Summary
Dit protocol beschrijft een optogenetische strategie voor het moduleren van mitogeen-geactiveerde proteïne kinase (MAPK) activiteit tijdens celdifferentiatie en Xenopus embryonale ontwikkeling. Deze methode maakt het mogelijk om de omkeerbare activering van de MAPK signalering weg in zoogdiercelcultuur en in multicellulaire levende organismen, zoals Xenopus embryo's, met een hoge ruimtelijke en temporale resolutie.
Abstract
Kinase-activiteit is cruciaal voor een overvloed aan cellulaire functies, waaronder celproliferatie, differentiatie, migratie en apoptose. Tijdens de vroege embryonale ontwikkeling is de kinase-activiteit zeer dynamisch en wijdverspreid over het embryo. Farmacologische en genetische benaderingen worden vaak gebruikt om kinase-activiteiten te onderzoeken. Helaas is het uitdagend om superieure ruimtelijke en temporale resolutie te bereiken met behulp van deze strategieën. Bovendien is het niet haalbaar om de kinaseactiviteit op een omkeerbare manier te controleren in levende cellen en multicellulaire organismen. Een dergelijke beperking blijft een knelpunt voor het bereiken van een kwantitatief begrip van kinase-activiteit tijdens ontwikkeling en differentiatie. Dit werk presenteert een optogenetische strategie die profiteert van een bicistronisch systeem dat fotoactivatabele eiwitten bevat Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) en het N-terminale domein van Cryptochrome-interactie Basis-Helix-Lus-Helix (CIBN). ReversiBle activatie van de mitogeen-geactiveerde proteïne kinase (MAPK) signalering route wordt bereikt door middel van licht gemedieerde eiwit translocatie in levende cellen. Deze aanpak kan toegepast worden op zoogdiercelculturen en levende embryo's van vertebraten. Dit bicistronische systeem kan worden genegaliseerd om de activiteit van andere kinasen te reguleren met soortgelijke activatiemechanismen en kan toegepast worden op andere modelsystemen.
Introduction
Groeifactoren zijn betrokken bij een breed spectrum van celfuncties, waaronder proliferatie, differentiatie, migratie en apoptose, en spelen in vele biologische gebeurtenissen een centrale rol, waaronder embryonale ontwikkeling, veroudering en regulering van de mentale status 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Veel groeifactoren signaleren via complexe intracellulaire signalerende cascades. Deze signaleringsgebeurtenissen worden op een nauwkeurig gereguleerde wijze 6 , 7 vaak door reversibele eiwitfosforylering bediend. Zo is een begrip van de signaleringsuitkomsten van proteïnekinasen, die verantwoordelijk zijn voor eiwitfosforylering, fundamenteel belangrijk.
Verschillende groeifactoren fungeren door een vrij algemeen intracellulair signaleringsnetwerk, ook al stimuleren ze distInkt cellulaire responsen 8 , 9 . Algemene intracellulaire mediatoren van receptor tyrosine kinasen omvatten Ras, Raf, extracellulaire signaal-gereguleerde kinase (ERK), mitogeen-geactiveerde proteïne kinase (MAPK) / ERK kinase (MEK), fosfoinositide 3-kinase (PI3K), Akt en fosfolipase C gamma (PLCy) 10 , 11 . Het verzamelen van bewijs suggereert dat signalering diversiteit en specificiteit afhangen van de ruimtelijke en tijdelijke regulatie van signaleringsactiviteit 12 . Bijvoorbeeld, bij ratfheochromocytoomcellen (PC12) stimuleert epidermale groeifactor (EGF) -stimulatie, die resulteert in celproliferatie, de ERK-route 9 transient actief. Anderzijds stimuleert stimulatie met zenuwgroeifactor (NGF), die leidt tot celdifferentiatie, de ERK-weg op een volgehoue wijze 9 , 13 . In gekweekte rBij hippocampale neuronen bevordert transiënte signalering door hersenafleidende neurotrofe factor (BDNF) de primaire neurietgroei, terwijl blijvende signalering leidt tot verhoogde neurietakking 14 . Tijdens de vroege embryonale ontwikkeling is de gefosforyleerde ERK-activiteit tijdelijk dynamisch en verspreid over het embryo 6 . Een recent genetisch scherm tijdens de vroege Xenopus embryogenese toonde aan dat ERK en Akt signaling cascades, twee stroomafwaartse primaire groeifactorroutes, display-specifieke activatieprofielen 7 tonen . Zo begrijpt een begrip van kinase signalering uitkomsten hulpmiddelen die de ruimtelijke en temporale kenmerken van kinase-activiteit met voldoende resolutie kunnen proberen.
Conventionele experimentele benaderingen om de dynamische aard van de signaaltransductie tijdens de ontwikkeling te onderzoeken, missen de wenselijke ruimtelijke en temporale resolutie. Bijvoorbeeld, farmacologische benaderingen gebruiken kleine chemIcal of biologische moleculen om signaaltransductie in cellen en weefsels te stimuleren of te onderdrukken. De diffusieve aard van deze kleine moleculen maakt het uitdagend om hun actie te beperken tot een bepaald gebied van belang 15 . Genetische benaderingen ( bijv. Transgenese, het Cre-Lox-systeem of mutagenese) leiden vaak tot de onomkeerbare activering of repressie van de doelgen-expressie of eiwitactiviteit 16 , 17 , 18 . Het Tet-On / Tet-Off systeem 19 biedt verbeterde tijdelijke controle van gentranscriptie, maar heeft geen strikte ruimtelijke controle omdat het afhankelijk is van de diffusie van tetracycline. Recente ontwikkelingen in chemisch geïnduceerde eiwitdimerisatie 20 of foto-uncaging 21 , 22 , 23 , 24 hebben een grote verbeteringDe tijdelijke controle van signaleringsnetwerken bewerkstelligd. De ruimtelijke controle blijft echter uitdagend door de diffusieve aard van de gecasteerde chemicaliën.
Recente opkomende optogenetische benaderingen, die de kracht van het licht aanwenden om eiwit-eiwitinteracties te beheersen, maken het mogelijk om de signaleringstrajecten te moduleren met hoge spatiotemporale precisie en omkeerbaarheid. Kort na zijn eerste succes bij het beheersen van neuronale ontsteking 25 , 26 , 27 is optogenetica uitgebreid om andere cellulaire processen te beheersen, zoals gentranscriptie, translatie, celmigratie, differentiatie en apoptose 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 . Een strategie met behulp van de pHotoactivatabele eiwitpaar Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) eiwit en het N-terminale domein van cryptochrome-interactie-basisschroef-lus-helix (CIBN) werd recent ontwikkeld om Raf1 kinase-activiteit in zoogdiercellen en Xenopus embryo's 35 te controleren. CRY2 bindt aan CIBN bij blauwlichtstimulatie, en het CRY2 / CIBN eiwitcomplex splitst spontaan in het donker 34 . Blauw licht verwekt de CRY2 cofactor, flavin adenine dinucleotide (FAD), wat leidt tot een conformatieve verandering in CRY2 en de daaropvolgende binding aan CIBN. Constitutief actieve (W374A) en flavin-deficiënte (D387A) mutanten van CRY2 kunnen worden geproduceerd door mutaties in de FAD-bindende zak: de CRY2 W374A mutant bindt aan CIBN onafhankelijk van licht, terwijl de CRY2 D387A mutant niet bindt aan CIBN onder blauw -lichtstimulatie 36 , 37 . Het optogenetische systeem beschreven iN dit protocol gebruikt wildtype CRY2 en CIBN om eiwittranslokatiegemedieerde Raf1-activering in levende cellen te induceren. Het is bekend dat de membraanaanwerving van Raf1 zijn activiteit 38 verbetert. In dit systeem wordt een tandem CIBN-module verankerd aan het plasmamembraan en CRY2-mCherry is gefuseerd aan de N-terminale van Raf1 35 . Bij gebrek aan blauw licht blijft CRY2-mCherry-Raf1 in het cytoplasma, en Raf1 is inactief. Blue-light stimulatie induceert CRY2-CIBN binding en rekruteert Raf1 aan het plasmamembraan, waar Raf1 geactiveerd is. Raf activering stimuleert een Raf / MEK / ERK signalering cascade. Beide CRY2- en CIBN-fusie-eiwitten worden gecodeerd in een bicistronisch genetisch systeem. Deze strategie kan worden genegaliseerd om andere kinasen te controleren, zoals Akt, waarvan de activeringsstaat ook kan worden aangestuurd door eiwittransplicatie in cellen 39 . Dit werk bevat gedetailleerde protocollen voor de implementatie van deze optogenetische strategie bij zoogdiercelcultuRes en multicellulaire organismen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dieronderzoek is uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen die zijn vastgesteld door het Institusionele Diervoeder- en Gebruikskomitee van Illinois (IACUC) en het departement van dierlijke hulpbronnen van de Universiteit van Illinois (DAR).
1. Optogenetische Inductie van Proteïne Lokalisatie in BHK21 Mammalian Cell Culture
OPMERKING: Stappen 1.1-1.3 geven een methode om een celcultuurkamer te monteren voor beeldvorming met hoge vergrotingsdoelstellingen (bijvoorbeeld 63X of 100X), die typisch korte werkafstanden hebben. Deze doelstellingen vereisen een dunne glazen deklaag ( bijv. # 1,5, 170 μm dikte) als het beeldvormende substraat. Als alternatief kan een glasbodemcultuurcultuurschotel / -schuif gebruikt worden. In dat geval kunnen stappen 1.1-1.3 worden overgeslagen.
- Reinigen van glazen deklagen
- Plaats 30 glazen deklagen in een dekselhouder.
- Voeg in een 600 ml plastic beker 20 g detergens en 400 ml warm kraanwater toe. PlacE de beker op een magnetische roerder en roer tot alle detergent is opgelost. Verwijder het schuim met behulp van tissuepapier.
- Gebruik de bodem van een 100 mm x 15 mm Petri schotel als een spacer van de roerbalk en als oppervlak voor de deklaaghouder. Om voldoende stroom tijdens het schoonmaakproces te behouden, maak 3-4 afvoergaten in de Petri-schotel.
- Om de afvoergaten te maken, verwarm een soldeerbout en breng door het plastic in een afgedekte afzuigkap.
VOORZICHTIG: Raak het verwarmde soldeerbout niet aan met blote handen. - Plaats de dekselhouder op de Petri-schotel in de beker. Roer gedurende 2 uur gedurende de nacht bij kamertemperatuur.
- Was drie keer met 500 ml DI water in een 1.000 ml beker. De wasmiddeloplossing kan opnieuw worden gebruikt.
- Pak individuele deklips op met behulp van tang. Dompel de dekglazen in 190-proof (95%) ethanol gedurende 1 minuut.
- Droog de dekglazen in een steriele kap. Bewaar de dekglazen in een steriele plastic container tot het gebruik.
- Het maken van poly-L-lysine (PLL) -coated coverlips
- Maak 0,1 M boraatbuffer door 1,24 g boorzuur en 1,9 g dinatriumtetraboraat in 400 ml water op te lossen. Pas de pH op op 8,5 met 10 M NaOH.
- PLL losmaken in de boraatbuffer tot een uiteindelijke concentratie van 1 mg / ml. Aliquot de PLL oplossing in 50 ml steriele centrifuge buizen.
- Voeg 50 ml PLL coatingoplossing toe aan een 10 cm weefselkweekschotel. Leg de schotel in een 37 ° C incubator om de PLL-oplossing op te warmen.
- Open de deklaaghouder (stap 1.1.8) in een steriele kap.
- Dompel de gereinigde deklagen één voor één in de voorverwarmde PLL-oplossing in de weefselkweekschotel. Vermijd belvorming om alle oppervlakken te onderdompelen.
- Plaats de schotel met de deklaag in een 37 ° C CO 2 -cubator gedurende de nacht. Verwijder elke deklaag en plaats hem in een steriele deklaaghouder. Spoel drie keer uit met geautoclaveerd ultraviolet water (18,2 MΩ & #183; cm resistiviteit) in een 1.000 ml beker in een steriele kap.
- Droog de dekglazen in de dekselhouder in de steriele kap. Bewaar de dekglazen in een steriele plastic container tot het gebruik.
- Montering van polydimethylsiloxaan (PDMS) celkweekkamers
- Weeg in een plastic container 40 g PDMS base en voeg 4 g hardingsmiddel toe om een 10: 1 w / w verhouding PDMS en uithardingsmiddel te bereiken. Meng het PDMS / uithardingsmiddel door 2 minuten met een pipettip te roeren. Alternatief, gebruik een centrifugaalmenger.
- Gebruik een beker met een diameter van 4 inch als een sjabloon om een houder te maken met een stuk aluminiumfolie. Plaats de aluminiumfoliehouder in een 15 cm Petri-schotel. Plaats een 4-inch siliconenwafel in deze aluminiumfoliehouder.
- Giet de gemengde PDMS-oplossing in de houder. Gebruik een dunne glasstang om de rand van de wafel voorzichtig aan te raken. Verwijder alle luchtbellen die onder de wafel vallen.
- Steek de 15 cm Petri-schotel in een vacuümkambeR om de PDMS-oplossing te ontgassen. Blijf doorgassen gedurende ongeveer 20 minuten, tot er geen bellen worden gegenereerd. Ondertussen verwarmt u een convectieoven tot 65 ° C.
- Plaats de 15 cm Petri-schaal voorzichtig in de oven. Incubeer gedurende 2 uur.
- Verwijder de plaat uit de oven. Gebruik een glazen staaf om de rand van de PDMS voorzichtig aan te raken en zorg ervoor dat de crosslinking compleet is. Indien niet, inkubeer langer, tot de PDMS stevig en niet-kleverig is.
- Verwijder de aluminiumfolie uit de plaat en haal het af van de siliconenwafel. Begin vanaf de rand, schuur de geharde PDMS zorgvuldig af van de siliconenwafel.
VOORZICHTIG: Vermijd te veel kracht, aangezien het de wafel kan breken. - Trim de PDMS in 20 mm x 30 mm rechthoekige stukken om de 24 mm x 40 mm deklaag met een scheermesje aan te passen.
- Gebruik een beitelvormige mes om een rechthoekige opening van 10 mm x 20 mm van het midden van elk PDMS stuk te snijden.
- Maak de PDMS-kamers schoon met behulp van het in stap 1.1 beschreven wasmiddelprotocol.
- Droog de PDMS-kamers in een schone kap. Plaats de droge kamers in een autoclaverbare container bedekt met aluminiumfolie.
- Autoklaaf de container gedurende 30 minuten met behulp van zwaartekracht (121 ° C, 15 psi) en houd de houder bij kamertemperatuur op.
- BHK21 celculturen en transfectie
- Maak 500 ml medium voor BHK21 celcultuur door 445 ml DMEM te mengen met 50 ml FBS en 5 ml 100 × Penn-Strep-Glutamine (10.000 U / ml penicilline, 10 mg / ml streptomycine en 29,2 mg / ml L glutamine). Zorg ervoor dat de uiteindelijke concentratie van FBS 10% bedraagt.
- Aliquot 10 ml niet-HEPES CO 2 -afhankelijk medium voor live-cel imaging.
OPMERKING: CO 2 -afhankelijk medium ondersteunt celgroei zonder een CO 2- incubator en is ideaal voor het imaging van cellen onder atmosferische omstandigheden. Raadpleeg de materiaallijst voor gedetailleerde informatie. Naast de BHK21 cellijn, moeten andere soorten zoogdiercellen ook gevenVergelijkbare resultaten. - Monteer een celcultuurapparaat door een autoklaafde, steriele PDMS-kamer (stap 1.3) op een steriele PLL-beklede deklaag (stap 1.2) in een steriele kap te plaatsen.
- Plaats elk apparaat in een steriele 60 mm Petri schotel.
- Gebruik 0,5 ml 0,25% trypsine om de cellen los te maken van een putje van een 12-weefselkweekplaat. Tel de celdichtheid met een hemocytometer. Platte 20.000 BHK21 cellen in de kamer (ongeveer 10.000 cellen / cm2) met 200 μl celcultuurmedium.
- Bereid DNA-plasmide met een plasmidpreparatiekit (zie de Materials List).
OPMERKING: Het ontwerp en de functionaliteit van de CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX zijn weergegeven in Figuur 1A - 1B . - Vierentwintig (24) uur na celplating, transfecteer de cellen met 50-100 ng CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX plasmide volgens het protocol van de fabrikant.
- Drie (3) uur na transfectie, verander de mEdium tot 200 μl vers cultureel medium (stap 1.4.1) en laat de cellen overnacht herstellen door de cultuur in een 37 ° C, 5% CO 2 incubator te incuberen.
- Fluorescentie live-cel beeldvorming
- Zet een computer, lichtbron, microscoop en camera aan. Gebruik een confocal fluorescentiemicroscoop (uitgerust met een 100x olie-immersion-doelstelling) voor de rest van het protocol.
OPMERKING: Een omgekeerde epifluorescentiemicroscoop kan ook gebruikt worden. - Vervang het celkweekmedium met 200 μl CO 2 -dependent medium.
- Stel het data-acquisition protocol in voordat u de cellen op de microscoop plaatst. Gebruik een 488 nm excitatie FITC kanaal voor optogenetische stimulatie. Gebruik een 561 nm excitatie TRITC kanaal om getransfecteerde cellen te lokaliseren en de cellulaire lokalisatie van mCherry gelabelde eiwitten te volgen.
- Stel de gain van FITC en TRITC-kanalen in respectievelijk 120 en 200. Gebruik een pixel-residentietijd van 2.21; s en grootte van 512 x 512 pixels.
- Meet de kracht van het 488 nm licht door een stroommeter dicht bij het objectief venster te plaatsen. Een totale vermogen van 2 μW (ongeveer 10.000 W / cm2 bij de focus) is voldoende om CIBN-CRY2PHR associatie te veroorzaken.
- Stel een timestampverwerving in met een 5 s interval en een totale aanschafstijd van 2 minuten.
- Breng passend index-bijpassend materiaal aan (dompel olie) op het objectief venster. Gebruik de fase-contrast modus om te concentreren op de cellen op de deklaag oppervlak.
- Zoek een getransfecteerde cel onder 561 nm licht door het microscoop stadium te verplaatsen.
VOORZICHTIG: Vermijd het gebruik van blauw licht tijdens deze stap, aangezien het de associatie tussen foto-activeerbare eiwitten zal activeren. - Zodra een getransfecteerde cel zich bevindt, start de data-acquisitie.
OPMERKING: succesvol getransfecteerde cellen moeten fluorescentie tonen in zowel FITC (vanaf 2CIBN-GFP-CaaX) en TRITC (van CRY2-mCherry-Raf1) kanalen ( Figuur 1C-D - Record een serie van de tijdstempelbeelden in zowel de FITC- als TRITC-kanalen ( Figuur 1D ).
- Om de spontane dissociatie van het CRY2-CIBN-eiwitcomplex te detecteren, moet u een andere tijdstempel met het Txred-kanaal alleen gedurende 20 minuten opnemen, met een interval van 30 s.
- Bewaar de gestempelde afbeelding voor data-analyse.
- Zet een computer, lichtbron, microscoop en camera aan. Gebruik een confocal fluorescentiemicroscoop (uitgerust met een 100x olie-immersion-doelstelling) voor de rest van het protocol.
- Beeldanalyse
- Open de afbeeldingen met een beeldanalysesoftware die de intensiteit van een afbeelding 40 kunt uittrekken.
- Selecteer twee representatieve snapshots: één voor de blauwe belichting en de andere blootstelling na het blauwe licht.
- Trek een lijn over de cel die de achtergrond, het plasmamembraan en het cytoplasma overspant. Project de intensiteit langs deze lijn. Bewaar de waarden en plot ze uit om het verschil voor en na de lichtbelichting te vergelijken ( Figuur 1D ).
- Om de kinetiek van eiwitvereniging te analyseren, selecT een representatieve regio van belang (ROI) in het plasmamembraan, een ROI in het cytoplasma en een ROI op de achtergrond.
- Verkrijg de gemiddelde intensiteiten van het plasmamembraan (I PM ), het cytoplasma (I CYT ) en de achtergrond (I BKD ) voor de beeldstapel.
- Bereken de verhouding van membraan / cytosolische intensiteit voor elke afbeelding met behulp van de volgende vergelijking:
- Bepaal de verhouding versus de tijd en bepaal de bindings- of dissociatiekinetiek van CRY2-CIBN ( Figuur 1E -F ).
2. Constructie van een LED-array voor langdurige lichtstimulatie in een CO 2- incubator
OPMERKING: Het algemene schema van de experimentele opstelling is weergegeven in figuur 2A .
- Maak de LED-array door 12 blauwe LED's in twee broodboarden in te voegenDs en verbindende stroombegrenzende weerstanden.
OPMERKING: Met een 30 V stroomtoevoer kunnen vier LED's in serie worden aangesloten, en hun helderheid kan worden geregeld door een stroombegrenzende weerstand. - Plaats de broodplaten in een aluminium doos.
OPMERKING: De hoogte van de aluminium doos moet 2 inch zijn. Deze hoogte is optimaal voor het verlichten van een weefselkweekplaat met 12 putjes, omdat de afmeting van de uiteenlopende lichtvlek hetzelfde is als die van een enkele put. - Gebruik twee metalen draden om verbinding te maken met de voeding. Zorg ervoor dat de lengte van de draad voldoende is wanneer de lichtbox in een CO 2- incubator zit.
- Gebruik een transparante lichtdiffuser als de omslag van de lichtbox ( figuur 2C ).
- Kalibreer de stroomuitgang van elke LED op een bereik van spanningsinvoer. Gebruik een kracht van 0,2 mW / cm 2 voor de 24 h PC12-celdifferentiatiebepaling. Gebruik een kracht van 5 mW / cm 2 voor levende Xenopus embryo's of -explosiesassays.
3. Optogenetische Inductie van PC12 Cell Differentiatie
- Celculturing en transfectie
- Maak 500 ml medium voor een celkweek van een rat feochromocytoom (PC12) door 407,5 ml F12K te mengen met 75 ml paardserum + 12,5 ml FBS + 5 ml 100 × Penn-Strep-Glutamine (eindconcentraties van paardserum en FBS : Respectievelijk 15% en 2,5%). Maak laag serummedium door 1 volume vol medium in 99 volumes F12K medium te mengen.
- Plate PC12 cellen in een 12-putjesplaat met een dichtheid van 300.000 cellen / putje of 75.000 cellen / cm2.
- Transfecteer de cellen met CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX 24 uur na celplating (vergelijkbaar met stap 1.4.7). Gebruik 1,2 μg DNA voor elke bron. Laat de cellen overnacht in kweekmedium herstellen in een 37 ° C incubator aangevuld met 5% CO2. Controleer de transfectie-efficiëntie 16 uur na transfectie.
OPMERKING: een 30-50% transfectie effIciency moet worden bereikt om een voldoende celtelling te waarborgen. - Vervang het medium tot het laag-serummedium 24 uur na transfectie. Gebruik 1 ml medium per putje van een 12-putjesplaat.
- Licht geïnduceerde PC12 cel differentiatie
- Plaats de LED-array in een CO 2- incubator. Sluit het aan op de voeding met behulp van een paar draden. Stel de stroom van de LED in op 0,2 mW / cm 2 . Plaats de 12-putjesplaat met getransfecteerde PC12-cellen (stap 3.1.3) in het raam van de LED-array. Breng continu lichtverlichting gedurende 24 uur in een 37 ° C-incubator aangevuld met 5% CO2.
- Fluorescentie levende celbeelden
- Volg stappen 1.5.1-1.5.4 voor microscoop en monsterbereiding.
- Stel single-moment data acquisition. Gebruik 200 ms voor zowel het GFP als het Txred-kanaal.
- Vang afbeeldingen van de getransfecteerde cellen in zowel de GFP als de Txred-kanalen. Record ongeveer 200 celVoor elke voorwaarde. Sla de bestanden op voor data analyse.
- Beeldanalyse
- Tel het percentage gedifferentieerde cellen over het totale aantal getransfecteerde cellen.
- Gebruik een celtellermodule in de beeldanalysesoftware om de cellen te tellen.
- Tellen de gedifferentieerde cellen handmatig.
OPMERKING: Gedifferentieerde cellen zijn gedefinieerd als die waarin tenminste één neuriet onderscheidbaar langer is dan het cellichaam ( Figuur 3A -3B ). - Herhaal stap 3.4.3 met ongedifferentieerde cellen.
- Bereken de differentiatieverhouding met behulp van de volgende vergelijking:
4. Optogenetische controle van kinase-activiteit in Xenopus embryo's
- Bereiding van buffers
- Bereid 1 L van 1x Marc's Modified Ringer (MMR): 100 mMNaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2 en 5 mM HEPES; PH 7,5.
- Bereiding van mRNA
- Digest het CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX plasmide DNA (2 μg) met 1 μL ApaI (50 eenheid) bij 37 ° C gedurende 2 uur.
- Neerlinieer gel lineariseerd DNA in 60 μl 100% ethanol. Spin bij 12.000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om het DNA te pelletiseren. Verwijder de supernatant zorgvuldig en doe de pellet opnieuw met 60 μl 70% ethanol. Spin bij 12.000 × g gedurende nog 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de supernatant zorgvuldig en verwijder de DNA-pellet in 6 μl RNase-vrije H20.
- Voer in vitro transcriptie uit door 1 μg gel lineariseerd DNA te incuberen met 2 μl toegevoerd SP6 RNA polymerase, een ribonucleotide mengsel (10 mM ATP, CTP en UTP; 2 mM GTP en 8 mM cap analoog) en 20 μL nuclease- Vrij water bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Verwijder de DNA-sjabloon door DNase I-digestie gedurende tenminste 15 minuten bij 37 ° C en zuivert het gesynthetiseerde RNA met behulp van een silica-membraan spin kolom.
- Stop de reactie en precipiteer het RNA door 30 μL nuclease-vrij water en 30 μl LiCl-precipitatieoplossing toe te voegen. Meng grondig en chill 30 minuten bij -20 ° C.
- Centrifugeer bij 4 ° C gedurende 15 minuten bij 12.000 × g om het RNA te pelletiseren.
- Verwijder de supernatant zorgvuldig. Was de RNA eenmaal met 1 ml 70% ethanol en resuspendeer in 40 μl nuclease-vrij water.
- Laad 40 μL RNA in een spin kolom. Centrifugeer bij 4 ° C gedurende 1 minuut bij 12.000 × g om de niet-geïncorporeerde nucleotiden en caps te verwijderen.
- Harvest Xenopus embryo's
- Volg het protocol beschreven door Sive et al. 41 om de Xenopus embryo's te verkrijgen .
- MRNA microinjectie
- FabricerenDe naalden voor microinjectie door glazen capillairen met een capillaire trekker te trekken. Stel het trekprogramma in op: warmte = 355, treksterkte = 80, snelheid = 50 en tijd = 100.
- Verwijder de jelly coat van de embryo's door ze te behandelen met 3% cysteïne (verdund in 0.2x MMR).
- Breng de embryo's over naar 3% polysucrose en 0,5x MMR oplossing voor microinjectie. Spuit 500 pg aan 1 ng CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX RNA in elk embryo.
OPMERKING: Injectie van een dosis hoger dan 1 ng resulteert in blauwe lichtonafhankelijke activering van de MAPK-signalering.
- Optogenetische stimulatie van kinase activiteit
- Cultuur microinjectie embryo's in 3% polysucrose, 0,5x MMR oplossing bij kamertemperatuur tot ze het middel gastrula stadium bereiken (fase 12). Vervolgens kweek de embryo's in 0,2x MMR-oplossing.
- Breng de embryo's of explanteren naar een 12-putjesplaat. Plaats de 12-putjesplaat op de huisgebouwde LED-array (stap 2.5) voor blauwlichtT (475 nm) behandeling.
- Plaats een spiegel op de bovenkant van de 12-putjesplaat om volledige bloemblaadjes te verlichten van de embryo's of explanteren.
- Stel de kracht van het blauwe licht in op 5 mW / cm 2 .
OPMERKING: Blauwlichtbehandeling kan op elk gewenst moment worden uitgevoerd, in 3% polysucrose, 0,5x MMR oplossing of 0,2x MMR oplossing. - Oog de embryo's op elk gewenst moment. Gebruik ze voor histologische, Western-blot- of gen-expressie-analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ratiometrische expressie van fotoactivatabele eiwitparen: Figuur 1A toont het ontwerp van een bicistronisch optogenetisch construct, CRY2-mCherry-Raf1-P2A-CIBN-CIBN-GFP-CaaX (aangeduid als CRY2-2A-2CIBN), gebaseerd op de porcine teschovirum- 1 2A (P2A) peptide, dat de hoogste ribosom-overspringende efficiëntie onder zoogdiercellijnen 42 toont. In eerdere werkzaamheden is vastgesteld dat de optimale verhouding voor CIBN-GFP-CaaX: CRY2-mCherry-Raf1 2: 1 is 35 . Deze configuratie zorgt voor voldoende membraan werving en activatie van CRY2-mCherry-Raf1 ( Figuur 1B ). Cellen die met CRY2-2A-2CIBN worden getransfecteerd, tonen duidelijke fluorescentie in zowel de GFP als Txred fluorescentiekanalen, ofwel onder epi-verlichting ( Figuur 1C ) of confocale microscopie ( Figuur 1D ). Blauwe lichtgemedieerde membraanNe-werving van CRY2-mCherry-Raf1 ( Figuur 1D ) kan duidelijk worden gedetecteerd in confocale microscopie. De associatie gebeurt binnen enkele seconden na blootstelling aan blauwe licht ( Figuur 1E ) en het CRY2-CIBN eiwitcomplex dissocieert met een halveringstijd van ongeveer 5,5 minuten ( Figuur 1F ).
Lichte-gecontroleerde PC12-celdifferentiatie bij afwezigheid van zenuwgroeifactor: een intrigerende waarneming in groeifactor-signalering is dat gemeenschappelijke stroomafwaartse signaleringstrajecten ( bv. ERK, PI3K-Akt en PLCy) diversiteit en specificiteit in signaleringsresponsen veroorzaken. Een beter begrip van groeifactor-gemedieerde signalering kan worden bereikt door technologie mogelijk te maken die de precieze spatotemporale regulering van individuele cascades mogelijk maakt. De optogenetische aanpak die in dit protocol wordt geïntroduceerd, toont een dergelijke technologie die de specifieke activatie mogelijk maaktN van de Raf / MEK / ERK signaalweg met hoge temporale resolutie. Omdat deze aanpak het proces van NGF-binding aan zijn membraanreceptoren overschrijdt, hangt de signaleringskinetiek niet meer af van de endogene receptoren. In plaats daarvan kan nauwkeurige kinetische controle worden bereikt door het temporale profiel van het stimulerende licht te moduleren ( Figuur 2A ). Zo biedt deze aanpak nieuwe mogelijkheden om de signaleringskinetiek van kinase-activiteit te bestuderen. Bovendien biedt deze experimentele opstelling een extreem eenvoudige en economische manier om de optogenetische aanpak te integreren in studies van intracellulaire signaaltransductie ( Figuur 2B -2D ). Voor de PC12-celdifferentiatiebepaling is een 24-u-continu-lichte stimulatie bij 0,2 mW / cm2 voldoende om significante neurietgroei te veroorzaken ( Figuur 3A ). Negatieve controles, inclusief getransfecteerde cellen zonder licht ( Figuur 3B) en niet-getransfecteerde cellen met of zonder licht ( Figuur 3C -3D ), tonen geen significante neurietgroei. Bij deze kracht worden cellen getransfecteerd met een constitutief actieve Raf1 (CA-Raf1) onderworpen aan normale differentiatie ( Figuur 3E ). Met name, cellen die met het bicistronische optogenetische construct zijn getransfecteerd, produceren een significant hogere differentieringsverhouding dan cellen die zijn gecranstransfecteerd met twee constructen, waardoor de waarde wordt geïnduceerd door CA-Raf1 ( Figuur 3F ). De differentiatieverhouding wordt berekend door het aantal gedifferentieerde cellen te verdelen door het aantal getransfecteerde cellen geleid door GFP-fluorescentie. Gedifferentieerde cellen worden gedefinieerd als die met ten minste één neuriet langer dan de grootte van het cellichaam 35 . Deze verbetering in de differentiatieverhouding komt voort uit: 1) een betere aflevering van fotoactivatabele eiwitten met het bicistronische systeem en 2) een opGetimede expressieverhouding tussen CIBN en CRY2 35 .
De reversibele optogenetische stimulatie van de Raf / MEK / ERK signalering weg in levende Xenopus laevis embryo's: X. laevis is een gevestigd model organisme voor het bestuderen van gentranscriptie, signaaltransductie en embryonale ontwikkeling. Vorige werk ontdekte dat de activatie van de Raf / MEK / ERK-weg leidt tot een celfateverandering, wat resulteert in de vorming van een ectopische staartachtige structuur in het tailbud stadium 43 . Als een krachtige mesoderminducer kan overexpressieerde Raf1 ectopische mesoderm induceren tijdens de kiemlaagspecificatie, die zich voordoen tijdens de blastula en de vroege gastrulaplaatsen, en resulteert later in de vorming van ectopische staartachtige structuren. Als alternatief kan overexpresseerde Raf1 een epitheliale-mesenchymale overgang (EMT) -gelijk evenement veroorzaken nadat de kiemlaagspecificatie is voltooid en direct kanTransformeer ectoderm naar neurale en mesodermlijnen. Dit wordt gevolgd door de proliferatie en uitbreiding van deze structuren 43 . In deze experimenten werden RNA's die coderen voor MET-receptor, Ras en Raf1 geïnjecteerd in embryo's in het twee-cel stadium. Kort nadat het RNA in het embryo werd geïnjecteerd, begon de overexpressieerde MET / Ras / Raf1 de stroomafwaartse signalerende cascades constitutief te activeren. Daarom was het technisch uitdagend om vroege ontwikkelingsstadia te omzeilen en Raf1 te activeren, specifiek na de kiemlaagspecificatie. Het was onmogelijk om een dergelijke strategie te gebruiken om te bepalen of de activering van de Raf / MEK / ERK-signalering na de kiemlaagspecificatie een verandering in het celfate zou veroorzaken, wat leidt tot de vorming van de ectopische staartachtige structuur.
Optogenetics biedt een mechanisme om de timing van de Raf1-activiteit te controleren. Toen het RNA van CRY2-2A-2CIBN in vroege ontwikkelingsstadium in embryo's werd geïnjecteerdS, Raf1 bleef inactief totdat blauw licht werd geleverd. De dierlijke cap assay werd gemakkelijk gebruikt om de signaleringsuitkomst te karakteriseren, omdat de basale ERK activiteit laag in dierlijke caps heeft. De lichtgemedieerde activering van de Raf / MEK / ERK signaleringscascade veroorzaakte een significante upregulatie van xbra, een mesodermale marker, zoals bepaald door RT-PCR ( Figuur 4A ) of in volledige hybridisatie in situ hybridisatie ( Figuur 4B ). Dynamische veranderingen in de fosforylering van ERK in reactie op blauw licht werden ook gedetecteerd door Western-blot analyse ( Figuur 4C ). In volledige embryo's werd een mengsel van CRY2-2A-2CIBN en n-P-gal RNA geïnjecteerd in het 8-cel stadium in een van de dorsale dierblastomeren, die later aanleiding geven tot het dorsale anterior weefsel. Vergeleken met onbehandelde embryo's ( Figuur 4D -4E ), die geïnjecteerd met CRY2-2A-2CIBN en behandeld met blauw licht voorMed ectopische staartachtige structuren ( Figuur 4F -4G ). Injecteerde embryo's in het donker ( Figuur 4H ) of niet geïnjecteerd onder blauwlichtverlichting ( Figuur 4I ) vormden geen staartachtige structuur. Blauwlichtverlichting na kiemlaagspecificatie induceerde significante staartachtige structuren ( Figuur 4J ).
Figuur 1: Het mechanisme van licht geïnduceerde eiwit lokalisatie en activatie van de kinase signalering route. ( A ) Ontwerp van een bicistronisch construct, met een geoptimaliseerde CIBN-naar-CRY2-verhouding (2 CIBN: 1 CRY2) die de lichtinduceerde activatie van de Raf / MEK / ERK kinase signaalweg mogelijk maakt. Bij ribosomale overspringen produceert één mRNA transcript twee eiwitten: CRY2-mCherry-Raf1-N2A (eindigendeMet aminozuren NPG) en proline-2CIBN-GFP-CaaX. ( B ) Lichtgeïnduceerde binding tussen CIBN en CRY2 leidt tot membraanaanwerving van CRY2-mCherry-Raf1, die de Raf / MEK / ERK signaalweg activeert. ( C ) Fluorescentiebeelden van BHK21-cellen getransfecteerd met CRY2-2A-2CIBN onder epi-verlichting. Schaalbalk: 20 μm. ( D ) Confocal fluorescentie beeldvorming van cellen getransfecteerd met CRY2-2A-2CIBN. Het linker paneel toont gesplitste 2CIBN-GFP-CaaX gelokaliseerd op het plasmamembraan; Het middenpaneel toont een momentopname van CRY2-mCherry-Raf1 voor de blauwe lichtstimulatie; Het rechterpaneel toont een momentopname van CRY2-mCherry-Raf1 na 10 pulsen van blauwlichtstimulatie. Het onderste paneel toont genormaliseerde intensiteitsprofielen langs een gele stippellijn over de cel, voor en na lichtstimulatie. Schaalbalk = 20 μm. ( E - F ) Kinetiek voor licht geïnduceerde CRY2-CIBN associatie ( E ) en spontane dissociatieN ( F ) van het CRY2-CIBN eiwitcomplex in het donker. Figuur 1A- B werd aangepast uit referentie 35 , gereproduceerd met de toestemming van de Vennootschap van Biologen. Figuur 1E -F is aangepast vanaf referentie 44 onder de Creative Commons Attribution (CC BY) licentie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Ontwerp en kalibratie van de in huis gebouwde LED-array. ( A ) Schematisch van de experimentele opstelling voor de licht gecontroleerde kinase activiteit in levende cellen. ( B ) Circuit board voor de home-built LED array. ( C ) een ligHt box die gebruikt kan worden voor langdurige lichtstimulatie in een CO 2 incubator. De hoogte van de aluminium doos is 2 inch. ( D ) Typische LED-uitgangsspanning versus spanning. Waarde licht vermogen per LED in een circuit waarin een stroombegrenzende weerstand en vier LED's in serie zijn aangesloten. Figuur 2A is aangepast uit referentie 35 , gereproduceerd met de toestemming van het bedrijf van biologen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Optogenetische inductie van PC12-celdifferentiatie. ( A ) Multi-kanaal snapshots van PC12 cellen getransfecteerd met CRY2-2A-2CIBN na 24 uur blauwe licht stimulatie (0,2 mW / cm 2 ). Een cIrcle markeert een gedifferentieerde cel. Een vierkant markeert een ongedifferentieerde cel. ( B ) Zelfde als ( A ), behalve dat er geen blauwe lichtstimulatie werd gebruikt. ( C - D ) Niet-getransfecteerde PC12-cellen onder 24 uur blauwe lichtstimulatie (0,2 mW / cm2) ( C ) of donkere incubatie ( D ). ( E ) Representatieve beelden van cellen getransfecteerd met Raf1-GFP-CaaX (CA-Raf1). De cirkel en rechthoek merken onderscheiden en ongedifferentieerde cellen respectievelijk. ( F ) Differentiatieverhoudingen van PC12-cellen getransfecteerd met CA-Raf1, gecotransfecteerd met CRY2-mCherry-Raf1 en CIBN-GFP-CaaX, en enkel getransfecteerd met CRY2-2A-2CIBN. 24 uur na transfectie werden cellen gedurende 24 uur aan het licht blootgesteld of in het donker geïncubeerd. De waarden vertegenwoordigen de gemiddelde ± SD uit vier onafhankelijke datasets. Alleen cellen die aan blauw licht werden blootgesteld, vertoonden significante differentiatie. Figuur 3FWerd aangepast uit referentie 35 , gereproduceerd met toestemming van de Vennootschap van Biologen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Optogenetische inductie van kinase activiteit in levende Xenopus embryo's. ( A ) RT-PCR-resultaten die aantonen dat blootstelling aan blauw licht de expressie van xbra, een pan-mesodermale marker, in CRY2-2A-2CIBN-geïnjecteerde dierenkappen in het vroege gastrula stadium veroorzaakte. ( B ) Whole-mount in situ hybridisatie van xbra in embryo's. Licht geïnduceerde activering van MAPK-activiteit moduleert de ruimtelijke verdeling van xbra (rode pijlen in het rechter onderpaneel ). Zwarte pijlen markeren nucleaire β-gaLactosidase als de lijntracer. AP: dierenpaal. VP: vegetale pole. ( C ) Western-blot analyse waaruit blijkt dat, in een dierlijke cap assay, CRY2-2A-2CIBN blauwe licht-afhankelijke, reversibele fosforylering van ERK geïnduceerde. ( D ) Beelden die de morfologie van normale embryo's tonen, zonder mRNA-injectie en zonder lichte behandelingen. ( E ) Een ingezoomd beeld van een enkel embryo. ( F - G ) Inzoomen en volledige veldbeelden voor embryo's geïnjecteerd met CRY2-2A-2CIBN mRNA en onderworpen aan blauwlichtstimulatie. Activatie van Raf1 door behandeling van CRY2-2A-2CIBN-geïnjecteerde embryo's met blauw licht induceert ectopische staartachtige structuren in het hoofdgebied. ( H - I ) Negatieve controles, met inbegrip van embryo's geïnjecteerd met CRY2-2A-2CIBN, maar onder donkere incubatie ( H ) en niet geïnjecteerde embryo's onder lichtstimulatie ( I ). Alle lichte stimulatie experimenten werden uitgevoerd met een vermogen van 5 mW / cm <Sup> 2. ( J ) Statistische analyse van het percentage embryo's die ectopische staartachtige structuur onder elke conditie tonen. Schaalbalk = ( D ) en ( G ): 1 mm; ( E - F ) en ( H - I ) 0,5 mm. Figuur 4A , C , E - F en H - J werden aangepast uit referentie 35 , gereproduceerd met toestemming van de Vennootschap van Biologen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bij het bouwen van de lichtbox moet de stroom van individuele LED's worden gemeten. Op basis van eerdere ervaringen kan de stroomuitgang variëren tussen individuele LED's door de fabricagevariantie. Selecteer een set LED's die een stroomuitgang hebben binnen 10% van elkaar. Het aantal LED's, de stroombegrenzende weerstand en de voedingsingang kunnen worden aangepast voor verschillende soorten celcultuurcontainers (bijvoorbeeld een 6-put of een 24-putje plaat). Een 24 uur lichtverlichting bij een vermogen van 0,2 mW / cm2 veroorzaakt geen detecteerbare fototoxiciteit 44 . Als er een hogere stroom wordt gebruikt, overweeg het gebruik van intermitterend licht om warmteopwekking en fototoxiciteit te verminderen. Het optogenetische systeem dat in dit protocol wordt geïntroduceerd, induceert neurietgroei in PC12 cellen onder intermitterende lichtstimulatie die vergelijkbaar is met die van continue lichtstimulatie, aangezien het donker interval tussen de twee aangrenzende lichtimpulsen minder is dan 45 min 44 . Ten gevolgeNaar intrinsieke verschillen in de kinetiek van eiwitvereniging en dissociatie, moet de duur tussen lichtpulsen worden afgestemd op elk uniek eiwitpaar. Overexpressie van cytosolische Raf1 veroorzaakt geen PC12-celdifferentiatie zonder blauwlichtverlichting. Door de hoeveelheid mRNA geïnjecteerd in elk embryo te beheersen, werden geen significante embryonale fenotypes in het donker waargenomen.
Hoewel een lage-energie blauw licht voldoende is om de associatie van CRY2- en CIBN-fusie-eiwitten te stimuleren, beperkt de arme penetratiediepte van blauw licht zijn gebruik bij diepe weefselstimulatie. Hoewel dergelijke stimulatie is bereikt door het leveren van licht via andere apparaten (bijvoorbeeld glasvezel), zijn de benaderingen invasieve 45 . Dit probleem kan op twee manieren worden aangepakt: door gebruik te maken van een eiwitpaar dat reageert op een langere golflengte (bijvoorbeeld het fytochroom-PIF6-eiwitpaar) of door gebruik te maken van twee-foton-excitatie. Beide benaderingen kunnen diep zorgenPenetratie, maar ze kunnen last hebben van andere beperkingen. Bijvoorbeeld, het PhyB-PIF6 paar vereist een synthetische cofactor om te functioneren, en twee-foton microscopie kost dure instrumentatie. Het gebrek aan afstemming in de CRY2-CIBN-interactie is een andere beperking om te overwegen. Wild type CRY2 dissocieert spontaan van CIBN met een halveringstijd van 5,5 min in het donker 34 . Afhankelijk van de kinetiek van de doelmeldingsweg kan een verkorte of langdurige dissociatiehalfwaardetijd de voorkeur hebben. Mutaties in CRY2 zijn gemaakt die de dissociatiehalfwaardetijd tot 2,5 minuten (W349R) kunnen verkorten of verlengen tot 24 minuten (L348F) 46 . Als alternatief kunnen op basis van schimmelfreceptor Vivid (VVD) en p / nMagFast1 en 2 gefabriceerde fotoactivatabele eiwitparen een halfwaardetijd van dissociatie van 4,2 minuten en 25 s respectievelijk 47 tonen . In dit protocol draait het wildtype CRY2-CIBN eiwitpaar de MAPK-weg binnen 5 minuten van de lichtstraalMulatie, en de activiteit viurt binnen 30 minuten terug naar het basale niveau in zoogdiercellen 44 en 1-2 uur in Xenopus embryo's 35 . Voor ruimtelijke controle kan de confocal microscopie de blauwe laser concentreren op de grootte van een diffractiegrenspunt van ongeveer 200 nm in het beeldvlak. Door de grootte van het velddiagram in een epi-verlichtingsmicroscoop aan te passen die is uitgerust met een niet-coherente lichtbron, is het mogelijk om de verlichtingsgrootte te beperken tot ongeveer 10 μm in diameter. Beide methoden zouden de subcellulaire controle van optogenetische stimulatie in celculturen kunnen bereiken.
Het vermogen van optogenetica om signaaltransductie met een hoge ruimtelijke en temporale resolutie omkeerbaar te ondervragen, biedt een geheel nieuwe mogelijkheid om dynamische intracellulaire signalering in levende cellen te bestuderen. Resultaten van dit protocol hebben aangetoond dat de activatie van Raf1 voornamelijk verantwoordelijk is voor de inductie van neuronale differentiatie in PC12 cellen 44 . Dezelfde weg veroorzaakt ook de vorming van secundaire staartachtige structuren bij het ontwikkelen van Xenopus embryo's. Door de timing van Raf1-activering te regelen, kan de staartachtige structuur worden geïnduceerd na het stadium van kiemlaagvorming 35 . De onlangs beschreven LOVTRAP-methode maakt gebruik van twee gemanipuleerde eiwitten, Zdark en LOV2, die selectief alleen in het donker aan elkaar binden om de licht geïnduceerde dissociatie van een interessant eiwit (POI) 48 te moduleren. In tegenstelling tot lichtgemedieerde eiwit-eiwit associatie, die in deze benadering wordt gebruikt, gebruikt LOVTRAP licht om eiwitdissociatie induceren. Deze nieuwe modaliteit is flexibeler bij modulerende eiwit lokalisatie en activiteit in levende cellen. Door de modus van activatie zorgvuldig te kiezen binnen een signaalcascade, is het mogelijk om signaaltransductie op onconventionele manieren te ontleden. Het is bijvoorbeeld mogelijk om receptor tyrosine kinasen zonder l te activerenIgand-receptor binding 49 of het induceren van een subset van ligand-opgewekte signalerende cascades 44 . De hier gerapporteerde strategie kan worden genegaliseerd om andere kinasen te controleren, zoals Akt 39 en GTPases ( bijv. Rho GTPase), waarvan de activatietoestanden ook kunnen worden aangestuurd door proteïne-translocatie. Optogenetica zal blijven toepassen op multicellulaire organismen, zoals aangetoond door recente werken met de optogenetische controle van eiwit lokalisatie en signalering in Drosophila 50 , zebravis 51 , 52 , 53 , 54 en Xenopus embryo's 35 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Universiteit van Illinois in Urbana-Champaign (UIUC) en de National Institutes of Health (NIGMS R01GM111816).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass coverslip | VWR | 48393 230 | Substrate for live cell imaging |
| Coverslip holder | Newcomer Supply | 6817B | Holder for coverslips |
| Detergent | ThermoFisher | 16 000 104 | For cleaning coverslips |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768-500G | For making PLL buffer |
| Disodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 71996-250G | For making PLL buffer |
| Plastic beaker | Nalgene | 1201-1000 | For cleaning coverslips |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465-2.5KG | For adjust pH |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1274-500MG | For coating coverslip |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC)-Treated Water | ThermoFisher Scientific | 750024 | For DNA preparation |
| Cover Glass Forceps | Ted Pella | 5645 | Cover glass handling |
| Tissue cutlure dish | Thermofisher | 12565321 | Cell culture dish |
| Sterile centrifuge tubes | ThermoFisher | 12-565-271 | Buffer storage |
| Transfection Reagent | ThermoFisher | R0534 | Transfection |
| CO2-independent medium | ThermoFisher | 18045088 | For live cell imaging |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | Form make cell chamber |
| Plasmid Maxiprep kit | Qiagen | 12965 | Plasmid preparation |
| DMEM medium | ThermoFisher | 11965-084 | Cell culturing medium component |
| F12K medium | ThermoFisher | 21127022 | Cell culturing medium component |
| Horse serum | ThermoFisher | 16050122 | Cell culturing medium component |
| Fetal Bovine Serum | Signa-Aldrich | 12303C-500 mL | Cell culturing medium component |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | ThermoFisher | 10378016 | Cell culturing medium component |
| Trypsin (0.25%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 15050065 | For mammalian cell dissociation |
| Agarose | Fisher Scientific | BP1356-100 | For DNA preparation |
| Ficoll PM400 | GE Heathcare Life Sciences | 17-5442-02 | For embryo buffer |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | 1.02839.0025 | Oocyte preparation |
| ApaI | ThermoFisher | FD1414 | For linearization of plasmids |
| Dnase I | ThermoFisher | AM2222 | For removing DNA template in the in vitro transcription assay |
| Index-match materials (immersion oil) | Thorlabs | MOIL-20LN | For matching the index between sample substrate and objective |
| Blue LED | Adafruit | 301 | Light source for optogenetic stimulation |
| Resistor kit | Amazon | EPC-103 | current-limiting resistor |
| Aluminum boxes | BUD Industries | AC-401 | light box |
| BreadBoard | Jekewin | 837654333686 | For making LED array |
| Hook up Wire | Electronix Express | 27WK22SLD25 | For making LED array |
| Relay Module | Jbtek | SRD-05VDC-SL-C | For intermittent light control |
| DC Power Supply | TMS | DCPowerSupply-LW-(PS-305D) | Power supply for LED |
| Silicon Power Head | Thorlabs | S121C | For light intensity measurement |
| Power meter | Thorlabs | PM100D | For light intensity measurement |
| Microscope | Leica Biosystems | DMI8 | For live cell imaging |
| BioSafety Cabinet | ThermoFisher | 1300 Series A2 | For mammalian cell handling |
| CO2 incubator | ThermoFisher | Isotemp | For mammalian cell culturing |
| Stereo microscope | Leica | M60 | For embryo micro-manipulation |
| Microinjector | Narishige | IM300 | For embryo microinjection |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P87 | Needle puller |
| in vitro transcription kit | ThermoFisher | AM1340 | For in vitro transcription. The kit includes nuclease-free water, SP6 RNA Polymerase, ribonucleotide mixture, cap analog, lithium choride precipitation solution, and spin column |
| RNA purfication kit | Qiagen | 74104 | Silica-membrane spin column for purification of synthesized RNA |
| Convection oven | MTI corporation | EQ-DHG-9015 | PDMS curing |
| Centrifugal mixer and teflon container | THINKY | AR310 | For mixing PDMS |
| Silicon wafer | UniversityWafer | 452 | Base for making PDMS devices |
| Blade | Techni Edge | 01-801 | For cutting PDMS |
| Capillary glass | Sutter Instruments | BF100-58-10 | For fabrication of injecting needles. |
References
- Schlessinger, J., Ullrich, A. Growth factor signaling by receptor tyrosine kinases. Neuron. 9 (3), 383-391 (1992).
- Thisse, B., Thisse, C. Functions and regulations of fibroblast growth factor signaling during embryonic development. Dev Biol. 287 (2), 390-402 (2005).
- Perrimon, N., Pitsouli, C., Shilo, B. Z. Signaling mechanisms controlling cell fate and embryonic patterning. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (8), a005975 (2012).
- Salles, F. H., et al. Mental disorders, functional impairment, and nerve growth factor. Psychol Res Behav Manag. 10, 9-15 (2017).
- Basson, M. A. Signaling in cell differentiation and morphogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (6), (2012).
- Schohl, A., Fagotto, F. beta-catenin, MAPK and Smad signaling during early Xenopus development. Development. 129 (1), 37-52 (2002).
- Zhang, S. W., Li, J. J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signalling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis. PloS one. 8 (11), e79469 (2013).
- Sweeney, C., et al. Growth factor-specific signaling pathway stimulation and gene expression mediated by ErbB receptors. J Biol Chem. 276 (25), 22685-22698 (2001).
- Marshall, C. J. Specificity of receptor tyrosine kinase signaling: transient versus sustained extracellular signal-regulated kinase activation. Cell. 80 (2), 179-185 (1995).
- Vandergeer, P., Hunter, T., Lindberg, R. A. Receptor Protein-Tyrosine Kinases and Their Signal-Transduction Pathways. Annu Rev Cell Biol. 10, 251-337 (1994).
- Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
- Hunter, T. Signaling--2000 and beyond. Cell. 100 (1), 113-127 (2000).
- Qiu, M. S., Green, S. H. PC12 cell neuronal differentiation is associated with prolonged p21ras activity and consequent prolonged ERK activity. Neuron. 9 (4), 705-717 (1992).
- Ji, Y., et al. Acute and gradual increases in BDNF concentration elicit distinct signaling and functions in neurons. Nat Neurosci. 13 (3), 302-309 (2010).
- Luby-Phelps, K. Cytoarchitecture and physical properties of cytoplasm: volume, viscosity, diffusion, intracellular surface area. Int Rev Cytol. 192, 189-221 (2000).
- Sauer, B. Inducible gene targeting in mice using the Cre/lox system. Methods-a Companion to Methods in Enzymology. 14 (4), 381-392 (1998).
- Ling, M. M., Robinson, B. H. Approaches to DNA mutagenesis: an overview. Anal Biochem. 254 (2), 157-178 (1997).
- Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. Animal transgenesis: an overview. Brain Struct Funct. 214 (2-3), 91-109 (2010).
- Wanka, F., et al. Tet-on, or Tet-off, that is the question: Advanced conditional gene expression in Aspergillus. Fungal Genet Biol. 89, 72-83 (2016).
- Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nat Biotechnol. 28 (7), 743-747 (2010).
- Liu, Q. Y., Deiters, A. Optochemical Control of Deoxyoligonucleotide Function via a Nucleobase-Caging Approach. Accounts of Chemical Research. 47 (1), 45-55 (2014).
- Arbely, E., Torres-Kolbus, J., Deiters, A., Chin, J. W. Photocontrol of tyrosine phosphorylation in mammalian cells via genetic encoding of photocaged tyrosine. J Am Chem Soc. 134 (29), 11912-11915 (2012).
- Gautier, A., Deiters, A., Chin, J. W. Light-activated kinases enable temporal dissection of signaling networks in living cells. J Am Chem Soc. 133 (7), 2124-2127 (2011).
- Nguyen, D. P., et al. Genetic Encoding of Photocaged Cysteine Allows Photoactivation of TEV Protease in Live Mammalian Cells. J Am Chem Soc. 136 (6), 2240-2243 (2014).
- Deisseroth, K. Optogenetics. Nat Methods. 8 (1), 26-29 (2011).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Banghart, M., Borges, K., Isacoff, E., Trauner, D., Kramer, R. H. Light-activated ion channels for remote control of neuronal firing. Nat Neurosci. 7 (12), 1381-1386 (2004).
- Zhang, K., Cui, B. Optogenetic control of intracellular signaling pathways. Trends in Biotechnology. 33 (2), 92-100 (2015).
- Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (8), 551-558 (2014).
- Kim, B., Lin, M. Z. Optobiology: optical control of biological processes via protein engineering. Biochemical Society Transactions. 41 (5), 1183-1188 (2013).
- Tucker, C. L. Manipulating cellular processes using optical control of protein-protein interactions. Prog Brain Res. 196, 95-117 (2012).
- Toettcher, J. E., Gong, D. Q., Lim, W. A., Weiner, O. D. Light Control of Plasma Membrane Recruitment Using the Phy-Pif System. Method Enzymol. 497, 409-423 (2011).
- Zoltowski, B. D., Gardner, K. H. Tripping the light fantastic: blue-light photoreceptors as examples of environmentally modulated protein-protein interactions. Biochemistry. 50 (1), 4-16 (2011).
- Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nat Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
- Krishnamurthy, V. V., et al. Reversible optogenetic control of kinase activity during differentiation and embryonic development. Development. 143 (21), 4085-4094 (2016).
- Liu, H., et al. Photoexcited CRY2 Interacts with CIB1 to Regulate Transcription and Floral Initiation in Arabidopsis. Science. 322 (5907), 1535-1539 (2008).
- Li, X., et al. Arabidopsis cryptochrome 2 (CRY2) functions by the photoactivation mechanism distinct from the tryptophan (trp) triad-dependent photoreduction. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20844-20849 (2011).
- Leevers, S. J., Paterson, H. F., Marshall, C. J. Requirement for Ras in Raf Activation Is Overcome by Targeting Raf to the Plasma-Membrane. Nature. 369 (6479), 411-414 (1994).
- Kohn, A. D., Takeuchi, F., Roth, R. A. Akt, a pleckstrin homology domain containing kinase, is activated primarily by phosphorylation. J Biol Chem. 271 (36), 21920-21926 (1996).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6 (4), e18556 (2011).
- Ishimura, A., et al. Oncogenic Met receptor induces ectopic structures in Xenopus embryos. Oncogene. 25 (31), 4286-4299 (2006).
- Zhang, K., et al. Light-Mediated Kinetic Control Reveals the Temporal Effect of the Raf/MEK/ERK Pathway in PC12 Cell Neurite Outgrowth. PloS one. 9 (3), e92917 (2014).
- Mohanty, S. K., Lakshminarayananan, V.
- Taslimi, A., et al. Optimized second-generation CRY2-CIB dimerizers and photoactivatable Cre recombinase. Nature chemical biology. 12 (6), 425-430 (2016).
- Kawano, F., Suzuki, H., Furuya, A., Sato, M. Engineered pairs of distinct photoswitches for optogenetic control of cellular proteins. Nat Commun. 6, 6256 (2015).
- Wang, H., et al. LOVTRAP: an optogenetic system for photoinduced protein dissociation. Nat Methods. 13 (9), 755-758 (2016).
- Chang, K. Y., et al. Light-inducible receptor tyrosine kinases that regulate neurotrophin signalling. Nat Commun. 5, 4057 (2014).
- Boulina, M., Samarajeewa, H., Baker, J. D., Kim, M. D., Chiba, A. Live imaging of multicolor-labeled cells in Drosophila. Development. 140 (7), 1605-1613 (2013).
- Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, C.
- Buckley, C. E., et al. Reversible Optogenetic Control of Subcellular Protein Localization in a Live Vertebrate Embryo. Dev Cell. 36 (1), 117-126 (2016).
- Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature chemical biology. 10 (3), 196-202 (2014).
- Beyer, H. M., et al. Red Light-Regulated Reversible Nuclear Localization of Proteins in Mammalian Cells and Zebrafish. ACS Synth Biol. 4 (9), 951-958 (2015).
