으로 중요합니다.
서로 다른 성장 인자가 dist를 자극하더라도 다소 일반적인 세포 내 신호 전달 네트워크를 통해 작용합니다.inct 세포 반응 8 , 9 . 수용체 티로신 키나아제의 일반적인 세포 내 매개체에는 Ras, Raf, 세포 외 신호 조절 키나아제 (MAPK) / ERK 키나제 (MEK), 포스 포이 노시 티드 3- 키나아제 (PI3K), Akt 및 포스 포 리파아제 Cγ (PLCγ) 10 , 11 . 축적 된 증거는 신호 다양성과 특이성이 신호 활동의 공간적, 시간적 조절에 달려 있음을 시사한다. 예를 들어, 쥐 갈색 세포종 세포 (PC12)에서 세포 증식을 일으키는 상피 세포 성장 인자 (EGF) 자극은 일시적으로 ERK 경로를 활성화시킵니다. 반면에, 세포 분화를 유도하는 신경 성장 인자 (NGF)로 자극하면 ERK 경로가 지속적으로 활성화됩니다 9 , 13 . 배양 된 r해마 뉴런에서 뇌 - 유도 신경영 인자 (BDNF)에 의한 일시적인 신호 전달은 1 차 신경 돌기의 성장을 촉진하는 반면, 지속적인 신호 전달은 증가 된 신경 돌기 분기를 유도한다. 초기 배아 발달 과정에서 인산화 ERK 활성은 일시적으로 역동적이며 배아 전반에 널리 퍼져있다. 초기의 Xenopus 배 발생 동안의 최근 유전자 스크린은 ERK 및 Akt 신호 전달 계류 (2 개의 다운 스트림 주 성장 인자 경로)가 단계 특이 적 활성화 프로파일을 나타내는 것으로 나타났다. 따라서, 키나아제 신호 결과의 이해는 충분한 분해능으로 키나아제 활성의 공간적 및 일시적 특징을 조사 할 수있는 도구를 필요로한다.
개발 과정에서 신호 변환의 동적 특성을 조사하기위한 기존의 실험적 접근 방법은 바람직한 공간적 및 시간적 해결책이 부족합니다. 예를 들어, 약리학 적 접근법은 작은 화학 물질세포 또는 조직에서의 신호 전달을 자극 또는 억제하기위한 생체 분자 또는 생물 분자. 이 작은 분자들의 확산 성질은 자신의 행동을 특정 관심 영역으로 제한하는 것을 어렵게 만든다. 유전자 접근법 ( 예 : 형질 전환, Cre-Lox 시스템 또는 돌연변이 유발)은 종종 표적 유전자 발현 또는 단백질 활성의 비가 역적 활성화 또는 억제를 유도합니다 16 , 17 , 18 . Tet-On / Tet-Off 시스템 19 는 유전자 전사의 향상된 시간 제어를 제공하지만 테트라 사이클린의 확산에 의존하기 때문에 엄격한 공간 제어가 부족합니다. 화학적으로 유도 된 단백질 이량 체화 (20) 또는 광 - 언 케이 징 ( uncaging ) 21 , 22 , 23 , 24의 최근 개발은 크게 향상되었다시그널링 네트워크의 시간 제어. 그러나 공간 제어는 갇힌 화학 물질의 확산 특성으로 인해 여전히 어려움을 겪고 있습니다.
단백질 - 단백질 상호 작용을 제어하기 위해 빛의 힘을 이용하는 최근 출현하는 광 생성 접근법은 높은 시공간 정밀도 및 가역성을 갖는 신호 전달 경로의 조절을 허용한다. 뉴런 사격 조절에있어 초기 성공 직후 25 , 26 , 27 , optogenetics는 유전자 전사, 번역, 세포 이동, 분화 및 세포 사멸과 같은 다른 세포 과정을 제어하기 위해 확장되었다 .28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 . p를 사용하는 전략(CRY2) 단백질과 Cryptochrome-interacting basic-helix-loop-helix (CIBN)의 N- 말단 도메인은 최근 포유류 세포와 Xenopus 배아에서 Raf1 키나아제 활성을 조절하기 위해 개발되었다. CRY2는 청색광 자극시 CIBN에 결합하고, CRY2 / CIBN 단백질 복합체는 암흑에서 자발적으로 해리한다. 청색광은 CRY2 보조 인자 인 플라 빈 아데닌 디 뉴클레오타이드 (FAD)를 자극하여 CRY2의 구조 변화와 그 후의 CIBN 결합을 유도합니다. CRY2의 구조적 활성 (W374A) 및 플라 빈 결핍 (D387A) 돌연변이는 FAD 결합 주머니의 돌연변이를 통해 생산 될 수 있습니다. CRY2 W374A 돌연변이는 빛과 무관하게 CIBN에 결합하지만 CRY2 D387A 돌연변이는 파란색으로 CIBN에 결합하지 않습니다 가벼운 자극 36 , 37 . optogenetic 시스템은 내가 설명한이 프로토콜은 야생형 CRY2와 CIBN을 사용하여 살아있는 세포에서 단백질 전좌 매개 Raf1 활성화를 유도합니다. Raf1의 멤브레인 모집은 그것의 활성을 증가시키는 것으로 알려져있다 38 . 이 시스템에서 탠덤 CIBN 모듈은 원형질막에 고정되어 있으며 CRY2-mCherry는 Raf1 35 의 N- 말단에 융합되어 있습니다. 푸른 빛이없는 경우, CRY2-mCherry-Raf1은 세포질에 머무르고, Raf1은 비활성입니다. 푸른 빛 자극은 CRY2-CIBN 결합을 유도하고 Raf1이 활성화 된 원형질막으로 Raf1을 모집합니다. Raf 활성화는 Raf / MEK / ERK 신호 전달 캐스케이드를 자극한다. CRY2 및 CIBN- 융합 단백질은 모두 바이 시스 트론 유전 시스템에서 코딩된다. 이 전략은 Akt와 같은 다른 키나아제를 조절하기 위해 일반화 될 수 있으며, 활성화 상태는 세포에서 단백질 전좌에 의해 활성화 될 수 있습니다 39 . 이 작품은 포유류 세포 cultu 에서이 optogenetic 전략을 구현하기위한 상세한 프로토콜을 제공합니다res 및 다세포 생물.
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Protocol
동물 연구는 일리노이 제도 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)와 일리노이 대학 동물 자원부 (DAR)가 정한 지침에 따라 수행되었습니다.
1. BHK21 포유 동물 세포 배양에서 단백질 국소화의 Optogenetic 유도
참고 : 1.1-1.3 단계는 일반적으로 짧은 작동 거리를 갖는 고배율 대물 렌즈 ( 예 : 63X 또는 100X)로 이미징을 위해 세포 배양 챔버를 조립하는 방법을 제공합니다. 이러한 목표는 얇은 유리 coverslip ( 예 : # 1.5, 170 μm의 두께) 이미징 기판으로 필요합니다. 또는, 유리 바닥 세포 배양 접시 / 슬라이드를 사용할 수 있습니다. 이 경우 단계 1.1-1.3은 건너 뛸 수 있습니다.
- 유리 커버 슬리 팅
- coverslip 홀더에 30 유리 coverslips을 놓으십시오.
- 600 mL 플라스틱 비이커에 20 g의 세제와 400 mL의 따뜻한 수돗물을 넣으십시오. Plac자석 교반기로 비이커에 넣고 모든 세제가 녹을 때까지 저어 준다. 티슈 페이퍼를 사용하여 폼을 제거하십시오.
- 100mm x 15mm 페트리 접시의 바닥을 스터 바에서 스페이서로 사용하고 coverslip 홀더의 표면으로 사용하십시오. 청소 과정 중에 적절한 유속을 유지하려면 페트리 접시에 3-4 배수구를 만드십시오.
- 배수구를 만들려면 통풍 후드의 납땜 인두를 가열하고 플라스틱을 통해 태우십시오.
주의 : 가열 된 납땜 인두를 맨 손으로 만지지 마십시오. - 비커의 페트리 접시에 coverslip 홀더를 놓습니다. 실온에서 2 시간에서 밤새 저어 준다.
- 1,000 mL 비이커에서 500 mL의 탈 이온수로 3 회 세척한다. 세제 용액은 재사용 할 수 있습니다.
- 겸자를 사용하여 개별 coverslips를 가져와. 190 - 증거 (95 %) 에탄올에 coverslips를 1 분 동안 담그십시오.
- 멸균 후드 내부 coverslips 건조. 사용할 때까지 멸균 플라스틱 용기에 coverslips를 저장하십시오.
- 폴리 -L- 라이신 (PLL) 코팅 된 커버 슬립 만들기
- 물 400mL에 붕산 1.24g과 사붕산이 나트륨 1.9g을 녹여 0.1M 붕산 완충액을 만든다. 10 M NaOH로 pH를 8.5로 조정한다.
- 붕산염 완충액에 PLL을 1mg / mL의 최종 농도로 용해시킨다. 50 mL 멸균 원심 분리 튜브에 나누어 진 PLL 용액.
- 10-cm 조직 배양 접시에 PLL 코팅 용액 50 mL를 넣는다. PLL 솔루션을 따뜻하게 37 ° C 배양기에 접시를 놓습니다.
- 멸균 후드에서 coverslip 컨테이너를 엽니 다 (1.1.8 단계).
- 조직 문화 접시에 미리 데워진 PLL 솔루션에 하나씩 청소 coverslips을 담그십시오. 모든 표면을 담그려면 거품 형성을 피하십시오.
- 하룻밤 37 ° C 2 인큐베이터에서 coverslip와 접시를 놓습니다. 각 coverslip을 꺼내 멸균 coverslip 홀더에 넣으십시오. 오토 클레이브 된 초순수 (18.2 MΩ &183, cm 비저항)을 멸균 후드 내의 1,000 mL 비이커에 넣었다.
- 멸균 후드의 coverslip 홀더에서 coverslips을 건조. 사용할 때까지 멸균 플라스틱 용기에 coverslips를 저장하십시오.
- 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 세포 배양 챔버 조립
- 플라스틱 용기에 PDMS베이스 40g을 넣고 4g의 경화제를 넣어 PDMS와 경화제를 10 : 1의 비율로 만듭니다. 2 분 동안 피펫 팁으로 저어서 PDMS / 경화 에이전트를 섞는다. 또는 원심 분리기를 사용하십시오.
- 4 인치 직경의 비이커를 주형으로 사용하여 알루미늄 호일로 홀더를 만드십시오. 알루미늄 호일 홀더를 15cm 페트리 접시에 넣으십시오. 이 알루미늄 호일 홀더 안에 4 인치 실리콘 웨이퍼를 놓습니다.
- 혼합 PDMS 솔루션을 홀더에 붓는다. 가는 유리 막대를 사용하여 웨이퍼의 가장자리를 부드럽게 닦으십시오. 웨이퍼 아래에 갇힌 기포를 제거하십시오.
- 15cm 페트리 접시를 진공 챔버에 넣습니다.PDMS 용액을 탈기시킨다. 기포가 발생하지 않을 때까지 약 20 분 동안 계속해서 가스 제거합니다. 그 동안 대류 오븐을 65 ° C로 예열하십시오.
- 조심스럽게 15cm 페트리 접시를 오븐에 넣으십시오. 2 시간 동안 품어 낸다.
- 오븐에서 접시를 꺼냅니다. 유리 막대를 사용하여 PDMS의 가장자리를 부드럽게 만져 완전히 가교 결합되도록하십시오. PDMS가 단단하고 끈적 거리지 않을 때까지 오랫동안 품어 야합니다.
- 플레이트에서 알루미늄 호일을 제거하고 실리콘 웨이퍼에서 떼어냅니다. 가장자리에서 시작하여 경화 된 PDMS를 실리콘 웨이퍼에서 조심스럽게 떼어냅니다.
주의 : 너무 많은 힘을 가하지 마십시오. 웨이퍼가 손상 될 수 있습니다. - PDMS를 20mm x 30mm 직사각형 조각으로 잘라내어 24mm x 40mm 커버 슬립을 면도날에 맞 춥니 다.
- 치즐 형 블레이드를 사용하여 각 PDMS 조각의 중앙에서 10mm x 20mm의 직사각형 구멍을 자릅니다.
- 단계 1.1에서 설명한 세제 프로토콜을 사용하여 PDMS 챔버를 청소합니다.
- 깨끗한 후드에서 PDMS 챔버를 건조시킵니다. 알루미늄 호일로 덮인 오토 클레이브 가능한 용기에 건조 챔버를 놓습니다.
- 용기를 중력 (121 ° C, 15 psi)으로 30 분간 오토 클레이브하고 실온에서 보관하십시오.
- BHK21 세포 배양 및 형질 감염
- FBS 50 ML과 100 × 펜 Strep - 글루타민 (10,000 U / ML 페니실린, 10 MG / ML 스트렙토 마이신, 그리고 29.2 MG / ML L의 5 ML과 445 ML DMEM을 혼합하여 BHK21 세포 배양에 대한 매체의 500 ML을 확인 - 글루타민). FBS의 최종 농도가 10 %인지 확인하십시오.
- 나누어 진 10 mL의 비 HEPES CO 2 - 생존 세포 이미징을위한 독립적 인 배지.
참고 : 이산화탄소 - 독립적 인 배지는 CO2 배양기없이 세포 성장을 지원하며 대기 조건에서 세포를 영상화하는 데 이상적입니다. 자세한 내용은 재료 목록을 참조하십시오. BHK21 세포주 외에도 포유 동물 세포의 다른 유형들도비슷한 결과. - 멸균 후드에서 멸균 PLL 코팅 coverslip (단계 1.2)에 하나의 autoclaved, 살균 PDMS 챔버 (단계 1.3)를 배치하여 세포 배양 장치를 조립.
- 각 장치를 멸균 60mm 페트리 접시에 넣으십시오.
- 12 잘 조직 문화 플레이트 중 하나에서 세포를 분리하는 0.25 % 트립신 0.5 ML을 사용합니다. hemocytometer로 세포 밀도를 세십시오. 세포 배양 배지 200 μL와 챔버 (약 10,000 세포 / cm 2 )에 플레이트 20,000 BHK21 세포.
- 플라스미드 준비 키트로 DNA 플라스미드를 준비하십시오 (재료 목록 참조).
참고 : CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX의 디자인과 기능은 그림 1A - 1B 에 나와 있습니다. - 세포 도금 24 시간 후, 제조사의 프로토콜에 따라 CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX 플라스미드 50-100 ng을 세포에 형질 감염시켰다.
- 형질 감염 3 시간 후, medium을 200 μL의 신선한 배지 (단계 1.4.1)로 옮기고 37 ° C, 5 % CO2 배양기에서 배양하여 하룻밤 동안 세포가 회복되도록합니다.
- 형광 라이브 셀 이미징
- 컴퓨터, 광원, 현미경 및 카메라를 켭니다. 프로토콜의 나머지 부분에 공 촛점 형광 현미경 (100X 오일 침지 객관식을 갖춘)를 사용하십시오.
참고 : 역상 형광 현미경을 사용할 수도 있습니다. - CO 2 - 독립 매체 200 μL와 세포 배양 매체를 교체하십시오.
- 현미경에 세포를 배치하기 전에 데이터 수집 프로토콜을 설정합니다. optogenetic 자극을위한 488 nm의 여기 FITC 채널을 사용하십시오. 형질 전환 된 세포를 찾고 mCherry로 표지 된 단백질의 세포질 위치를 추적하기 위해 561 nm 여기 TRITC 채널을 사용하십시오.
- FITC 및 TRITC 채널의 게인을 각각 120 및 200으로 설정합니다. 픽셀 거주 시간 2.2를 사용하십시오.1, s 및 크기는 512 x 512 픽셀입니다.
- 파워 미터를 대칭 창 가까이에 놓아 488 nm 광 출력을 측정합니다. CIBN-CRY2PHR 결합을 유도하는 데 2μW의 총 출력 (약 10,000W / cm2의 초점)으로 충분합니다.
- 5 초 간격 및 총 획득 시간 2 분으로 타임 스탬프 수집을 설정하십시오.
- 대물 윈도우에 적절한 인덱스 매칭 재료 (침적 오일)를 바르십시오. 위상차 모드를 사용하여 coverslip 표면에있는 셀에 초점을 맞 춥니 다.
- 현미경 스테이지를 이동하여 561 nm의 빛 아래에서 transfected 세포를 찾습니다.
주의 :이 단계에서 청색광을 사용하지 마십시오. 광 활성화 단백질 간의 결합이 활성화됩니다. - 형질 감염된 세포가 발견되면 데이터 수집을 시작하십시오.
참고 : 성공적으로 transfected 세포는 FITC (2CIBN-GFP-CaaX)와 TRITC (CRY2-mCherry-Raf1) 채널 모두에서 형광을 나타내야합니다 ( 그림 1C-D). - FITC 및 TRITC 채널 모두에 일련의 타임 스탬프 이미지를 기록하십시오 ( 그림 1D ).
- CRY2-CIBN 단백질 복합체의 자발적 해리를 조사하기 위해 30 초 간격으로 Txred 채널만으로 20 분 동안 다른 시간 기록을 기록하십시오.
- 데이터 분석을 위해 시간이 표시된 이미지를 저장하십시오.
- 컴퓨터, 광원, 현미경 및 카메라를 켭니다. 프로토콜의 나머지 부분에 공 촛점 형광 현미경 (100X 오일 침지 객관식을 갖춘)를 사용하십시오.
- 이미지 분석
- 이미지 40 에서 강도를 추출 할 수있는 이미지 분석 소프트웨어로 이미지를 엽니 다.
- 두 개의 대표적인 스냅 샷을 선택하십시오 : 하나는 청색광 노출 이전이고 다른 하나는 다른 청색광 노출 후입니다.
- 백그라운드, 원형질 막 및 세포질에 이르는 세포를 가로 지르는 선을 그리십시오. 이 선을 따라 강도를 투사하십시오. 값을 저장하고 그 값을 플롯하여 빛 노출 전후의 차이를 비교하십시오 ( 그림 1D ).
- 단백질 결합의 동역학을 분석하기 위해, selec세포막에서 하나의 대표 관심 영역 (ROI), 세포질에서 하나의 ROI, 백그라운드에서 하나의 ROI.
- 이미지 스택의 원형 막 (I PM ), 세포질 (I CYT ) 및 배경 (I BKD )의 평균 강도를 얻습니다.
- 다음 방정식을 사용하여 각 이미지에 대한 막 / 세포질 강도의 비율을 계산합니다.
- 시간 대 비율을 플롯하고 CRY2-CIBN의 결합 또는 해리 동역학을 결정하십시오 ( 그림 1E -F ).
2. CO 2 배양기에서 장기간의 빛 자극을위한 LED 어레이의 제작
참고 : 실험 설정의 전체 개요가 그림 2A 에 나와 있습니다.
- 두 개의 빵가루에 12 개의 파란색 LED를 삽입하여 LED 배열을 만듭니다.ds 및 전류 제한 저항 연결.
참고 : 30V 전원 공급 장치를 사용하면 4 개의 LED를 직렬로 연결할 수 있으며 전류 제한 저항으로 밝기를 제어 할 수 있습니다. - 브레드 보드를 알루미늄 상자에 넣으십시오.
참고 : 알루미늄 상자의 높이는 2 인치 여야합니다.이 높이는 발산 광점의 크기가 단일 우물의 크기와 같기 때문에 12- 웰 조직 배양 플레이트를 비추는 데 최적입니다. - 두 개의 금속선을 사용하여 전원 공급 장치에 연결하십시오. 라이트 박스가 CO 2 배양기 안에있을 때 와이어의 길이가 충분한 지 확인하십시오.
- 조명 상자의 덮개로 투명한 광 확산기를 사용하십시오 ( 그림 2C ).
- 다양한 전압 입력에서 각 LED의 전원 출력을 보정하십시오. 24 시간 PC12 세포 분화 분석을 위해 0.2 mW / cm 2 의 출력을 사용하십시오. 살아있는 Xenopus 배아 또는 이식편에는 5 mW / cm 2 의 출력을 사용하십시오.분석법.
3. PC12 세포 분화의 광 유발 유도
- 세포 배양 및 형질 감염
- F12K 407.5 mL와 말 혈청 75 mL + FBS 12.5 mL + 100 x Penn-Strep-Glutamine 5 mL (말 혈청 및 FBS의 최종 농도)를 혼합하여 쥐 갈색 세포 교종 (PC12) 세포 배양 용 배지 500 mL를 만든다. : 15 % 및 2.5 %). 99 볼륨의 F12K 배지에 1 배 용량의 완전 배지를 혼합하여 저 혈청 배지를 만듭니다.
- 300,000 세포 / 음 또는 75,000 세포 / cm 2 의 밀도에서 12 잘 접시에 판 PC12 세포.
- 셀 도금 후 24 시간 CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX로 세포를 트랜 스펙 션하십시오 (1.4.7 단계와 유사). 각 우물에 1.2 μg의 DNA를 사용하십시오. 세포가 5 % CO 2 보충 37 ° C 배양기에서 문화 매체에서 하룻밤을 복구 할 수 있습니다. 형질 감염 16 시간 후 transfection 효율을 확인하십시오.
참고 : 30 ~ 50 % transfection eff충분한 세포 수를 확보하기 위해서는 충분한 양을 확보해야한다. - 트랜 스펙 션 24 시간 후 배지를 저 혈청 배지로 교환한다. 12 잘 접시의 우물 당 매체 1 ML을 사용합니다.
- 광 유도 PC12 세포 분화
- CO2 배양기에 LED 배열을 놓습니다. 한 쌍의 전선을 사용하여 전원 공급 장치에 연결하십시오. LED의 전원을 0.2 mW / cm 2로 설정 하십시오. transfected PC12 세포 (단계 3.1.3)가 들어있는 12 - 웰 플레이트를 LED 배열의 창에 놓습니다. 5 % CO2로 보충 된 37 ° C 배양기에서 24 시간 동안 연속 조명 조명을 적용하십시오.
- 형광 라이브 셀 이미징
- 현미경 및 시료 준비에 대해서는 1.5.1-1.5.4 단계를 따르십시오.
- 단일 스냅 샷 데이터 수집을 설정합니다. GFP 및 Txred 채널 모두에 200ms를 사용하십시오.
- GFP 및 Txred 채널에서 transfect 된 세포의 이미지를 캡처하십시오. 대략 200 셀 기록각 조건에 대한 ls. 데이터 분석을 위해 파일을 저장하십시오.
- 이미지 분석
- Transfect 된 세포의 총 수에 대한 분화 된 세포의 백분율을 센다.
- 이미지 분석 소프트웨어의 모든 세포 계수 모듈을 사용하여 세포를 계산하십시오.
- 분화 된 세포를 수동으로 계산하십시오.
참고 : 분화 된 세포는 적어도 하나의 신경 돌기가 세포체보다 식별 가능하게 길다는 것으로 정의됩니다 ( 그림 3A- 3B ). - 미분화 세포로 3.4.3 단계를 반복하십시오.
- 다음 방정식을 사용하여 미분 비율을 계산합니다.
4. Xenopus 태아의 키나아제 활성의 Optogenetic 제어
- 버퍼 준비
- 1X Marc 's Modified Ringer (MMR) 1 L 준비 : 100 mMNaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, pH 7.5.
- mRNA의 제조
- 2 시간 동안 37 ° C에서 ApaI (50 유닛) 1 μL와 CRY2 - mCherry - Raf1-2A - 2CIBN - GFP - CaaX 플라스미드 DNA (2 μg)를 소화.
- 선형화 된 DNA를 100 μL의 에탄올에서 60 μL로 침전시킵니다. 상온에서 12,000 × g으로 5 분간 회전시켜 DNA를 펠렛으로 만든다. 조심스럽게 상등액을 제거하고 70 % 에탄올 60 μL로 다시 펠렛을 씻으십시오. 상온에서 12,000 × g으로 5 분간 회전시킨다. 조심스럽게 상등액을 제거하고 RNase가없는 H 2 O 6 μL로 DNA 펠렛을 재현 탁하십시오.
- 공급 SP6 RNA 중합 효소, 리보 뉴클레오티드 혼합물 (10 MM ATP, CTP 및 UTP, 2 MM GTP 및 8 MM 캡 아날로그) 2 μL와 선형 DNA의 1 μg을 incubating하여 시험 관내 전사를 수행하고 nuclease- 1 시간 동안 상온에서 유리 수.
- D 제거NA template를 DNase I로 37 ℃에서 최소 15 분 동안 소화시키고 실리카 멤브레인 스핀 컬럼을 사용하여 합성 RNA를 정제한다.
- 반응을 멈추고 Nuclease-free 물 30 μL와 LiCl 침전 용액 30 μL를 첨가하여 RNA를 침전시킨다. 철저히 혼합하고 -20 ° C에서 30 분 동안 식힌다.
- 12,000 × g에서 15 분 동안 4 ℃에서 원심 분리하여 RNA를 펠렛으로 만든다.
- 조심스럽게 상등액을 제거하십시오. 70 % 에탄올 1 ML와 RNA를 씻어 Nuclease 무료 물 40 μL에 resuspend.
- 스핀 컬럼에 RNA 40 μL를 넣으십시오. 12,000 × g에서 1 분간 4 ℃에서 원심 분리하여 비 결합 뉴클레오타이드 및 대문자를 제거한다.
- 수확 Xenopus 배아
- Sive et al. Xenopus 배아를 얻기 위해 41 번 .
- mRNA 마이크로 인젝션
- 만들다모세관 풀러로 유리 모세관을 잡아 당김으로써 미세 주입 용 바늘 당기기 프로그램을 열 = 355, 힘 = 80, 속도 = 50, 시간 = 100으로 설정하십시오.
- 3 % 시스테인 (0.2x MMR로 희석)로 그들을 치료하여 배아에서 젤리 코트를 제거합니다.
- Microinjection 3 % polysucrose과 0.5x MMR 솔루션에 배아를 전송합니다. 각각의 배아에 CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX RNA 1 개를 500 ng 씩 주입합니다.
참고 : 1 ng보다 높은 용량의 주사는 파란색 빛에 독립적 인 MAPK 신호 전달 활성화를 초래합니다.
- kinase 활성의 Optogenetic stimulation
- 문화는 3 % polysucrose, 중순 gastrula 단계 (12 단계)에 도달 할 때까지 상온에서 0.5x MMR 솔루션에 배아를 microinjected. 그런 다음 0.2x MMR 솔루션으로 배아를 배양하십시오.
- 배아 또는 explants를 12 잘 플레이트로 전송합니다. 파랗 - ligh에 대한 집에서 만든 LED 배열 (단계 2.5)에 12 잘 접시를 놓으십시오t (475 nm) 처리.
- 배아 또는 explants의 전체 푸른 빛 조명을 보장하기 위해 12 - 웰 플레이트의 상단에 거울을 놓습니다.
- 청색광의 출력을 5 mW / cm 2로 조정하십시오.
참고 : 푸른 빛 처리는 3 % polysucrose, 0.5x MMR 솔루션 또는 0.2x MMR 솔루션에서 원하는 시간에 수행 할 수 있습니다. - 원하는 시간에 배아를 수확하십시오. 조직 학적, 서양 얼룩 또는 유전자 발현 분석에 사용하십시오.
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Representative Results
photoactivatable 단백질 쌍의 비례 발현 : 그림 1A 는 bicistronic optogenetic 구조물, CRY2-mCherry-Raf1-P2A-CIBN-CIBN-GFP-CaaX (CRY2-2A-2CIBN라고 함) 1 2A (P2A) 펩타이드는 포유류 세포주 중 가장 높은 리보좀 건너 뛰기 효율을 보여줍니다 42 . 이전 연구에서 CIBN-GFP-CaaX : CRY2-mCherry-Raf1의 최적 비율은 2 : 1로 결정되었다. 이 구성은 CRY2-mCherry-Raf1 ( 그림 1B )의 충분한 멤브레인 모집 및 활성화를 허용합니다. CRY2-2A - 2CIBN으로 단독으로 transfected 세포는 epi - 조명 ( 그림 1C ) 또는 공 촛점 현미경 ( 그림 1D ) 아래 GFP 및 Txred 형광 채널 모두에서 명확한 형광을 보여줍니다. 청색광 매개 막공 촛점 현미경에서 CRY2-mCherry-Raf1 ( 도 1D )의 동원이 명확하게 검출 될 수있다. 결합은 청색 빛 노출 후 수초 내에 일어나고 ( 그림 1E ), CRY2-CIBN 단백질 복합체는 약 5.5 분의 반감기로 해리됩니다 ( 그림 1F ).
신경 성장 인자가없는 경우 빛 조절 PC12 세포 분화 : 성장 인자 신호 전달에서 흥미로운 관찰은 일반적인 하류 신호 전달 경로 ( 예 : ERK, PI3K-Akt 및 PLCγ)가 신호 반응에서 다양성과 특이성을 이끌어내는 것입니다. 성장 인자 매개 시그널링에 대한 더 나은 이해는 개별 캐스케이드의 정확한 시공간 조절을 가능하게하는 기술을 가능하게함으로써 달성 될 수있다. 이 프로토콜에서 소개 된 광학 유전학 접근법은 특정 활성을 허용하는 하나의 기술을 보여줍니다n의 Raf / MEK / ERK 신호 전달 경로를 제공한다. 이 접근법은 NGF가 막 수용체에 결합하는 과정을 우회하기 때문에 신호 전달 역학은 더 이상 내인성 수용체에 의존하지 않습니다. 대신에, 정확한 운동 제어는 자극 광선의 시간적 프로파일을 조절함으로써 달성 될 수있다 ( 도 2A ). 따라서,이 접근법은 키나아제 활성의 신호 동력학을 연구하는 새로운 가능성을 열어 준다. 또한,이 실험 설정은 세포 내 신호 전달 연구 ( 그림 2B -2D )에 optogenetic 접근 방식을 통합하는 매우 간단하고 경제적 인 방법을 제공합니다. PC12 세포 분화 분석의 경우, 0.2 mW / cm 2 에서 24 시간 연속 광 자극으로 상당한 신경 돌기의 성장을 유도 할 수 있습니다 ( 그림 3A ). 빛이없는 형질 감염된 세포를 포함한 음성 대조군 ( 그림 3B) 및 빛이 있거나없는 비 형질 전환 세포 ( 도 3C- 3D )는 유의 한 신경 돌기 성장을 나타내지 않는다. 이 힘에서, 구성 적으로 활동적인 Raf1 (CA-Raf1)으로 형질 감염된 세포는 정상 분화를 겪습니다 ( 그림 3E ). 특히, bicistronic optogenetic 구조로 transfected 세포는 CA - Raf1 ( 그림 3F )에 의해 유도 된 가치에 도달, 두 구조로 공동 transfected 세포보다 상당히 높은 분화 비율을 생산하고 있습니다. 분화 비율은 분화 된 세포의 수를 GFP 형광에 의해 유도 된 형질 전환 된 세포의 수로 나눔으로써 계산된다. 분화 된 세포는 적어도 하나의 신경 돌기가 세포체 35 의 크기보다 긴 세포로 정의됩니다. 분화 비의 이러한 향상은 1) 바이 시스 트론 시스템으로 광 활성화 가능한 단백질을보다 잘 전달하고, 2)CIBN과 CRY2 간의 시간 표현 비율 35 .
라이브 Xenopus laevis 배아에서의 Raf / MEK / ERK 신호 전달 경로의 가역적 인 광 생성 자극 : X. laevis 는 유전자 전사, 신호 전달 및 배아 발달을 연구하기위한 잘 확립 된 모델 유기체입니다. 이전의 연구는 Raf / MEK / ERK 경로의 활성화가 세포 운명 변화를 유도하여 테일 부리 단계 43 에서 자궁외 테일과 같은 구조를 형성한다는 것을 발견했다. 강력한 중배엽 유도제로서, 과발현 된 Raf1은 포배 및 조기 gastrula 단계 동안 발생하는 배아 층의 특성화 동안 이소성 중배엽을 유도 할 수 있고, 이후에 이소성 (ectopic) 꼬리 유사 구조가 형성 될 수있다. 대안으로, 과발현 된 Raf1은 세균층 상세화가 완료된 후 상피 간엽 전이 (EMT)와 유사한 현상을 유발할 수 있으며,신경 외배엽 계통으로 외배엽을 변형시킨다. 그 다음에 이러한 구조가 확산되고 확장됩니다 43 . 이 실험에서, MET 수용체, Ras 및 Raf1을 코딩하는 RNA를 2 세포 단계에서 배아에 주사 하였다. RNA가 배아에 주입 된 직후, 과다 발현 된 MET / Ras / Raf1은 하류 신호 전달 계통을 구성 적으로 활성화하기 시작했다. 따라서 조기 발달 단계를 우회하여 세균층 지정 후 Raf1을 특이 적으로 활성화시키는 것은 기술적으로 어려웠습니다. germ-layer specification 후 Raf / MEK / ERK 신호 전달의 활성화가 세포의 운명 변화를 유도하여 자궁외의 꼬리 모양의 구조를 형성 하는지를 결정하기 위해 그러한 전략을 사용하는 것은 불가능했다.
Optogenetics는 Raf1 활성의 타이밍을 제어하는 메커니즘을 제공합니다. 초기 발달 단계에서 CRY2-2A-2CIBN의 RNA가 배아에 주입되었을 때s, Raf1은 청색광이 공급 될 때까지 비활성 상태를 유지했다. 동물 캡 분석은 기초적인 ERK 활성이 동물 뚜껑에서 낮기 때문에 신호 결과를 특징 짓기 위해 편리하게 사용되었다. Raf / MEK / ERK signaling cascade의 빛에 의한 활성화는 RT-PCR ( 그림 4A ) 또는 whole-mount in situ hybridization ( 그림 4B )에 의해 결정된 중배엽 마커 인 xbra의 상당한 상향 조절을 유도했다. 파란 빛에 반응하여 ERK의 인산화의 동적 인 변화는 또한 Western-blot 분석에 의해 검출되었다 ( 그림 4C ). 전체 배아에서, CRY2-2A-2CIBN과 n-β-gal RNA의 혼합물을 8 셀 단계에서 후부 동물의 갈라진 사람 중 한쪽으로 주입하였고, 나중에 배면 앞쪽 조직을 발생시켰다. 처리되지 않은 배아와 비교하여 ( 그림 4D -4E ), CRY2-2A-2CIBN으로 주입되고med 자궁외 꼬리와 같은 구조 ( 그림 4F -4G ). 어둠 ( 그림 4H ) 또는 푸른 빛 조명 ( 그림 4I ) 아래 주사하지 않은 배아는 꼬리 모양의 구조를 형성하지 않았다. 세균층 지정 후 푸른 빛 조명은 중요한 꼬리 모양의 구조를 유도했다 ( 그림 4J ).
그림 1 : 빛 유도 단백질의 위치 및 키나아제 신호 전달 경로의 활성화 메커니즘. ( A ) Raf / MEK / ERK 키나아제 신호 전달 경로의 광 유발 활성화를 허용하는 최적화 된 CIBN 대 CRY2 비율 (2 CIBN : 1 CRY2)을 갖는 바이 시스트 론 구조의 설계. ribosomal 건너 뛰기에, 1 mRNA 전 사물은 2 개의 단백질을 생성한다 : CRY2-mCherry-Raf1-N2A (결말아미노산 NPG를 포함 함) 및 프롤린 -2CIBN-GFP-CaaX. ( B ) CIBN과 CRY2 사이의 빛에 의해 유도 된 결합은 Raf / MEK / ERK 신호 전달 경로를 활성화시키는 CRY2-mCherry-Raf1의 막 모집을 유도한다. ( C ) epi-illumination 하에서 CRY2-2A-2CIBN으로 형질 감염된 BHK21 세포의 형광 이미지. 스케일 바 : 20 μm. ( D ) CRY2-2A - 2CIBN으로 transfected 세포의 공 촛점 형광 이미징. 왼쪽 패널은 절단 된 2CIBN-GFP-CaaX가 원형질 막에 국한되었음을 보여줍니다. 중간 패널은 청색광 자극 전에 CRY2-mCherry-Raf1의 스냅 샷을 보여줍니다. 오른쪽 패널은 10 회의 청색광 자극 후에 CRY2-mCherry-Raf1의 스냅 샷을 보여줍니다. 아래쪽 패널은 빛 자극 전과 후에 세포 전반의 노란색 점선을 따라 표준화 된 강도 프로파일을 보여줍니다. 스케일 바 = 20 μm. ( E - F ) 빛 유도 CRY2 - CIBN 협회 ( E )에 대한 속도론 및 자발적인 해리어두운 곳에서 CRY2-CIBN 단백질 복합체의 n ( F ). 그림 1A- B 는 생물학 자의 허락하에 재현 된 참고 문헌 35 에서 채택되었습니다. 그림 1E -F 는 Creative Commons Attribution (CC BY) 라이센스에 따라 참조 번호 44 에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 집에서 만든 LED 어레이의 설계 및 교정. ( A ) 살아있는 세포에서 빛을 조절 키나아제 활성에 대한 실험 준비의 도식. ( B ) 집에서 만든 LED 배열 용 회로 보드. ( C ) 리간드ht 박스는 CO2 인큐베이터에서 장기적인 빛 자극에 사용될 수 있습니다. 알루미늄 상자의 높이는 2 인치 ( D )입니다. 일반적인 LED 출력 대 전압. 전류 제한 저항과 4 개의 LED가 직렬로 연결된 회로에서 LED 당 값이 밝아집니다. 그림 2A 는 생물학 자의 허가를 받아 재현 된 참고 문헌 35 에서 채택되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : PC12 세포 분화의 Optogenetic 유도. ( A ) 24 시간의 청색광 자극 (0.2 mW / cm 2 ) 후에 CRY2-2A-2CIBN으로 형질 감염된 PC12 세포의 다 채널 스냅 샷. A circle은 분화 된 세포를 표시합니다. 사각형은 미분화 세포를 표시합니다. ( B ) 청색광 자극이 사용되지 않았다는 점을 제외하고는 ( A )와 동일. ( C - D ) 청색광 자극 (0.2 mW / cm 2 ) ( C ) 또는 어두운 배양 ( D )의 24 H에서 non-transfected PC12 세포. ( E ) Raf1-GFP-CaaX (CA-Raf1)로 형질 감염된 세포의 대표적인 이미지. 원과 사각형 표지는 각각 분화 된 세포와 미분화 된 세포입니다. ( F ) CRY2-mCherry-Raf1 및 CIBN-GFP-CaaX와 함께 형질 감염시킨 CA-Raf1로 형질 감염시킨 PC12 세포의 분화 비 및 CRY2-2A-2CIBN으로 단독 형질 감염시킨 PC12 세포의 분화 비. 24 시간 후, 세포를 빛에 노출 시키거나 어두운 곳에서 24 시간 동안 배양 하였다. 이 값은 4 개의 독립적 인 데이터 세트의 평균 ± 표준 편차를 나타냅니다. 청색 빛에 노출 된 세포들만이 중요한 분화를 보였다. 도 3f생물학 자의 허가를 받아 재현 된 참고 문헌 35 에서 채택되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 살아있는 Xenopus 배아에서 키나아제 활성의 Optogenetic 유도. ( A ) 초기 gastrula 단계에서 CRY2-2A-2CIBN 주사 동물 캡에서 청색광에 노출되면 중배엽 마커 인 xbra의 발현이 유도 된 것을 보여주는 RT-PCR 결과. 배아 에서 xbra의 ( B ) 전체 마운트 in situ 하이브리드 화. 빛에 의한 MAPK 활성의 활성화는 xbra의 공간 분포를 조절합니다 (오른쪽 아래 패널의 빨간색 화살표). 검은 화살표는 핵 β-ga를 표시계통 추적자로서의 락토시다 제. AP : 동물 극. 부사장 : 식물성 극. ( C ) 동물 캡 분석에서 CRY2-2A-2CIBN이 청색광 의존성, ERK의 가역적 인산화를 유도한다는 것을 보여주는 웨스턴 블롯 분석. ( D ) mRNA 주입 및 빛 처리가없는 정상 배아의 형태를 보여주는 이미지. ( E ) 단일 배아의 확대 된 이미지. ( F - G ) CRY2 - 2A - 2CIBN mRNA가 주입되고 푸른 빛 자극을받은 배아에 대한 확대 및 전체 필드 이미지. CRY2-2A-2CIBN 주입 된 배아를 청색광으로 처리하여 Raf1을 활성화 시키면 머리 부분에 이소성 (ectopic) 꼬리 모양의 구조가 유도된다. ( H - I ) 부정적인 컨트롤, CRY2-2A - 2CIBN하지만 어두운 배양 ( H ) 및 빛 자극 ( I )하에 주입하지 않은 배아에서 주입 주입을 포함합니다. 모든 광 자극 실험은 5 mW /2이다. ( J ) 각 조건 하에서 자궁외 테일 유사 구조를 나타내는 배아의 백분율에 대한 통계 분석. 스케일 바 = ( D ) 및 ( G ) : 1mm; ( E - F ) 및 ( H - I ) 0.5 mm. 그림 4A , C , E - F 및 H - J 는 생물 학자 회사의 허락하에 재현 된 참고 문헌 35 에서 채택되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
조명 상자를 만들 때 개별 LED의 전원을 측정해야합니다. 이전의 경험을 바탕으로 제조 출력 차이로 인해 LED마다 전원 출력이 다를 수 있습니다. 서로 10 % 이내의 출력을 갖는 LED 세트를 선택하십시오. LED의 수, 전류 제한 저항 및 전원 입력은 다양한 유형의 세포 배양 용기 ( 예 : 6- 웰 또는 24- 웰 플레이트)에 대해 수정할 수 있습니다. 0.2mW / cm 2 의 출력에서 24 시간 동안 빛을 비추면 광독성이 관찰되지 않는다. 더 높은 전력을 사용하는 경우 열 발생과 광독성을 줄이기 위해 간헐적 인 빛을 사용하는 것이 좋습니다. 이 프로토콜에 도입 된 optogenetic 시스템은 두 개의 인접한 광 펄스 사이의 어두운 간격이 45 분 미만 44 주어진 간헐적 인 빛 자극에 비해 지속적인 빛 자극의 PC12 세포에서 신경 돌기 파생물을 유도합니다. 정당한단백질 결합 및 해리의 동력학의 본질적인 차이에 따라, 빛 펄스 사이의 지속 시간은 각각의 독특한 단백질 쌍에 대해 조정되어야한다. cytosolic Raf1의 과발현은 푸른 빛 조명없이 PC12 세포 분화를 일으키지 않습니다. 각 배아에 주입 된 mRNA의 양을 조절함으로써, 어두운 곳에서 중요한 배아 표현형은 관찰되지 않았다.
저전력의 청색광이 CRY2와 CIBN 융합 단백질의 결합을 자극하기에 충분하지만 청색광의 침투 깊이가 좋지 않아 깊은 조직 자극에 사용이 제한됩니다. 이러한 자극은 다른 장치 ( 예 : 광섬유)를 통해 빛을 전달함으로써 이루어졌지만 접근법은 침투성이 있습니다 45 . 이 문제는 두 가지 방법으로 해결할 수 있습니다 : 더 긴 파장 ( 예 : phytochrome-PIF6 단백질 쌍)에 반응하는 단백질 쌍을 사용하거나 2 광자 여기를 사용합니다. 두 가지 방법 모두 깊이를 제공 할 수 있습니다.r 침투, 그러나 그들은 다른 제한에서 영속 할 수 있었다. 예를 들어, PhyB-PIF6 쌍은 합성 보조 자극제가 필요하며 2 광자 현미경 검사는 값 비싼 계측을 필요로합니다. CRY2-CIBN 상호 작용에서 튜너 빌리티의 부족은 고려해야 할 또 다른 한계입니다. 야생형 CRY2는 CIBN에서 자발적으로 해리 34에서 반감기 5.5 분으로 해리된다. 표적 신호 경로의 동력학에 따라, 짧거나 길어진 해리 반감기가 선호 될 수있다. 해리 반감기를 2.5 분 (349R)으로 단축하거나 24 분 (L348F)까지 연장 할 수있는 CRY2의 변이가 만들어졌습니다. 또는 곰팡이 수용체 Vivid (VVD) 및 p / nMagFast1 및 2에 기초한 조작 된 광 활성화 가능한 단백질 쌍은 각각 4.2 분 및 25 초의 해리 반감기를 나타낸다 ( 47) . 이 프로토콜에서, 야생형 CRY2-CIBN 단백질 쌍은 5 분 동안 가벼운 sti 내에서 MAPK 경로를 켭니다배양하고, 액티비티는 포유류 세포에서 30 분 이내에 기저 수준으로 되돌아 가고, Xenopus 배아에서 44 및 1-2 시간이 걸린다. 공간 제어를 위해, 공 초점 현미경은 청색 레이저를 상 평면에서 약 200nm의 회절 한계 스폿의 크기로 포커싱 할 수있다. 비 간섭 성 광원이 장착 된 낙서 식 현미경 (epi-illumination microscope)에서 필드 다이어그램의 크기를 조정함으로써 조명 크기를 직경 약 10 μm로 제한 할 수 있습니다. 두 방법 모두 세포 배양에서 광 유발 자극의 세포 내 조절을 달성 할 수 있어야한다.
높은 공간 및 시간 해상도로 신호 변환을 가역적으로 조사하는 광학 유전학의 능력은 살아있는 세포에서 동적 세포 내 신호 전달을 연구 할 수있는 완전히 새로운 기회를 제공합니다. 이 프로토콜의 결과는 Raf1 활성화가 주로 PC에서의 연결 분화 유도에 대한 원인임을 밝혀냈다12 셀 44 . 동일한 경로는 또한 Xenopus 태아 발육에서 이차 꼬리와 같은 구조의 형성을 일으킨다. Raf1 활성화의 타이밍을 제어함으로써 꼬리 모양의 구조는 세균 층 형성 단계 35 이후에 유도 될 수 있습니다. 최근에 기술 된 LOVTRAP 방법은 관심 단백질 (POI) 48 의 빛에 의해 유도 된 해리를 조절하기 위해 암흑에서만 선택적으로 서로 결합하는 2 개의 조작 된 단백질 인 Zdark 및 LOV2를 이용한다. 이 접근법에서 사용되는 light-mediated protein-protein association과 달리, LOVTRAP은 빛을 이용하여 단백질 해리를 유도합니다. 이 새로운 양식은 살아있는 세포에서 단백질의 위치와 조절을 조절할 때보다 유연합니다. 시그널링 캐스케이드 내에서 활성화 모드를 신중하게 선택함으로써, 신호 변환을 비 전통적인 방식으로 분석 할 수 있습니다. 예를 들어, I없이 수용체 티로신 키나아제를 활성화시키는 것이 가능하다igand-receptor binding 49 또는 ligand-elicited signaling cascades의 subset을 유도하는 것 44 . 여기에보고 된 전략은 Akt 39 및 GTPases ( 예 : Rho GTPase)와 같은 다른 키나아제를 조절하기 위해 일반화 할 수 있으며, 활성화 상태는 단백질 전좌에 의해 활성화 될 수 있습니다. Optogenetics는 Drosophila 50 , zebrafish 51 , 52 , 53 , 54 및 Xenopus 배아 35 에서 단백질 로컬 리 제이션 및 시그널링의 광학 유전 학적 제어를 특징으로하는 최근의 연구에 의해 입증 된 것처럼, 다세포 생물의 생존에 계속 적용될 것입니다.
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Disclosures
저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 작업은 Urbana-Champaign의 일리노이 대학 (UIUC)과 국립 보건원 (NIGMS R01GM111816)의 지원을 받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass coverslip | VWR | 48393 230 | Substrate for live cell imaging |
| Coverslip holder | Newcomer Supply | 6817B | Holder for coverslips |
| Detergent | ThermoFisher | 16 000 104 | For cleaning coverslips |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768-500G | For making PLL buffer |
| Disodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 71996-250G | For making PLL buffer |
| Plastic beaker | Nalgene | 1201-1000 | For cleaning coverslips |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465-2.5KG | For adjust pH |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1274-500MG | For coating coverslip |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC)-Treated Water | ThermoFisher Scientific | 750024 | For DNA preparation |
| Cover Glass Forceps | Ted Pella | 5645 | Cover glass handling |
| Tissue cutlure dish | Thermofisher | 12565321 | Cell culture dish |
| Sterile centrifuge tubes | ThermoFisher | 12-565-271 | Buffer storage |
| Transfection Reagent | ThermoFisher | R0534 | Transfection |
| CO2-independent medium | ThermoFisher | 18045088 | For live cell imaging |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | Form make cell chamber |
| Plasmid Maxiprep kit | Qiagen | 12965 | Plasmid preparation |
| DMEM medium | ThermoFisher | 11965-084 | Cell culturing medium component |
| F12K medium | ThermoFisher | 21127022 | Cell culturing medium component |
| Horse serum | ThermoFisher | 16050122 | Cell culturing medium component |
| Fetal Bovine Serum | Signa-Aldrich | 12303C-500 mL | Cell culturing medium component |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | ThermoFisher | 10378016 | Cell culturing medium component |
| Trypsin (0.25%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 15050065 | For mammalian cell dissociation |
| Agarose | Fisher Scientific | BP1356-100 | For DNA preparation |
| Ficoll PM400 | GE Heathcare Life Sciences | 17-5442-02 | For embryo buffer |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | 1.02839.0025 | Oocyte preparation |
| ApaI | ThermoFisher | FD1414 | For linearization of plasmids |
| Dnase I | ThermoFisher | AM2222 | For removing DNA template in the in vitro transcription assay |
| Index-match materials (immersion oil) | Thorlabs | MOIL-20LN | For matching the index between sample substrate and objective |
| Blue LED | Adafruit | 301 | Light source for optogenetic stimulation |
| Resistor kit | Amazon | EPC-103 | current-limiting resistor |
| Aluminum boxes | BUD Industries | AC-401 | light box |
| BreadBoard | Jekewin | 837654333686 | For making LED array |
| Hook up Wire | Electronix Express | 27WK22SLD25 | For making LED array |
| Relay Module | Jbtek | SRD-05VDC-SL-C | For intermittent light control |
| DC Power Supply | TMS | DCPowerSupply-LW-(PS-305D) | Power supply for LED |
| Silicon Power Head | Thorlabs | S121C | For light intensity measurement |
| Power meter | Thorlabs | PM100D | For light intensity measurement |
| Microscope | Leica Biosystems | DMI8 | For live cell imaging |
| BioSafety Cabinet | ThermoFisher | 1300 Series A2 | For mammalian cell handling |
| CO2 incubator | ThermoFisher | Isotemp | For mammalian cell culturing |
| Stereo microscope | Leica | M60 | For embryo micro-manipulation |
| Microinjector | Narishige | IM300 | For embryo microinjection |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P87 | Needle puller |
| in vitro transcription kit | ThermoFisher | AM1340 | For in vitro transcription. The kit includes nuclease-free water, SP6 RNA Polymerase, ribonucleotide mixture, cap analog, lithium choride precipitation solution, and spin column |
| RNA purfication kit | Qiagen | 74104 | Silica-membrane spin column for purification of synthesized RNA |
| Convection oven | MTI corporation | EQ-DHG-9015 | PDMS curing |
| Centrifugal mixer and teflon container | THINKY | AR310 | For mixing PDMS |
| Silicon wafer | UniversityWafer | 452 | Base for making PDMS devices |
| Blade | Techni Edge | 01-801 | For cutting PDMS |
| Capillary glass | Sutter Instruments | BF100-58-10 | For fabrication of injecting needles. |
References
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