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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Un Marco Metodológico Unificado para la Investigación de Schwannoma Vestibular

Published: June 20, 2017 doi: 10.3791/55827
Automatic Translation
*1,2,3, *1,4, 1,4, 1,2, 1,2, 1,2,4
1Eaton Peabody Laboratories, Department of Otolaryngology, Massachusetts Eye and Ear, 2Department of Otolaryngology, Harvard Medical School, 3Department of Otolaryngology, Vienna General Hospital, Medical University of Vienna, 4Program in Speech and Hearing Bioscience and Technology, Harvard Medical School
* These authors contributed equally

Summary

El objetivo de este protocolo es describir la recolección y el procesamiento de muestras quirúrgicas humanas para múltiples aplicaciones de aguas abajo en schwannoma vestibular y la investigación con células de Schwann.

Abstract

Los schwannomas vestibulares son las neoplasias más comunes del ángulo cerebelopontino, constituyendo un 6-8% de todos los crecimientos intracraneales. Aunque estos tumores causan pérdida auditiva neurosensorial en hasta el 95% de los individuos afectados, los mecanismos moleculares subyacentes a esta pérdida auditiva siguen siendo esquivos. Este artículo describe los pasos establecidos en nuestro laboratorio para facilitar la recolección y procesamiento de varias muestras de tejido humano primario para aplicaciones de investigación en aguas abajo integrantes del estudio de schwannomas vestibulares. Específicamente, este trabajo describe un marco metodológico unificado para la recolección, procesamiento y cultivo de células de Schwann y schwannoma de muestras quirúrgicas. Esto se integra con los pasos de procesamiento paralelos ahora considerados esenciales para la investigación actual: la recolección de secreciones tumorales y nerviosas, la preservación del ARN y la extracción de proteínas de tejidos recolectados, la fijación de tejido para la preparación de secciones,D la exposición de las células humanas primarias a los virus adeno-asociados para su aplicación a la terapia génica. Además, este trabajo destaca el enfoque quirúrgico translabyrinthine para recoger este tumor como una oportunidad única para obtener epitelio sensorial humano desde el oído interno y perilymph. Se proporcionan consejos para mejorar la calidad experimental y se destacan las trampas comunes.

Introduction

Los schwannomas vestibulares (SV) son los neoplasmas más comunes del ángulo cerebelopontino, diagnosticados en 1 de cada 100.000 individuos. Aunque no metastásicos, estos tumores afectan gravemente la calidad de vida del paciente 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Los individuos afectados comúnmente viven con pérdida de audición, tinnitus, y una sensación de plenitud auditiva. Los síntomas se vuelven cada vez más debilitantes a medida que el tumor crece, causando problemas de equilibrio, parálisis facial y deterioro de otras funciones del nervio craneal. Complicaciones potencialmente mortales debido a la compresión del tronco encefálico también puede resultar 7 .

Las opciones de manejo para VS se limitan esencialmente a la espera vigilante de tumores estáticos y radioterapia estereotáctica o resección quirúrgica de tumores en crecimiento

Debido a que los VSs surgen de un nervio sensorial periférico ( es decir, el nervio vestibular), es importante comparar las observaciones asociadas con VS con las derivadas de un nervio control adecuado, como el gran nervio auricular humano (GAN). Los GAN sanos se sacrifican regularmente durante las parotidectomías o disecciones del cuello y pueden utilizarse como modelos robustos para la fisiología sana de las células de Schwann 9 .

Debido a que no hay fármacos aprobados por la FDA para el tratamiento o la prevención de VS esporádicos, es imperativo que los investigadores elucidar el mecanismo molecular subyacenteDe la enfermedad para identificar objetivos terapéuticos. Las proteínas que se ha demostrado que juegan un papel en la patogenia VS incluyen merlin, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), ciclooxigenasa 2 (COX-2), factor nuclear kappa B (NF-κ B), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa) , Receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), y moléculas de señalización relacionadas 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 .

Recientes avances han ampliado y mejorado los protocolos para la recolección, procesamiento, cultivo, y la investigación posterior de primaria schwannomas vestibulares humanos y tejidos nerviosos saludables [ 18 , 19] . Sin embargo, la mayoría de los protocolos existentes están diseñados paraDe dichos tejidos para una única solicitud de investigación posterior ( es decir, cultivo celular solo). Este artículo presenta un marco metodológico unificado para el procesamiento simultáneo de una única muestra primaria VS o GAN humana para múltiples aplicaciones aguas abajo: cultivo específico de tipo celular, extracción de proteínas, preservación de ARN, recolección de secreción tumoral y fijación de tejido. Este trabajo también detalla la colección quirúrgica y el procesamiento de líquido cefalorraquídeo humano (LCR) y perilinfa durante la resección translaviríntica VS, ya que estos tejidos estrechamente relacionados pueden servir como fuentes importantes de biomarcadores para VS. Finalmente, este protocolo presenta pasos para la transducción viral de células VS humanas primarias en cultivo como una aplicación novedosa de este tejido para uso en terapia génica.

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Protocol

El consentimiento informado por escrito para la recogida de todas las muestras se obtuvo antes de la cirugía, y los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con el Código de Ética de la Asociación Médica Mundial (Declaración de Helsinki). Todas las secciones del protocolo del estudio fueron aprobadas por la Junta de Revisión Institucional de Massachusetts Eye and Ear y Massachusetts General Hospital.

NOTA: Las Secciones 1-7 a continuación están diseñadas para ser ejecutadas secuencialmente al recibir una muestra primaria de VS o GAN humana de la sala de operaciones. El tratamiento debe comenzar siempre con la sección 1. Luego, por regla general, se debe preservar primero el ARN (sección 2), seguido de la preparación de tejido para la recolección de secreciones (sección 3) y la extracción de proteínas (sección 4). El tejido a cultivar (sección 5 para VS, sección 6 para GAN) puede permanecer en medio de cultivo suplementado mientras se realizan las secciones 2, 3 y 4. La fijación del tejido para la sección (sección 7) es muy corta y cA realizarse durante cualquier paso de centrifugación. La sección 8 (procesamiento del perilinismo) y la sección 9 (procesamiento del LCR) se pueden llevar a cabo al recibir el perilinfa o el LCR del quirófano durante una resección translaviríntica VS. La sección 10 (transducción viral) se puede realizar en cultivo de células VS o Schwann en cultivo.

1. Preparación y recepción de una muestra quirúrgica

NOTA: Los siguientes pasos se deben realizar en un ambiente estéril, tal como una campana de cultivo de tejidos o una campana de flujo laminar. Se espera una familiaridad con la técnica estéril básica.

  1. Preparación de medio para cultivo de células VS o Schwann humano primario
    1. Descongele una alícuota de 50 ml de suero fetal bovino congelado (FBS) en un baño de agua a 37 ° C.
    2. Añadir 5 mL de mezcla de penicilina / estreptomicina a una botella de 500 mL de DMEM / F-12, dando como resultado una dilución final de 1: 100.
    3. Añadir los 50 mL de FBS descongelado a la botella de 500 mL de DMEM / F-12,Dando como resultado una dilución final de 1:10.
    4. Escriba la fecha, las iniciales del investigador y la información suplementaria ( por ejemplo, P / S al 1%, FBS al 10%) en la botella.
    5. Coloque el nuevo medio de cultivo en el refrigerador (4 ° C).
  2. Recepción y limpieza de la muestra VS o GAN
    1. En el quirófano, coloque la muestra recién cosechada VS o GAN en solución salina estéril en un recipiente de muestra. Transporte la muestra en hielo de la sala de operaciones a una campana de flujo laminar en el laboratorio.
      NOTA: Los tamaños y pesos de las muestras varían significativamente entre los pacientes basándose en el tamaño del tumor relevante o la cantidad de nervio extirpado.
    2. Eliminar al congelador las alícuotas de solución de hialuronidasa (25.000 U / ml) y colagenasa (3.200 U / ml) y dejar que las enzimas se descongelen a temperatura ambiente (requeridas para la etapa 5.1.4 o 6.1.6, dependiendo de si la muestra es Un VS o un GAN).
      NOTA: La resuspensión de las enzimas liofilizadas iS descritas en detalle en las hojas de información del producto. La colagenasa puede resuspenderse en cualquier solución de sal equilibrada libre de calcio e hialuronidasa en una solución de tampón fosfato 0,02 M (pH 7,0), NaCl 77 mM y 0,01% de 1 mg / ml de albúmina de suero bovino. La actividad específica para cada enzima liofilizada varía con el lote y debe ser verificada antes de la resuspensión.
    3. Usando una serie de tres tubos de 1,5 ml llenos con 1,4 ml de PBS estéril 1x, lave la muestra VS o GAN tres veces. Con cuidado, transfiera el espécimen de tubo a tubo con pinzas estériles. Cierre cada tubo una vez que contiene la muestra, y agite suavemente para lavar.
      NOTA: Para evitar la inundación de los tubos de 1,5 mL, se puede usar menos de 1,4 mL de PBS por tubo si la pieza del tumor es grande.
    4. Coloque la muestra en una placa de Petri seca de 60 mm y utilice una pinza para extraer todo el tejido muerto ( es decir, porciones cauterizadas, que suelen ser de color blanco u opaco) y áreas con vasos sanguíneos prominentes.
    5. Uso fOrceps o una hoja de bisturí para dividir la muestra en piezas separadas para la preservación del ARN, la extracción de proteínas, la recolección de secreciones, la fijación y el cultivo celular (ver las secciones 2 - 6, más adelante).
    6. Transferir la pieza del espécimen designado para cultivo celular (sección 5/6) a un nuevo plato de cultivo de 60 mm que contiene 5-8 ml de medio DMEM / F-12 suplementado en frío (alternativamente, la tapa del primer plato de cultivo puede ser Utilizado para este paso).
      NOTA: La cantidad de medio DMEM / F-12 necesaria (del paso 1.1) dependerá del tamaño del tumor o nervio, pero debe caer entre 5 y 8 ml. Esta pieza puede sentarse en medio de cultivo mientras se realizan las etapas subsiguientes.

2. Preservación del ARN del tejido VS y GAN (también válido para el epitelio sensorial humano)

  1. Bajo la campana de flujo laminar, transfiera 1-1,2 ml de solución de estabilización de ARN a un nuevo tubo de 1,5 ml.
  2. Después de lavar la muestra con PBS (paso 1.2.3), sumerja brevemente la pequeña tartaCe de tejido designado para la preservación de ARN (aproximadamente 3 mm3 de VS o una longitud de 5 mm de GAN) en la solución de estabilización de ARN. Asegúrese de que la muestra esté completamente sumergida en la solución.
  3. Preparar y etiquetar un nuevo tubo de 1,5 ml. Recuperar la muestra de la solución de estabilización de ARN, transferirla al nuevo tubo y almacenarla en un congelador de -80 ° C.

3. Recolección de las Secreciones VS y GAN

  1. Día 1
    1. Después de lavar la muestra con PBS (paso 1.2.3), coloque la pieza de VS o GAN designada para la recogida de secreciones en un tubo vacío de 1,5 ml.
    2. Preparar dos tubos adicionales de 1,5 ml y pipetear 500 μL de DMEM (no suplementado con FBS) en cada tubo.
      NOTA: El primer tubo de DMEM se utilizará para recoger las secreciones tumorales, y el segundo tubo de DMEM servirá como un control emparejado. Las secreciones pueden recogerse en DMEM, cualquier otro medio de cultivoSuplementado con suero, o PBS.
    3. Coloque uno de los tubos que contienen DMEM en una escala digital calibrada. Tara la escala, de modo que cuando el tubo se sienta encima de la escala, se lea 0 mg.
    4. Quitar el tubo de DMEM de la balanza, colocar el trozo de espécimen designado para la recogida de secreciones en el tubo, y pesarlo. Observe el resultado, que representará el peso del tejido solo.
    5. Bajo una campana de flujo laminar, ajustar el volumen de DMEM en el tubo a 100 μL por 10 mg de muestra.
    6. Colocar el tubo que contiene la muestra de tejido y su control emparejado (DMEM solo) en la incubadora (37 ° C, 5% CO 2 ) durante un período compatible con los planes para este experimento. Incubar el tejido durante al menos 72 h para recoger cantidades biológicamente útiles de tumor o secreciones nerviosas [ 15] .
  2. Día 4
    1. Después de la incubación durante 72 h, eliminar el medio que contiene secreción de laEspécimen ( es decir, medio acondicionado de tejido) usando una pipeta de 1 ml. Para prevenir ciclos repetidos de congelación-descongelación, alícuote el medio en tubos nuevos de acuerdo con los análisis de aguas abajo planificados ( por ejemplo, para realizar un ELISA con 4 pocillos que requieren 50 μl cada uno, pueden prepararse alícuotas de 210 μl).
    2. Si es necesario, congelar la pieza de tejido que queda en el tubo original (ya marcada el día 1) a -80 ° C para análisis adicionales, como la extracción de ADN, en una fecha posterior.
    3. Almacenar el tejido, las secreciones y el DMEM de control en un congelador de -80 ° C hasta que se inicien las aplicaciones aguas abajo ( por ejemplo, ELISAs, LC-MS / MS, matrices de citoquinas, etc. ).

4. Extracción de proteínas de tejido VS o GAN

  1. Preparación de tampón RIPA fortificado
    1. Añadir un comprimido de inhibidor de fosfatasa y un comprimido de inhibidor de proteasa a 10 ml de tampón RIPA en un tubo de 15 ml; Esto está fortalecidoRIPA.
      NOTA: Guarde el tampón RIPA a 4 ° C y añada los comprimidos justo antes de su uso.
  2. Extracción de proteínas
    1. Transferir 210 μl de tampón RIPA fortificado (paso 4.1.1) a un nuevo tubo de 1,5 ml.
    2. Después de lavar el espécimen con PBS (paso 1.2.3), transfiera el trozo pequeño de tejido designado para la extracción de proteínas (aproximadamente 3 mm3 de VS o 5 mm de longitud de GAN) al tubo que contiene tampón RIPA y colóquelo sobre hielo Durante al menos 10 min. Si el estudio de las formas fosforiladas de las proteínas, complementar el buffer RIPA con proteasa y fosfatasa inhibidores [ 14] . Entretanto, pueden llevarse a cabo etapas para otros componentes del procesamiento de tejidos, tales como la fijación (sección 7).
    3. Pre-enfriar la centrífuga a 4 ° C.
    4. Usando un mazo de plástico, homogeneice el tejido en el tubo que contiene el tampón RIPA. Sonicar el tejido durante 10-15 s al 20% de amplitud. Asegúrese de que la muestraPermanece sobre hielo, incluso durante la sonicación.
    5. Centrifugar durante 10 minutos a 15.000 xg y 4 ° C.
    6. Alícuota del sobrenadante en incrementos de 50 μL en nuevos tubos de 0,5 ml (dependiendo de las aplicaciones de aguas abajo previstas, se puede elegir cualquier tamaño de incremento).
    7. Almacenar las alícuotas de lisado de proteína en un congelador de -80 ° C hasta que se inicien las aplicaciones aguas abajo ( por ejemplo, ELISA o Western blots) 20 , 21 .

5. Cultura VS Humana Primaria

  1. Día 1
    1. Separar el tejido VS designado para cultivo celular (que ha estado sentado en medio de cultivo, como se describe en el paso 1.2.6) en aproximadamente 1 mm 3 piezas usando un par de pinzas en cada mano.
    2. Aspirar el medio que contiene la pieza del tumor con una pipeta serológica de 10 ml y transferir todo el contenido a un tubo cónico de 15 ml.
    3. Centrifugar durante 3 min a1.000 xg y 25 ° C.
    4. Preparar el medio de desintegración en un nuevo plato de cultivo de 60 mm combinando 4,7 ml de medio DMEM / F-12 suplementado con 250 μl de colagenasa (concentración final: 160 U / ml) y 50 μl de hialuronidasa (concentración final: 250 U / ml) , Para un volumen final de 5 ml.
      NOTA: Ambas enzimas deben ser almacenadas en un congelador de -20 ° C pero descongeladas antes de la preparación de este medio (paso 1.2.2).
    5. Después de la centrifugación, las piezas tumorales formarán un gránulo en el fondo del tubo cónico. Con cuidado, pipetear y desechar el sobrenadante.
    6. Añadir 2 ml del medio de desintegración que contiene enzima recién hecho (paso 5.1.4) al sedimento tumoral. Pipeta hacia arriba y hacia abajo varias veces para movilizar el tejido y transferir el tumor que contiene el medio a la placa de cultivo de 60 mm.
    7. Colocar el plato de cultivo en la incubadora (37 ° C, 5% CO 2 ) durante 18 h.
  2. Dia 2
    1. CálidoMEM / F - 12 suplementado con FBS al 10% y penicilina / estreptomicina al 1% (preparado en el paso 1.1) en un baño de agua a 37ºC.
    2. Quitar la placa de Petri que contiene el cultivo VS de la incubadora (paso 5.1.7). Utilizando una aguja de 22 G unida a una jeringa de 6 ml, aspirar el medio que contiene el cultivo y transferirlo a un nuevo tubo cónico de 15 ml.
    3. Centrifugar durante 5 min a 1.000 xg y 37 ° C.
    4. Mientras tanto, use fórceps estériles para colocar el número requerido de cubreobjetos de vidrio revestidos con poli-D-lisina y laminina en una placa de cultivo de 24 pocillos.
      NOTA: El número de pozos a cultivar depende del tamaño de la muestra; Aproximadamente 24-32 pocillos pueden cultivarse a partir de un tumor de 1 cm3, por lo que para la mayoría de los tumores más pequeños, la planificación para 8-16 pocillos de células cultivadas es apropiada.
    5. Después de la centrifugación, desechar el sobrenadante ( es decir, el medio enriquecido en enzimas) y resuspender el sedimento celular residual en medio DMEM / F-12 suplementado, precalentadoEn el paso 5.2.1.
      NOTA: El volumen en el que resuspender el gránulo está determinado por el número de pozos previsto en el paso 5.2.4, estimando 1 mL de medio por pozo planificado.
    6. Aspirar 2 ml del medio celular resuspendido (paso 5.2.5) usando una pipeta serológica de 5 ml. Depositar 1 ml del medio que contiene células tumorales en cada pocillo preparado de la placa de 24 pocillos.
    7. Continuar aspirando y depositando el medio que contiene células tumorales (aspirando en incrementos de 2 mL, de los cuales se deposita 1 mL en cada pocillo planificado) hasta que la suspensión de células tumorales se divida por igual entre todos los pocillos preparados.
    8. Colocar la placa de 24 pocillos en la incubadora a 37ºC durante la noche.
  3. Día 3
    1. Si se observan desechos significativos en el fondo de los pozos, cambie cuidadosamente el medio en cada pocillo a un nuevo medio de cultivo DMEM / F-12 suplementado, teniendo cuidado de no desalojar las células adherentes. Si no, devuelva la placa a la incubadora y cambie laE media por primera vez el día 5.
  4. Días 5-7 y después
    1. Cambie el medio cada 3 días.
      NOTA: Las células VS y GAN humanas primarias se mantienen generalmente en cultivo hasta su uso en aplicaciones aguas abajo, aproximadamente a los 14 días de edad. La pureza del cultivo disminuye después de este 19 .

6. Cultura primaria del GAN ​​humano

  1. Día 1
    1. Bajo un microscopio de disección, aislar los fascículos del tejido designado para el cultivo de GAN (que ha estado sentado en medio de cultivo, como se describe en el paso 1.2.6).
      1. Aísle los fascículos del epineuro y la vaina fibrosa tirando del perineuro usando el n. 5 mientras pinzas el epineuro con el n. 3 pinzas.
    2. Una vez que los fascículos están suficientemente aislados del epineuro circundante, transferirlos a un nuevo plato de cultivo que contenga 2 ml de nuevo supPlementado.
    3. Cortar los fascículos en segmentos de 1 a 2 mm usando la cuchilla de bisturí.
    4. Pipetear las pequeñas piezas del fascículo y el medio circundante en un tubo de 15 mL que contenga 3 mL de medio de cultivo suplementado fresco, de manera que el volumen total en el tubo de 15 mL sea de 5 mL.
    5. Centrifugar la muestra durante 3 min a 1.000 xg y 25 ° C.
    6. Mientras tanto, preparar un medio de cultivo de células de Schwann en una nueva placa de Petri de 60 mm combinando 4,7 ml de medio DMEM / F-12 suplementado, 250 μl de colagenasa y 50 μl de hialuronidasa, para un volumen final de 5 ml.
      NOTA: Guarde las dos enzimas a -20 ° C; Descongelarlos a temperatura ambiente antes de preparar este medio (paso 1.2.2).
    7. Después de la centrifugación de la muestra, los fascículos se condensarán en un pequeño gránulo en el tubo cónico. Deseche el sobrenadante.
    8. Añadir 2 ml del medio de desintegración enzimática recién hecho (paso 6.1.6) a la pastilla de nervio. Pipeta hacia arriba y dVarias veces para movilizar el tejido y transferirlo a un nuevo plato de cultivo de 60 mm.
    9. Colocar el plato en la incubadora (37 ° C, 5% CO 2 ) durante 20-22 h.
      NOTA: Esta es una incubación más larga de la que se necesita para muestras VS (paso 5.1.7).
  2. Dia 2
    1. Medio DMEM / F-12 suplementado con calor en un baño de agua a 37 ° C.
    2. Utilizando una aguja de 22 G unida a una jeringa de 6 ml, aspirar el medio que contiene el cultivo celular y transferirlo a un nuevo tubo cónico de 15 ml.
    3. Centrifugar durante 5 min a 1.000 xg y 37 ° C.
    4. Deseche el sobrenadante y resuspenda la muestra en medio de cultivo DMEM / F-12 suplementado, previamente calentado y suplementado.
    5. Utilice fórceps estériles para colocar el número requerido de cubreobjetos recubiertos en los pocillos de una placa de cultivo de 24 pocillos.
      NOTA: El cálculo de dos pocillos de células cultivadas por espécimen del nervio de 1 cm promueve un crecimiento robusto del cultivo.
    6. Añadir 1 ml del medio que contiene el cultivo a cadaDesignado bien en la placa de 24 pocillos.
    7. Colocar la placa de 24 pocillos en la incubadora a 37 ° C y 5% de CO 2 .
  3. Día 3
    1. Si se observan restos significativos en los pozos, sustituir cuidadosamente el medio con nuevo medio de cultivo DMEM / F-12 suplementado, teniendo cuidado de no desalojar las células adherentes. Si no es así, devuelva la placa a la incubadora y cambie el medio por primera vez el día 5.
  4. Días 5-7 y después
    1. Cambie el medio cada 3 días.

7. Fijación de tejidos VS & GAN

  1. Pipetear 1-1,2 ml de paraformaldehído al 4% (PFA, PRECAUCIÓN) en un nuevo tubo de 1,5 ml.
  2. Después de lavar el tumor o el nervio con PBS (paso 1.2.3), transferir un trozo pequeño de tejido (aproximadamente 3 mm3 de VS o 5 mm de longitud de GAN) en PFA al 4% y colocar el tubo en un agitador a 4 ° DO. Asegúrese de que la muestra esté completamente sumergida en tLa solución.
  3. Después de al menos 2 h de fijación, extraer el tubo del agitador y continuar con el procesamiento posterior ( por ejemplo, incrustación en parafina o compuesto óptimo de temperatura de corte (OCT) para inmunohistoquímica o inmunofluorescencia subsiguiente) 22 , 23 , 24 . Alternativamente, el tejido puede ser congelado instantáneamente, como se ha descrito previamente 25 , 26 .

8. Recolección y almacenamiento de perilinfa humana durante la resección de Translabyrinthine VS

  1. Coloque tres tubos estériles de 1,5 ml en hielo.
    NOTA: Un tubo será guardado como respaldo en caso de contaminación.
  2. Llenar un tubo de 1,5 ml con aproximadamente 1,2 ml de solución de PBS que se ha filtrado dos veces con un filtro de 0,22 μm.
    NOTA: Para recolectar perilinfa durante una resección translabiríntica VS, el cirujano debe primero asegurarse de que el surgiEl campo calórico está libre de polvo óseo, sangre o solución salina. El cirujano puede usar un tubo de succión Schuknecht 21 ó 24 G en la mano no dominante para este propósito.
    Un lugar típico desde el cual extraer el perilinfo es el canal semicircular lateral (sin embargo, también se puede acceder al canal semicircular posterior oa la membrana de la ventana redonda, dependiendo de la preferencia del cirujano). El cirujano debe retirar cuidadosamente el hueso laberíntico con una fresa de diamante (mientras usa irrigación continua por succión) para identificar la línea azul ( es decir, el laberinto membranoso) del canal semicircular. El canal semicircular se penetra a través de la línea azul usando una aguja larga de 27 G unida a una jeringuilla de tuberculina de 1 ml.
  3. Pida al cirujano que aspire suavemente una pequeña cantidad de perilinfa y luego pase la jeringa y la aguja adjunta a la enfermera quirúrgica.
    NOTA: Normalmente, se recoge una gota de perilinf o menos. Si el volumen observado es mayor, es probable que la muestra se contamine con otros fLuis
  4. Abra el tubo vacío de 1,5 ml preparado y el tubo lleno de PBS directamente antes de su uso. Tenga cuidado de no tocar el interior de las tapas del tubo mientras las abre.
  5. Recibir la jeringa y la aguja adjunta de la enfermera quirúrgica y purgar el líquido completamente en el tubo vacío, teniendo cuidado de no tocar el tubo con la aguja.
  6. Desprenda cuidadosamente la aguja de la jeringa. No contamine la punta de la aguja, y continúe sosteniéndola en una mano.
    NOTA: Se ha recolectado un volumen muy pequeño de perilinfa, por lo que puede quedar algún líquido en la punta larga de la aguja.
  7. Con la otra mano, use la jeringa en sí (sin la aguja) para succionar 0,2 ml de solución de PBS filtrada desde el tubo preparado en el cuerpo de la jeringa.
  8. Vuelva a colocar la aguja en la jeringa. Evacuar completamente la jeringa dentro del tubo que contiene perilinfa, usando el PBS estéril para limpiar la punta de la aguja.
  9. Cierre el tubo que contiene perilimina y PBS y coloque En hielo
  10. Deseche la aguja en un contenedor de objetos punzocortantes.
  11. Coloque el tubo que contiene perilymph en el congelador de -80 ° C tan pronto como sea posible.

9. Recolección y almacenamiento de CSF humano

  1. Coloque tres (o más) tubos estériles de 1,5 ml en hielo.
    NOTA: Un tubo será una copia de seguridad en caso de contaminación o un volumen de muestra que es mayor de lo esperado.
  2. Después de abrir la duramadre, pídale al cirujano que recoja el LCR con una jeringa de 3 ml (sin una aguja adjunta).
    NOTA: Para prevenir la contaminación, la recolección de LCR debe realizarse inmediatamente después de la apertura de la duramadre.
  3. Pida al cirujano que entregue la jeringa a la enfermera quirúrgica.
  4. Recibir la jeringa de la enfermera quirúrgica y evacuar completamente el volumen requerido de LCR en el (los) tubo (s).
  5. Cierre el (los) tubo (s) y colóquelos en hielo.
  6. Coloque el (los) tubo (s) en el congelador de -80 ° C tan pronto como sea posible.
E "> 10. Experimentos de transducción viral para células VS primarias

  1. Utilizando la concentración del stock viral como referencia, calcule el número de recuento del genoma (gc) y la multiplicidad de infección (MOI) necesarios para el experimento de transducción propuesto; Virus se puede diluir directamente en medio de cultivo suplementado.
    NOTA: Se puede usar cualquier vector viral adecuado para la transducción de células primarias; Véase Landegger et al. (2017) para una comparación detallada de seis diferentes serotipos de virus adeno-asociados [ 27] . Además, cuando se cultivan células humanas primarias, los recuentos de células no se determinan típicamente antes de depositarlas sobre cubreobjetos. Las células VS primarias no responden bien a tripsinización y pasaje, por lo que para un cálculo fiable de MOI, el número de células adherentes por pocillo puede estimarse usando un microscopio de contraste de fase. Alternativamente, si las células están cerca de la confluencia, sus números pueden estimarse de forma fiable utilizando valores de densidad de células estándares paraUna placa de 24 pocillos ( por ejemplo, 5 x 104 células por pocillo).
  2. Bajo una campana de flujo laminar, se prepara un medio suplementado que contiene la cantidad deseada de virus en un tubo de laboratorio cónico de 15 ml, de manera que se prepara 1 ml de medio que contiene virus para cada pocillo de células a transducir. Pipetee el medio que contiene el virus hacia arriba y hacia abajo para mezclar suavemente pero a fondo.
  3. Usando fórceps estériles, transfiera los cubreobjetos que contienen las células VS primarias (paso 5.2.8) de la placa original de 24 pocillos a una nueva placa de 24 pocillos. Después de la transferencia de cada cubreobjetos, agregue 1 mL de medio que contenga virus. Remueva la placa cada vez que se añade medio para asegurar que las células estén recubiertas uniformemente con el virus.
  4. Incubar a 37 ° C y 5% de CO 2 durante la duración del experimento previsto.
    NOTA: Las incubaciones que van desde 48-120 h han mostrado resultados prometedores de transducción [ 27] .

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Representative Results

Las células VS humanas primarias en cultivo, como se establece en la sección 5, pueden tratarse como modelos informativos para procesos asociados a enfermedades en muchas aplicaciones de investigación posteriores ( Figura 1 ). Las células sanas de Schwann cultivadas en la sección 6 proporcionan un punto de comparación directo e instructivo. Como se describe a continuación, los datos extensos de VSs y GANs procesados ​​de acuerdo con este marco metodológico unificado están disponibles en varios artículos publicados previamente 12 , 13 , 14 , 15 , 27 .

La transducción exitosa de células VS primarias con virus adeno-asociados para terapia génica se presenta aquí por primera vez ( Figura 2 ). Las células VS primarias se transdujeron en cultivo w Ith Anc80-que expresa GFP, un ancestro predicho de los virus adeno-asociados [ 28] . Anc80 ha demostrado ser un vector de máxima eficiencia para la transferencia de genes en los tejidos cocleares murinos in vitro e in vivo [ 27] . La transducción efectiva de células humanas primarias con este vector tiene implicaciones importantes para futuras incursiones en la terapia génica para VS.

Figura 1
Figura 1: Imágenes de campo claro de culturas de Schwannoma vestibular humano primario.
Se pueden identificar patrones típicos en la organización de células VS en cultivo. Barra de escala = 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Imagen inmunofluorescente representativa de los cultivos de Schwannoma vestibular humano primario después de la exposición a Anc80 que expresaba GFP durante 48 h a una multiplicidad de infección (MOI) de 250.000.
Verde = GFP; Rojo = faloidina / F-actina (mancha el citoesqueleto); Azul = DAPI (mancha el núcleo). Barras de escala = 50 μm (A) y 100 μm (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Este manuscrito describe un marco metodológico unificado para la investigación VS, que describe el procesamiento simultáneo de especímenes humanos VS y GAN para aplicaciones de investigación aguas abajo. A medida que la investigación VS entra en la era de la medicina de precisión, la preparación de la misma muestra en formas capaces de responder a numerosas preguntas de investigación permitirá el descubrimiento de los conocimientos moleculares, celulares, genéticos y proteómicos específicos de cada paciente.

La pureza de la célula de Schwann humana y los cultivos de VS se evaluaron minuciosamente a lo largo del tiempo mediante inmunocitoquímica, utilizando la relación de células positivas para el marcador S100 a las positivas para la tinción nuclear DAPI 19 . Por consiguiente, se recomienda llevar a cabo experimentos en cultivos primarios de células de Schwann humano dentro de las primeras dos semanas después de depositar las células, ya que la pureza de estas células es la más alta durante este período; Después, las células similares a fibroblastos comienzan a predominar. TúLos cultivos de células GH VS son también máximamente puros a las dos semanas de cultivo, las células VS carecen de inhibición mediada por contacto y continuarán proliferando en etapas posteriores. Además, una comparación directa de microarrays de la expresión de la proteína del tejido VS (sección 4) y células VS en el cultivo de los mismos tumores (sección 5) demostró con éxito que los cultivos VS demuestran un nivel satisfactorio de similitud biológica a sus respectivos tumores progenitores [ 19] . La cuantificación exitosa de proteínas de interés puede realizarse mediante Western blot de lisados ​​de proteínas generados en la sección 4 y la cuantificación de transcritos de ARN mediante qRT-PCR de ARN extraído de tejidos conservados con solución de estabilización de ARN (sección 2) 12 , 13 , 14 .

Las células VS y GAN en cultivo pueden estar expuestas a sustancias químicamente activas, tales como fármacos antiinflamatorios no esteroideos,L ARNs interferentes (siRNAs) o compuestos orgánicos naturales para elucidar mecanismos moleculares específicos de la enfermedad o para probar un objetivo terapéutico 13 , 14 , 29 . Los compuestos de interés se pueden añadir directamente a células en cultivo después de diluciones apropiadas en medio de cultivo suplementado regular. Para evaluar el efecto de tales sustancias sobre aspectos importantes de la fisiología celular, el marcaje de bromodesoxiuridina (BrdU) para la proliferación, la desoxinucleotidil transferasa terminal dUTP marcación final (TUNEL) para la apoptosis y la 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) La reducción del bromuro de 2,5-difeniltetrazolio (MTT) para la viabilidad metabólica son ensayos fiables que pueden utilizarse con confianza en estas células 19 . El medio de cultivo de células tratadas también puede ser aspirado cuidadosamente, almacenado a -20ºC, y ensayado para cuantificar niveles relativos de sustancias secretadas, tales como prostaglandina E2, cuya secreción cA ser afectados por el tratamiento con drogas 13 . Además, la fijación de tejidos (sección 7) y posterior incrustación en OCT o parafina proporciona un sustrato robusto para ensayos de inmunofluorescencia [ 13 , 14] .

El medio condicionado por tumor o nervio generado en la sección 3 proporciona una manera simple y eficaz de evaluar moléculas solubles secretadas por VS y extraer las vesículas extracelulares. Las matrices de citoquinas o ELISAs pueden llevarse a cabo sobre estas secreciones, como se indica en los protocolos de los fabricantes, esbozados en dos estudios publicados 9 , 12 . Las vesículas extracelulares pueden purificarse a partir de estas secreciones usando ultracentrifugación, como se detalla en una publicación anterior 30 . Alternativamente, las propias secreciones pueden usarse como reactivos específicos del paciente para aplicaciones de investigación aguas abajo. Por ejemplo, en un experimento que reveUn nuevo mecanismo subyacente a la pérdida auditiva neurossensorial asociada a VS, se recolectaron secreciones del tejido VS de pacientes con pacientes con insuficiencia auditiva y VS con buena audición después de la incubación en DMEM durante 72 h (sección 3). Estas secreciones tumorales se aplicaron entonces a los explantes cocleares murinos y se reveló que las secreciones tumorales de pacientes VS con mala audición causaban más daño a los explantes cocleares que las secreciones de pacientes VS con buen oído 15 . Es importante destacar que las secreciones recogidas en los puntos de tiempo antes de las 72 h no causaron daños sustanciales.

El perilimato humano recolectado de los pacientes sometidos a una resección translavirríntica VS (sección 8) representa una excitante nueva vía para el descubrimiento de biomarcadores VS. Los especímenes recogidos de acuerdo con la sección 8 se analizaron mediante cromatografía líquida-espectrometría de masa en tándem (LC-MS / MS) para mapear el proteoma del perilinfo humano, y 15 biomarcadores candidatos de VS fueron exitosamente iIdentificado 31 . Un análisis similar podría ser posible utilizando CSF ​​humano recogido de pacientes VS (sección 9).

Una consideración significativa en la investigación VS es la selección de tejido de control adecuado. Estudios previos han utilizado el nervio coclear, el nervio vestibular, y los nervios periféricos no relacionados (como el nervio ciático), a efecto variable [ 22 , 32] . Sin embargo, varias razones llevan al apoyo del uso de GAN como controles de máxima relevancia 15 . Al igual que el nervio vestibular, el GAN ​​es un nervio sensorial periférico con axones enshedrhed por células de Schwann. Es importante destacar que una investigación bibliográfica revela que nunca se ha encontrado que los schwannomas se desarrollen a partir del GAN, haciendo improbables los cambios neoplásicos en este tejido. Además, los GANs se sacrifican regularmente al acceder a las estructuras del cuello más profundo, dando a los investigadores hospitalarios acceso fácil a la saludY durante las disecciones de rutina y las parotidectomías. Aunque el nervio coclear se sacrifica a menudo durante la cirugía VS y puede estar fácilmente disponible, su proximidad a los nervios vestibulares corre el riesgo de compartir el mismo microambiente, lo que puede demostrar cambios moleculares pre-tumorales 33 . Otros laboratorios también han utilizado con éxito GANs como un control adecuado para la investigación VS, y se recomienda continuar con esta práctica 20 , 21 , 22 , 34 .

Un paso crítico pero a menudo pasado por alto dentro de los protocolos de cultivo específicos del tipo de célula (secciones 5 y 6) es la eliminación apropiada de tejidos y vasos sanguíneos no viables. La eliminación de estos tejidos no tumorales es crucial para generar cultivos robustos de máxima pureza. Además, cuando se coloca un medio de cultivo que contiene células sobre cubreobjetos, es importantePreste mucha atención a la cantidad de tejido transferida a cada pocillo. El logro de una distribución uniforme, ligeramente densa de células que contienen unos pocos "trozos" de tejido más denso en cada pocillo es particularmente importante para las células de Schwann, que requieren un número suficiente de células adherentes para prosperar. El recubrimiento de los cubreobjetos con poli-D-lisina y laminina también permite el crecimiento eficiente de las células. Las células proliferan más fuertemente cuando los cubreobjetos se recubren en el laboratorio, en comparación con los productos pre-recubiertos comercialmente disponibles.

Para asegurar una extracción de proteínas y ARN de alta calidad, verifique que el tejido permanezca a temperaturas inferiores a 4 ° C a lo largo de las secciones 2 y 4. Además, como la literatura sobre el análisis de las secreciones VS es escasa (sección 3), los nuevos proyectos podrían requerir Nuevas innovaciones y diferentes longitudes de incubación.

Como los métodos para abordar la pathobiología VS continúan avanzando, el uso de este strUna combinación eamlined de técnicas fundamentales permitirá la cantidad máxima de información que se obtiene de una sola muestra humana. El procesamiento simultáneo informado de los tejidos VS y GAN será fundamental para la generación de terapias farmacológicas y genéticas efectivas contra este tumor debilitante.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Sordera y otros trastornos de la comunicación subvenciones R01DC015824 (KMS) y T32DC00038 (apoyo JES y SD), el Departamento de Defensa W81XWH-14-1-0091 (KMS), la Fundación Bertarelli (KMS) , La Fundación Nancy Sayles Day (KMS), el Lauer Tinnitus Research Center (KMS) y la Fundación Barnes (KMS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin 12 mm #1 German Glass Coverslip Corning 354087 Or prepare coverslips with Corning Laminin (CB-40232) and Cultrex Poly-L-Lysine (3438-100-01)
CELLSTAR 15 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile Greiner Bio-One 188161
CELLSTAR 50 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile Greiner Bio-One 227261
CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 mm Greiner Bio-One 628160
Collagenase from Clostridium histolyticum, Sterile-filtered Sigma-Aldrich C1639
Costar 24 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates, Sterile Corning 3526
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Thermo Fisher Scientific D1306
DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 mL Thermo Fisher Scientific 10313-039
DMEM/F-12, 500 mL Thermo Fisher Scientific 11320-033
Dumont #3 Forceps, Dumoxel Fine Science Tools 11231-30 Autoclave prior to use
Dumont #5 Forceps, Standard tip, Inox Fine Science Tools 11251-20 Autoclave prior to use
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions, 500 mL Thermo Fisher Scientific 10437-028 Aliquot in 50 mL tubes and store in -20°C freezer
Hyaluronidase from Bovine Testes, Type I-S, Lyophilized Powder Sigma-Aldrich H3506
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, sterile EMD Millipore SLGP033RS
Paraformaldehyde, Reagent Grade, Crystalline Sigma-Aldrich P6148 Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online
PBS, pH 7.4, 500 mL Thermo Fisher Scientific 10010-023 Autoclave prior to use
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100 mL Thermo Fisher Scientific 15140-122
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Tablets Roche 04906845001
Pierce Protease Inhibitor Tablets Thermo Fisher Scientific 88666
Pipettes and pipette tips, 5/10/25 mL Variable Variable
Plastic Homogenization Pestle for 1.5/2.0 mL Microtubes E&K Scientific EK-10539
PrecisionGlide Needles, 27 G x 1 1/2 in BD 301629
RIPA Buffer Boston BioProducts BP-115
RNAlater (RNA stabilization solution) Thermo Fisher Scientific AM7021
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 mL Eppendorf 022363719 Autoclave prior to use
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 mL Eppendorf 022363204 Autoclave prior to use
Saline - 0.9% Sodium Chloride Injection, bacteriostatic, 20 mL Hospira 0409-1966-05
Scalpel Blades - #15 Fine Science Tools 10015-00
Schuknecht Suction Tube 24 gauge Bausch + Lomb N1698 42 Useful for the surgical approach (in addition to common otologic surgical instruments) and e.g. a blue surgical marker
Specimen Container, OR sterile, 4OZ Medline DYND30331H
Stemi 2000-C Stereo Microscope Zeiss 000000-1106-133
Syringe/Needle Combination, Luer-Lok Tip, 5 mL, 22 G x 1 in. BD 309630
Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 1 mL BD 309659
Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 3 mL BD 309656
Ultrasonic homogenizer, 4710 Series, CV18 probe Cole-Parmer CP25013

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References

  1. Babu, R., et al. Vestibular schwannomas in the modern era: epidemiology, treatment trends, and disparities in management. J Neurosurg. 119 (1), 121-130 (2013).
  2. Gal, T. J., Shinn, J., Huang, B. Current epidemiology and management trends in acoustic neuroma. Otolaryngol Head Neck Surg. 142 (5), 677-681 (2010).
  3. Propp, J. M., McCarthy, B. J., Davis, F. G., Preston-Martin, S. Descriptive epidemiology of vestibular schwannomas. Neuro Oncol. 8 (1), 1-11 (2006).
  4. Stangerup, S. E., Tos, M., Thomsen, J., Caye-Thomasen, P. True incidence of vestibular schwannoma? Neurosurgery. 67 (5), 1335-1340 (2010).
  5. Tos, M., Stangerup, S. E., Caye-Thomasen, P., Tos, T., Thomsen, J. What is the real incidence of vestibular schwannoma? Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 130 (2), 216-220 (2004).
  6. Stangerup, S. E., Caye-Thomasen, P. Epidemiology and natural history of vestibular schwannomas. Otolaryngol Clin North Am. 45 (2), 257-268 (2012).
  7. Mahaley, M. S., Mettlin, C., Natarajan, N., Laws, E. R., Peace, B. B. Analysis of patterns of care of brain tumor patients in the United States: a study of the Brain Tumor Section of the AANS and the CNS and the Commission on Cancer of the ACS. Clin Neurosurg. 36, 347-352 (1990).
  8. Carlson, M. L., Link, M. J., Wanna, G. B., Driscoll, C. L. Management of sporadic vestibular schwannoma. Otolaryngol Clin North Am. 48 (3), 407-422 (2015).
  9. Dilwali, S., et al. Sporadic vestibular schwannomas associated with good hearing secrete higher levels of fibroblast growth factor 2 than those associated with poor hearing irrespective of tumor size. Otol Neurotol. 34 (4), 748-754 (2013).
  10. Caye-Thomasen, P., et al. VEGF and VEGF receptor-1 concentration in vestibular schwannoma homogenates correlates to tumor growth rate. Otol Neurotol. 26 (1), 98-101 (2005).
  11. Koutsimpelas, D., et al. The VEGF/VEGF-R axis in sporadic vestibular schwannomas correlates with irradiation and disease recurrence. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 74 (6), 330-338 (2012).
  12. Dilwali, S., Roberts, D., Stankovic, K. M. Interplay between VEGF-A and cMET signaling in human vestibular schwannomas and schwann cells. Cancer Biol Ther. 16 (1), 170-175 (2015).
  13. Dilwali, S., Kao, S. Y., Fujita, T., Landegger, L. D., Stankovic, K. M. Nonsteroidal anti-inflammatory medications are cytostatic against human vestibular schwannomas. Transl Res. 166 (1), 1-11 (2015).
  14. Dilwali, S., et al. Preclinical validation of anti-nuclear factor-kappa B therapy to inhibit human vestibular schwannoma growth. Mol Oncol. 9 (7), 1359-1370 (2015).
  15. Dilwali, S., Landegger, L. D., Soares, V. Y., Deschler, D. G., Stankovic, K. M. Secreted Factors from Human Vestibular Schwannomas Can Cause Cochlear Damage. Sci Rep. 5, 18599 (2015).
  16. Blakeley, J. Development of drug treatments for neurofibromatosis type 2-associated vestibular schwannoma. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 20 (5), 372-379 (2012).
  17. Schroeder, R. D., Angelo, L. S., Kurzrock, R. NF2/merlin in hereditary neurofibromatosis 2 versus cancer: biologic mechanisms and clinical associations. Oncotarget. 5 (1), 67-77 (2014).
  18. Schularick, N. M., Clark, J. J., Hansen, M. R. Primary culture of human vestibular schwannomas. J Vis Exp. (89), (2014).
  19. Dilwali, S., et al. Primary culture of human Schwann and schwannoma cells: improved and simplified protocol. Hear Res. , 25-33 (2014).
  20. Brown, C. M., Ahmad, Z. K., Ryan, A. F., Doherty, J. K. Estrogen receptor expression in sporadic vestibular schwannomas. Otol Neurotol. 32 (1), 158-162 (2011).
  21. Cioffi, J. A., et al. MicroRNA-21 overexpression contributes to vestibular schwannoma cell proliferation and survival. Otol Neurotol. 31 (9), 1455-1462 (2010).
  22. Doherty, J. K., Ongkeko, W., Crawley, B., Andalibi, A., Ryan, A. F. ErbB and Nrg: potential molecular targets for vestibular schwannoma pharmacotherapy. Otol Neurotol. 29 (1), 50-57 (2008).
  23. Aguiar, P. H., Tatagiba, M., Samii, M., Dankoweit-Timpe, E., Ostertag, H. The comparison between the growth fraction of bilateral vestibular schwannomas in neurofibromatosis 2 (NF2) and unilateral vestibular schwannomas using the monoclonal antibody MIB 1. Acta Neurochir (Wien). 134 (1-2), 40-45 (1995).
  24. Cattoretti, G., et al. Monoclonal antibodies against recombinant parts of the Ki-67 antigen (MIB 1 and MIB 3) detect proliferating cells in microwave-processed formalin-fixed paraffin sections. J Pathol. 168 (4), 357-363 (1992).
  25. Hung, G., et al. Immunohistochemistry study of human vestibular nerve schwannoma differentiation. Glia. 38 (4), 363-370 (2002).
  26. Archibald, D. J., et al. B7-H1 expression in vestibular schwannomas. Otol Neurotol. 31 (6), 991-997 (2010).
  27. Landegger, L. D., et al. A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).
  28. Zinn, E., et al. In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector. Cell Rep. 12 (6), 1056-1068 (2015).
  29. Kim, B. G., et al. Sulforaphane, a natural component of broccoli, inhibits vestibular schwannoma growth in vitro and in vivo. Sci Rep. 6, 36215 (2016).
  30. Soares, V. Y., et al. Extracellular vesicles derived from human vestibular schwannomas associated with poor hearing damage cochlear cells. Neuro Oncol. 18 (11), 1498-1507 (2016).
  31. Lysaght, A. C., et al. Proteome of human perilymph. J Proteome Res. 10 (9), 3845-3851 (2011).
  32. Caye-Thomasen, P., Borup, R., Stangerup, S. E., Thomsen, J., Nielsen, F. C. Deregulated genes in sporadic vestibular schwannomas. Otol Neurotol. 31 (2), 256-266 (2010).
  33. Schulz, A., et al. The importance of nerve microenvironment for schwannoma development. Acta Neuropathol. 132 (2), 289-307 (2016).
  34. Torres-Martin, M., et al. Global profiling in vestibular schwannomas shows critical deregulation of microRNAs and upregulation in those included in chromosomal region 14q32. PLoS One. 8 (6), e65868 (2013).

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