Modulation réversible médiée par la lumière du pathogène protéinique Kinase activé par Mitogen pendant la différenciation cellulaire et<em&gt; Xenopus</em&gt; Développement embryonnaire

Vishnu V. Krishnamurthy; Aurora J. Turgeon; John S. Khamo; Payel Mondal; Savanna R. Sharum; Wenyan Mei; Jing Yang; Kai Zhang

doi:10.3791/55823

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Article de méthode

Modulation réversible médiée par la lumière du pathogène protéinique Kinase activé par Mitogen pendant la différenciation cellulaire et

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DOI :

10.3791/55823

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15 juin 2017

Vishnu V. Krishnamurthy^*¹ , Aurora J. Turgeon^*² , John S. Khamo¹ , Payel Mondal¹ , Savanna R. Sharum¹ , Wenyan Mei² , Jing Yang² , Kai Zhang¹^,³^,⁴

¹Department of Biochemistry, University of Illinois at Urbana-Champaign, ²Department of Comparative Biosciences, University of Illinois at Urbana-Champaign, ³Neuroscience Program, University of Illinois at Urbana-Champaign, ⁴Center for Biophysics and Quantitative Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign

^* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une stratégie opto-génétique pour moduler l'activité de la protéine kinase activée par mitogène (MAPK) pendant la différenciation cellulaire et le développement embryonnaire de Xenopus . Cette méthode permet l'activation réversible de la voie de signalisation MAPK dans la culture de cellules de mammifères et dans les organismes vivants multicellulaires, comme les embryons de Xenopus , avec une résolution spatiale et temporelle élevée.

Résumé

L'activité de la kinase est cruciale pour une pléthore de fonctions cellulaires, y compris la prolifération cellulaire, la différenciation, la migration et l'apoptose. Au début du développement embryonnaire, l'activité kinase est très dynamique et répandue dans l'embryon. Les approches pharmacologiques et génétiques sont couramment utilisées pour sondage des activités kinase. Malheureusement, il est difficile d'obtenir une résolution spatiale et temporelle supérieure en utilisant ces stratégies. En outre, il n'est pas possible de contrôler l'activité kinase de manière réversible dans les cellules vivantes et les organismes multicellulaires. Une telle limitation reste un goulet d'étranglement pour obtenir une compréhension quantitative de l'activité kinase pendant le développement et la différenciation. Ce travail présente une stratégie opto-génétique qui profite d'un système bicistronique contenant des protéines photoactivables Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) et le domaine N-terminal de l'hélice-hélice-hélice basique interagissant avec le cryptochrome (CIBN). ReversiL'activation de la voie de signalisation de la protéine kinase activée par mitogène (MAPK) est obtenue grâce à une translocation de protéines à médiation légère dans des cellules vivantes. Cette approche peut être appliquée aux cultures cellulaires de mammifères et aux embryons de vertébrés vivants. Ce système bicistronique peut être généralisé pour contrôler l'activité d'autres kinases avec des mécanismes d'activation similaires et peut être appliqué à d'autres systèmes modèles.

Introduction

Les facteurs de croissance sont impliqués dans un large éventail de fonctions cellulaires, y compris la prolifération, la différenciation, la migration et l'apoptose, et jouent un rôle central dans de nombreux événements biologiques, y compris le développement embryonnaire, le vieillissement et la régulation de l'état mental ¹ ^, ² ^, ³ ^, ⁴ ^, ⁵ . De nombreux facteurs de croissance signalent des cascades de signalisation intracellulaire complexes. Ces événements de signalisation sont souvent opérés pa....