Summary
والهدف من هذا البروتوكول هو الخطوط العريضة لجمع ومعالجة العينات الجراحية البشرية لتطبيقات المصب متعددة في شفاني الدهليزي والبحوث خلية شوان.
Abstract
ششوانوماس الدهليزي هي الأورام الأكثر شيوعا من زاوية سيريبيلوبونتين، مما يشكل 6-8٪ في المئة من جميع النمو داخل الجمجمة. على الرغم من أن هذه الأورام تسبب فقدان السمع العصبي في ما يصل إلى 95٪ من الأفراد المتضررين، والآليات الجزيئية الكامنة وراء هذا فقدان السمع تبقى بعيد المنال. توضح هذه المقالة الخطوات المنصوص عليها في مختبرنا لتسهيل جمع ومعالجة مختلف عينات الأنسجة البشرية الأولية لتطبيقات البحوث المصب لا يتجزأ من دراسة ششوانوماس الدهليزي. على وجه التحديد، يصف هذا العمل إطار منهجي موحد لجمع ومعالجة وثقافة شوان وخلايا شفاني من العينات الجراحية. يتم دمج هذا مع خطوات المعالجة المتوازية التي تعتبر ضرورية حاليا للبحوث الحالية: جمع الورم وإفرازات الأعصاب، والحفاظ على الحمض النووي الريبي واستخراج البروتين من الأنسجة التي تم جمعها، تثبيت الأنسجة لإعداد أقسام،د تعرض الخلايا البشرية الأولية إلى الفيروسات المرتبطة الغدة لتطبيق العلاج الجيني. بالإضافة إلى ذلك، هذا العمل يسلط الضوء على النهج الجراحي ترانزبيرينثين لجمع هذا الورم كفرصة فريدة للحصول على ظهارة حسية الإنسان من الأذن الداخلية و بيرليمف. وتقدم نصائح لتحسين الجودة التجريبية والمزالق المشتركة أبرزت.
Introduction
ششوانوماس الدهليزي (فس) هي الأورام الأكثر شيوعا من زاوية سيريبيلوبونتين، وتشخص في 1 من كل 100،000 شخص. على الرغم من غير النقيلي، وهذه الأورام تؤثر بشدة على نوعية حياة المريض 1 ، 2 ، 3 ، 4 ، 5 ، 6 . الأفراد المصابون عادة يعانون من فقدان السمع، وطنين، والشعور بالامتلاء السمعي. الأعراض تصبح المنهكة على نحو متزايد مع نمو الورم، مما تسبب في مشاكل التوازن، وشلل في الوجه، وضعف وظائف العصب القحفي الأخرى. المضاعفات التي تهدد الحياة بسبب ضغط الدماغ قد تتسبب أيضا 7 .
تقتصر خيارات الإدارة ل فس أساسا على الانتظار الساهرة للأورام الثابتة والعلاج الإشعاعي المجسم أو استئصال الجراحي لزراعة الأورام لأن فس تنشأ من العصب الحسي المحيطي ( أي العصب الدهليزي)، فمن المهم مقارنة الملاحظات المرتبطة فس مع تلك المستمدة من العصب السيطرة المناسبة، مثل العصب الأذني عظيم الإنسان (غان). يتم التضحية غانز صحي بانتظام خلال استئصال الأوتار أو تشريح الرقبة، ويمكن استخدامها كنماذج قوية لصحة شوان علم وظائف الأعضاء الخلية 9 . لأنه لا توجد أدوية وافقت عليها ادارة الاغذية والعقاقير لعلاج أو الوقاية من متفرقة فس، فمن الضروري أن الباحثين توضيح ميكا الجزيئية الكامنةنيسز من هذا المرض لتحديد الأهداف العلاجية. البروتينات التي تبين أن تلعب دورا في المرضية فس تشمل ميرلين، عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (فيغف)، الأكسدة الحلقية 2 (كوكس-2)، عامل النووي كابا B (نف-κB)، عامل نخر الورم ألفا (تنف-ألفا) ، ومستقبل عامل نمو البشرة (إغفر)، وجزيئات التشوير ذات الصلة 10 و 11 و 12 و 13 و 14 و 15 و 16 و 17 . وقد توسعت التطورات الأخيرة وتحسين بروتوكولات لجمع ومعالجة، والثقافة، والتحقيق المصب من ششوانوماس الدهليزي الإنسان الأولية وأنسجة العصب صحية 18 ، 19 . ومع ذلك، تم تصميم معظم البروتوكولات القائمة لاستيعاب إعدادمن هذه الأنسجة لتطبيق بحث واحد المصب ( أي ثقافة الخلية وحدها). تقدم هذه المقالة إطار منهجي موحد للتجهيز في وقت واحد من فس واحد أو عينة غان الإنسان الأساسية لتطبيقات المصب متعددة: ثقافة نوع الخلية محددة، واستخراج البروتين، والحفاظ على الحمض النووي الريبي، وجمع إفراز الورم، وتثبيت الأنسجة. هذا العمل أيضا تفاصيل جمع الجراحية ومعالجة السائل النخاعي البشري (كسف) و بيرليمف خلال ترانزابيرابينثين فس استئصال، لأن هذه الأنسجة وثيقة الصلة قد تكون بمثابة مصادر هامة من المؤشرات الحيوية ل VS. وأخيرا، يعرض هذا البروتوكول خطوات لتنبيغ الفيروسية من الخلايا فس الإنسان الأولية في الثقافة باعتبارها تطبيق رواية من هذا النسيج لاستخدامها في العلاج الجيني.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم الحصول على الموافقة الخطية المستنيرة لجمع جميع العينات قبل الجراحة، وأجريت التجارب وفقا لمدونة أخلاقيات الجمعية الطبية العالمية (إعلان هلسنكي). تمت الموافقة على جميع أقسام بروتوكول الدراسة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية في مستشفى ماساتشوستس للعيون والأذن ومستشفى ماساتشوستس العام.
ملاحظة: تم تصميم الأقسام 1-7 أدناه ليتم تنفيذها بالتتابع عند استلام عينة أساسية فس أو غان الإنسان من غرفة العمليات. وينبغي أن تبدأ المعالجة دائما بالقسم 1. ثم، كقاعدة عامة، ينبغي الحفاظ على الحمض النووي الريبي أولا (القسم 2)، تليها إعداد الأنسجة لجمع إفرازات (القسم 3) واستخراج البروتين (القسم 4). الأنسجة التي يمكن استزراعها (القسم 5 ل فس، القسم 6 ل غان) يمكن أن يجلس في مستنبت ثقافة مكملة في حين يتم تنفيذ الأقسام 2 و 3 و 4. تثبيت الأنسجة ل سيكتيونينغ (القسم 7) قصيرة جدا و جيتم القيام بها أثناء أي خطوة الطرد المركزي. يمكن إجراء القسم 8 (معالجة بيرليمف) والباب 9 (تجهيز كسف) عند استلام بيرليمف أو كسف من غرفة العمليات خلال استئصال فس ترانزبايرينثين. القسم 10 (التنبيغ الفيروسي) يمكن أن يؤديها على تزايد فس أو خلايا شوان في الثقافة.
1. إعداد واستلام عينة الجراحية
ملاحظة: الخطوات التالية هي التي يتعين القيام بها في بيئة معقمة، مثل غطاء الأنسجة الأنسجة أو غطاء تدفق الصفحي. ومن المتوقع الألفة مع تقنية معقمة الأساسية.
- إعداد المتوسطة لل فس الأولية الإنسان أو شوان ثقافة الخلية
- ذوبان الجليد قسامة 50 مل من المصل البقري الجنين المجمدة (فبس) في حمام مائي 37 درجة مئوية.
- إضافة 5 مل من مزيج البنسلين / الستربتومايسين إلى زجاجة 500 مل من دمم / F-12، مما أدى إلى التخفيف النهائي من 1: 100.
- إضافة 50 مل من فبس ذوبان إلى زجاجة 500 مل من دمم / F-12،مما أدى إلى التخفيف النهائي من 1:10.
- كتابة التاريخ، والأحرف الأولى الباحث، والمعلومات التكميلية (على سبيل المثال، 1٪ P / S، 10٪ فبس) على الزجاجة.
- وضع وسط ثقافة جديدة في الثلاجة (4 درجة مئوية).
- استلام وتطهير فس أو عينة غان
- في غرفة العمليات، ضع عينة فس أو غان الطازج في محلول ملحي معقم في حاوية العينة. نقل العينة على الجليد من غرفة العمليات لغطاء تدفق الصفحي في المختبر.
ملاحظة: أحجام العينة والأوزان تختلف اختلافا كبيرا بين المرضى على أساس حجم الورم ذات الصلة أو كمية العصب استئصال. - إزالة أليكوتس حل محلول هيالورونيداز (25،000 U / مل) وكولاجيناز (3،200 U / مل) من الثلاجة والسماح للإنزيمات ذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة (مطلوب للخطوة 5.1.4 أو 6.1.6، اعتمادا على ما إذا كان العينة هو أو فس أو غان).
ملاحظة: إعادة تعليق الانزيمات مجفف بالتجميد طs موضحة بالتفصيل على صحائف معلومات المنتج. يمكن إعادة تعليق الكولاجيناز في أي محلول ملح متوازن خال من الكالسيوم و هيالورونيداز في محلول من العازلة الفوسفاتية 0.02 م (الرقم الهيدروجيني 7.0)، 77 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 0.01٪ من 1 ملغم / مل من ألبومين المصل البقري. النشاط المحدد لكل انزيم مجفف بالتجميد يختلف مع الكثير ويجب التحقق من قبل إعادة تعليق. - باستخدام سلسلة من ثلاثة 1.5 مل أنابيب مليئة 1.4 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة 1X، وغسل فس أو غان عينة ثلاث مرات. نقل بعناية عينة من أنبوب إلى أنبوب مع ملقط معقم. إغلاق كل أنبوب مرة واحدة أنه يحتوي على العينة، ويهز بلطف لغسل.
ملاحظة: لتجنب الفيضانات أنابيب 1.5 مل، وأقل من 1.4 مل من برنامج تلفزيوني يمكن استخدامها في أنبوب إذا كانت الورم قطعة كبيرة. - وضع العينة في جافة طبق بتري 60 ملم واستخدام ملقط لإزالة جميع الأنسجة الميتة ( أي أجزاء الكي، والتي عادة ما تكون بيضاء أو مبهمة في اللون) والمناطق مع الأوعية الدموية بارزة.
- استخدام fأورسيبس أو شفرة مشرط لتقسيم العينة إلى قطع منفصلة للحفاظ على الحمض النووي الريبي، واستخراج البروتين، وجمع إفراز، وتثبيت، والثقافة الخلية (انظر الأقسام 2 - 6، أدناه).
- نقل قطعة من العينة المخصصة لثقافة الخلية (القسم 5/6) إلى طبق ثقافة جديدة 60 ملم تحتوي على 5-8 مل من البارد، على أن تستكمل دمم / F-12 المتوسطة (بدلا من ذلك، يمكن أن يكون الغطاء من طبق الثقافة الأولى تستخدم لهذه الخطوة).
ملاحظة: كمية دمم / F-12 المتوسطة اللازمة (من الخطوة 1.1) سوف تعتمد على حجم الورم أو العصب، ولكن ينبغي أن تقع بين 5 و 8 مل. هذه القطعة يمكن الجلوس في وسط الثقافة في حين يتم تنفيذ الخطوات اللاحقة.
- في غرفة العمليات، ضع عينة فس أو غان الطازج في محلول ملحي معقم في حاوية العينة. نقل العينة على الجليد من غرفة العمليات لغطاء تدفق الصفحي في المختبر.
2. الحمض النووي الريبي الحفاظ على فس وغان الأنسجة (صالحة أيضا للظهارة الحسية الإنسان)
- تحت غطاء محرك السيارة تدفق الصفحي، ونقل 1-1.2 مل من الحمض النووي الريبي حل الاستقرار إلى أنبوب 1.5 مل جديد.
- بعد غسل العينة مع برنامج تلفزيوني (الخطوة 1.2.3)، تراجع لفترة وجيزة فطيرة صغيرةسي من الأنسجة المخصصة لحفظ الحمض النووي الريبي (حوالي 3 مم 3 من فس أو طول 5 ملم من غان) في حل الاستقرار الحمض النووي الريبي. تأكد من أن العينة مغمورة تماما في الحل.
- إعداد وتسمية أنبوب 1.5 مل جديد. استرجاع العينة من الحل استقرار الحمض النووي الريبي، ونقله إلى أنبوب جديد، وتخزينه في الفريزر -80 درجة مئوية.
3. جمع إفرازات فس و غان
- اليوم 1
- بعد غسل العينة مع برنامج تلفزيوني (الخطوة 1.2.3)، ضع قطعة من فس أو غان المعينة لجمع إفرازات في أنبوب فارغ 1.5 مل.
- إعداد اثنين إضافية 1.5 مل أنابيب وماصة 500 ميكرولتر من دمم (لا تستكمل مع فبس) في كل أنبوب.
ملاحظة: سيتم استخدام أنبوب الأول من دمم لجمع إفرازات الورم، وسوف أنبوب الثاني من دمم بمثابة السيطرة المتطابقة. ويمكن جمع إفرازات في دمم، أي وسيلة أخرى نموذجية ثقافة لاتكمل مع المصل، أو برنامج تلفزيوني. - وضع واحد من أنابيب دمم التي تحتوي على مقياس رقمي معايرة. الفارغة الحجم، بحيث عندما يجلس أنبوب فوق مقياس، فإنه يقرأ 0 ملغ.
- إزالة أنبوب دمم من نطاق، ووضع قطعة من العينة المخصصة لجمع إفرازات في الأنبوب، وتزن عليه. لاحظ النتيجة، والتي سوف تمثل وزن الأنسجة وحدها.
- تحت غطاء محرك السيارة تدفق الصفحي، وضبط حجم دمم في أنبوب إلى 100 ميكرولتر لكل 10 ملغ من العينة.
- وضع أنبوب يحتوي على عينة الأنسجة ومطابقتها السيطرة (دمم وحدها) في الحاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ كو 2 ) لفترة تتفق مع خطط لهذه التجربة. احتضان الأنسجة لمدة 72 ساعة على الأقل لجمع كميات مفيدة بيولوجيا من الورم أو إفرازات العصب 15 .
- اليوم الرابع
- بعد الحضانة لمدة 72 ساعة، وإزالة المتوسطة التي تحتوي على إفراز منعينة ( أي المتوسطة مكيفة الأنسجة) باستخدام ماصة 1 مل. لمنع تكرار تجميد ذوبان الجليد دورات، قسامة المتوسطة إلى أنابيب جديدة وفقا لتحليلات المصب المخطط (على سبيل المثال، لتشغيل إليسا مع 4 آبار تتطلب 50 ميكرولتر لكل منهما، يمكن إعداد قسامات 210 ميكرولتر).
- إذا لزم الأمر، تجميد قطعة الأنسجة المتبقية في أنبوب الأصلي (المسمى بالفعل في يوم 1) في -80 درجة مئوية لإجراء تحليلات إضافية، مثل استخراج الحمض النووي، في وقت لاحق.
- تخزين الأنسجة والإفرازات، ومراقبة دمم في الفريزر -80 درجة مئوية حتى يتم بدء التطبيقات المصب (على سبيل المثال، إليساس، لك-مس / مس، صفائف السيتوكينات، وما إلى ذلك ).
4. استخراج البروتين من فس أو غان الأنسجة
- إعداد المحمية عازلة ريبا
- إضافة قرص واحد من المانع الفوسفاتيز وحي واحد من مثبط الأنزيم البروتيني إلى 10 مل من العازلة ريبا في أنبوب 15 مل. وهذا محصنالمخزن المؤقت ريبا.
ملاحظة: تخزين المخزن المؤقت ريبا في 4 درجات مئوية وإضافة أقراص فقط قبل الاستخدام.
- إضافة قرص واحد من المانع الفوسفاتيز وحي واحد من مثبط الأنزيم البروتيني إلى 10 مل من العازلة ريبا في أنبوب 15 مل. وهذا محصنالمخزن المؤقت ريبا.
- استخراج البروتين
- نقل 210 ميكرولتر من العازلة المحمية ريبا (الخطوة 4.1.1) إلى أنبوب 1.5 مل جديد.
- بعد غسل العينة مع برنامج تلفزيوني (الخطوة 1.2.3)، ونقل قطعة صغيرة من الأنسجة المخصصة لاستخراج البروتين (حوالي 3 مم 3 من فس أو طول 5 مم من غان) إلى أنبوب تحتوي على المخزن المؤقت ريبا ووضعه على الجليد لمدة 10 دقيقة على الأقل. إذا دراسة أشكال فوسفهوريلاتد من البروتينات، تكملة العازلة ريبا مع البروتيني ومثبطات الفوسفاتيز 14 . في هذه الأثناء، خطوات لمكونات أخرى من معالجة الأنسجة، مثل التثبيت (القسم 7)، يمكن القيام بها.
- قبل تبريد أجهزة الطرد المركزي إلى 4 درجات مئوية.
- باستخدام مدقة بلاستيكية، تجانس الأنسجة في أنبوب تحتوي على المخزن المؤقت ريبا. يصوتن الأنسجة لمدة 10-15 ثانية في 20٪ السعة. تأكد من أن العينةيبقى على الجليد، حتى أثناء سونيكيشن.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 15،000 زغ و 4 درجات مئوية.
- قسامة طاف في 50 ميكرولتر الزيادات في أنابيب 0.5 مل جديدة (اعتمادا على التطبيقات المصب المقصود، أي حجم الزيادة يمكن اختيار).
- تخزين أليكوتس من المحللة البروتين في الفريزر -80 درجة مئوية حتى يتم بدء التطبيقات المصب (على سبيل المثال، إليساس أو البقع الغربية) 20 ، 21 .
5. الإنسان الأساسي فس الثقافة
- اليوم 1
- فصل الأنسجة فس المعينة للثقافة الخلية (الذي كان يجلس في وسط الثقافة، كما هو موضح في الخطوة 1.2.6) إلى حوالي 1 ملم 3 قطع باستخدام زوج من ملقط في كل يد.
- نضح الورم قطعة تحتوي على المتوسطة مع ماصة 10 مل المصلية ونقل جميع المحتويات إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في1،000 x ج و 25 درجة مئوية.
- إعداد المتوسطة تفكك في طبق ثقافة جديدة 60 ملم من خلال الجمع بين 4.7 مل من دمم / F-12 تستكمل المتوسطة مع 250 ميكرولتر من كولاجيناز (التركيز النهائي: 160 U / مل) و 50 ميكرولتر من هيالورونيداز (التركيز النهائي: 250 U / مل) ، للحصول على الحجم النهائي من 5 مل.
ملاحظة: يجب أن يتم تخزين كل من الإنزيمات في الفريزر -20 درجة مئوية ولكن ذوبان قبل إعداد هذه الوسيلة (الخطوة 1.2.2). - بعد الطرد المركزي، وقطع الورم تشكيل بيليه في الجزء السفلي من أنبوب مخروطي الشكل. ماصة بعناية قبالة وتجاهل طاف.
- إضافة 2 مل من الطازجة التي تحتوي على انزيم التي تحتوي على المتوسطة التفكك (الخطوة 5.1.4) إلى بيليه الورم. ماصة صعودا وهبوطا عدة مرات لتعبئة الأنسجة ونقل الورم قطعة تحتوي على المتوسطة إلى طبق الثقافة 60 ملم.
- وضع طبق الثقافة في الحاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ كو 2 ) لمدة 18 ساعة.
- اليوم الثاني
- دافئ Dميم / F-12 المتوسطة تستكمل مع 10٪ فبس و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين (أعدت في الخطوة 1.1) في حمام مائي 37 درجة مئوية.
- إزالة طبق بتري تحتوي على ثقافة فس من الحاضنة (الخطوة 5.1.7). باستخدام إبرة 22 G تعلق على حقنة 6 مل، نضح المتوسطة التي تحتوي على الثقافة ونقله إلى أنبوب مخروطي 15 مل جديد.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 1000 x ج و 37 درجة مئوية.
- في هذه الأثناء، استخدم ملقط معقم لوضع العدد المطلوب من بولي-D- ليسين- و كامينسليبس المغلفة لامينين الزجاج إلى لوحة الثقافة 24-جيدا.
ملاحظة: عدد الآبار التي سيتم استزراعها يعتمد على حجم العينة. ما يقرب من 24-32 الآبار يمكن استزراعه من ورم 1 سم 3 ، وذلك بالنسبة لمعظم الأورام أصغر، والتخطيط ل 8-16 بئر من الخلايا المستزرعة هو المناسب. - بعد الطرد المركزي، وتجاهل طاف ( أي وسط التخصيب الانزيم) و ريسوسبيند بيليه الخلية المتبقية في الطازجة، تكمل دمم / F-12 المتوسطة، قبل دافئإد إن ستيب 5.2.1.
ملاحظة: يتم تحديد حجم الذي ريسوسبيند بيليه من قبل عدد من الآبار المخطط لها في الخطوة 5.2.4، وتقدير 1 مل من المتوسطة لكل بئر المخطط. - نضح 2 مل من المتوسطة خلية معلق (الخطوة 5.2.5) باستخدام ماصة 5 مل المصلية. إيداع 1 مل من الخلية التي تحتوي على الورم في كل بئر أعدت من لوحة 24 جيدا.
- مواصلة الشفط وإيداع الورم التي تحتوي على الخلية المتوسطة (الشفط في الزيادات من 2 مل، منها 1 مل يودع في كل المخطط جيدا) حتى يتم تقسيم تعليق خلية الورم بالتساوي بين جميع الآبار المعدة.
- وضع لوحة 24 جيدا في الحاضنة 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- يوم 3
- إذا لوحظ وجود حطام كبير على قاع الآبار، قم بتغيير الوسط في كل بئر إلى مستنبت دمم / F-12 المكمل الجديد، مع الحرص على عدم إزاحة الخلايا الملتصقة. إن لم يكن، وإرجاع لوحة إلى الحاضنة وتغيير ثe متوسط لأول مرة في يوم 5.
- أيام 5-7 وبعد ذلك
- تغيير الوسيط كل 3 أيام.
ملاحظة: يتم الاحتفاظ خلايا الإنسان فس الأساسية و غان عموما في الثقافة حتى استخدامها في التطبيقات المصب، في أو حوالي 14 يوما من العمر. تناقص ثقافة نقاء بعد هذا 19 .
- تغيير الوسيط كل 3 أيام.
6. ثقافة الإنسان الأساسية غان
- اليوم 1
- تحت المجهر تشريح، عزل كراسات من الأنسجة المخصصة للثقافة غان (الذي كان يجلس في وسط الثقافة، على النحو المبين في الخطوة 1.2.6).
- عزل الكراسات من إبينوريوم والغمد الليفي عن طريق سحب على بيرينيوريوم باستخدام لا. 5 ملقط في حين ربط إبينوريوم مع لا. 3 ملقط.
- مرة واحدة في كليات معزولة بما فيه الكفاية من إبينوريوم المحيطة بها، ونقلها إلى طبق ثقافة جديدة تحتوي على 2 مل من سوب الطازجةالمتوسط المكمل.
- قطع الكراسات إلى شرائح 1-2 ملم باستخدام شفرة مشرط.
- ماصة قطع صغيرة الملزمة وسط المحيطة في أنبوب 15 مل تحتوي على 3 مل من مستكمل الطازجة المتوسطة الثقافة، بحيث يصبح الحجم الكلي في أنبوب 15 مل 5 مل.
- الطرد المركزي العينة لمدة 3 دقائق في 1000 x ج و 25 درجة مئوية.
- في هذه الأثناء، وجعل شوان المتوسطة ثقافة الخلية في طبق بتري 60 ملم جديد من خلال الجمع بين 4.7 مل من دمم / تكملها F-12 المتوسطة، 250 ميكرولتر من كولاجيناز، و 50 ميكرولتر من هيالورونيداز، للحصول على الحجم النهائي من 5 مل.
ملاحظة: تخزين كل الانزيمات في -20 درجة مئوية. ذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة قبل إعداد هذه الوسيلة (الخطوة 1.2.2). - بعد الطرد المركزي من العينة، سوف تتكثف الكراسات إلى بيليه صغير في أنبوب مخروطي الشكل. تجاهل طاف.
- إضافة 2 مل من الطازجة التي تحتوي على انزيم التي تحتوي على المتوسطة التفكك (الخطوة 6.1.6) إلى بيليه العصب. ماصة تصل ودتملك عدة مرات لتعبئة الأنسجة ونقله إلى طبق ثقافة جديدة 60 ملم.
- مكان الطبق في الحاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ كو 2 ) لمدة 20-22 ح.
ملاحظة: هذا هو حضانة أطول مما هو مطلوب لعينات فس (الخطوة 5.1.7).
- تحت المجهر تشريح، عزل كراسات من الأنسجة المخصصة للثقافة غان (الذي كان يجلس في وسط الثقافة، على النحو المبين في الخطوة 1.2.6).
- اليوم الثاني
- دافئ تستكمل دمم / F-12 المتوسطة في حمام مائي 37 درجة مئوية.
- باستخدام إبرة 22 G تعلق على حقنة 6 مل، نضح وسط الخلية التي تحتوي على ثقافة ونقله إلى أنبوب مخروطي 15 مل جديد.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 1000 x ج و 37 درجة مئوية.
- تجاهل طاف و ريسوسبيند العينة في جديد، قبل تحسنت، تكمل دمم / F-12 الثقافة المتوسطة.
- استخدام ملقط معقم لوضع العدد المطلوب من كوفرسليبس المغلفة في آبار لوحة الثقافة 24 جيدا.
ملاحظة: حساب اثنين من الآبار من الخلايا المستزرعة لكل 1 سم عينة العصب يعزز نمو ثقافة قوية. - إضافة 1 مل من المتوسطة التي تحتوي على الثقافة إلى كلالمعينة جيدا في لوحة 24 جيدا.
- وضع لوحة 24 جيدا في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ كو 2 .
- يوم 3
- إذا لوحظ وجود حطام كبير في الآبار، يحل محل الوسط بعناية مع مستنبت جديد دمم / F-12 مستنبت، مع الحرص على عدم طرد الخلايا الملتصقة. إن لم يكن، وإرجاع لوحة إلى الحاضنة وتغيير المتوسطة للمرة الأولى يوم 5.
- أيام 5-7 وبعد ذلك
- تغيير الوسيط كل 3 أيام.
7. فس & غان الأنسجة التثبيت
- ماصة 1-1.2 مل من بارافورمالدهيد 4٪ (بفا؛ تنبيه) إلى أنبوب 1.5 مل جديد.
- بعد غسل الورم أو العصب مع برنامج تلفزيوني (الخطوة 1.2.3)، ونقل قطعة صغيرة من الأنسجة (حوالي 3 مم 3 من فس أو طول 5 ملم من غان) في بفا 4٪ ووضع أنبوب على شاكر في 4 درجة C. تأكد من أن العينة مغمورة تماما في رهو حل.
- بعد ما لا يقل عن 2 ساعة من التثبيت، واسترداد أنبوب من شاكر والمضي قدما في مزيد من المعالجة (على سبيل المثال، التضمين في البارافين أو الأمثل مجمع درجة الحرارة القطع (أكتوبر) للمناعية المناعية اللاحقة أو المناعي) 22 ، 23 ، 24 . بدلا من ذلك، يمكن أن يكون الأنسجة المفاجئة المجمدة، كما هو موضح سابقا 25 ، 26 .
8. جمع وتخزين بيرليمف الإنسان خلال ترانزلازابرينثين فس استئصال
- وضع ثلاثة العقيمة 1.5 مل أنابيب على الجليد.
ملاحظة: سيتم الاحتفاظ أنبوب واحد كنسخة احتياطية في حالة التلوث. - ملء واحد أنبوب 1.5 مل مع ما يقرب من 1.2 مل من حل برنامج تلفزيوني التي تم تصفيتها مرتين باستخدام فلتر 0.22 ميكرون.
ملاحظة: لجمع بيرليمف خلال استئصال فس ترانزبايرينثين، يجب على الجراح أولا التأكد من أن سورجيحقل خال من غبار العظام، والدم، أو المالحة. الجراح يمكن استخدام شكونشت 21 أو 24 G أنبوب الشفط في اليد غير المهيمنة لهذا الغرض.
وهناك مكان نموذجي يمكن من خلاله استخراج بيرليمف هو القناة الهلالية الجانبية (ومع ذلك، يمكن أيضا الوصول إلى القناة الهلالية الخلفية أو غشاء النافذة المستديرة، تبعا لتفضيل الجراح). يجب على الجراح أن يزيل عظام المتاهة بعناية مع بريق الماس (أثناء استخدام الري بالشفط المستمر) لتحديد الخط الأزرق ( أي المتاهة الغشائية) للقناة الهلالية. يتم اختراق القناة نصف دائرية من خلال الخط الأزرق باستخدام إبرة 27 G طويلة تعلق على حقنة توبركولين 1 مل. - اطلب من الجراح أن ينضح بلطف كمية صغيرة من بيريليمف ثم يمر المحاقن وإبرة المرفقة إلى الممرضة الجراحية.
ملاحظة: عادة، يتم جمع قطرة من بيريليمف أو أقل. إذا كان حجم لوحظ أكبر، ومن المرجح أن تلوث العينة مع f أخرىluid. - فتح استعداد، فارغة أنبوب 1.5 مل وأنبوب مليئة بس مباشرة قبل الاستخدام. يجب الحرص على عدم لمس داخل الأغطية أنبوب أثناء فتحها.
- تلقي حقنة وإرفاقها إبرة من الممرضة الجراحية وتطهير السائل تماما في أنبوب فارغ، مع الحرص على عدم لمس أنبوب نفسه مع الإبرة.
- فصل بعناية الإبرة من حقنة. لا تلوث طرف الإبرة، والاستمرار في عقد في يد واحدة.
ملاحظة: تم جمع حجم صغير جدا من بيريليمف، لذلك قد تبقى بعض السوائل في طرف طويل من الإبرة. - مع ناحية أخرى، واستخدام حقنة نفسها (بدون الإبرة) لامتصاص 0.2 مل من حل برنامج تلفزيوني تصفيتها من أنبوب أعدت في الجسم من حقنة.
- أعد إبرة الحقنة. إخلاء تماما الحقنة في أنبوب يحتوي على بيريليمف، وذلك باستخدام برنامج تلفزيوني العقيمة لطرد طرف الإبرة.
- إغلاق أنبوب perelymph- و بس التي تحتوي على ومكان على الجليد.
- تخلص من الإبرة في حاوية الأدوات الحادة.
- وضع أنبوب يحتوي على بيريليمف في -80 درجة مئوية الفريزر في أقرب وقت ممكن.
9. جمع وتخزين كسف الإنسان
- وضع ثلاثة (أو أكثر) العقيمة 1.5 مل أنابيب على الجليد.
ملاحظة: أنبوب واحد سيكون نسخة احتياطية في حالة التلوث أو حجم العينة التي هي أكبر مما كان متوقعا. - بعد فتح الأم الجافية، اطلب من الجراح لجمع كسف مع حقنة 3 مل (دون إبرة المرفقة).
ملاحظة: لمنع التلوث، وينبغي أن يتم جمع كسف مباشرة بعد افتتاح الأم الجافية. - اطلب من الجراح تسليم المحقنة إلى الممرضة الجراحية.
- تلقي حقنة من الممرضة الجراحية وإخلاء كامل الحجم المطلوب من كسف في أنبوب (ق).
- إغلاق أنبوب (ق) ووضعها على الجليد.
- وضع أنبوب (ق) في الفريزر -80 درجة مئوية في أقرب وقت ممكن.
- باستخدام تركيز الأسهم الفيروسية كمرجع، حساب عدد الجينوم المطلوب (غ) عدد وتعدد العدوى (وزارة الداخلية) اللازمة لتجربة تنبيغ المقترحة. يمكن تخفيف مخزون الفيروس مباشرة إلى مستنبت مستكمل.
ملاحظة: أي ناقلات الفيروسية مناسبة لتنبيب الخلايا الأولية يمكن استخدامها. انظر لانديجر إت آل. (2017) لإجراء مقارنة تفصيلية بين ستة أنماط مختلفة من الأنماط المصلية للفيروس الغدة 27 . بالإضافة إلى ذلك، عند زراعة الخلايا البشرية الأولية، لا يتم تحديد عدد الخلايا عادة قبل الطلاء على كوفرسليبس. الخلايا فس الأولية لا تستجيب بشكل جيد لتريبسينيزاتيون والمرور، وذلك لحساب موثوق بها وزارة الداخلية، ويمكن تقدير عدد الخلايا الملتصقة لكل بئر باستخدام المجهر المرحلة النقيض من ذلك. بدلا من ذلك، إذا كانت الخلايا قريبة من التقاء، يمكن تقدير أعدادهم بشكل موثوق به باستخدام قيم كثافة الخلايا القياسية للوحة 24-جيدا (على سبيل المثال، 5 × 10 4 خلايا لكل بئر). - تحت غطاء تدفق الصفحي، وإعداد تستكمل المتوسطة التي تحتوي على المبلغ المطلوب من الفيروس في أنبوب المختبر المخروطية 15 مل، بحيث يتم إعداد 1 مل من المتوسطة التي تحتوي على فيروس لكل بئر من الخلايا إلى ترانسدوسد. ماصة المتوسطة التي تحتوي على فيروس صعودا وهبوطا لخلط بلطف ولكن بدقة.
- باستخدام ملقط معقم، ونقل كوفرسليبس التي تحتوي على الخلايا فس الأولية (الخطوة 5.2.8) من الأصلي 24 لوحة جيدا إلى لوحة جديدة 24 جيدا. بعد نقل كل ساترة الفردية، إضافة 1 مل من المتوسطة التي تحتوي على الفيروس. دوامة لوحة كل مرة يتم إضافة المتوسطة للتأكد من أن الخلايا المغلفة بالتساوي مع الفيروس.
- احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ كو 2 لمدة التجربة المخطط لها.
ملاحظة: حضانات تتراوح بين 48-120 ح أظهرت كل نتائج واعدة تنبيغ 27 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويمكن معالجة الخلايا فس الإنسان الأولية في الثقافة، على النحو المنصوص عليه في القسم 5، كنماذج إعلامية للعمليات المرتبطة بالمرض في العديد من تطبيقات البحوث المصب ( الشكل 1 ). خلايا شوان صحية مثقف في القسم 6 توفر نقطة مباشرة ومفيدة من المقارنة. وكما هو مبين أدناه، تتوفر بيانات واسعة من محطات فس و غان وفقا لهذا الإطار المنهجي الموحد في مقالات متعددة نشرت سابقا 12 و 13 و 14 و 15 و 27 .
ويرد تنبيغ الناجح من الخلايا فس الأولية مع الفيروسات الغدة المرتبطة للعلاج الجيني هنا للمرة الأولى ( الشكل 2 ). تم ترانزدوسد الخلايا فس الأولية في الثقافة ث إيث غفب معربا عن Anc80، سلف سلفا من الفيروسات المرتبطة الغدة 28 . وقد تبين أن Ac80 أن يكون ناقلا كفاءة قصوى لنقل الجينات في الأنسجة القوقعة الفئران في المختبر وفي الجسم الحي 27 . تناقل فعال من الخلايا البشرية الأولية مع هذا المتجه يحمل آثار هامة بالنسبة للغروب المستقبلية في العلاج الجيني ل VS.
الشكل 1: صور حقل مشرق من الثقافات ششوانوما الدهليزي الإنسان الأولية.
ويمكن تحديد أنماط نموذجية في تنظيم الخلايا فس في الثقافة. شريط مقياس = 200 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
2 "كلاس =" زفيجيمغ "سرك =" / فيليز / ftp_upload / 55827 / 55827fig2.jpg "/>
الشكل 2: صورة إمونوفلورزنت الممثل من الثقافات شفاني الإنسان الدهليزي الأساسي بعد التعرض ل غفب معبر عن Anc80 لمدة 48 ساعة في تعدد العدوى (وزارة الداخلية) من 250،000.
الأخضر = غفب. الأحمر = فالويدين / F- أكتين (البقع الهيكل الخلوي)؛ الأزرق = دابي (البقع النواة). الحانات مقياس = 50 ميكرون (A) و 100 ميكرون (B). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تصف هذه المخطوطة إطارا منهجيا موحدا للبحث فس، وتحدد المعالجة المتزامنة للعينات البشرية فس و غان لتطبيقات البحث المصب. كما يدخل بحث فس عمر الطب الدقة، وإعداد نفس العينة في أشكال قادرة على الإجابة على العديد من الأسئلة البحثية سوف تمكن من اكتشاف رؤى الجزيئية والخلوية والجينية، والبروتينية محددة للمرضى الفردية.
تم تقييم نقاء الخلايا شوان الإنسان والثقافات فس بدقة مع مرور الوقت عن طريق إمونوسيتوشيميستري، وذلك باستخدام نسبة الخلايا إيجابية للعلامة S100 لتلك الإيجابية ل دابي وصمة عار النووية 19 . وفقا لذلك، فمن المستحسن لإجراء تجارب على الإنسان الأساسية شوان خلايا الخلية في غضون الأسبوعين الأولين بعد طلاء الخلايا، كما نقاء هذه الخلايا هو الأعلى خلال هذه الفترة؛ بعد ذلك، الخلايا الليفية تشبه تبدأ في الغلبة. أنتغ فس الثقافات الخلية هي أيضا نقية إلى أقصى حد في أسبوعين في الثقافة، فس الخلايا تفتقر إلى الاتصال بوساطة تثبيط وسوف تستمر في التكاثر في مراحل لاحقة. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت مقارنة ميكروأري المباشر من التعبير البروتين من الأنسجة فس (القسم 4) والخلايا فس في الثقافة من نفس الأورام (القسم 5) بنجاح أن الثقافات فس تثبت مستوى عال مرضيا من التشابه البيولوجي للأورام الأم منها 19 . يمكن إجراء القياس الكمي الناجح للبروتينات من الفائدة عن طريق لطخة غربية من بروتينات البروتين ولدت في القسم 4 وتقدير الكميات من الحمض النووي الريبي النصوص عن طريق كرت-ير من الحمض النووي الريبي المستخرجة من الأنسجة المحفوظة مع حل الاستقرار الحمض النووي الريبي (القسم 2) 12 ، 13 ، 14 .
فس و غان الخلايا في الثقافة يمكن أن تتعرض للمواد الفعالة كيميائيا، مثل العقاقير المضادة للالتهابات غير الستيرويدية، سمال(رناس)، أو المركبات العضوية الطبيعية لتوضيح الآليات الجزيئية المرضية محددة أو لاختبار الهدف العلاجي 13 ، 14 ، 29 . يمكن إضافة المركبات ذات الأهمية مباشرة إلى الخلايا في الثقافة بعد التخفيفات المناسبة في وسط الثقافة المكملة العادية. لتقييم تأثير هذه المواد على جوانب مهمة من علم وظائف الأعضاء الخلوية، برومودوكسيوريدين (بردو) وضع العلامات على الانتشار، محطة ديوكسينوكلأوديل ترانفيراس دوتب نيك نهاية وضع العلامات (تونيل) لموت الخلايا المبرمج، و 3- (4،5-ديميثيلثيازول-2-يل) - 2،5-ديفينيلتيترازوليوم بروميد (مت) الحد للبقاء الأيضية هي المقايسات موثوقة التي يمكن استخدامها مع الثقة على هذه الخلايا 19 . ويمكن أيضا أن يستنشق وسط الثقافة من الخلايا المعالجة بعناية، وتخزينها في -20 درجة مئوية، واختبارها لتحديد المستويات النسبية للمواد المفرزة، مثل البروستاجلاندين E2، إفراز جأن يتأثر العلاج من تعاطي المخدرات 13 . بالإضافة إلى ذلك، تثبيت الأنسجة (القسم 7) والتضمين لاحق في أكتوبر أو البارافين يوفر الركيزة قوية لمقايسات المناعية 13 ، 14 .
يوفر الوسيط الذي يحتوي على الورم أو العصبية المتولدة في القسم 3 طريقة بسيطة وفعالة لتقييم الجزيئات القابلة للذوبان فس التي تم إفرازها واستخراج الحويصلات خارج الخلية. يمكن إجراء صفائف السيتوكين أو إليساس على هذه الإفرازات، كما هو مبين في بروتوكولات الشركات المصنعة، المبينة في دراستين منشورتين 9 و 12 . يمكن تنقية الحويصلات خارج الخلية من هذه الإفرازات باستخدام التنبيذ الفائق، كما هو مفصل في منشور سابق 30 . بدلا من ذلك، فإن الإفرازات نفسها يمكن أن تستخدم الكواشف الخاصة بالمريض لتطبيقات البحوث المصب. على سبيل المثال، في تجربة تكشفأليف آلية رواية الكامنة وراء فقدان السمع الحسي العصبي فس، تم جمع إفرازات من الأنسجة فس من المرضى الذين يعانون من ضعف السمع والمرضى فس مع السمع جيدة بعد الحضانة في دمم لمدة 72 ساعة (القسم 3). ثم تم تطبيق هذه الإفرازات الورم على المستكشفات القوقعة الفئران، وتبين أن إفرازات الورم من مرضى فس مع ضعف السمع تسبب المزيد من الأضرار التي لحقت إكسبلانتس القوقعة من إفرازات مرضى فس مع السمع جيدة 15 . الأهم من ذلك، الإفرازات التي تم جمعها في نقاط زمنية قبل 72 ساعة لم يؤدي إلى أضرار كبيرة.
يمثل بيرليمف الإنسان التي تم جمعها من المرضى الذين يخضعون لاستئصال فس ترانزبايرينثين (القسم 8) وسيلة جديدة مثيرة لاكتشاف المؤشرات الحيوية فس. تم تحليل العينات التي تم جمعها وفقا للقسم 8 عن طريق اللوني السائل جنبا إلى جنب الطيف الكتلي (لك-مس / مس) لرسم خريطة بروتيوم الإنسان بيرليمف، و 15 المؤشرات الحيوية المرشحة من فس بنجاح أنادنتيفيد 31 . ويمكن إجراء تحليل مماثل باستخدام كسف البشري التي تم جمعها من المرضى فس (القسم 9).
وهناك اعتبار كبير في البحث فس هو اختيار الأنسجة السيطرة المناسبة. وقد استخدمت الدراسات السابقة العصب القوقعي، العصب الدهليزي، والأعصاب الطرفية غير ذات الصلة (مثل العصب الوركي)، إلى تأثير متغير 22 ، 32 . ومع ذلك، فإن عدة أسباب تؤدي إلى دعم استخدام الشبكات الحكومية العالمية باعتبارها الضوابط ذات الصلة القصوى 15 . على غرار العصب الدهليزي، و غان هو الطرفية، العصب الحسي مع محاور عصبية تتراكم خلايا شوان. الأهم من ذلك، بحث الأدب يكشف أن ششوانوماس لم يتم العثور على تطوير من غان، مما يجعل التغييرات الورم في هذا النسيج غير محتملة. بالإضافة إلى ذلك، يتم التضحية غان بانتظام عند الوصول إلى هياكل الرقبة أعمق، وإعطاء الباحثين المستندة إلى المستشفى سهولة الوصول إلى الصحةy خلال تشريح الرقبة الروتينية والباروتيدكتوميس. على الرغم من أن العصب القوقعي غالبا ما تضحى خلال جراحة فس ويمكن أن تكون متاحة بسهولة، وقربها من الأعصاب الدهليزي خطر تقاسم نفس المكروية، والتي قد تظهر التغيرات الجزيئية قبل الورم 33 . وقد نجحت مختبرات أخرى أيضا في استخدام شبكات غان كسيطرة كافية للبحوث فس، ويوصى بمواصلة هذه الممارسة 20 ، 21 ، 22 ، 34 .
واحدة خطوة حاسمة ولكن غالبا ما يتم تجاهلها ضمن بروتوكولات ثقافة نوع الخلية محددة (القسمين 5 و 6) هو الإزالة السليمة للأنسجة غير قابلة للحياة والأوعية الدموية. إزالة هذه الأنسجة غير الورم أمر حاسم لتوليد ثقافات قوية من النقاء القصوى. وعلاوة على ذلك، عند طلاء المتوسطة التي تحتوي على الخلية التي تحتوي على كوفرسليبس، فمن المهمإيلاء اهتمام وثيق لكمية الأنسجة نقلها إلى كل بئر. إن تحقيق توزيع كثيف حتى معتدل من الخلايا التي تحتوي على عدد قليل من "قطع" الأنسجة الأكثر كثافة في كل بئر له أهمية خاصة بالنسبة لخلايا شوان، التي تتطلب عددا كافيا من الخلايا الملتصقة لتزدهر. طلاء كوفرسليبس مع بولي-D- يسين و لامينين كما يسمح للنمو الفعال للخلايا. تتكاثر الخلايا بشكل أكثر قوة عندما تكون المغلفة كوفرسليبس في المختبر، بالمقارنة مع المنتجات المتاحة مسبقا المغلفة تجاريا.
لضمان بروتين عالي الجودة واستخراج الحمض النووي الريبي، تحقق من أن الأنسجة لا تزال في درجات حرارة أقل من 4 درجات مئوية في جميع أنحاء الأقسام 2 و 4. بالإضافة إلى ذلك، منذ الأدب المتعلق بتحليل إفرازات فس نادرة (القسم 3)، قد تتطلب مشاريع جديدة المزيد من الابتكارات وأطوال مختلفة من الحضانة.
كما أساليب لمعالجة فس علم الأمراض تستمر في التقدم، واستخدام هذه السلسلةفإن الجمع بين الخطوط الأساسية للتقنيات الأساسية سيتيح الحصول على أكبر قدر ممكن من المعلومات من عينة بشرية واحدة. إن المعالجة المتزامنة المستنيرة للأنسجة فس و غان سوف تكون جزءا لا يتجزأ من توليد العلاجات الدوائية والوراثية الفعالة ضد هذا الورم المنهك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للصمم وغيرها من منح اضطرابات الاتصالات R01DC015824 (كمز) و T32DC00038 (دعم جيس و سد)، ومنح وزارة الدفاع W81XWH-14-1-0091 (كمز)، ومؤسسة بيرتاريللي (كمز) ، ومؤسسة يوم نانسي سايلز (كمز)، ومركز لور تينيتوس للبحوث (كمز)، ومؤسسة بارنز (كمز).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin 12 mm #1 German Glass Coverslip | Corning | 354087 | Or prepare coverslips with Corning Laminin (CB-40232) and Cultrex Poly-L-Lysine (3438-100-01) |
| CELLSTAR 15 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 188161 | |
| CELLSTAR 50 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 227261 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Sterile-filtered | Sigma-Aldrich | C1639 | |
| Costar 24 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates, Sterile | Corning | 3526 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10313-039 | |
| DMEM/F-12, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 11320-033 | |
| Dumont #3 Forceps, Dumoxel | Fine Science Tools | 11231-30 | Autoclave prior to use |
| Dumont #5 Forceps, Standard tip, Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | Autoclave prior to use |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | Aliquot in 50 mL tubes and store in -20°C freezer |
| Hyaluronidase from Bovine Testes, Type I-S, Lyophilized Powder | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, sterile | EMD Millipore | SLGP033RS | |
| Paraformaldehyde, Reagent Grade, Crystalline | Sigma-Aldrich | P6148 | Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online |
| PBS, pH 7.4, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | Autoclave prior to use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100 mL | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Tablets | Roche | 04906845001 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets | Thermo Fisher Scientific | 88666 | |
| Pipettes and pipette tips, 5/10/25 mL | Variable | Variable | |
| Plastic Homogenization Pestle for 1.5/2.0 mL Microtubes | E&K Scientific | EK-10539 | |
| PrecisionGlide Needles, 27 G x 1 1/2 in | BD | 301629 | |
| RIPA Buffer | Boston BioProducts | BP-115 | |
| RNAlater (RNA stabilization solution) | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 mL | Eppendorf | 022363719 | Autoclave prior to use |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 mL | Eppendorf | 022363204 | Autoclave prior to use |
| Saline - 0.9% Sodium Chloride Injection, bacteriostatic, 20 mL | Hospira | 0409-1966-05 | |
| Scalpel Blades - #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Schuknecht Suction Tube 24 gauge | Bausch + Lomb | N1698 42 | Useful for the surgical approach (in addition to common otologic surgical instruments) and e.g. a blue surgical marker |
| Specimen Container, OR sterile, 4OZ | Medline | DYND30331H | |
| Stemi 2000-C Stereo Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| Syringe/Needle Combination, Luer-Lok Tip, 5 mL, 22 G x 1 in. | BD | 309630 | |
| Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 1 mL | BD | 309659 | |
| Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 3 mL | BD | 309656 | |
| Ultrasonic homogenizer, 4710 Series, CV18 probe | Cole-Parmer | CP25013 |
References
- Babu, R., et al. Vestibular schwannomas in the modern era: epidemiology, treatment trends, and disparities in management. J Neurosurg. 119 (1), 121-130 (2013).
- Gal, T. J., Shinn, J., Huang, B. Current epidemiology and management trends in acoustic neuroma. Otolaryngol Head Neck Surg. 142 (5), 677-681 (2010).
- Propp, J. M., McCarthy, B. J., Davis, F. G., Preston-Martin, S.
- Stangerup, S. E., Tos, M., Thomsen, J., Caye-Thomasen, P.
- Tos, M., Stangerup, S. E., Caye-Thomasen, P., Tos, T., Thomsen, J. What is the real incidence of vestibular schwannoma? Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 130 (2), 216-220 (2004).
- Stangerup, S. E., Caye-Thomasen, P. Epidemiology and natural history of vestibular schwannomas. Otolaryngol Clin North Am. 45 (2), 257-268 (2012).
- Mahaley, M. S., Mettlin, C., Natarajan, N., Laws, E. R., Peace, B. B. Analysis of patterns of care of brain tumor patients in the United States: a study of the Brain Tumor Section of the AANS and the CNS and the Commission on Cancer of the ACS. Clin Neurosurg. 36, 347-352 (1990).
- Carlson, M. L., Link, M. J., Wanna, G. B., Driscoll, C. L.
- Dilwali, S., et al. Sporadic vestibular schwannomas associated with good hearing secrete higher levels of fibroblast growth factor 2 than those associated with poor hearing irrespective of tumor size. Otol Neurotol. 34 (4), 748-754 (2013).
- Caye-Thomasen, P., et al. VEGF and VEGF receptor-1 concentration in vestibular schwannoma homogenates correlates to tumor growth rate. Otol Neurotol. 26 (1), 98-101 (2005).
- Koutsimpelas, D., et al. The VEGF/VEGF-R axis in sporadic vestibular schwannomas correlates with irradiation and disease recurrence. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 74 (6), 330-338 (2012).
- Dilwali, S., Roberts, D., Stankovic, K. M. Interplay between VEGF-A and cMET signaling in human vestibular schwannomas and schwann cells. Cancer Biol Ther. 16 (1), 170-175 (2015).
- Dilwali, S., Kao, S. Y., Fujita, T., Landegger, L. D., Stankovic, K. M. Nonsteroidal anti-inflammatory medications are cytostatic against human vestibular schwannomas. Transl Res. 166 (1), 1-11 (2015).
- Dilwali, S., et al. Preclinical validation of anti-nuclear factor-kappa B therapy to inhibit human vestibular schwannoma growth. Mol Oncol. 9 (7), 1359-1370 (2015).
- Dilwali, S., Landegger, L. D., Soares, V. Y., Deschler, D. G., Stankovic, K. M. Secreted Factors from Human Vestibular Schwannomas Can Cause Cochlear Damage. Sci Rep. 5, 18599 (2015).
- Blakeley, J. Development of drug treatments for neurofibromatosis type 2-associated vestibular schwannoma. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 20 (5), 372-379 (2012).
- Schroeder, R. D., Angelo, L. S., Kurzrock, R. NF2/merlin in hereditary neurofibromatosis 2 versus cancer: biologic mechanisms and clinical associations. Oncotarget. 5 (1), 67-77 (2014).
- Schularick, N. M., Clark, J. J., Hansen, M. R. Primary culture of human vestibular schwannomas. J Vis Exp. (89), (2014).
- Dilwali, S., et al. Primary culture of human Schwann and schwannoma cells: improved and simplified protocol. Hear Res. , 25-33 (2014).
- Brown, C. M., Ahmad, Z. K., Ryan, A. F., Doherty, J. K. Estrogen receptor expression in sporadic vestibular schwannomas. Otol Neurotol. 32 (1), 158-162 (2011).
- Cioffi, J. A., et al. MicroRNA-21 overexpression contributes to vestibular schwannoma cell proliferation and survival. Otol Neurotol. 31 (9), 1455-1462 (2010).
- Doherty, J. K., Ongkeko, W., Crawley, B., Andalibi, A., Ryan, A. F. ErbB and Nrg: potential molecular targets for vestibular schwannoma pharmacotherapy. Otol Neurotol. 29 (1), 50-57 (2008).
- Aguiar, P. H., Tatagiba, M., Samii, M., Dankoweit-Timpe, E., Ostertag, H. The comparison between the growth fraction of bilateral vestibular schwannomas in neurofibromatosis 2 (NF2) and unilateral vestibular schwannomas using the monoclonal antibody MIB 1. Acta Neurochir (Wien). 134 (1-2), 40-45 (1995).
- Cattoretti, G., et al. Monoclonal antibodies against recombinant parts of the Ki-67 antigen (MIB 1 and MIB 3) detect proliferating cells in microwave-processed formalin-fixed paraffin sections. J Pathol. 168 (4), 357-363 (1992).
- Hung, G., et al. Immunohistochemistry study of human vestibular nerve schwannoma differentiation. Glia. 38 (4), 363-370 (2002).
- Archibald, D. J., et al.
- Landegger, L. D., et al. A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).
- Zinn, E., et al. In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector. Cell Rep. 12 (6), 1056-1068 (2015).
- Kim, B. G., et al. Sulforaphane, a natural component of broccoli, inhibits vestibular schwannoma growth in vitro and in vivo. Sci Rep. 6, 36215 (2016).
- Soares, V. Y., et al. Extracellular vesicles derived from human vestibular schwannomas associated with poor hearing damage cochlear cells. Neuro Oncol. 18 (11), 1498-1507 (2016).
- Lysaght, A. C., et al.
- Caye-Thomasen, P., Borup, R., Stangerup, S. E., Thomsen, J., Nielsen, F. C. Deregulated genes in sporadic vestibular schwannomas. Otol Neurotol. 31 (2), 256-266 (2010).
- Schulz, A., et al. The importance of nerve microenvironment for schwannoma development. Acta Neuropathol. 132 (2), 289-307 (2016).
- Torres-Martin, M., et al. Global profiling in vestibular schwannomas shows critical deregulation of microRNAs and upregulation in those included in chromosomal region 14q32. PLoS One. 8 (6), e65868 (2013).
