Summary
Målet med detta protokoll är att skissera samlingen och behandlingen av mänskliga kirurgiska prover för flera nedströmsapplikationer i vestibulär schwannom och Schwann-cellforskning.
Abstract
Vestibulära schwannomer är de vanligaste neoplasma av cerebellopontinvinkeln, vilket utgör 6-8% av alla intrakraniella tillväxter. Även om dessa tumörer orsakar sensorineural hörselnedsättning i upp till 95% av de drabbade individerna, förblir de molekylära mekanismerna som ligger till grund för denna hörselnedsättning förvirrande. Denna artikel beskriver de steg som fastställts i vårt laboratorium för att underlätta insamling och behandling av olika primära humana vävnadsprover för nedströms forskningsapplikationer som är integrerade i studien av vestibulära schwannom. Specifikt beskriver detta arbete ett enhetligt metodiskt ramverk för insamling, bearbetning och odling av Schwann- och schwannomaceller från kirurgiska prover. Detta är integrerat med parallella behandlingssteg som nu anses nödvändiga för aktuell forskning: insamling av tumör- och nervsekretioner, bevarande av RNA och extraktion av protein från uppsamlade vävnader, fixering av vävnad för framställning av sektioner, enD exponering av primära humana celler på adeno-associerade virus för applicering på genterapi. Dessutom framhäver detta arbete det translabyrintiska kirurgiska sättet att samla denna tumör som en unik möjlighet att erhålla mänskligt sensoriskt epitel från inre örat och perilimf. Tips för att förbättra experimentell kvalitet tillhandahålls och vanliga fallgropar framhävs.
Introduction
Vestibulära schwannom (VS) är de vanligaste neoplasma av cerebellopontinvinkeln, diagnostiserad hos 1 av 100 000 individer. Även om de inte är metastatiska, påverkar dessa tumörer allvarligt en patients livskvalitet 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Berörda individer lever vanligen med hörselnedsättning, tinnitus och en känsla av ljudfylldhet. Symtom blir alltmer försvagande när tumören växer, vilket orsakar balansproblem, ansiktsförlamning och försämring av andra kranialnervfunktioner. Livshotande komplikationer på grund av hjärnstammens kompression kan också medföra 7 .
Förvaltningsalternativ för VS är väsentligen begränsad till vaksam väntan på statiska tumörer och stereotaktisk strålbehandling eller kirurgisk resektion för växande tumörer Eftersom VSs härrör från en perifer sensorisk nerv ( dvs vestibulärnerven) är det viktigt att jämföra VS-associerade observationer med de som härrör från en lämplig kontrollnerv, såsom den mänskliga stora aurikulärnerven (GAN). Friska GANs avlivas regelbundet under parotidektomi eller nackdisektioner och kan användas som robusta modeller för hälsosam Schwann cellfysiologi 9 . Eftersom det inte finns några FDA-godkända läkemedel för behandling eller förebyggande av sporadisk VS, är det absolut nödvändigt att forskare belyser den underliggande molekylära mechaSjukdomar av sjukdomen för att identifiera terapeutiska mål. Proteiner som har visats spela en roll i VS-patogenes innefattar merlin, vaskulär endotel tillväxtfaktor (VEGF), cyklooxygenas 2 (COX-2), kärnfaktor kappa B (NF-KB), tumörnekrosfaktor alfa (TNF-alfa) Epidermal tillväxtfaktorreceptor (EGFR) och besläktade signalmolekyler 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . Nya framsteg har utvidgats och förbättrat protokoll för insamling, bearbetning, kultur och efterföljande undersökning av primära humana vestibulära schwannomer och friska nervvävnader 18 , 19 . Men de flesta befintliga protokoll är utformade för att tillgodose förberedelsenVävnad för sådana vävnader för en enda nedströms forskningsapplikation ( dvs. cellkultur ensam). Denna artikel presenterar ett enhetligt metodiskt ramverk för samtidig bearbetning av ett enskilt primärt humant VS- eller GAN-prov för flera nedströmsapplikationer: celltypsspecifik kultur, proteinutvinning, RNA-bevarande, insamling av tumörsecretion och vävnadsfixering. Detta arbete beskriver också kirurgisk insamling och behandling av human cerebrospinalvätska (CSF) och perilimf under translabyrint VS-resektion, eftersom dessa närbesläktade vävnader kan fungera som viktiga källor till biomarkörer för VS. Slutligen presenterar detta protokoll steg för viraltransduktion av primära humana VS-celler i odling som en ny applicering av denna vävnad för användning i genterapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Skriftligt informerat samtycke för insamling av alla prover erhölls före operationen, och försöken utfördes enligt Etiket för Världsmedicinsk Förening (Helsingforsdeklaration). Alla delar av studieprotokollet godkändes av Institutional Review Board of Massachusetts Eye och Ear och Massachusetts General Hospital.
OBS! Sektionerna 1-7 nedan är konstruerade för att utföras sekventiellt vid mottagandet av ett primärt humant VS- eller GAN-prov från operationsstugan. Behandling bör alltid börja med avsnitt 1. Då bör RNA i regel bevaras först (avsnitt 2), följt av framställning av vävnad för insamling av sekret (avsnitt 3) och proteinutvinning (avsnitt 4). Vävnad som skall odlas (avsnitt 5 för VS, sektion 6 för GAN) kan sitta i kompletterat odlingsmedium medan sektionerna 2, 3 och 4 utförs. Fixeringen av vävnad för snittning (avsnitt 7) är mycket kort och cEn utförs under något centrifugeringssteg. Avsnitt 8 (behandling av perilimfen) och avsnitt 9 (CSF-behandling) kan utföras vid mottagande av perilimf eller CSF från operationsrummet under en translabyrintisk VS-resektion. Sektion 10 (viraltransduktion) kan utföras på växande VS- eller Schwann-celler i odling.
1. Förberedelse för och kvittning av en kirurgisk prov
OBS! Följande steg ska utföras i en steril miljö, såsom en vävnadskulturhuvud eller laminärflödeskåpa. Förtrogenhet med grundläggande steril teknik förväntas.
- Framställning av medium för primär human VS- eller Schwann-cellodling
- Tina en 50 ml alikvot av fruset fetalt bovint serum (FBS) i ett 37 ° C vattenbad.
- Tillsätt 5 ml penicillin / streptomycinblandning till en 500 ml flaska DMEM / F-12, vilket resulterar i en slutlig utspädning av 1: 100.
- Tillsätt 50 ml upptinad FBS till 500 ml flaska DMEM / F-12,Resulterande i en slutlig spädning av 1:10.
- Skriv datumet, forskarens initialer och kompletterande information ( t.ex. 1% P / S, 10% FBS) på flaskan.
- Placera det nya odlingsmediet i kylskåp (4 ° C).
- Kvitto och rengöring av VS eller GAN-provet
- I operatören placera det nyligen skördade VS- eller GAN-provet i steril saltlösning i en provbehållare. Transportera provet på is från operationssalen till ett laminärt flödeshuv i laboratoriet.
OBS: Provstorlekar och vikter varierar signifikant mellan patienter baserat på den aktuella tumörens storlek eller mängden excised nerv. - Ta bort alikvoter av stamlösning av hyaluronidas (25 000 U / ml) och kollagenas (3 200 U / ml) från frysen och låt enzymerna tina vid rumstemperatur (krävs för steg 5.1.4 eller 6.1.6 beroende på om provet är En VS eller en GAN).
OBS: Resuspendering av lyofiliserade enzymer iS beskrivs i detalj på produktdatablad. Kollagenas kan resuspenderas i någon kalciumfri balanserad saltlösning och hyaluronidas i en lösning av 0,02 M fosfatbuffert (pH 7,0), 77 mM NaCl och 0,01% 1 mg / ml bovint serumalbumin. Den specifika aktiviteten för varje lyofiliserat enzym varierar med partiet och bör verifieras före resuspendering. - Använd en serie av tre 1,5 ml rör fyllda med 1,4 ml 1x steril PBS, tvätta VS- eller GAN-provet tre gånger. Överför försiktigt provet från rör till rör med sterila tångar. Stäng varje rör när det innehåller provet och skaka försiktigt för att tvätta.
OBS! För att undvika översvämning av 1,5 ml rör kan mindre än 1,4 ml PBS användas per rör om tumörstycket är stort. - Sätt provet i en torr 60 mm petriskål och använd tång för att ta bort all död vävnad ( dvs. kauteriserade delar, som vanligen är vita eller ogenomskinliga) och områden med framstående blodkärl.
- Använd fOrceps eller ett skalpblad för att dela provet i separata delar för RNA-konservering, proteinutvinning, sekretionsuppsamling, fixering och cellodling (se avsnitt 2-6 nedan).
- Överför stycket av provet som är bestämt för cellodling (avsnitt 5/6) till en ny 60 mm odlingsskål innehållande 5-8 ml kallt, tillsatt DMEM / F-12 medium (alternativt kan locket i den första odlingsskålen vara Används för detta steg).
OBS: Mängden DMEM / F-12-medium som behövs (från steg 1.1) beror på tumörens eller nervens storlek, men den ska falla mellan 5 och 8 ml. Denna bit kan sitta i odlingsmedium medan de följande stegen utförs.
- I operatören placera det nyligen skördade VS- eller GAN-provet i steril saltlösning i en provbehållare. Transportera provet på is från operationssalen till ett laminärt flödeshuv i laboratoriet.
2. RNA-konservering av VS och GAN-vävnad (även giltigt för humant sensoriskt epitel)
- Under laminarflödeshuven, överför 1-1,2 ml RNA-stabiliseringslösning till ett nytt 1,5 ml rör.
- Efter tvättning av provet med PBS (steg 1.2.3) doppas den lilla pajen kortCe av vävnad betecknad för RNA-bevarande (ungefär 3 mm 3 VS eller en 5 mm längd av GAN) i RNA-stabiliseringslösningen. Se till att provet är helt nedsänkt i lösningen.
- Förbered och märka ett nytt 1,5 ml rör. Hämta provet från RNA-stabiliseringslösningen, överför det till det nya röret och förvara det i en -80 ° C frys.
3. Samling av VS- och GAN-sekretionerna
- Dag 1
- Efter tvättning av provet med PBS (steg 1.2.3), placera den del av VS eller GAN som är avsedd för uppsamling av sekretioner i ett tomt 1,5 ml rör.
- Förbered två ytterligare 1,5 ml rör och pipett 500 μL DMEM (ej tillsatt med FBS) i varje rör.
ANMÄRKNING: Det första röret DMEM kommer att användas för att samla tumörsekretionerna, och det andra röret DMEM kommer att fungera som en matchad kontroll. Sekretioner kan samlas in i DMEM, vilket annat typiskt odlingsmedium inteKompletterat med serum eller PBS. - Placera ett DMEM-innehållande rör på en kalibrerad digital skala. Tara skalan, så att när röret sitter uppe på skalan läser det 0 mg.
- Ta bort DMEM-röret från skalan, placera det provstycke som utses för insamling av sekret i röret och väga det. Notera resultatet, vilket representerar vävnadens vikt bara.
- Justera volymen DMEM i röret under en laminär flödeskåpa till 100 μl per 10 mg prov.
- Placera röret som innehåller vävnadsprovet och dess matchade kontroll (DMEM ensam) i inkubatorn (37 ° C, 5% CO2) under en period som överensstämmer med planerna för detta experiment. Inkubera vävnaden i minst 72 timmar för att samla biologiskt användbara mängder av tumör- eller nervutsöndringar 15 .
- Dag 4
- Efter inkubering i 72 h, avlägsna det sekretionshaltiga mediet frånProv ( dvs vävnadskonditionerat medium) med en 1 ml pipett. För att förhindra upprepade frys-tina cykler, alikvotera mediet i nya rör enligt de planerade nedströmsanalyserna (t ex att köra en ELISA med 4 brunnar som kräver 50 μl vardera kan alikvoter på 210 μl framställas).
- Om så erfordras, frysa det kvarvarande vävnadsstycket i originalröret (redan märkt på dag 1) vid -80 ° C för ytterligare analyser, såsom DNA-extraktion, vid ett senare tillfälle.
- Förvara vävnaden, sekretionerna och kontrollera DMEM i en -80 ° C frysare tills nedströmsansökningarna initieras ( t.ex. ELISA, LC-MS / MS, cytokin-arrays, etc. ).
4. Proteinuttagning från VS eller GAN-vävnad
- Framställning av befäst RIPA-buffert
- Lägg till en tablett fosfatashämmare och en tablett proteashämmare till 10 ml RIPA-buffert i ett 15 ml rör; Detta är förstärktRIPA-buffert.
OBS: Förvara RIPA-bufferten vid 4 ° C och tillsätt tabletterna strax före användning.
- Lägg till en tablett fosfatashämmare och en tablett proteashämmare till 10 ml RIPA-buffert i ett 15 ml rör; Detta är förstärktRIPA-buffert.
- Protein extraktion
- Överför 210 μL befäst RIPA-buffert (steg 4.1.1) till ett nytt 1,5 ml rör.
- Efter tvättning av provet med PBS (steg 1.2.3), överför den lilla vävnad som är utsedd för proteinutvinning (ungefär 3 mm 3 VS eller en 5 mm längd av GAN) till RIPA-buffertinnehållande rör och placera den på is I minst 10 min. Om du studerar fosforylerade former av proteiner kompletterar du RIPA-bufferten med proteas och fosfatashämmare 14 . Under tiden kan steg för andra komponenter i vävnadsprocessen, såsom fixering (avsnitt 7), utföras.
- Förkyl centrifugen till 4 ° C.
- Använd en plastpestel, homogenisera vävnaden i det RIPA-buffertinnehållande röret. Sonikera vävnaden i 10-15 s vid 20% amplitud. Se till att provetFörblir på is, även under sonication.
- Centrifugera i 10 minuter vid 15 000 xg och 4 ° C.
- Aliquot supernatanten i steg om 50 μl i nya 0,5 ml rör (beroende på de avsedda nedströmsapplikationerna kan valfri inkrementstorlek väljas).
- Förvara alikvoter av proteinlysat i en -80 ° C frysare tills nedströmsansökningarna initieras ( t.ex. ELISA eller Western blots) 20 , 21 .
5. Primär mänsklig VS-kultur
- Dag 1
- Separera VS-vävnaden betecknad för cellodling (som har suttit i odlingsmedium, såsom beskrivits i steg 1.2.6) i ungefär 1 mm 3 stycken med användning av ett par tångar i varje hand.
- Aspirera det tumörstyckeinnehållande mediet med en 10 ml serologisk pipett och överför allt innehåll till ett 15 ml koniskt rör.
- Centrifugera i 3 minuter vid1000 xg och 25 ° C.
- Förbered sönderdelningsmediet i en ny 60 mm odlingsskål genom att kombinera 4,7 ml tillsatt DMEM / F-12-medium med 250 μl kollagenas (slutkoncentration: 160 U / ml) och 50 μl hyaluronidas (slutkoncentration: 250 U / ml) , För en slutlig volym av 5 ml.
OBS! Båda enzymerna ska förvaras i en -20 ° C frys men tinas före preparatet av detta medium (steg 1.2.2). - Efter centrifugering bildar tumörbitarna en pellets i botten av det koniska röret. Pipa försiktigt bort och kassera supernatanten.
- Tillsätt 2 ml det färskgjorda enzyminnehållande sönderdelningsmediet (steg 5.1.4) till tumörpelleten. Pipettera upp och ner flera gånger för att mobilisera vävnaden och överföra det tumörformiga mediet till 60 mm odlingsskålen.
- Placera odlingsskålen i inkubatorn (37 ° C, 5% CO2) i 18 timmar.
- Dag 2
- Varm DMEM / F-12-medium kompletterat med 10% FBS och 1% penicillin / streptomycin (framställt i steg 1.1) i ett 37 ° C vattenbad.
- Ta bort petriskålen som innehåller VS-kulturen från inkubatorn (steg 5.1.7). Använd en 22 G-nål fäst på en 6 ml spruta, aspirera det odlingshaltiga mediet och överför det till ett nytt 15 ml koniskt rör.
- Centrifugera i 5 min vid 1000 xg och 37 ° C.
- Under tiden använder du sterila tångar för att placera det önskade antalet poly-D-lysin- och lamininbelagda glasöverdrag i en 24-brunns odlingsplatta.
OBS: Antal brunnar som odlas beror på provets storlek. Ca 24-32 brunnar kan odlas från en 1 cm 3- tumör, så för de flesta mindre tumörer är planering för 8-16 brunnar av odlade celler lämplig. - Efter centrifugering kasseras supernatanten ( dvs. enzymberikat medium) och resuspendera kvarvarande cellpelleten i färskt, kompletterat DMEM / F-12-medium, förvarmaEd i steg 5.2.1.
OBS: Volymen för att resuspendera pelleten bestäms av antalet brunnar planerade i steg 5.2.4, uppskattning av 1 ml medium per planerad brunn. - Aspirera 2 ml av det resuspenderade cellmediet (steg 5.2.5) med användning av en 5 ml serologisk pipett. Deponera 1 ml av det tumörcellinnehållande mediet i varje beredd brunn i 24-brunnsplattan.
- Fortsätt aspirera och deponera tumörcellhaltigt medium (aspirera i steg om 2 ml, varav 1 ml deponeras i varje planerad brunn) tills tumörcellsuspensionen är lika fördelad mellan alla beredda brunnar.
- Placera 24-brunnsplattan i 37 ° C inkubatorn över natten.
- Dag 3
- Om betydande skräp noteras på botten av brunnarna, byt försiktigt mediet i varje brunn till nytt, kompletterat DMEM / F-12 odlingsmedium, var försiktig så att inte adhäva vidhäftande celler. Om inte, sätt tillbaka plattan till inkubatorn och byt ut denE medium för första gången på dag 5.
- Dag 5-7 och därefter
- Byt mediet var tredje dag.
OBS! Primär mänskliga VS- och GAN-celler upprätthålls i allmänhet i odling tills de används i nedströmsapplikationer, vid eller omkring 14 dagar. Kulturrenligheten minskar efter denna 19 .
- Byt mediet var tredje dag.
6. Primär human GAN-kultur
- Dag 1
- Under ett dissekeringsmikroskop isolerar fascikaler från vävnaden utsedd för GAN-kulturen (som har suttit i odlingsmedium, såsom beskrivs i steg 1.2.6).
- Isolera fasciklerna från epineurium och fibröst skede genom att dra på perineurium med nr. 5 tångar medan du klämmer fast epineurium med nr. 3 tångar.
- När fasciklarna är tillräckligt isolerade från det omgivande epineuriet, överför dem till en ny odlingsskål innehållande 2 ml färskt supGenomfört medium.
- Skär fästarna i 1 till 2 mm segment med skalpelsbladet.
- Pipettera de små fassiklisterna och omgivande medium i ett 15 ml rör innehållande 3 ml färskt tillsatt odlingsmedium, så att den totala volymen i 15 ml röret blir 5 ml.
- Centrifugera provet i 3 minuter vid 1000 xg och 25 ° C.
- Under tiden gör du ett Schwann-cellodlingsmedium i en ny 60 mm petriskål genom att kombinera 4,7 ml tillsatt DMEM / F-12-medium, 250 | il kollagenas och 50 | il hyaluronidas, för en slutlig volym av 5 ml.
OBS: Förvara båda enzymerna vid -20 ° C; Tina dem vid rumstemperatur innan du preparerar detta medium (steg 1.2.2). - Efter centrifugering av provet kommer kondenserna att kondensera till en liten pellet i det koniska röret. Kassera supernatanten.
- Tillsätt 2 ml det färskgjorda enzyminnehållande sönderdelningsmediet (steg 6.1.6) till nervpelleten. Pipetter upp och dÄger flera gånger för att mobilisera vävnaden och överföra den till en ny 60 mm odlingsskål.
- Placera skålen i inkubatorn (37 ° C, 5% CO2) i 20-22 timmar.
OBS: Detta är en längre inkubation än vad som behövs för VS-prov (steg 5.1.7).
- Under ett dissekeringsmikroskop isolerar fascikaler från vävnaden utsedd för GAN-kulturen (som har suttit i odlingsmedium, såsom beskrivs i steg 1.2.6).
- Dag 2
- Varmt tillsatt DMEM / F-12-medium i ett 37 ° C vattenbad.
- Använd en 22 G-nål fäst på en 6 ml spruta, aspirera det cellodlingshaltiga mediet och överför det till ett nytt 15 ml koniskt rör.
- Centrifugera i 5 min vid 1000 xg och 37 ° C.
- Kassera supernatanten och resuspendera provet i nytt, förvärmt, kompletterat DMEM / F-12 odlingsmedium.
- Använd sterila tångar för att placera det önskade antalet belagda täckglas i brunnarna i en 24-brunns odlingsplatta.
ANMÄRKNING: Beräkning av två brunnar av odlade celler per 1 cm nervprov främjar robust kulturtillväxt. - Tillsätt 1 ml av det odlingshaltiga mediet till varderaBetecknas väl i 24-brunnsplattan.
- Placera 24-brunnsplattan i inkubatorn vid 37 ° C och 5% CO2.
- Dag 3
- Om betydande skräp noteras i brunnarna, ersätt försiktigt mediet med nytt tillsatt DMEM / F-12 odlingsmedium, var försiktig så att inte adherenta celler avlägsnas. Om inte, skicka plattan till inkubatorn och byt mediet första gången på dag 5.
- Dag 5-7 och därefter
- Byt mediet var tredje dag.
7. VS & GAN Tissue Fixation
- Pipett 1-1,2 ml 4% paraformaldehyd (PFA; CAUTION) i ett nytt 1,5 ml rör.
- Efter tvättning av tumören eller nerven med PBS (steg 1.2.3), överför en liten bit vävnad (ca 3 mm 3 VS eller en 5 mm längd GAN) till 4% PFA och placera röret på en skakning vid 4 ° C. Se till att provet är helt nedsänkt i tHan lösning.
- Efter minst 2 timmars fixering, hämta röret från skakan och fortsätt med vidare bearbetning ( t.ex. inbäddning i paraffin eller optimal skärtemperaturförening (OCT) för efterföljande immunhistokemi eller immunofluorescens) 22 , 23 , 24 . Alternativt kan vävnaden snäppfrysas, såsom tidigare beskrivits 25 , 26 .
8. Insamling och lagring av humant perilymph under translabyrintisk VS-resektion
- Placera tre sterila 1,5 ml rör på is.
OBS: Ett rör sparas som en säkerhetskopia vid förorening. - Fyll ett 1,5 ml rör med ca 1,2 ml PBS-lösning som har filtrerats två gånger med ett 0,22 μm filter.
OBS! För att samla perilimf under en translabyrint VS-resektion måste kirurgen först se till att surgiKalfältet är fritt från benstoft, blod eller saltlösning. Kirurgen kan använda ett Schuknecht 21 eller 24 G sugrör i den icke dominerande handen för detta ändamål.
En typisk plats för att extrahera perilimfen är den laterala halvcirkelformiga kanalen (dock kan det bakre halvcirkelformiga kanalen eller runda fönstermembranet också nås, beroende på kirurgens preferens). Kirurgen ska försiktigt avlägsna det labyrintiska benet med en diamantburna (med kontinuerlig sugbevattning) för att identifiera den blå linjen ( dvs den membranösa labyrinten) i den halvcirkelformiga kanalen. Den halvcirkelformiga kanalen tränger igenom den blå linjen med en lång 27 G-nål fäst på en 1 ml tuberkulinspruta. - Be kirurgen att försiktigt aspirera en liten mängd perilimf och sedan passera sprutan och den medföljande nålen till den kirurgiska sjuksköterskan.
OBS: Vanligen samlas en droppe perilymph eller mindre. Om den observerade volymen är större, är provet sannolikt förorenat med andra fluid. - Öppna det beredda, tomma 1,5 ml röret och röret fyllt med PBS direkt före användning. Var försiktig så att du inte rör rörets lock innan du öppnar dem.
- Ta in sprutan och den fästa nålen från kirurgiska sjuksköterskan och rengör vätskan helt i det tomma röret, var försiktig så att du inte rör röret självt med nålen.
- Lossa försiktigt nålen från sprutan. Förorena inte nålspetsen och fortsätt att hålla den i ena handen.
OBS! En mycket liten volym perilimf har samlats in, så lite vätska kan förbli i nålens långa spets. - Å andra sidan, använd själva sprutan (utan nålen) att suga 0,2 ml filtrerad PBS-lösning från det beredda röret i sprutans kropp.
- Sätt tillbaka nålen på sprutan. Evakuera sprutan fullständigt i röret som innehåller perilymph, med hjälp av sterila PBS för att spola nålspetsen.
- Stäng perilymph- och PBS-innehållande rör och placera Det på is.
- Kassera nålen i en spärrbehållare.
- Placera röret som innehåller perilymph i -80 ° C frysaren så snart som möjligt.
9. Samling och lagring av human CSF
- Placera tre (eller mer) sterila 1,5 ml rör på is.
OBS! Ett rör kommer att vara en säkerhetskopia vid förorening eller en provvolym som är större än förväntat. - Efter att du öppnat dura materen, fråga kirurgen att samla CSF med en 3 ml spruta (utan en fast nål).
OBS! För att förhindra förorening bör CSF-samling ske omedelbart efter öppnandet av dura materen. - Be kirurgen att ge sprutan till operationssjuksköterskan.
- Ta in sprutan från den kirurgiska sjuksköterskan och evakuera fullständigt den önskade volymen av CSF i röret / tubarna.
- Stäng röret och placera dem på is.
- Placera röret / -rören i -80 ° C frysaren så snart som möjligt.
- Beräkna det önskade genomantalet (gc) -antalet och multipliciteten av infektion (MOI) som är nödvändig för det föreslagna transduktionsexperimentet med hjälp av virusstockskoncentrationen som referens Virusbeståndet kan utspädes direkt i tillskott av odlingsmedium.
OBS: Varje viral vektor som är lämplig för primärcellstransduktion kan användas; Se Landegger et al. (2017) för en detaljerad jämförelse av sex olika adeno-associerade virus serotyper 27 . Vidare, vid odling av primära humana celler bestäms cellantalet inte typiskt före plätering på täckglas. Primär VS-celler svarar inte bra på trypsinisering och passering, så för en pålitlig MOI-beräkning kan antalet adherenta celler per brunn beräknas med ett faskontrastmikroskop. Alternativt, om cellerna ligger nära sammanflödet, kan deras antal beräknas på ett tillförlitligt sätt med hjälp av standardcelltäthetsvärden förEn brunn med 24 brunnar ( t.ex. 5 x 10 4 celler per brunn). - Under en laminärflödeskåpa, bereda kompletterat medium innehållande den önskade mängden virus i ett 15 ml koniskt laboratorierör, så att 1 ml virusinnehållande medium framställes för varje cell av celler som skall transduceras. Pipettera det virusinnehållande mediet upp och ner för att blanda försiktigt men noggrant.
- Använd sterila tångar, överför täckglasen med primära VS-celler (steg 5.2.8) från den ursprungliga 24-brunnsplattan till en ny 24-brunnsplatta. Efter överföringen av varje enskild täckglas lägger man till 1 ml virusinnehållande medium. Virvel plattan varje gång mediet tillsättes för att säkerställa att cellerna är belagda jämnt med viruset.
- Inkubera vid 37 ° C och 5% CO2 under det planerade experimentets varaktighet.
OBS: Inkubationer som sträcker sig från 48-120 h har alla visat lovande transduktionsresultat 27 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Primära humana VS-celler i odling, som fastställd i avsnitt 5, kan behandlas som informativa modeller för sjukdomsassocierade processer i många nedströms forskningsapplikationer ( Figur 1 ). Friska Schwann-celler som odlas i avsnitt 6 ger en direkt och lärorik jämförelsepunkt. Som beskrivs nedan finns omfattande data från VS och GAN som behandlas enligt denna enhetliga metodiska ram finns i flera artiklar som tidigare publicerats 12 , 13 , 14 , 15 , 27 .
Den framgångsrika transduktionen av primära VS-celler med adeno-associerade virus för genterapi presenteras här för första gången ( Figur 2 ). Primär-VS-celler transducerades i kultur w Med GFP-uttryckande Anc80, en förutsedd förfader till adeno-associerade virus 28 . Anc80 har visat sig vara en maximalt effektiv vektor för genöverföring i murina cochleära vävnader in vitro och in vivo 27 . Den effektiva transduktionen av primära humana celler med denna vektor bär viktiga implikationer för framtida forays i genterapi för VS.
Figur 1: Ljusfältbilder av primära humana vestibulära Schwannomakulturer.
Typiska mönster i organisationen av VS-celler i kulturen kan identifieras. Skalstång = 200 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
2 "class =" xfigimg "src =" / files / ftp_upload / 55827 / 55827fig2.jpg "/>
Figur 2: Representativ immunfluorescensbild av primära humana vestibulära Schwannom-kulturer efter exponering för GFP-uttryckande Anc80 i 48 h vid en mångfald av infektion (MOI) på 250 000.
Grön = GFP; Röd = faloidin / F-aktin (fläckar cytoskeletten); Blå = DAPI (fläckar kärnan). Skalstänger = 50 μm (A) och 100 μm (B). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta manuskript beskriver en enhetlig metodisk ram för VS-forskning, som beskriver samtidig behandling av humana VS- och GAN-prover för nedströms forskningsapplikationer. Eftersom VS-forskning går in i precisionsmedicinens ålder, kan det vara möjligt att upptäcka molekylära, cellulära, genetiska och proteomiska insikter som är specifika för enskilda patienter för att förbereda samma prov i former som kan svara på många forskningsfrågor.
Renheten hos humana Schwann-celler och VS-kulturer utvärderades grundligt med tiden genom immuncytokemi, med användning av förhållandet mellan cellerna positiva för S100-markören och de positiva för DAPI-nukleär fläcken 19 . Följaktligen rekommenderas att man utför experiment på primära humana Schwann-cellkulturer inom de första två veckorna efter plätering av cellerna, eftersom renheten hos dessa celler är den högsta under denna period; Därefter börjar fibroblastliknande celler att dominera. DuGh VS-cellkulturer är också maximalt rena vid två veckor i odling, VS-celler saknar kontaktmedierad hämning och kommer fortsätta att proliferera vid senare steg. Dessutom visade en direkt mikroarray-jämförelse av proteinuttryck från VS-vävnad (sektion 4) och VS-celler i odling från samma tumörer (avsnitt 5) framgångsrikt att VS-kulturer uppvisar en tillfredsställande hög nivå av biologisk likhet med deras respektive modertumörer 19 . Den framgångsrika kvantifieringen av proteiner av intresse kan utföras via Western blot av proteinlysat genererade i sektion 4 och kvantifieringen av RNA-transkript via qRT-PCR av RNA extraherad från vävnader bevarade med RNA-stabiliseringslösning (avsnitt 2) 12 , 13 , 14 .
VS- och GAN-celler i odling kan exponeras för kemiskt aktiva substanser, såsom icke-steroida antiinflammatoriska läkemedel, smalaL interfererande RNA (siRNA) eller naturliga organiska föreningar för att belysa sjukdomsspecifika molekylära mekanismer eller för att testa ett terapeutiskt mål 13 , 14 , 29 . Föreningar av intresse kan direkt tillsättas till celler i odling efter lämpliga spädningar i regelbundet tillsatt odlingsmedium. För att bedöma effekten av sådana substanser på viktiga aspekter av cellfysiologi, bromodeoxiidin (BrdU) -märkning för proliferation, terminal deoxynukleotidyltranferas-DUTP-nickändmärkning (TUNEL) för apoptos och 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) - Reduktion av 2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) för metabolisk lönsamhet är tillförlitliga analyser som kan användas med förtroende för dessa celler 19 . Kulturmedium från behandlade celler kan också försiktigt aspireras, förvaras vid -20 ° C och testas för att kvantifiera relativa nivåer av utsöndrade substanser, såsom prostaglandin E2, utsöndringen av vilken cEn påverkas av läkemedelsbehandling 13 . Dessutom tillhandahåller vävnadsfixering (avsnitt 7) och efterföljande inbäddning i OCT eller paraffin ett robust substrat för immunofluorescensanalyser 13 , 14 .
Det tumör- eller nervkonditionerade medium som alstras i avsnitt 3 tillhandahåller ett enkelt och effektivt sätt att bedöma VS-utsöndrade lösliga molekyler och extrahera extracellulära vesiklar. Cytokin-arrays eller ELISA kan utföras på dessa sekret, enligt vad som anges i tillverkarens protokoll, som beskrivs i två publicerade studier 9 , 12 . Extracellulära vesiklar kan renas från dessa sekreter med användning av ultracentrifugering, såsom detaljerad i en tidigare publikation 30 . Alternativt kan sekreterna själva användas som patientspecifika reagens för nedströms forskningsapplikationer. Till exempel, i ett experiment som avslöjarLedde till en ny mekanism som låg till grund för VS-associerad sensorineural hörselnedsättning, sekreter uppsamlades från VS-vävnaden hos patienter med dåliga hörsel- och VS-patienter med god hörsel efter inkubation i DMEM i 72 timmar (avsnitt 3). Dessa tumörsekretioner applicerades sedan på murina cochleära explants, och det avslöjades att tumörsekretioner från VS-patienter med dålig hörsel orsakade mer skada på cochleära explanter än utsöndringar från VS-patienter med god hörsel 15 . Det är viktigt att sekret som samlats vid tidpunkter före 72 timmar inte resulterade i väsentlig skada.
Humant perilymph som samlats in från patienter som genomgår translabyrintisk VS resektion (avsnitt 8) representerar en spännande ny aveny för upptäckten av VS biomarkörer. Prov som samlats in enligt avsnitt 8 analyserades genom vätskekromatografi-tandemmasspektrometri (LC-MS / MS) för att kartlägga proteinet av humant perilimf och 15 kandidatbiomarkörer av VS lyckades iDentified 31 . En liknande analys kan vara möjlig med användning av human CSF samlad från VS-patienter (avsnitt 9).
Ett viktigt övervägande i VS-forskning är valet av lämplig kontrollvävnad. Tidigare studier har använt den cochleära nerven, den vestibulära nerven och orelaterade perifera nerver (såsom den sciatic nerven), till variabel effekt 22 , 32 . Men flera orsaker leder till stöd för användningen av GAN som maximalt relevanta kontroller 15 . Liksom den vestibulära nerven är GAN en perifer, sensorisk nerv med axoner ensheathed av Schwann celler. Det är viktigt att en litteratursökning avslöjar att schwannomer aldrig har visat sig utveckla från GAN, vilket gör neoplastiska förändringar i denna vävnad osannolik. Dessutom avlivas GAN regelbundet när man når till de djupare halsens strukturer, vilket ger sjukhusbaserade forskare lätt tillgång till hälsaY prover under rutinmässiga halsdissektioner och parotidektomier. Även om den kochleära nerven ofta offras under VS-kirurgi och kan vara lättillgänglig, riskerar dess närhet till de vestibulära nerverna delningen av samma mikromiljö, vilket kan visa före-tumörmolekylära förändringar 33 . Andra laboratorier har också framgångsrikt utnyttjat GAN som en adekvat kontroll för VS-forskning, och det rekommenderas att fortsätta denna praxis 20 , 21 , 22 , 34 .
Ett kritiskt men ofta förbisett steg inom celltypspecifika kulturprotokoll (sektionerna 5 och 6) är korrekt avlägsnande av icke-livskraftig vävnad och blodkärl. Avlägsnande av dessa icke-tumörvävnader är avgörande för att skapa robusta odlingar med maximal renhet. Vidare är det viktigt att plätera cellinnehållande odlingsmedium på täckglasVar noga med hur mycket vävnad som överförs till varje brunn. Att uppnå en jämn, lätt tät fördelning av celler som innehåller några "bitar" av tätare vävnad i varje brunn är särskilt viktigt för Schwann-celler, vilket kräver ett tillräckligt antal vidhäftande celler att frodas. Beläggning av täckglas med poly-D-lysin och laminin möjliggör också en effektiv tillväxt av celler. Cellerna sprider mer robust när täckglasen är belagda i laboratoriet, jämfört med kommersiellt tillgängliga förbelagda produkter.
För att säkerställa en högkvalitativ protein- och RNA-extraktion, verifiera att vävnaden förblir vid temperaturer under 4 ° C under sektionerna 2 och 4. Dessutom, eftersom litteraturen om analys av VS-sekret är knappa (avsnitt 3), kan nya projekt kräva Ytterligare innovationer och olika inkubationslängder.
Eftersom metoder för att adressera VS-patobiologi fortsätter att avancera, användningen av denna strEamlined kombination av grundläggande tekniker gör det möjligt att maximera informationen från ett enda humant prov. Den informerade samtidig bearbetningen av VS- och GAN-vävnader kommer att vara integrerad i genereringen av effektiva farmakologiska och genetiska terapier mot denna försvagande tumör.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institute of Deafness och andra kommunikationsstörningar som ger R01DC015824 (KMS) och T32DC00038 (stödja JES och SD), försvarsministeriet W81XWH-14-1-0091 (KMS), Bertarelli Foundation (KMS) , Nancy Sayles Day Foundation (KMS), Lauder Tinnitus Research Center (KMS) och Barnes Foundation (KMS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin 12 mm #1 German Glass Coverslip | Corning | 354087 | Or prepare coverslips with Corning Laminin (CB-40232) and Cultrex Poly-L-Lysine (3438-100-01) |
| CELLSTAR 15 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 188161 | |
| CELLSTAR 50 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 227261 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Sterile-filtered | Sigma-Aldrich | C1639 | |
| Costar 24 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates, Sterile | Corning | 3526 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10313-039 | |
| DMEM/F-12, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 11320-033 | |
| Dumont #3 Forceps, Dumoxel | Fine Science Tools | 11231-30 | Autoclave prior to use |
| Dumont #5 Forceps, Standard tip, Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | Autoclave prior to use |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | Aliquot in 50 mL tubes and store in -20°C freezer |
| Hyaluronidase from Bovine Testes, Type I-S, Lyophilized Powder | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, sterile | EMD Millipore | SLGP033RS | |
| Paraformaldehyde, Reagent Grade, Crystalline | Sigma-Aldrich | P6148 | Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online |
| PBS, pH 7.4, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | Autoclave prior to use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100 mL | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Tablets | Roche | 04906845001 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets | Thermo Fisher Scientific | 88666 | |
| Pipettes and pipette tips, 5/10/25 mL | Variable | Variable | |
| Plastic Homogenization Pestle for 1.5/2.0 mL Microtubes | E&K Scientific | EK-10539 | |
| PrecisionGlide Needles, 27 G x 1 1/2 in | BD | 301629 | |
| RIPA Buffer | Boston BioProducts | BP-115 | |
| RNAlater (RNA stabilization solution) | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 mL | Eppendorf | 022363719 | Autoclave prior to use |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 mL | Eppendorf | 022363204 | Autoclave prior to use |
| Saline - 0.9% Sodium Chloride Injection, bacteriostatic, 20 mL | Hospira | 0409-1966-05 | |
| Scalpel Blades - #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Schuknecht Suction Tube 24 gauge | Bausch + Lomb | N1698 42 | Useful for the surgical approach (in addition to common otologic surgical instruments) and e.g. a blue surgical marker |
| Specimen Container, OR sterile, 4OZ | Medline | DYND30331H | |
| Stemi 2000-C Stereo Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| Syringe/Needle Combination, Luer-Lok Tip, 5 mL, 22 G x 1 in. | BD | 309630 | |
| Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 1 mL | BD | 309659 | |
| Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 3 mL | BD | 309656 | |
| Ultrasonic homogenizer, 4710 Series, CV18 probe | Cole-Parmer | CP25013 |
References
- Babu, R., et al. Vestibular schwannomas in the modern era: epidemiology, treatment trends, and disparities in management. J Neurosurg. 119 (1), 121-130 (2013).
- Gal, T. J., Shinn, J., Huang, B. Current epidemiology and management trends in acoustic neuroma. Otolaryngol Head Neck Surg. 142 (5), 677-681 (2010).
- Propp, J. M., McCarthy, B. J., Davis, F. G., Preston-Martin, S.
- Stangerup, S. E., Tos, M., Thomsen, J., Caye-Thomasen, P.
- Tos, M., Stangerup, S. E., Caye-Thomasen, P., Tos, T., Thomsen, J. What is the real incidence of vestibular schwannoma? Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 130 (2), 216-220 (2004).
- Stangerup, S. E., Caye-Thomasen, P. Epidemiology and natural history of vestibular schwannomas. Otolaryngol Clin North Am. 45 (2), 257-268 (2012).
- Mahaley, M. S., Mettlin, C., Natarajan, N., Laws, E. R., Peace, B. B. Analysis of patterns of care of brain tumor patients in the United States: a study of the Brain Tumor Section of the AANS and the CNS and the Commission on Cancer of the ACS. Clin Neurosurg. 36, 347-352 (1990).
- Carlson, M. L., Link, M. J., Wanna, G. B., Driscoll, C. L.
- Dilwali, S., et al. Sporadic vestibular schwannomas associated with good hearing secrete higher levels of fibroblast growth factor 2 than those associated with poor hearing irrespective of tumor size. Otol Neurotol. 34 (4), 748-754 (2013).
- Caye-Thomasen, P., et al. VEGF and VEGF receptor-1 concentration in vestibular schwannoma homogenates correlates to tumor growth rate. Otol Neurotol. 26 (1), 98-101 (2005).
- Koutsimpelas, D., et al. The VEGF/VEGF-R axis in sporadic vestibular schwannomas correlates with irradiation and disease recurrence. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 74 (6), 330-338 (2012).
- Dilwali, S., Roberts, D., Stankovic, K. M. Interplay between VEGF-A and cMET signaling in human vestibular schwannomas and schwann cells. Cancer Biol Ther. 16 (1), 170-175 (2015).
- Dilwali, S., Kao, S. Y., Fujita, T., Landegger, L. D., Stankovic, K. M. Nonsteroidal anti-inflammatory medications are cytostatic against human vestibular schwannomas. Transl Res. 166 (1), 1-11 (2015).
- Dilwali, S., et al. Preclinical validation of anti-nuclear factor-kappa B therapy to inhibit human vestibular schwannoma growth. Mol Oncol. 9 (7), 1359-1370 (2015).
- Dilwali, S., Landegger, L. D., Soares, V. Y., Deschler, D. G., Stankovic, K. M. Secreted Factors from Human Vestibular Schwannomas Can Cause Cochlear Damage. Sci Rep. 5, 18599 (2015).
- Blakeley, J. Development of drug treatments for neurofibromatosis type 2-associated vestibular schwannoma. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 20 (5), 372-379 (2012).
- Schroeder, R. D., Angelo, L. S., Kurzrock, R. NF2/merlin in hereditary neurofibromatosis 2 versus cancer: biologic mechanisms and clinical associations. Oncotarget. 5 (1), 67-77 (2014).
- Schularick, N. M., Clark, J. J., Hansen, M. R. Primary culture of human vestibular schwannomas. J Vis Exp. (89), (2014).
- Dilwali, S., et al. Primary culture of human Schwann and schwannoma cells: improved and simplified protocol. Hear Res. , 25-33 (2014).
- Brown, C. M., Ahmad, Z. K., Ryan, A. F., Doherty, J. K. Estrogen receptor expression in sporadic vestibular schwannomas. Otol Neurotol. 32 (1), 158-162 (2011).
- Cioffi, J. A., et al. MicroRNA-21 overexpression contributes to vestibular schwannoma cell proliferation and survival. Otol Neurotol. 31 (9), 1455-1462 (2010).
- Doherty, J. K., Ongkeko, W., Crawley, B., Andalibi, A., Ryan, A. F. ErbB and Nrg: potential molecular targets for vestibular schwannoma pharmacotherapy. Otol Neurotol. 29 (1), 50-57 (2008).
- Aguiar, P. H., Tatagiba, M., Samii, M., Dankoweit-Timpe, E., Ostertag, H. The comparison between the growth fraction of bilateral vestibular schwannomas in neurofibromatosis 2 (NF2) and unilateral vestibular schwannomas using the monoclonal antibody MIB 1. Acta Neurochir (Wien). 134 (1-2), 40-45 (1995).
- Cattoretti, G., et al. Monoclonal antibodies against recombinant parts of the Ki-67 antigen (MIB 1 and MIB 3) detect proliferating cells in microwave-processed formalin-fixed paraffin sections. J Pathol. 168 (4), 357-363 (1992).
- Hung, G., et al. Immunohistochemistry study of human vestibular nerve schwannoma differentiation. Glia. 38 (4), 363-370 (2002).
- Archibald, D. J., et al.
- Landegger, L. D., et al. A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).
- Zinn, E., et al. In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector. Cell Rep. 12 (6), 1056-1068 (2015).
- Kim, B. G., et al. Sulforaphane, a natural component of broccoli, inhibits vestibular schwannoma growth in vitro and in vivo. Sci Rep. 6, 36215 (2016).
- Soares, V. Y., et al. Extracellular vesicles derived from human vestibular schwannomas associated with poor hearing damage cochlear cells. Neuro Oncol. 18 (11), 1498-1507 (2016).
- Lysaght, A. C., et al.
- Caye-Thomasen, P., Borup, R., Stangerup, S. E., Thomsen, J., Nielsen, F. C. Deregulated genes in sporadic vestibular schwannomas. Otol Neurotol. 31 (2), 256-266 (2010).
- Schulz, A., et al. The importance of nerve microenvironment for schwannoma development. Acta Neuropathol. 132 (2), 289-307 (2016).
- Torres-Martin, M., et al. Global profiling in vestibular schwannomas shows critical deregulation of microRNAs and upregulation in those included in chromosomal region 14q32. PLoS One. 8 (6), e65868 (2013).
