Summary
El polvo de bambú se pretrató con NaOH y se hidrolizó enzimáticamente. El hidrolizado de bambú se utilizó como materia prima para la producción de ácido 2,3-butanodiol, R -acetona, ácido 2-cetoglucónico y ácido xilónico por Klebsiella pneumoniae .
Abstract
El bambú es una biomasa importante, y el hidrolizado de bambú es utilizado por Klebsiella pneumoniae como materia prima para la producción química. En este caso, el polvo de bambú se pretrató con NaOH y se lavó hasta un pH neutro. Se añadió celulasa al polvo de bambú pretratado para generar el hidrolizado, que contenía 30 g / l de glucosa y 15 g / l de xilosa y se usó como fuente de carbono para preparar un medio para la producción química. Cuando se cultivaron en condiciones microaeróbicas, se produjo 12,7 g / l de 2,3-butanodiol por K. pneumoniae de tipo salvaje. En condiciones aerobias, 13,0 g / L de acetona R fue producida por el mutante budC de K. pneumoniae . Una mezcla de 25,5 g / L de ácido 2-cetoglucónico y 13,6 g / l de ácido xilónico fue producida por el mutante budA de K. pneumoniae en una fermentación controlada por pH de dos etapas con alta suplementación de aire. En la primera etapa de fermentación, el cultivo se mantuvo a un pH neutro; Después del crecimiento celular, la fermentaciónN pasó a la segunda etapa, durante la cual se dejó que el cultivo se volviera ácido.
Introduction
Klebsiella pneumoniae es una bacteria que crece bien bajo condiciones aerobias y anaerobias. K. pneumoniae es un importante microorganismo industrial utilizado para producir muchos productos químicos. 1,3-propanodiol es un producto químico valioso que se utiliza principalmente como un monómero para sintetizar tereftalato de politrimetileno. El poli (tereftalato de etileno) es un poliéster biodegradable que presenta mejores propiedades que las del 1,2-propanodiol, butanodiol o etilenglicol 1 . 1,3-propanodiol se produce por K. pneumoniae utilizando glicerol como un sustrato en condiciones de oxígeno limitado 2 . 2,3-butanodiol y sus derivados tienen aplicaciones en el campo de los plásticos, la producción de disolventes y el caucho sintético y tienen potencial para ser utilizados como biocombustibles 3 . Con la glucosa como sustrato, el 2,3-butanodiol es el metabolito principal de la cepa 4 de tipo salvaje. 2,3-butanodiol es sintetizadorEd de piruvato. En primer lugar, dos moléculas de piruvato se condensan para dar α-acetolactato; Esta reacción es catalizada por α-acetolactato sintasa. El acetonato de α-acetato se convierte entonces en acetoin por α-acetolactato decarboxilasa. La R -acetina puede reducirse adicionalmente a 2,3-butanodiol cuando se cataliza con butanodiol-deshidrogenasa. Se ha explorado un método eficiente de reemplazo genético adecuado para K. pneumoniae , y se han construido muchos mutantes 5 , 6 , 7 . Un mutante budC , que perdió su actividad de 2,3-butanodiol deshidrogenasa, acumula altos niveles de acetoin en caldo de cultivo. La acetoína se utiliza como aditivo para mejorar el sabor de los alimentos 8 . Cuando budA , que codifica α-acetolactato descarboxilasa, está mutado, el ácido 2-cetoglucónico se acumula en el caldo. El ácido 2-cetoglucónico se utiliza para la síntesis de ácido eritórbico (ácido isoascórbico), Un antioxidante utilizado en la industria alimentaria 9 . El ácido 2-cetoglucónico es un intermedio de la vía de oxidación de la glucosa; En esta vía, situada en el espacio periplásmico, la glucosa se oxida a ácido glucónico y luego se oxida a ácido 2-cetoglucónico. El ácido glucónico y el ácido 2-cetoglucónico producido en el periplasma pueden ser transportados al citoplasma para un metabolismo adicional. La acumulación de ácido 2-cetoglucónico depende de condiciones ácidas, y una mayor suplementación de aire favorece la producción de ácido 2-cetoglucónico 10 . Gluconato deshidrogenasa, codificada por gad , Cataliza la conversión del ácido glucónico en ácido 2-cetolucucónico. El mutante gad de K. pneumoniae produjo altos niveles de ácido glucónico en lugar de ácido 2-cetoglucónico, y este proceso también depende de condiciones ácidas. El ácido glucónico es un ácido orgánico a granel y se utiliza como aditivo para aumentar las propiedades del cemento 11. La oxidación de la glucosa al ácido glucónico es catalizada por la glucosa deshidrogenasa. La xilosa es también un sustrato adecuado de glucosa deshidrogenasa. Cuando se utiliza xilosa como sustrato, K. pneumoniae produce ácido xilónico 12 .
La producción química utilizando la biomasa como materia prima es un tema candente en la biotecnología 13 . Los componentes principales de la biomasa son la celulosa, la hemicelulosa y la lignina. Sin embargo, estos compuestos macromoleculares no pueden ser catabolizados directamente por la mayoría de los microorganismos (incluyendo K. pneumoniae ). La celulosa y hemicelulosas en la biomasa deben ser hidrolizadas a glucosa y xilosa y luego pueden ser utilizadas por microorganismos. La presencia de lignina en lignocelulosas crea una barrera protectora que previene la hidrolización de la biomasa por enzimas. Por lo tanto, un proceso de pretratamiento que elimina la lignina y las hemicelulosas y reduce la cristalinidad de la celulosa se realiza siempre durante la utilización de la biomasa por micrófonoRoorganismos. Se han desarrollado muchos métodos de pretratamiento: son comunes los pretratamientos con ácido, alcalino, amoníaco y vapor.
El bambú es abundante en las regiones tropicales y subtropicales y es un importante recurso de biomasa. Aquí, se presenta la preparación de hidrolizado de bambú y la producción química utilizando hidrolizado de bambú
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparación de hidrolizado de bambú
- Añadir 5 g de polvo de bambú a 40 ml de una solución de NaOH para lograr una concentración final de 10% (g / g) en un matraz de 250 ml. Utilizar una serie de soluciones de NaOH que varían de 0,05 M a 0,50 M en incrementos de 0,05 M.
- Incubar la mezcla durante 60 minutos a 60 ° C o 100 ° C en un baño de agua. Incubar a 121 ° C en un autoclave.
- Después de la incubación, dejar reposar la mezcla durante 4 h a temperatura ambiente. A continuación, eliminar el sobrenadante. Añadir 100 ml de agua dulce y mezclar.
- Repetir este lavado 5-6 veces, hasta que el pH del sobrenadante alcance 6,8. Utilizar el sólido obtenido para la siguiente etapa de hidrólisis enzimática.
- Para la hidrólisis, ajustar 50 ml de la mezcla anterior a pH 5,0 usando H2SO4 al 98%. A continuación, añadir 0,5 ml de 200 de papel de filtro de actividad (FPU) / ml de celulasa.
NOTA: La proporción final de celulasa a bambú shOld ser 20 FPU por 1 g de bambú. - Incubar la mezcla a 50 ° C durante 36 h en un agitador.
NOTA: Después de la hidrólisis, permanecerá algún sólido en la mezcla. - Obtener un hidrolizado claro por centrifugación a 7,690 xg durante 5 min.
- Cuantificar la glucosa, la xilosa y otros productos químicos con un sistema de cromatografía líquida de alta presión equipado con un detector de índice de refracción y un detector de matriz de fotodiodos. Utilizar una columna HPX-87H (300 mm x 7,8 mm) y una fase móvil de solución de H 2 SO 4 5 mM a una velocidad de flujo de 0,8 ml / min.
- Para un gran volumen de preparación de hidrolizado, mezclar 2 kg de polvo de bambú y 18 L de NaOH 0,25 M en un tanque de acero inoxidable de 30 litros.
- Incubar el tanque a 121 ° C en un autoclave durante 60 min. Después de la incubación, lavar la mezcla con 40 L de agua en un tanque de plástico de 60 l. Repita este lavado 5 veces.
- Utilice agua para ajustar el bambú lavado total a un volumen de 20 L.Ajustar el pH de la mezcla a 5,0 con H2SO4 al 98%.
- Hidrolice enzimáticamente la mezcla en un baño de agua de agitación modificado, equipado con un agitador mecánico para asegurar que la mezcla está bien distribuida. Añadir 200 ml de 200 FPU / ml de celulasa e incubar la mezcla a 50 ° C durante 36 h.
- Después de hidrólisis, centrifugar la mezcla a 4.700 xg durante 10 min.
2. Producción de 2,3-butanodiol por Wildtype K. pneumoniae
- Utilice 3 L de hidrolizado de bambú como disolvente para la preparación del medio.
- Preparar un medio de fermentación que contenga 4 g / l de licor de maíz, 2 g / L de (NH 4 ) 2 SO 4 , 6 g / LK 2 HPO 4 , 3 g / L de KH 2 PO 4 y 0,2 g / L de MgSO 4 . Ajustar el pH del medio a neutro usando NaOH 2,5 M. Utilizar un biorreactor de 5 L que contenga 3 L de medio de fermentación autoclavado para la fermentación.
- Utilice K. pneumoniaeCélulas almacenadas en un refrigerador a baja temperatura de -80 ° C.
- Para el cultivo de siembra, incubar un matraz de 250 ml que contiene 50 ml de medio Luria-Bertani (LB) durante la noche a 37 ° C, con agitación a 200 rpm. Utilizar medio LB que contenga 10 g / l de triptona, 5 g / l de extracto de levadura y 10 g / l de NaCl.
NOTA: La densidad celular del cultivo de siembra debe alcanzar OD2 (densidad óptica a 600 nm). - Inocular un frasco de 50 ml del cultivo de siembra en el biorreactor. Mantener el cultivo a pH 6,0 y 37 ° C. Utilice una tasa de suplementación de aire de 2 l / min y una velocidad de agitación de 250 rpm, creando una condición microaeróbica.
- Recoger muestras de 5 mL cada 2 h durante la fermentación y analizarlas con cromatografía líquida de alta presión para determinar las concentraciones químicas en el caldo 4 .
- Monitoree el álcali agregado al bioreactor en línea usando MFCS / DA.
NOTA: Los ácidos orgánicos se producen en el proceso de fermentación,Y se añade NaOH para mantener el pH del cultivo estable. El volumen de álcali añadido representa la cantidad de ácido producido. Cuando el álcali-agregó la línea de las mesetas, el proceso está terminado, ya sea debido al agotamiento de la fuente de carbono o muerte celular.
- Monitoree el álcali agregado al bioreactor en línea usando MFCS / DA.
3. Producción de R- acetona por el mutante budC de K. pneumoniae
- Preparar un medio para la producción de acetoína que contenga 4 g / l de licor de maíz, 2 g / l de (NH4) 2SO4, 3 g / l de acetato de sodio, 0,4 g / l de KCl y 0,1 g / l de MgSO4.
- Utilice K. pneumoniae-ΔbudC para la producción de R -acetoin. Repita los pasos 2.4-2.5.
NOTA: budC codifica 2,3-butanodiol deshidrogenasa. K. pneumoniae-ΔbudC pierde la actividad de 2,3-butanodiol deshidrogenasa y produce R -acetoin en lugar de 2,3-butanediol. - Mantener el cultivo a pH 6,0 y 37 ° C. Utilice una tasa de suplementación de aire de 4 L / min y una agitaciónN de 450 rpm, una condición aerobia.
NOTA: El suplemento de oxígeno es mayor que el de la producción de 2,3-butanodiol. - Ensayar las muestras como en el paso 2.6.
4. Producción de ácido 2-cetoglucónico por el mutante budA de K. pneumoniae
- Para la producción de ácido 2-cetoglucónico, utilice el mismo medio que para la producción de R -acetoin.
- Utilice K. pneumoniae-ΔbudA para la producción de ácido 2-cetoglucónico. Repita los pasos 2.4-2.5.
NOTA: budA codifica α-acetolactato decarboxilasa. K. pneumoniae-ΔbudA pierde la actividad α-acetolactato decarboxilasa y produce ácido 2-cetoglucónico, utilizando glucosa como sustrato.
NOTA: La síntesis de ácido 2-cetoglucónico es un proceso ácido dependiente de la condición. Se ha desarrollado una fermentación en dos etapas para la producción de ácido 2-cetoglucónico 10 ; En la primera etapa, el cultivo de siembra se inocula en el biorreactor. - Ensayar las muestras como en el paso 2.6. Utilizando el hidrolizado de bambú como fuente de carbono.
NOTA: La glucosa en el medio se convierte en ácido 2-cetoglucónico y la xilosa se convierte en ácido xilónico. De este modo, se obtiene una mezcla de ácido 2-cetoglucónico y ácido xilónico.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En este protocolo, el bambú fue pretratado usando álcali. Los parámetros óptimos de incubación -una temperatura de 121 ° C y NaOH 0,25 M- se determinaron en las Figuras 1 y 2 . El bambú pretratado se hidrolizó enzimáticamente y se midieron las concentraciones de glucosa y xilosa obtenidas en el hidrolizado. Las temperaturas más altas favorecían la producción de azúcar, por lo que se seleccionó 121 ° C como temperatura óptima. La glucosa y la xilosa producidas en el hidrolizado aumentaron con una concentración de NaOH en el intervalo de 0,05 a 0,25 M. Otros incrementos en la concentración de NaOH no tuvieron efecto positivo sobre la producción de azúcar. Ası, se seleccionó NaOH a 0,25 M como concentración óptima.
Figura 1: El efecto de la temperatura de pretratamiento sobre la glucosa y la xilosaCentrado en hidrolizado de bambú. Columna roja: glucosa; Columna azul: xilosa. Temperaturas más altas favorecían la producción de azúcar, y 121 ° C se seleccionó para la preparación de gran volumen de hidrolizado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: El efecto de la concentración de NaOH utilizada durante el pretratamiento sobre la concentración de glucosa y xilosa en el hidrolizado de bambú. Línea roja: glucosa; Línea azul: xilosa. La glucosa y la xilosa producidas en el hidrolizado aumentaron con una concentración de NaOH en el intervalo de 0,05-0,50 M, y se seleccionó 0,25 M para la preparación de hidrolizado de gran volumen. Por favor, haga clic en élPara ver una versión más grande de esta figura.
Se produjeron aproximadamente 20 g / l de glucosa y 10 g / l de xilosa durante el hidrolizado en la hidrólisis enzimática en escala de matraz; Se obtuvieron 30 g / l de glucosa y 15 g / l de xilosa a partir de la preparación de gran volumen de hidrolizado. Esto se debió a que la preparación de gran volumen se realizó en un agitador de baño de agua abierta, y se evaporó algo de agua en el proceso, dando lugar a la concentración del hidrolizado. La glucosa y la xilosa en el hidrolizado de bambú fueron utilizadas por K. pneumoniae como fuentes de carbono para la producción química. Otros compuestos del hidrolizado fueron celobiosa (1,4 g / l), arabinosa (8,9 g / l), ácido acético (1,9 g / l) y ácido fórmico (0,2 g / l).
El 2,3-butanodiol fue producido por K. pneumoniae en condiciones microaeróbicas ( Figura 3 ). El proceso se dividió en dos períodos. En el fPrimero, la glucosa fue utilizada por las células para producir 7,6 g / l de 2,3-butanodiol, mientras que el nivel de xilosa en el caldo permaneció sin cambios. La glucosa se agotó a las 8 h, y esta vez marcó el cambio al siguiente período. En el segundo período, la xilosa en el caldo fue utilizada por las células, y se produjo un 2,3-butanodiol adicional de 5,1 g / L. La producción de 2,3-butanodiol fue más lenta en el segundo período. Al final del proceso, se había producido un total de 12,7 g / l de 2,3-butanodiol. Los subproductos de este proceso fueron ácido láctico, ácido acético y etanol. El ácido láctico y el etanol se sintetizaron principalmente en el primer período (cuando se utilizó glucosa como fuente de carbono), y el ácido acético se sintetizó continuamente.
Figura 3: Producción de 2,3-butanodiol utilizando hidrolizado de bambú como materia prima. Línea roja: glucosa; Línea azul: xilosa; mamáLina de genta: 2,3 - butanodiol; Línea naranja: ácido láctico; Línea negra: ácido acético; Línea verde: etanol. La glucosa y la xilosa en el hidrolizado se usaron ambas para la síntesis de 2,3-butanodiol, pero la glucosa se usó en primer lugar, seguido de xilosa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
R- acetoin fue producido por el mutante budC de K. pneumoniae en condiciones aerobias ( Figura 4 ]. Como en la producción de 2,3-butanodiol por la cepa de tipo salvaje, la glucosa y luego la xilosa se usaron secuencialmente por K. pneumoniae-ΔbudC . La xilosa se agotó a las 16 h, y la tasa de consumo fue más rápida que la producción de 2,3-butanodiol por el tipo salvaje. La producción de R -acetoin fue de 13 g / L al final del proceso, y los subproductos fueron 2,3-butanodiol, ácido acético y eThanol
Figura 4: Producción de R -acetina utilizando hidrolizado de bambú como materia prima. Línea roja: glucosa; Línea azul: xilosa; Línea violeta: acetoin; Lınea magenta: 2,3-butanodiol; Línea negra: ácido acético; Línea verde: etanol. La glucosa y la xilosa en el hidrolizado se usaron ambas para la síntesis de R -acetoin, y su uso fue en secuencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Ácido 2-cetoglucónico y ácido xilónico por el mutante budA de K. pneumoniae ( Figura 5 ). Este proceso requirió un alto suplemento de aire. La glucosa en el medio se convirtió primero en gluconQue se acumulaba en el caldo. El ácido glucónico alcanzó un nivel máximo de 15 g / L a las 8 h de cultivo, y después de eso, su concentración disminuyó. No se produjo ácido 2-cetoglucónico hasta las 6 h en el cultivo. A continuación se sintetizó a una velocidad elevada y se produjo ácido 2-cetoglucónico 25 g / l al final del proceso. La xilosa en el medio se convirtió en ácido xilónico; Esta reacción comenzó más tarde que la conversión de glucosa en ácido glucónico. Durante el proceso se produjo algún ácido acético como subproducto.
Figura 5: producción de ácido 2-cetoglucónico y ácido xilónico utilizando hidrolizado de bambú como materia prima. Línea roja: glucosa; Línea naranja: ácido glucónico; Línea magenta: ácido 2 - cetoglucónico; Línea azul: xilosa; Línea negra: ácido acético; Línea verde: etanol. La glucosa en el hidrolizado se convirtió en ácido glucónicoY se convirtió adicionalmente en ácido 2-cetoglucónico. La xilosa en el hidrolizado se convirtió en ácido xilónico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
K. pneumoniae pertenece al género Klebsiella en la familia Enterobacteriaceae . K. pneumoniae se distribuye ampliamente en entornos naturales como el suelo, la vegetación y el agua 14 . La cepa de K. pneumoniae de tipo salvaje utilizada en esta investigación se aisló del suelo y se utiliza para la producción de 1,3-propanodiol 15 . K. pneumoniae y mutantes de esta especie producen muchos productos químicos bajo diferentes condiciones.
El pH del cultivo y la suplementación con el aire son factores clave que afectan la producción química de K. pneumoniae . Wildtype K. pneumoniae produce el 2,3-butanodiol como el catabolito principal a pH 6. Sin embargo, el ácido 2-cetoglucónico cambia al catabolito principal cuando se cultiva a pH 5 o inferior 9 . Aumentar el suplemento de aire disminuye la síntesis de 2,3-butanodiol, mientras que la síntesis de actina- R se mejora 8 et al. 16 , que es fácil de realizar en el laboratorio, especialmente a escala litera.
Temperaturas de pretratamiento superiores favorecen la producción de azúcar durante la hidrólisis enzimática. El tratamiento a ≤ 100ºC se realizó en un baño de agua ya 121ºC en un autoclave. Estas dos piezas de equipo son comunes en los laboratorios, y varios litros de líquido fueron procesados en cada lote. Las temperaturas más altas requieren reactores de alta presión. Por ejemplo, nuestro laboratorio tiene reactores de alta presión de 50 mL y 1-L, pero los volúmenes de estos reactores limitan su uso durante los pretratamientos de biomasa.
La preparación de hidrolizado de bambú mostrada en esta investigación fue fácil de llevar a cabo en frascos. Sin embargo, cuando se hace en grandes volúmenes, a veces se obtienen niveles más bajos de glucosa y xilosa. La mezcla de hidrólisis debe estar bien distribuida. La precipitación de la biomasa conduciría a niveles más bajos de hidrólisis.
A diferencia de la glucosa pura y la xilosa, el hidrolizado de biomasa está contaminado por muchos productos químicos tóxicos que pueden inhibir el crecimiento de microorganismos. Se han desarrollado muchos métodos para eliminar tales inhibidores, pero se suman a los costos del proceso y tienden a reducir los rendimientos de azúcar 17 . En esta investigación, no se realizó ningún trabajo especial para eliminar los inhibidores. Utilizando el hidrolizado de bambú generado en este trabajo como materia prima, la productividad (0,95 g / Lh) y la relación de conversión (0,25 g / g) de glucosa a 2,3-butanodiol durante la primera etapa, cuando se consumió glucosa, fueron más bajas Que cuando se usó glucosa purificada como fuente de carbono, reportada previamente (1,4 g / Lh y 0,3 g / g, respectivamente) 4 . La productividad de 2,3-butanedIol durante la segunda etapa, cuando se consumió xilosa, fue más lento que en la primera etapa. Sin embargo, la relación de conversión de xilosa a 2,3-butanodiol alcanzó 0,34 g / g, lo cual fue mayor que cuando se usó glucosa purificada como fuente de carbono 4 . La producción de R -acetina utilizando el hidrolizado de bambú como materia prima tenía una relación de productividad y de conversión del sustrato de 0,92 g / Lh y 0,29 g / g, respectivamente. Ambas proporciones fueron menores que cuando se utilizó glucosa purificada como sustrato (1,7 g / Lh y 0,34 g / g, respectivamente) 8 . La productividad y la relación de conversión del ácido 2-cetoglucónico en este estudio fueron 2,3 g / Lh y 0,91 g / g, respectivamente, menor que cuando se utilizó glucosa purificada como fuente de carbono (4,2 g / Lh y 1 g / g, respectivamente ) 10 .
La xilosa es el segundo azúcar más abundante en la naturaleza después de la glucosa. A diferencia de la glucosa, la xilosa no es fácilmente utilizada por la mayoría de los microorganismos. En este pernoY, la xilosa fue totalmente consumida por K. pneumoniae para la producción química. 2,3-butanodiol, R -acetina, ácido 2-cetoglucónico y ácido xilónico son todos productos químicos valiosos, y sus procesos de producción varían de condiciones microaeróbicas a muy aeróbicas. Los resultados de la fermentación aquí indican que los azúcares en el hidrolizado de bambú son fuentes de carbono adecuadas para el crecimiento de K. pneumoniae y la producción química en diferentes condiciones.
El uso de hidrolizado de biomasa como materia prima es un método prometedor para la producción química. Sin embargo, todavía hay muchas deficiencias que deben superarse, tales como la gran cantidad de agua necesaria para lavar la biomasa pretratada y la cantidad de tiempo necesaria para la hidrólisis enzimática.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Grant No. 21576279, 20906076) y el Programa de Iniciativa de Investigación KRIBB (KGM2211531).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| autoclave | SANYO | 3780 | |
| bioreactor | Sartorius stedim biotech | Bostat Aplus | |
| agitator | IKA | RW 20 | |
| water bath shaker | Zhicheng | ZWY-110X50 | |
| high performance liquid chromatograph system | Shimadzu Corp | 20AVP | |
| centrifuge | Hitachi | CR22G III | |
| Bamboo powder | purchased from Zhejiang Province, China | mesh number, 50 | |
| cellulase | Youtell Biochemical, Shandong, China | 200 PFU/mL |
References
- Zeng, A. P., Biebl, H. Bulk chemicals from biotechnology: the case of 1, 3-propanediol production and the new trends. Adv Biochem Eng Biotechnol. 74, 239-259 (2002).
- Wei, D., Wang, M., Jiang, B., Shi, J., Hao, J. Role of dihydroxyacetone kinases I and II in the dha regulon of Klebsiella pneumoniae. J Biotechnol. 177, 13-19 (2014).
- Celińska, E., Grajek, W. Biotechnological production of 2,3-butanediol-current state and prospects. Biotechnol Adv. 27 (6), 715-725 (2009).
- Chen, C., Wei, D., Shi, J., Wang, M., Hao, J. Mechanism of 2, 3-butanediol stereoisomer formation in Klebsiella pneumoniae. Appl Microbiol Biotechnol. 98 (10), 4603-4613 (2014).
- Wei, D., Wang, M., Shi, J., Hao, J. Red recombinase assisted gene replacement in Klebsiella pneumoniae. J Ind Microbiol Biotechnol. 39 (8), 1219-1226 (2012).
- Wei, D., Sun, J., Shi, J., Liu, P., Hao, J. New strategy to improve efficiency for gene replacement in Klebsiella pneumoniae. J Ind Microbiol Biotechnol. 40 (5), 523-527 (2013).
- Chen, C., et al. Inhibition of RecBCD in Klebsiella pneumoniae by Gam and its effect on the efficiency of gene replacement. J Basic Microbiol. 56 (2), 120-126 (2016).
- Wang, D., et al. R-acetoin accumulation and dissimilation in Klebsiella pneumoniae. J Ind Microbiol Biotechnol. 42 (8), 1105-1115 (2015).
- Wei, D., Xu, J., Sun, J., Shi, J., Hao, J. 2-Ketogluconic acid production by Klebsiella pneumoniae CGMCC 1.6366. J Ind Microbiol Biotechnol. 40 (6), 561-570 (2013).
- Sun, Y., et al. Two-stage fermentation for 2-ketogluconic acid production by Klebsiella pneumoniae. J Microbiol Biotechnol. 24 (6), 781-787 (2014).
- Wang, D., et al. Gluconic acid production by gad mutant of Klebsiella pneumoniae. World J Microbiol Biotechnol. 32 (8), 1-11 (2016).
- Wang, C., et al. Production of xylonic acid by Klebsiella pneumoniae. Appl Microbiol Biotechnol. 100 (23), 10055-10063 (2016).
- Kumar, P., Barrett, D. M., Delwiche, M. J., Stroeve, P. Methods for pretreatment of lignocellulosic biomass for efficient hydrolysis and biofuel production. Ind Eng Chem Res. 48 (8), 3713-3729 (2009).
- Brisse, S., Grimont, F., Grimont, P. A. The genus Klebsiella. The Prokaryotes. , Springer. 159-196 (2006).
- Hao, J., Lin, R., Zheng, Z., Liu, H., Liu, D. Isolation and characterization of microorganisms able to produce 1, 3-propanediol under aerobic conditions. World J Microbiol Biotechnol. 24 (9), 1731-1740 (2008).
- Hong, E., et al. Optimization of alkaline pretreatment on corn stover for enhanced production of 1.3-propanediol and 2, 3-butanediol by Klebsiella pneumoniae AJ4. Biomass Bioenerg. 77, 177-185 (2015).
- Pienkos, P. T., Zhang, M. Role of pretreatment and conditioning processes on toxicity of lignocellulosic biomass hydrolysates. Cellulose. 16 (4), 743-762 (2009).
