Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

En samlet metodologisk ramme for Vestibular Schwannoma Research

Published: June 20, 2017 doi: 10.3791/55827
Automatic Translation
*1,2,3, *1,4, 1,4, 1,2, 1,2, 1,2,4
1Eaton Peabody Laboratories, Department of Otolaryngology, Massachusetts Eye and Ear, 2Department of Otolaryngology, Harvard Medical School, 3Department of Otolaryngology, Vienna General Hospital, Medical University of Vienna, 4Program in Speech and Hearing Bioscience and Technology, Harvard Medical School
* These authors contributed equally

Summary

Formålet med denne protokol er at skitsere indsamling og behandling af humane kirurgiske prøver til flere downstream-applikationer i vestibulær schwannoma og Schwann-cellet forskning.

Abstract

Vestibulære schwannomer er de mest almindelige neoplasmer af cerebellopontinvinklen og udgør 6-8% af alle intrakraniale vækst. Skønt disse tumorer forårsager sensorineurelt høretab i op til 95% af de ramte individer, forbliver de molekylære mekanismer, der ligger til grund for dette høretab, unnvikende. Denne artikel beskriver de trin, der er etableret i vores laboratorium for at lette indsamling og behandling af forskellige primære humane vævsprøver til downstream-forskningsapplikationer, der er integreret i studiet af vestibulære schwannomer. Specifikt beskriver dette værk en samlet metodologisk ramme for indsamling, behandling og kultur af Schwann- og schwannomaceller fra kirurgiske prøver. Dette er integreret med parallelle behandlingstrin, der nu betragtes som afgørende for nuværende forskning: indsamling af tumor- og nervesekretioner, bevaring af RNA og ekstraktion af protein fra indsamlede væv, fiksering af væv til fremstilling af sektioner, enD eksponering af primære humane celler til adeno-associerede vira til anvendelse på genterapi. Desuden fremhæver dette arbejde den translabyrintiske kirurgiske tilgang til at samle denne tumor som en unik mulighed for at opnå menneskelig sensorisk epithel fra det indre øre og periliem. Der gives tips til forbedring af eksperimentelle kvalitet og almindelige faldgruber fremhævet.

Introduction

Vestibulære schwannomer (VS'er) er de mest almindelige neoplasmer af cerebellopontinvinklen, diagnosticeret hos 1 ud af hver 100.000 individer. Selvom ikke-metastatisk, påvirker disse tumorer alvorligt en patients livskvalitet 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Berørte personer lever normalt med høretab, tinnitus og en følelse af lydhørhed. Symptomer bliver mere og mere svækkende, da tumoren vokser, hvilket skaber balanceproblemer, ansigtslamper og svækkelse af andre kraniale nervefunktioner. Livstruende komplikationer som følge af hjernestamme kompression kan også resultere 7 .

Forvaltningsmuligheder for VS er i det væsentlige begrænset til vågent venter på statiske tumorer og stereotaktisk strålebehandling eller kirurgisk resektion for voksende tumorer

Fordi VS'er stammer fra en perifer sensorisk nerve ( dvs. den vestibulære nerve), er det vigtigt at sammenligne VS-associerede observationer med dem, der stammer fra en passende kontrolnerve, såsom den humane store aurikulære nerve (GAN). Friske GAN'er aflives regelmæssigt under parotidektomi eller halsdissektioner og kan bruges som robuste modeller til sund Schwann-cellefysiologi 9 .

Fordi der ikke findes FDA-godkendte lægemidler til behandling eller forebyggelse af sporadisk VS, er det afgørende, at forskere belyser den underliggende molekylære mechaSygdomme af sygdommen for at identificere terapeutiske mål. Proteiner, der har vist sig at spille en rolle i VS-patogenesen, omfatter merlin, vaskulær endothelial vækstfaktor (VEGF), cyclooxygenase 2 (COX-2), nuklear faktor kappa B (NF-KB), tumornekrosefaktor alfa (TNF-alpha) , Epidermal vækstfaktorreceptor (EGFR) og beslægtede signalmolekyler 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 .

Nylige fremskridt har udvidet og forbedret protokoller til indsamling, behandling, kultur og efterfølgende undersøgelse af primære humane vestibulære schwannomer og sunde nervevæv 18 , 19 . Imidlertid er de fleste eksisterende protokoller designet til at rumme forberedelsenAtion af sådanne væv til en enkelt downstreamforskning ( dvs. cellekultur alene). Denne artikel præsenterer en samlet metodologisk ramme for samtidig behandling af en enkelt primær human VS- eller GAN-prøve til flere downstream-applikationer: celletypespecifik kultur, proteinekstraktion, RNA-konservering, tumorsekretionsopsamling og vævsfiksering. Dette arbejde beskriver også kirurgisk indsamling og behandling af human cerebrospinalvæske (CSF) og perilymph under translabyrint VS-resektion, da disse nært beslægtede væv kan tjene som vigtige kilder til biomarkører til VS. Endelig præsenterer denne protokol trin for viral transduktion af primære humane VS-celler i kultur som en ny anvendelse af dette væv til anvendelse i genterapi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Skriftligt informeret samtykke til indsamling af alle prøver blev opnået inden operationen, og forsøgene blev udført i overensstemmelse med etiske regler for Verdensmedicinsk Forening (Helsinki-erklæringen). Alle afsnit af studieprotokollen blev godkendt af den institutionelle undersøgelsesstyrelse i Massachusetts Eye and Ear og Massachusetts General Hospital.

BEMÆRK: Sektion 1-7 nedenfor er designet til at udføres sekventielt ved modtagelse af en primær human VS eller GAN-prøve fra operationsstuen. Forarbejdning bør altid begynde med afsnit 1. Derefter bør RNA i princippet bevares først (afsnit 2) efterfulgt af vævsfremstilling til indsamling af sekreter (afsnit 3) og proteinekstraktion (afsnit 4). Væv, der skal dyrkes (afsnit 5 for VS, sektion 6 for GAN) kan sidde i suppleret dyrkningsmedium, medens sektioner 2, 3 og 4 udføres. Fastgørelsen af ​​væv til snitning (afsnit 7) er meget kort og cEn udføres under et centrifugeringstrin. Afsnit 8 (perilimfeforarbejdning) og afsnit 9 (CSF-behandling) kan udføres ved modtagelse af perilymph eller CSF fra operationsrummet under en translabyrintisk VS-resektion. Sektion 10 (viral transduktion) kan udføres på voksende VS eller Schwann celler i kultur.

1. Forberedelse og modtagelse af en kirurgisk prøve

BEMÆRK: Følgende trin skal udføres i et sterilt miljø, såsom en vævskulturhætte eller laminær flowhætte. Kendskab til grundlæggende steril teknik forventes.

  1. Fremstilling af medium til primær human VS- eller Schwann-cellekultur
    1. Optø en 50 ml alikvot af frosset føtalt bovint serum (FBS) i et 37 ° C vandbad.
    2. Tilsæt 5 ml penicillin / streptomycin-blanding til en 500 ml flaske DMEM / F-12, hvilket resulterer i en endelig fortynding på 1: 100.
    3. Tilsæt 50 ml optøet FBS til 500 ml flasken DMEM / F-12,Hvilket resulterer i en endelig fortynding på 1:10.
    4. Skriv datoen, forskerens initialer og supplerende oplysninger ( f.eks. 1% P / S, 10% FBS) på flasken.
    5. Anbring det nye kulturmedium i køleskabet (4 ° C).
  2. Kvittering og rensning af VS eller GAN prøve
    1. I operationsrummet skal du placere den nyhøstede VS- eller GAN-prøve i steril saltvand i en prøvebeholder. Transport prøven på is fra operationsstuen til en laminær flowhætte i laboratoriet.
      BEMÆRK: Prøvestørrelser og vægt varierer signifikant mellem patienter baseret på størrelsen af ​​den relevante tumor eller mængden af ​​udskåret nerve.
    2. Fjern alikvoter af hyaluronidase (25.000 U / ml) og kollagenase (3.200 U / ml) fra fryseren, og lad enzymerne optøne ved stuetemperatur (kræves til trin 5.1.4 eller 6.1.6 afhængigt af om prøven er En VS eller en GAN).
      BEMÆRK: Resuspensionen af ​​lyofiliserede enzymer iS beskrevet detaljeret på produktdatabladene. Kollagenase kan resuspenderes i en hvilken som helst calciumfri, afbalanceret saltopløsning og hyaluronidase i en opløsning af 0,02 M phosphatpuffer (pH 7,0), 77 mM NaCl og 0,01% 1 mg / ml bovint serumalbumin. Den specifikke aktivitet for hvert lyofiliseret enzym varierer med partiet og bør verificeres forud for resuspension.
    3. Brug en serie på tre 1,5 ml rør fyldt med 1,4 ml 1x sterilt PBS, vask VS eller GAN prøven tre gange. Overfør forsigtigt prøven fra rør til rør med sterile tang. Luk hvert rør, når det indeholder prøven, og ryb det forsigtigt for at vaske.
      BEMÆRK: For at undgå oversvømmelse af 1,5 ml rør kan mindre end 1,4 ml PBS anvendes per rør, hvis tumorstykket er stort.
    4. Sæt prøven i en tør 60 mm petriskål og brug tang for at fjerne alt dødt væv ( dvs. kauteriserede portioner, som normalt er hvide eller uigennemsigtige) og områder med fremtrædende blodkar.
    5. Brug fOrceps eller et skalpelsblad til at opdele prøven i separate stykker til RNA-konservering, proteinekstraktion, sekretionsopsamling, fiksering og cellekultur (se afsnit 2 - 6 nedenfor).
    6. Overfør stykket af prøven udpeget til cellekultur (sektion 5/6) til en ny 60 mm dyrkningsskål indeholdende 5-8 ml koldt suppleret DMEM / F-12-medium (alternativt kan låget i den første dyrkningsskål være Bruges til dette trin).
      BEMÆRK: Mængden af ​​DMEM / F-12-medium der kræves (fra trin 1.1) afhænger af tumorens eller nervens størrelse, men den skal falde mellem 5 og 8 ml. Dette stykke kan sidde i dyrkningsmedium, mens de efterfølgende trin udføres.

2. RNA bevaring af VS og GAN væv (også gyldig for human sensorisk epitel)

  1. Under den laminære strømningshætte overføres 1-1,2 ml RNA-stabiliseringsopløsning til et nyt 1,5 ml rør.
  2. Efter vask af prøven med PBS (trin 1.2.3), dypp kort den lille tærte kortCe af væv udpeget til RNA-bevaring (ca. 3 mm3 VS eller en 5 mm længde af GAN) i RNA-stabiliseringsopløsningen. Sørg for, at prøven er helt nedsænket i opløsningen.
  3. Klargør og mærket et nyt 1,5 ml rør. Hent prøven fra RNA stabiliseringsopløsningen, overfør den til det nye rør og opbevar den i en fryser på -80 ° C.

3. Indsamling af VS- og GAN-sekretionerne

  1. Dag 1
    1. Efter vask af prøven med PBS (trin 1.2.3) skal du placere stykket VS eller GAN udpeget til opsamling af sekretioner i et tomt 1,5 ml rør.
    2. Forbered to yderligere 1,5 ml rør og pipetter 500 μL DMEM (ikke suppleret med FBS) i hvert rør.
      BEMÆRK: Det første rør af DMEM vil blive brugt til at samle tumorsekretionerne, og det andet rør af DMEM vil fungere som en matchet kontrol. Sekretioner kan indsamles i DMEM, hvilket som helst andet typisk kulturmedium ikkeSuppleret med serum eller PBS.
    3. Anbring et af DMEM-holdige rør på en kalibreret digital skala. Tør skalaen, sådan at når røret sidder på toppen af ​​skalaen, læser det 0 mg.
    4. Fjern rør af DMEM fra skalaen, læg det stykke prøve, der er udpeget til indsamling af sekretioner i røret, og veje det. Bemærk resultatet, som vil repræsentere vægten af ​​vævet alene.
    5. Juster volumenet af DMEM i røret under en laminarstrømshætte til 100 μl pr. 10 mg prøve.
    6. Placer røret, der indeholder vævsprøven og dens matchede kontrol (DMEM alene) i inkubatoren (37 ° C, 5% CO2) i en periode, som er i overensstemmelse med planerne for dette forsøg. Inkuber vævet i mindst 72 timer for at samle biologisk anvendelige mængder af tumor- eller nervesekretioner 15 .
  2. Dag 4
    1. Efter inkubering i 72 timer, fjern det sekretionsholdige medium fraPrøve ( dvs. vævskonditioneret medium) ved anvendelse af en 1 ml pipette. For at forhindre gentagne fryse-optøningscykler, alikvote mediet til nye rør i overensstemmelse med de planlagte downstream-analyser ( fx at køre en ELISA med 4 brønde, der kræver 50 μl hver, kan der fremstilles portioner på 210 μl).
    2. Hvis det er nødvendigt, frys det resterende vævstykke i det oprindelige rør (allerede mærket på dag 1) ved -80 ° C til yderligere analyser, såsom DNA-ekstraktion, på et senere tidspunkt.
    3. Opbevar vævet, sekretionerne og kontroller DMEM i en fryser på -80 ° C, indtil nedstrømsapplikationerne påbegyndes ( f.eks. ELISA'er, LC-MS / MS, cytokin-arrays osv. ).

4. Proteinekstraktion fra VS eller GAN Tissue

  1. Fremstilling af befæstet RIPA buffer
    1. Tilsæt en tablet phosphataseinhibitor og en tablet proteaseinhibitor til 10 ml RIPA-buffer i et 15 ml rør; Dette er berigetRIPA buffer.
      BEMÆRK: Opbevar RIPA-bufferen ved 4 ° C og læg tabletterne lige før brug.
  2. Proteinekstraktion
    1. Overfør 210 μl befæstet RIPA buffer (trin 4.1.1) til et nyt 1,5 ml rør.
    2. Efter vask af prøven med PBS (trin 1.2.3), overfør det lille stykke væv, der er udpeget til proteinekstraktion (ca. 3 mm3 VS eller en 5 mm længde af GAN) til RIPA-bufferholdige rør og læg det på is I mindst 10 min. Hvis man studerer phosphorylerede former af proteiner, supplerer RIPA-bufferen med protease- og phosphataseinhibitorer 14 . I mellemtiden kan trin for andre komponenter i vævsprocessen, såsom fiksering (afsnit 7), udføres.
    3. Forkøl centrifugen til 4 ° C.
    4. Ved hjælp af en plastpestle homogeniseres vævet i det RIPA-bufferholdige rør. Sonikere vævet i 10-15 s ved 20% amplitude. Sørg for at prøvenForbliver på is, selv under lydbehandling.
    5. Centrifuge i 10 minutter ved 15.000 xg og 4 ° C.
    6. Aliquot supernatanten i trin 50 μL i nye 0,5 ml rør (afhængig af de tilsigtede downstream applikationer, kan enhver inkrementstørrelse vælges).
    7. Opbevar alikvoterne af proteinlysat i en fryser på -80 ° C indtil nedstrømsapplikationerne påbegyndes ( f.eks. ELISA'er eller Western blots) 20 , 21 .

5. Primary Human VS Culture

  1. Dag 1
    1. Separat VS-væv udpeget til cellekultur (som har siddet i dyrkningsmedium som beskrevet i trin 1.2.6) i ca. 1 mm 3 stykker ved anvendelse af et par tang i hver hånd.
    2. Aspirer det tumorstykkeholdige medium med en 10 ml serologisk pipette og overfør alt indhold til et 15 ml konisk rør.
    3. Centrifuge i 3 min1000 xg og 25 ° C.
    4. Klargør desintegrationsmedium i en ny 60 mm kulturskål ved at kombinere 4,7 ml suppleret DMEM / F-12 medium med 250 μl kollagenase (slutkoncentration: 160 U / ml) og 50 μl hyaluronidase (slutkoncentration: 250 U / ml) , Til et slutvolumen på 5 ml.
      BEMÆRK: Begge enzymer skal opbevares i en fryser på -20 ° C, men optøes før fremstillingen af ​​dette medium (trin 1.2.2).
    5. Efter centrifugering danner tumorstykkerne en pellet i bunden af ​​det koniske rør. Pipetter forsigtigt og kassér supernatanten.
    6. Tilsæt 2 ml det frisklavede enzymholdige desintegrationsmedium (trin 5.1.4) til tumorpellet. Pipetter op og ned adskillige gange for at mobilisere vævet og overføre det tumormaterialeholdige medium til 60 mm kulturskålen.
    7. Anbring kulturskålen i inkubatoren (37 ° C, 5% CO2) i 18 timer.
  2. Dag 2
    1. Varm DMEM / F-12-medium suppleret med 10% FBS og 1% penicillin / streptomycin (fremstillet i trin 1.1) i et 37 ° C vandbad.
    2. Fjern petriskålen, der indeholder VS-kulturen fra inkubatoren (trin 5.1.7). Ved hjælp af en 22 G-nål fastgjort til en 6 ml sprøjte, aspirere det kulturholdige medium og overfør det til et nyt 15 ml konisk rør.
    3. Centrifuge i 5 minutter ved 1000 xg og 37 ° C.
    4. I mellemtiden skal du bruge sterile pincetter til at placere det krævede antal poly-D-lysin- og lamininbelagte glasdæksler i en 24-brønds kulturplade.
      BEMÆRK: Antallet af brønde, der skal dyrkes, afhænger af prøvenes størrelse. Ca. 24-32 brønde kan dyrkes fra en 1 cm 3 tumor, så for de fleste mindre tumorer er planlægning for 8-16 brønde af dyrkede celler passende.
    5. Efter centrifugering kasseres supernatanten ( dvs. enzymberiget medium) og resuspender den resterende cellepellet i frisk suppleret DMEM / F-12-medium, forvarmeEd i trin 5.2.1.
      BEMÆRK: Volumenet til at resuspendere pelleten bestemmes af antallet af brønde, der er planlagt i trin 5.2.4, og estimerer 1 ml medium pr. Planlagt brønd.
    6. Aspirer 2 ml af det resuspenderede cellemedium (trin 5.2.5) ved anvendelse af en 5 ml serologisk pipette. Indsæt 1 ml af det tumorcelleholdige medium i hver fremstillede brønd i 24-brøndspladen.
    7. Fortsæt aspirering og deponering af tumorcelleholdigt medium (aspirering i trin på 2 ml, hvorfra 1 ml deponeres i hver planlagt brønd), indtil tumorcellesuspensionen er ligeligt fordelt mellem alle fremstillede brønde.
    8. Placer 24-brøndspladen i 37 ° C inkubatoren natten over.
  3. Dag 3
    1. Hvis der konstateres betydelige affald på bunden af ​​brøndene, ændres mediet omhyggeligt i hver brønd til nyt suppleret DMEM / F-12 dyrkningsmedium, idet man sørger for ikke at løsne adhærente celler. Hvis ikke, returner pladen til inkubatoren og skift thE medium for første gang på dag 5.
  4. Dage 5-7 og bagefter
    1. Skift medie hver 3. dag.
      BEMÆRK: Primær humane VS- og GAN-celler opretholdes generelt i kultur indtil deres anvendelse i downstream-applikationer, ved eller omkring 14 dage. Kultur renhed falder efter dette 19 .

6. Primær human GAN-kultur

  1. Dag 1
    1. Under et dissekeringsmikroskop isolerer fascikler fra vævet udpeget til GAN-kulturen (som har været i kulturmedium som beskrevet i trin 1.2.6).
      1. Isolér fasciklerne fra epineurium og fibrøs kappe ved at trække på perineuriet ved hjælp af nr. 5 pincet mens clasping epineurium med nr. 3 tang.
    2. Når fasciklene er tilstrækkeligt isolerede fra det omgivende epineurium, overføres dem til en ny kulturskål, der indeholder 2 ml frisk supGennemført medium.
    3. Skær fasciklene i 1 til 2 mm segmenter med scalpel bladet.
    4. Pipetter de små fascikeltyper og omgivende medium ind i et 15 ml rør indeholdende 3 ml frisk suppleret dyrkningsmedium, således at det samlede volumen i 15 ml rør bliver 5 ml.
    5. Centrifuger prøven i 3 minutter ved 1000 xg og 25 ° C.
    6. I mellemtiden fremstilles et Schwann cellekulturmedium i en ny 60 mm petriskål ved at kombinere 4,7 ml suppleret DMEM / F-12 medium, 250 μl kollagenase og 50 μl hyaluronidase til et slutvolumen på 5 ml.
      BEMÆRK: Opbevar begge enzymer ved -20 ° C; Optøbe dem ved stuetemperatur før fremstilling af dette medium (trin 1.2.2).
    7. Efter centrifugeringen af ​​prøven kondenserer fascikterne ind i en lille pille i det koniske rør. Kassér supernatanten.
    8. Tilsæt 2 ml det frisklavede enzymholdige desintegrationsmedium (trin 6.1.6) til nervepellet. Pipetter op og dEgen flere gange for at mobilisere vævet og overføre det til en ny 60 mm kulturskål.
    9. Anbring skålen i inkubatoren (37 ° C, 5% CO 2 ) i 20-22 timer.
      BEMÆRK: Dette er en længere inkubation end nødvendigt for VS-prøver (trin 5.1.7).
  2. Dag 2
    1. Varmt suppleret DMEM / F-12-medium i et 37 ° C vandbad.
    2. Ved hjælp af en 22 G-nål fastgjort til en 6 ml sprøjte, aspirere det cellekulturholdige medium og overfør det til et nyt 15 ml konisk rør.
    3. Centrifuge i 5 minutter ved 1000 xg og 37 ° C.
    4. Kassér supernatanten og resuspender prøven i nyt, forvarmet, suppleret DMEM / F-12 dyrkningsmedium.
    5. Brug sterile pincetter til at placere det krævede antal overtrukne dækslip i brøndene på en 24-brønds kultiveringsplade.
      BEMÆRK: Beregning af to brønde af dyrkede celler pr. 1 cm nerveprøve fremmer robust kulturvækst.
    6. Tilsæt 1 ml af det kulturholdige medium til hverUdpeget godt i 24-brøndspladen.
    7. Placer 24-brøndspladen i inkubatoren ved 37 ° C og 5% CO2.
  3. Dag 3
    1. Hvis der konstateres betydelige affald i brøndene, udskiftes mediet forsigtigt med nyt suppleret DMEM / F-12 dyrkningsmedium, idet man sørger for ikke at løsne adhærente celler. Hvis ikke, returner pladen til inkubatoren og skift mediet for første gang på dag 5.
  4. Dage 5-7 og bagefter
    1. Skift medie hver 3. dag.

7. VS & GAN Tissue Fixation

  1. Pipetter 1-1,2 ml 4% paraformaldehyd (PFA; CAUTION) i et nyt 1,5 ml rør.
  2. Efter vask af tumoren eller nerven med PBS (trin 1.2.3), overfør et lille stykke væv (ca. 3 mm 3 VS eller en 5 mm længde GAN) til 4% PFA, og rør røret på en ryster ved 4 ° C. Sørg for, at prøven er helt nedsænket i tHan løsning.
  3. Efter mindst 2 timers fiksering, hent røret fra rysteren og fortsæt med yderligere behandling ( fx indlejring i paraffin eller optimal snittemperaturforbindelse (OCT) til efterfølgende immunhistokemi eller immunofluorescens) 22 , 23 , 24 . Alternativt kan vævet snapsfrosses som tidligere beskrevet 25 , 26 .

8. Indsamling og opbevaring af human perilymph under translabyrinthin VS resektion

  1. Anbring tre sterile 1,5 ml rør på is.
    BEMÆRK: Et rør opbevares som backup i tilfælde af kontaminering.
  2. Fyld et 1,5 ml rør med ca. 1,2 ml PBS-opløsning, der er filtreret to gange ved anvendelse af et 0,22 μm filter.
    BEMÆRK: For at indsamle perilymph under en translabyrintisk VS resektion skal kirurgen først sikre sig, at surgiCal-feltet er fri for knoglesvamp, blod eller saltvand. Kirurgen kan bruge et Schuknecht 21 eller 24 G sugeslange i den ikke-dominerende hånd til dette formål.
    Et typisk sted, hvorfra man kan udtrække perilymph, er den laterale halvcirkelformede kanal (dog kan man også få adgang til den bakre halvcirkelformede kanal eller runde vinduesmembran afhængigt af kirurgens præference). Kirurgen bør omhyggeligt fjerne den labyrintiske knogle med en diamantbur (under anvendelse af kontinuerlig sugevand) for at identificere den blå linje ( dvs. den membraniske labyrint) i den halvcirkelformede kanal. Den halvcirkelformede kanal trænger gennem den blå linje ved hjælp af en lang 27 G nål fastgjort til en 1 ml tuberkulinsprøjte.
  3. Bed kirurgen om at forsigtigt aspirere en lille smule perilimfe og derefter passere sprøjten og den fastgjorte nål til den kirurgiske sygeplejerske.
    BEMÆRK: En dråbe perilymph eller mindre indsamles typisk. Hvis det observerede volumen er større, er prøven sandsynligvis forurenet med andre fLUID.
  4. Åbn det forberedte, tomme 1,5 ml rør, og røret fyldt med PBS direkte inden brug. Pas på ikke at røre indersiden af ​​rørlågene, mens du åbner dem.
  5. Modtag sprøjten og den vedlagte nål fra den kirurgiske sygeplejerske og rens væsken helt ind i det tomme rør, og pas på ikke at røre selve røret med nålen.
  6. Løsn forsigtigt nålen fra sprøjten. Forurener ikke nålespidsen, og fortsæt med at holde den i den ene hånd.
    BEMÆRK: En meget lille mængde perilimf er blevet opsamlet, så der kan være noget væske i nålens lange spids.
  7. På den anden side skal du bruge sprøjten selv (uden nålen) til at suge 0,2 ml filtreret PBS-opløsning fra det fremstillede rør ind i sprøjtens legeme.
  8. Fastgør nålen til sprøjten. Fyld evt. Sprøjten i røret, der indeholder perilymph, ved hjælp af sterile PBS for at skylle nålespidsen.
  9. Luk det perilymph- og PBS-holdige rør og sted Det på is.
  10. Kassér nålen i en sharps container.
  11. Placer røret indeholdende perilymph i -80 ° C fryseren så hurtigt som muligt.

9. Indsamling og opbevaring af human CSF

  1. Placer tre (eller flere) sterile 1,5 ml rør på is.
    BEMÆRK: Et rør er en sikkerhedskopi i tilfælde af forurening eller et prøvevolumen, der er større end forventet.
  2. Efter åbning af dura materen, spør kirurgen at indsamle CSF med en 3 ml sprøjte (uden en vedhæftet nål).
    BEMÆRK: For at forhindre forurening skal CSF-samlingen finde sted umiddelbart efter åbningen af ​​dura mater.
  3. Bed kirurgen om at aflevere sprøjten til kirurgisk sygeplejerske.
  4. Modtag sprøjten fra den kirurgiske sygeplejerske og evakuer fuldt ud det nødvendige volumen af ​​CSF i røret / rørene.
  5. Luk rørene og læg dem på is.
  6. Placer røret / rørene i -80 ° C fryseren så hurtigt som muligt.
E "> 10. Viraltransduktionsforsøg for primære VS-celler

  1. Ved anvendelse af den virale bestandskoncentration som reference skal du beregne det ønskede genomantal (gc) antal og multiplikation af infektion (MOI), der er nødvendige for det foreslåede transduktionsforsøg; Virusbestand kan fortyndes direkte i suppleret dyrkningsmedium.
    BEMÆRK: Enhver viral vektor, der er egnet til primærcelletransduktion, kan anvendes; Se Landegger et al. (2017) til en detaljeret sammenligning af seks forskellige adenoassocierede virusserotyper 27 . Når dyrkning af primære humane celler dyrkes, bestemmes celletællinger typisk ikke før plettering på dæksler. Primære VS-celler reagerer ikke godt på trypsinisering og passage, så for en pålidelig MOI-beregning kan antallet af vedhæftede celler pr. Brønd estimeres ved anvendelse af et fasekontrastmikroskop. Alternativt, hvis celler er tæt på sammenløbet, kan deres tal beregnes pålideligt ved hjælp af standardcelletæthedsværdier forEn 24-brønds plade ( f.eks. 5 x 10 4 celler pr. Brønd).
  2. Under en laminær strømningshætte fremstilles suppleret medium indeholdende den ønskede mængde virus i et 15 ml konisk laboratorierør, således at 1 ml virusholdigt medium fremstilles for hver brønd af celler, der skal transduceres. Pipetter det virusholdige medium op og ned for at blande forsigtigt men grundigt.
  3. Overfør dækslerne, der indeholder primære VS-celler (trin 5.2.8), fra den oprindelige 24-brønds plade til en ny 24-brønds plade. Efter overførslen af ​​hvert enkelt dækslip tilsættes 1 ml virusholdigt medium. Vend pladen hver gang medium tilsættes for at sikre, at cellerne er coatede jævnt med virussen.
  4. Inkuber ved 37 ° C og 5% CO2 under varigheden af ​​det planlagte forsøg.
    BEMÆRK: Incubationer fra 48-120 timer har alle vist lovende transduktionsresultater 27 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Primære humane VS-celler i kultur som fastlagt i afsnit 5 kan behandles som informative modeller for sygdomsassocierede processer i mange downstream-forskningsapplikationer ( Figur 1 ). Friske Schwann-celler dyrket i afsnit 6 giver et direkte og lærerigt sammenligningspunkt. Som beskrevet nedenfor er omfattende data fra VS'er og GAN'er behandlet i overensstemmelse med denne ensartede metodologiske ramme tilgængelige i flere artikler, der tidligere er offentliggjort 12 , 13 , 14 , 15 , 27 .

Den vellykkede transduktion af primære VS-celler med adenoassocierede vira til genterapi er præsenteret her for første gang ( figur 2 ). Primære VS-celler blev transduceret i kultur w Med GFP-udtrykkende Anc80, en forudsagt forfader for adeno-associerede vira 28 . Anc80 har vist sig at være en maksimal effektiv vektor til genoverførsel i murine cochleære væv in vitro og in vivo 27 . Den effektive transduktion af primære humane celler med denne vektor bærer vigtige implikationer for fremtidige forays i genterapi for VS.

figur 1
Figur 1: Lysbilleder af primære humane vestibulære schwannomakulturer.
Typiske mønstre i organisationen af ​​VS-celler i kultur kan identificeres. Skalestang = 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

2 "class =" xfigimg "src =" / files / ftp_upload / 55827 / 55827fig2.jpg "/>
Figur 2: Repræsentativt immunfluorescensbillede af primære humane vestibulære Schwannoma-kulturer efter eksponering for GFP-ekspression af Anc80 i 48 timer ved en multipliceret infektion (MOI) på 250.000.
Grøn = GFP; Rød = phalloidin / F-actin (pletter cytoskelettet); Blå = DAPI (pletter kernen). Skalestænger = 50 μm (A) og 100 μm (B). Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dette manuskript beskriver en samlet metodologisk ramme for VS-forskning, der beskriver samtidig behandling af humane VS- og GAN-prøver til downstream-forskningsapplikationer. Da VS-forskning går i en alder af præcisionsmedicin, kan det være muligt at opdage molekylære, cellulære, genetiske og proteomiske indsigter, som er specifikke for de enkelte patienter, når man forbereder den samme prøve i formularer, der kan svare på talrige forskningsspørgsmål.

Renheden af ​​humane Schwann-celle- og VS-kulturer blev grundigt vurderet over tid ved hjælp af immuncytokemi ved anvendelse af forholdet mellem celler positive for S100-markøren til de positive for DAPI-nukleare plet 19 . Det anbefales derfor at udføre forsøg på primære humane Schwann-cellekulturer inden for de første to uger efter plating af cellerne, idet renheden af ​​disse celler er den højeste i denne periode; Efterfølgende begynder fibroblastlignende celler at dominere. duGh VS-cellekulturer er også maksimalt rene i to uger i dyrkning, VS-celler mangler kontaktmedieret inhibering og vil fortsætte med at proliferere ved senere stadier. Derudover viste en direkte mikroarray-sammenligning af proteinekspression fra VS-væv (sektion 4) og VS-celler i kultur fra de samme tumorer (sektion 5) med succes, at VS-kulturer viser et tilfredsstillende højt niveau af biologisk lighed med deres respektive modertumorer 19 . Den vellykkede kvantificering af proteiner af interesse kan udføres via Western blot af proteinlysater frembragt i afsnit 4 og kvantificering af RNA-transkripter via qRT-PCR af RNA ekstraheret fra væv bevaret med RNA-stabiliseringsopløsning (sektion 2) 12 , 13 , 14 .

VS- og GAN-celler i kultur kan udsættes for kemisk aktive stoffer, såsom ikke-steroide antiinflammatoriske lægemidler, smalL interfererende RNA'er (siRNA'er) eller naturlige organiske forbindelser for at belyse sygdomsspecifikke molekylære mekanismer eller at teste et terapeutisk mål 13 , 14 , 29 . Forbindelser af interesse kan tilsættes direkte til celler i kultur efter passende fortyndinger i regelmæssigt suppleret dyrkningsmedium. For at vurdere virkningen af ​​sådanne stoffer på vigtige aspekter af cellulær fysiologi, bromodeoxyuridin (BrdU) mærkning til proliferation, terminal deoxynucleotidyl tranferase dUTP nick end-mærkning (TUNEL) til apoptose og 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) - Reduktion af 2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) for metabolisk levedygtighed er pålidelige analyser, der kan anvendes med tillid på disse celler 19 . Kulturmedium fra behandlede celler kan også forsigtigt aspireres, opbevares ved -20 ° C og testes for at kvantificere relative niveauer af udskillede stoffer, såsom prostaglandin E2, udskillelsen af ​​hvilken cEn påvirkes af lægemiddelbehandling 13 . Endvidere tilvejebringer vævsfiksering (afsnit 7) og efterfølgende indlejring i OCT eller paraffin et robust substrat til immunofluorescensassays 13 , 14 .

Det tumor- eller nervekonditionerede medium frembragt i afsnit 3 tilvejebringer en enkel og effektiv måde at vurdere VS-udskilles opløselige molekyler og ekstraherer ekstracellulære vesikler. Cytokin-arrays eller ELISA'er kan udføres på disse sekreter, som angivet i producentens protokoller, skitseret i to offentliggjorte undersøgelser 9 , 12 . Ekstracellulære vesikler kan oprenses fra disse sekreter ved anvendelse af ultracentrifugering, som beskrevet i en tidligere publikation 30 . Alternativt kan sekretionerne selv anvendes som patientspecifikke reagenser til downstream-forskningsapplikationer. For eksempel i et eksperiment, der afslørerFremkaldt en ny mekanisme, der ligger til grund for VS-associeret sensorineuralt høretab, blev sekreter indsamlet fra VS-væv af patienter med dårlige høre- og VS-patienter med god hørelse efter inkubation i DMEM i 72 timer (afsnit 3). Disse tumorsekretioner blev derefter påført murine cochleære eksplanteringsmidler, og det blev afsløret, at tumorsekretioner fra VS-patienter med dårlig hørelse forårsagede mere skade på cochleære eksplanterende stoffer end sekreter fra VS-patienter med god hørelse 15 . Det er vigtigt, at sekreter indsamlet på tidspunktet inden 72 timer ikke medførte væsentlige skader.

Human perilymph indsamlet fra patienter, der gennemgår translabyrintisk VS resektion (afsnit 8) repræsenterer en spændende ny avenue til opdagelsen af ​​VS biomarkører. Prøver opsamlet ifølge afsnit 8 blev analyseret via væskekromatografi-tandemmassespektrometri (LC-MS / MS) for at kortlægge proteinet af human perilymph, og 15 kandidatbiomarkører af VS var succesfuldt iDentified 31 . En lignende analyse kunne være mulig ved anvendelse af human CSF indsamlet fra VS patienter (afsnit 9).

En væsentlig overvejelse i VS-forskning er udvælgelsen af ​​passende kontrolvæv. Tidligere undersøgelser har brugt den cochleære nerve, den vestibulære nerve og ikke-relaterede perifere nerver (såsom sciatic nerve) til variabel virkning 22 , 32 . Men flere årsager fører til understøttelsen af ​​brugen af ​​GAN som maksimalt relevante kontroller 15 . På samme måde som den vestibulære nerve er GAN en perifer, sensorisk nerve med axoner ensheathed af Schwann celler. Det er vigtigt, at en litteratur søgning viser, at schwannomer aldrig har vist sig at udvikle sig fra GAN, hvilket gør neoplastiske ændringer i dette vævs usandsynlige. Derudover ofres GANs regelmæssigt, når de får adgang til strukturer i dybere nakke, hvilket giver hospitalsbaserede forskere let adgang til sundhedY prøver under rutinemæssige halsdissektioner og parotidektomi. Selvom den cochleære nerve ofte ofrer under VS-kirurgi og kan være let tilgængelig, risikerer dets nærhed til de vestibulære nerver delingen af ​​det samme mikro-miljø, hvilket kan demonstrere prætumorøse molekylære forandringer 33 . Andre laboratorier har også succesfuldt brugt GAN'er som en tilstrækkelig kontrol for VS-forskning, og det anbefales at fortsætte denne praksis 20 , 21 , 22 , 34 .

Et kritisk, men ofte overset trin inden for celletypespecifikke kulturprotokoller (sektioner 5 og 6) er den korrekte fjernelse af ikke-levedygtige væv og blodkar. Fjernelse af disse ikke-tumorvæv er afgørende for at generere robuste kulturer med maksimal renhed. Endvidere er det vigtigt at pletter celleholdigt dyrkningsmedium på coverlipsVær meget opmærksom på mængden af ​​væv overført til hver brønd. At opnå en jævn, mildt tæt distribution af celler indeholdende nogle få "klumper" af tættere væv i hver brønd er særligt vigtigt for Schwann-celler, som kræver et tilstrækkeligt antal vedhængende celler til at trives. Coating coverslips med poly-D-lysin og laminin tillader også den effektive vækst af celler. Celler prolifererer mere robust, når dækslisterne er belagt i laboratoriet, sammenlignet med kommercielt tilgængelige forbelagte produkter.

For at sikre en høj kvalitet protein- og RNA-ekstraktion, skal du kontrollere, at vævet forbliver ved temperaturer under 4 ° C i afsnit 2 og 4. Da litteraturen vedrørende analysen af ​​VS-sekretioner er knappe (afsnit 3), kan nye projekter kræve Yderligere innovationer og forskellige længder af inkubation.

Som metoder til at adressere VS patobiologi fortsætter med at avancere, brugen af ​​denne strEamlined kombination af grundlæggende teknikker vil tillade den maksimale mængde information, der skal hentes fra en enkelt human prøve. Den informerede samtidige behandling af VS- og GAN-væv vil vise sig at være integreret i dannelsen af ​​effektive farmakologiske og genetiske terapier mod denne svækkende tumor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Institute of Dovenhed og andre kommunikationsforstyrrelser tilskud R01DC015824 (KMS) og T32DC00038 (støtte JES og SD), Department of Defense grant W81XWH-14-1-0091 (KMS), Bertarelli Foundation (KMS) , Nancy Sayles Day Foundation (KMS), Lauer Tinnitus Research Center (KMS) og Barnes Foundation (KMS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin 12 mm #1 German Glass Coverslip Corning 354087 Or prepare coverslips with Corning Laminin (CB-40232) and Cultrex Poly-L-Lysine (3438-100-01)
CELLSTAR 15 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile Greiner Bio-One 188161
CELLSTAR 50 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile Greiner Bio-One 227261
CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 mm Greiner Bio-One 628160
Collagenase from Clostridium histolyticum, Sterile-filtered Sigma-Aldrich C1639
Costar 24 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates, Sterile Corning 3526
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Thermo Fisher Scientific D1306
DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 mL Thermo Fisher Scientific 10313-039
DMEM/F-12, 500 mL Thermo Fisher Scientific 11320-033
Dumont #3 Forceps, Dumoxel Fine Science Tools 11231-30 Autoclave prior to use
Dumont #5 Forceps, Standard tip, Inox Fine Science Tools 11251-20 Autoclave prior to use
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions, 500 mL Thermo Fisher Scientific 10437-028 Aliquot in 50 mL tubes and store in -20°C freezer
Hyaluronidase from Bovine Testes, Type I-S, Lyophilized Powder Sigma-Aldrich H3506
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, sterile EMD Millipore SLGP033RS
Paraformaldehyde, Reagent Grade, Crystalline Sigma-Aldrich P6148 Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online
PBS, pH 7.4, 500 mL Thermo Fisher Scientific 10010-023 Autoclave prior to use
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100 mL Thermo Fisher Scientific 15140-122
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Tablets Roche 04906845001
Pierce Protease Inhibitor Tablets Thermo Fisher Scientific 88666
Pipettes and pipette tips, 5/10/25 mL Variable Variable
Plastic Homogenization Pestle for 1.5/2.0 mL Microtubes E&K Scientific EK-10539
PrecisionGlide Needles, 27 G x 1 1/2 in BD 301629
RIPA Buffer Boston BioProducts BP-115
RNAlater (RNA stabilization solution) Thermo Fisher Scientific AM7021
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 mL Eppendorf 022363719 Autoclave prior to use
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 mL Eppendorf 022363204 Autoclave prior to use
Saline - 0.9% Sodium Chloride Injection, bacteriostatic, 20 mL Hospira 0409-1966-05
Scalpel Blades - #15 Fine Science Tools 10015-00
Schuknecht Suction Tube 24 gauge Bausch + Lomb N1698 42 Useful for the surgical approach (in addition to common otologic surgical instruments) and e.g. a blue surgical marker
Specimen Container, OR sterile, 4OZ Medline DYND30331H
Stemi 2000-C Stereo Microscope Zeiss 000000-1106-133
Syringe/Needle Combination, Luer-Lok Tip, 5 mL, 22 G x 1 in. BD 309630
Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 1 mL BD 309659
Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 3 mL BD 309656
Ultrasonic homogenizer, 4710 Series, CV18 probe Cole-Parmer CP25013

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Babu, R., et al. Vestibular schwannomas in the modern era: epidemiology, treatment trends, and disparities in management. J Neurosurg. 119 (1), 121-130 (2013).
  2. Gal, T. J., Shinn, J., Huang, B. Current epidemiology and management trends in acoustic neuroma. Otolaryngol Head Neck Surg. 142 (5), 677-681 (2010).
  3. Propp, J. M., McCarthy, B. J., Davis, F. G., Preston-Martin, S. Descriptive epidemiology of vestibular schwannomas. Neuro Oncol. 8 (1), 1-11 (2006).
  4. Stangerup, S. E., Tos, M., Thomsen, J., Caye-Thomasen, P. True incidence of vestibular schwannoma? Neurosurgery. 67 (5), 1335-1340 (2010).
  5. Tos, M., Stangerup, S. E., Caye-Thomasen, P., Tos, T., Thomsen, J. What is the real incidence of vestibular schwannoma? Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 130 (2), 216-220 (2004).
  6. Stangerup, S. E., Caye-Thomasen, P. Epidemiology and natural history of vestibular schwannomas. Otolaryngol Clin North Am. 45 (2), 257-268 (2012).
  7. Mahaley, M. S., Mettlin, C., Natarajan, N., Laws, E. R., Peace, B. B. Analysis of patterns of care of brain tumor patients in the United States: a study of the Brain Tumor Section of the AANS and the CNS and the Commission on Cancer of the ACS. Clin Neurosurg. 36, 347-352 (1990).
  8. Carlson, M. L., Link, M. J., Wanna, G. B., Driscoll, C. L. Management of sporadic vestibular schwannoma. Otolaryngol Clin North Am. 48 (3), 407-422 (2015).
  9. Dilwali, S., et al. Sporadic vestibular schwannomas associated with good hearing secrete higher levels of fibroblast growth factor 2 than those associated with poor hearing irrespective of tumor size. Otol Neurotol. 34 (4), 748-754 (2013).
  10. Caye-Thomasen, P., et al. VEGF and VEGF receptor-1 concentration in vestibular schwannoma homogenates correlates to tumor growth rate. Otol Neurotol. 26 (1), 98-101 (2005).
  11. Koutsimpelas, D., et al. The VEGF/VEGF-R axis in sporadic vestibular schwannomas correlates with irradiation and disease recurrence. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 74 (6), 330-338 (2012).
  12. Dilwali, S., Roberts, D., Stankovic, K. M. Interplay between VEGF-A and cMET signaling in human vestibular schwannomas and schwann cells. Cancer Biol Ther. 16 (1), 170-175 (2015).
  13. Dilwali, S., Kao, S. Y., Fujita, T., Landegger, L. D., Stankovic, K. M. Nonsteroidal anti-inflammatory medications are cytostatic against human vestibular schwannomas. Transl Res. 166 (1), 1-11 (2015).
  14. Dilwali, S., et al. Preclinical validation of anti-nuclear factor-kappa B therapy to inhibit human vestibular schwannoma growth. Mol Oncol. 9 (7), 1359-1370 (2015).
  15. Dilwali, S., Landegger, L. D., Soares, V. Y., Deschler, D. G., Stankovic, K. M. Secreted Factors from Human Vestibular Schwannomas Can Cause Cochlear Damage. Sci Rep. 5, 18599 (2015).
  16. Blakeley, J. Development of drug treatments for neurofibromatosis type 2-associated vestibular schwannoma. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 20 (5), 372-379 (2012).
  17. Schroeder, R. D., Angelo, L. S., Kurzrock, R. NF2/merlin in hereditary neurofibromatosis 2 versus cancer: biologic mechanisms and clinical associations. Oncotarget. 5 (1), 67-77 (2014).
  18. Schularick, N. M., Clark, J. J., Hansen, M. R. Primary culture of human vestibular schwannomas. J Vis Exp. (89), (2014).
  19. Dilwali, S., et al. Primary culture of human Schwann and schwannoma cells: improved and simplified protocol. Hear Res. , 25-33 (2014).
  20. Brown, C. M., Ahmad, Z. K., Ryan, A. F., Doherty, J. K. Estrogen receptor expression in sporadic vestibular schwannomas. Otol Neurotol. 32 (1), 158-162 (2011).
  21. Cioffi, J. A., et al. MicroRNA-21 overexpression contributes to vestibular schwannoma cell proliferation and survival. Otol Neurotol. 31 (9), 1455-1462 (2010).
  22. Doherty, J. K., Ongkeko, W., Crawley, B., Andalibi, A., Ryan, A. F. ErbB and Nrg: potential molecular targets for vestibular schwannoma pharmacotherapy. Otol Neurotol. 29 (1), 50-57 (2008).
  23. Aguiar, P. H., Tatagiba, M., Samii, M., Dankoweit-Timpe, E., Ostertag, H. The comparison between the growth fraction of bilateral vestibular schwannomas in neurofibromatosis 2 (NF2) and unilateral vestibular schwannomas using the monoclonal antibody MIB 1. Acta Neurochir (Wien). 134 (1-2), 40-45 (1995).
  24. Cattoretti, G., et al. Monoclonal antibodies against recombinant parts of the Ki-67 antigen (MIB 1 and MIB 3) detect proliferating cells in microwave-processed formalin-fixed paraffin sections. J Pathol. 168 (4), 357-363 (1992).
  25. Hung, G., et al. Immunohistochemistry study of human vestibular nerve schwannoma differentiation. Glia. 38 (4), 363-370 (2002).
  26. Archibald, D. J., et al. B7-H1 expression in vestibular schwannomas. Otol Neurotol. 31 (6), 991-997 (2010).
  27. Landegger, L. D., et al. A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).
  28. Zinn, E., et al. In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector. Cell Rep. 12 (6), 1056-1068 (2015).
  29. Kim, B. G., et al. Sulforaphane, a natural component of broccoli, inhibits vestibular schwannoma growth in vitro and in vivo. Sci Rep. 6, 36215 (2016).
  30. Soares, V. Y., et al. Extracellular vesicles derived from human vestibular schwannomas associated with poor hearing damage cochlear cells. Neuro Oncol. 18 (11), 1498-1507 (2016).
  31. Lysaght, A. C., et al. Proteome of human perilymph. J Proteome Res. 10 (9), 3845-3851 (2011).
  32. Caye-Thomasen, P., Borup, R., Stangerup, S. E., Thomsen, J., Nielsen, F. C. Deregulated genes in sporadic vestibular schwannomas. Otol Neurotol. 31 (2), 256-266 (2010).
  33. Schulz, A., et al. The importance of nerve microenvironment for schwannoma development. Acta Neuropathol. 132 (2), 289-307 (2016).
  34. Torres-Martin, M., et al. Global profiling in vestibular schwannomas shows critical deregulation of microRNAs and upregulation in those included in chromosomal region 14q32. PLoS One. 8 (6), e65868 (2013).

Tags

Cancer Research udgave 124 vestibulær schwannoma stor auricular nerve kirurgisk prøve primærcellekultur vævssekretioner adenoassocieret virus perilymph-prøveudtagning Schwann-celler
En samlet metodologisk ramme for Vestibular Schwannoma Research
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Landegger, L. D., Sagers, J. E.,… More

Landegger, L. D., Sagers, J. E., Dilwali, S., Fujita, T., Sahin, M. I., Stankovic, K. M. A Unified Methodological Framework for Vestibular Schwannoma Research. J. Vis. Exp. (124), e55827, doi:10.3791/55827 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter