Summary
Bambuspulver wurde mit NaOH vorbehandelt und enzymatisch hydrolysiert. Das Hydrolysat von Bambus wurde als Ausgangsmaterial für 2,3-Butandiol, R- Acetoin, 2-Ketogluonsäure und Xylonsäure-Produktion von Klebsiella pneumoniae verwendet .
Abstract
Bambus ist eine wichtige Biomasse, und Bambushydrolysat wird von Klebsiella pneumoniae als Ausgangsmaterial für die chemische Produktion verwendet. Hier wurde Bambuspulver mit NaOH vorbehandelt und auf einen neutralen pH-Wert gewaschen. Cellulase wurde dem vorbehandelten Bambuspulver zugesetzt, um das Hydrolysat zu erzeugen, das 30 g / l Glucose und 15 g / l Xylose enthielt und als Kohlenstoffquelle verwendet wurde, um ein Medium für die chemische Produktion herzustellen. Bei kultivierten mikroaerobischen Bedingungen wurden 12,7 g / l 2,3-Butandiol durch Wildtyp- K. pneumoniae hergestellt . In aeroben Bedingungen wurden 13,0 g / l R- Acetoin durch die budC- Mutante von K. pneumoniae produziert . Eine Mischung aus 25,5 g / l 2-Ketoglorkonsäure und 13,6 g / l Xylonsäure wurde durch die budA- Mutante von K. pneumoniae in einer zweistufigen, pH-kontrollierten Fermentation mit hoher Luftzufuhr hergestellt. In der ersten Stufe der Fermentation wurde die Kultur bei einem neutralen pH-Wert gehalten; Nach Zelle Wachstum, die FermentatioN ging in die zweite Stufe über, in der die Kultur sauer werden durfte.
Introduction
Klebsiella pneumoniae ist ein Bakterium, das unter aeroben und anaeroben Bedingungen gut wächst. K. pneumoniae ist ein wichtiger industrieller Mikroorganismus, der verwendet wird, um viele Chemikalien herzustellen. 1,3-propandiol ist eine wertvolle Chemikalie, die hauptsächlich als Monomer zur Synthese von Polytrimethylenterephthalat verwendet wird. Polytrimethylenterephthalat ist ein biologisch abbaubarer Polyester, der bessere Eigenschaften aufweist als die von 1,2-Propandiol, Butandiol oder Ethylenglykol 1 . 1,3-propandiol wird von K. pneumoniae unter Verwendung von Glycerin als Substrat in sauerstoffbeschränkten Bedingungen hergestellt 2 . 2,3-Butandiol und seine Derivate haben Anwendungen auf dem Gebiet der Kunststoffe, der Lösemittelherstellung und des synthetischen Kautschuks und haben das Potential, als Biokraftstoff verwendet zu werden 3 . Mit Glucose als Substrat ist 2,3-Butandiol der Hauptmetabolit des Wildtyp-Stammes 4 . 2,3-Butandiol ist SyntheseEd von pyruvate Zuerst kondensieren zwei Moleküle Pyruvat, um α-Acetolactat zu ergeben; Diese Reaktion wird durch α-Acetolactatsynthase katalysiert. Α-Acetolactat wird dann durch α-Acetolactat-Decarboxylase in Acetoin umgewandelt. R- Acetoin kann bei der Katalyse von Butandiol-Dehydrogenase weiter zu 2,3-Butandiol reduziert werden. Ein effizientes Gen-Ersatzverfahren, das für K. pneumoniae geeignet ist, wurde untersucht und viele Mutanten wurden 5 , 6 , 7 konstruiert. Eine budC- Mutante, die ihre 2,3-Butandiol-Dehydrogenase-Aktivität verloren hat, akkumuliert ein hohes Maß an Acetoin in Kulturbrühe. Acetoin wird als Additiv verwendet, um den Geschmack der Nahrung zu verbessern 8 . Wenn budA , das für α-Acetolactat-Decarboxylase kodiert, mutiert ist, sammelt sich 2-Ketoglorkonsäure in der Brühe an. 2-Ketoglasonsäure wird für die Synthese von Erythorbinsäure (Isoascorbinsäure), Ein Antioxidans in der Lebensmittelindustrie verwendet 9 . 2-Ketoglasonsäure ist ein Zwischenprodukt des Glucose-Oxidationswegs; In diesem Weg, der sich im periplasmatischen Raum befindet, wird Glukose zu Gluconsäure oxidiert und dann weiter zu 2-Ketogluonsäure oxidiert. Glukonsäure und 2-Ketoglorkonsäure, die im Periplasma produziert werden, können zum weiteren Metabolismus zum Cytoplasma transportiert werden. Die Anhäufung von 2-Ketoglorkonsäure hängt von sauren Bedingungen ab, und eine höhere Luftzufuhr begünstigt die 2-Ketogluconinsäure-Produktion 10 . Gluconat-Dehydrogenase, kodiert durch Gad , Katalysiert die Umwandlung von Gluconsäure in 2-Ketolguconinsäure. Die Gad- Mutante von K. pneumoniae produzierte ein hohes Maß an Glukonsäure anstelle von 2-Ketogluonsäure, und dieser Prozeß hängt auch von sauren Bedingungen ab. Glukonsäure ist eine organische Grundsäure und wird als Additiv zur Erhöhung der Eigenschaften von Zement 1 verwendet1 Glucose-Oxidation zu Gluconsäure wird durch Glucose-Dehydrogenase katalysiert. Xylose ist auch ein geeignetes Substrat der Glukose-Dehydrogenase. Wenn Xylose als Substrat verwendet wird, erzeugt K. pneumoniae Xylonsäure 12 .
Die chemische Produktion mit Biomasse als Rohstoff ist ein heißes Thema in der Biotechnologie 13 . Die Hauptkomponenten der Biomasse sind Cellulose, Hemicellulose und Lignin. Allerdings können diese makromolekularen Verbindungen nicht direkt von den meisten Mikroorganismen (einschließlich K. pneumoniae ) katabolisiert werden. Cellulose und Hemicellulosen in der Biomasse müssen zu Glucose und Xylose hydrolysiert werden und können dann von Mikroorganismen verwendet werden. Die Anwesenheit von Lignin in Lignocellulosen schafft eine Schutzbarriere, die die Biomasse-Hydrolyse durch Enzyme verhindert. So wird ein Vorbehandlungsprozess, der Lignin und Hemicellulosen entfernt und die Kristallinität von Cellulose reduziert, immer während der Biomasseverwendung durch Mic durchgeführtRoorganismen Es wurden viele Vorbehandlungsmethoden entwickelt: Säure-, Alkali-, Ammoniak- und Dampfvorbehandlungen sind üblich.
Bambus ist reich an tropischen und subtropischen Regionen und ist eine wichtige Biomasse-Ressource. Hier werden die Herstellung von Bambushydrolysat und die chemische Produktion mit Bambushydrolysat vorgestellt
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Protocol
1. Vorbereitung von Bambushydrolysat
- Füge 5 g Bambuspulver zu 40 ml einer NaOH-Lösung hinzu, um eine 10% ige (g / g) Endkonzentration in einem 250 ml-Kolben zu erreichen. Verwenden Sie eine Reihe von NaOH-Lösungen im Bereich von 0,05 M bis 0,50 M in Schritten von 0,05 M.
- Inkubieren Sie die Mischung für 60 min bei 60 ° C oder 100 ° C in einem Wasserbad. Inkubieren bei 121 ° C in einem Autoklaven.
- Nach der Inkubation die Mischung 4 h bei Raumtemperatur stehen lassen. Dann entfernen Sie den Überstand. 100 ml Frischwasser zugeben und mischen.
- Wiederholen Sie dieses Waschen 5-6 mal, bis der pH-Wert des Überstandes 6,8 erreicht hat. Verwenden Sie den erhaltenen Feststoff für den nächsten Schritt der enzymatischen Hydrolyse.
- Zur Hydrolyse 50 ml der obigen Mischung auf pH 5,0 unter Verwendung von 98% H 2 SO 4 einstellen. Dann fügen Sie 0,5 ml 200 Filterpapieraktivität (FPU) / ml Cellulase hinzu.
HINWEIS: Das endgültige Verhältnis von Cellulase zu Bambus shSollte 20 FPU pro 1 g Bambus sein. - Inkubieren Sie die Mischung bei 50 ° C für 36 h in einem Shaker.
HINWEIS: Nach der Hydrolyse bleibt ein Feststoff in der Mischung. - Man empfängt ein klares Hydrolysat durch Zentrifugieren bei 7,690 xg für 5 min.
- Quantifizieren Sie die Glukose, Xylose und andere Chemikalien mit einem Hochdruck-Flüssigkeitschromatographen-System, das mit einem Brechungsindex-Detektor und einem Photodioden-Array-Detektor ausgestattet ist. Verwenden Sie eine HPX-87H-Säule (300 mm x 7,8 mm) und eine mobile Phase von 5 mM H 2 SO 4 -Lösung mit einer Durchflussrate von 0,8 mL / min.
- Für ein großes Volumen an Hydrolysatzubereitung werden 2 kg Bambuspulver und 18 l 0,25 M NaOH in einem 30-l-Edelstahlbehälter gemischt.
- Den Tank bei 121 ° C in einem Autoklaven für 60 min inkubieren. Nach der Inkubation die Mischung mit 40 l Wasser in einem 60 l Plastikbehälter waschen. Wiederholen Sie diese Reinigung 5 mal.
- Verwenden Sie Wasser, um den gesamten gewaschenen Bambus auf ein Volumen von 20 L einzustellen.Den pH-Wert des Gemisches mit 98% H 2 SO 4 auf 5,0 einstellen.
- Enzymatische Hydrolyse der Mischung in einem modifizierten Schüttelwasserbad, ausgestattet mit einem mechanischen Rührwerk, um sicherzustellen, dass die Mischung gut verteilt ist. Füge 200 ml von 200 FPU / ml Cellulase hinzu und inkubiere die Mischung bei 50 ° C für 36 h.
- Nach der Hydrolyse wird die Mischung bei 4,700 xg für 10 min zentrifugiert.
2. 2,3-Butandiol-Produktion von Wildtype K. pneumoniae
- Verwenden Sie 3 l Bambushydrolysat als Lösungsmittel für die mittlere Zubereitung.
- Es wird ein Fermentationsmedium mit 4 g / l Maisquellwasser, 2 g / l (NH 4 ) 2 SO 4 , 6 g / lK 2 HPO 4 , 3 g / l KH 2 PO 4 und 0,2 g / l MgSO 4 hergestellt . Den pH-Wert des Mediums mit 2,5 M NaOH neutralisieren. Verwenden Sie einen 5-L-Bioreaktor mit 3 l autoklaviertem Fermentationsmedium zur Fermentation.
- Verwenden Sie K. pneumoniaeZellen, die in einem -80 ° C-Tiefkühlschrank gespeichert sind.
- Für die Saatkultur inkubieren Sie einen 250 ml-Kolben, der 50 ml Luria-Bertani (LB) -Medium über Nacht bei 37 ° C enthält, unter Schütteln bei 200 U / min. Verwenden Sie LB-Medium, das 10 g / l Trypton, 5 g / l Hefeextrakt und 10 g / l NaCl enthält.
HINWEIS: Die Zelldichte der Saatkultur sollte OD 2 erreichen (optische Dichte bei 600 nm). - Inokulieren Sie einen Kolben von 50 ml der Impfkultur im Bioreaktor. Die Kultur bei pH 6,0 und 37 ° C pflegen. Verwenden Sie eine Luftzufuhrrate von 2 L / min und eine Rührgeschwindigkeit von 250 U / min, wodurch eine mikroaerobe Bedingung entsteht.
- Sammeln Sie 5 mL Proben alle 2 h während der Fermentation und analysieren sie mit Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie, um die chemischen Konzentrationen in der Brühe zu bestimmen 4 .
- Überwachen Sie das Alkali, das dem Bioreaktor online unter Verwendung von MFCS / DA hinzugefügt wird.
HINWEIS: Organische Säuren werden im Fermentationsverfahren hergestelltNd NaOH wird zugegeben, um die Kultur pH stabil zu halten. Das Volumen des zugegebenen Alkalis stellt die Menge der erzeugten Säure dar. Wenn die Alkali-Zuglinie Plateaus, der Prozess abgeschlossen ist, entweder wegen der Kohlenstoff-Quelle Erschöpfung oder Zelltod.
- Überwachen Sie das Alkali, das dem Bioreaktor online unter Verwendung von MFCS / DA hinzugefügt wird.
3. R- Acetoin-Produktion durch die BudC- Mutante von K. pneumoniae
- Bereiten Sie ein Medium für die Acetinproduktion vor, das 4 g / l Maisquellwasser, 2 g / l (NH 4 ) 2 SO 4 , 3 g / l Natriumacetat, 0,4 g / l KCl und 0,1 g / l MgSO 4 enthält .
- Verwenden Sie K. pneumoniae-ΔbudC für die R -Acetoin- Produktion. Wiederholen Sie die Schritte 2.4-2.5.
ANMERKUNG : budC kodiert 2,3-Butandiol-Dehydrogenase. K. pneumoniae-ΔbudC verliert die 2,3-Butandiol-Dehydrogenase-Aktivität und produziert R- Acetoin anstelle von 2,3-Butandiol. - Die Kultur bei pH 6,0 und 37 ° C pflegen. Verwenden Sie eine Luftzufuhrrate von 4 L / min und eine AgitatioN Rate von 450 U / min, ein aerobe Zustand.
HINWEIS: Die Sauerstoffergänzung ist höher als die der 2,3-Butandiol-Produktion. - Assay die Proben wie in Schritt 2.6.
4. 2-Ketogluconsäure-Herstellung durch die budA- Mutante von K. pneumoniae
- Für die Herstellung von 2-Ketogluconsäure verwenden Sie dasselbe Medium wie für die R- Acetoin-Herstellung.
- Verwenden Sie K. pneumoniae-ΔbudA für die Herstellung von 2-Ketogluconsäure. Wiederholen Sie die Schritte 2.4-2.5.
HINWEIS : budA kodiert α-Acetolactat-Decarboxylase. K. pneumoniae-ΔbudA verliert die α-Acetolactat-Decarboxylase-Aktivität und produziert 2-Ketoglorkonsäure unter Verwendung von Glucose als Substrat.
HINWEIS: Die 2-Ketoglasonsäure-Synthese ist ein saurer bedingungsabhängiger Prozess. Für die 2-Ketogluconinsäure-Produktion wurde eine zweistufige Fermentation entwickelt; In der ersten Stufe wird die Saatkultur im Bioreaktor geimpft. - Assay die Proben wie in Schritt 2.6. Mit dem Hydrolysat von Bambus als Kohlenstoffquelle.
HINWEIS: Die Glukose im Medium wird in 2-Ketoglorkonsäure umgewandelt und die Xylose wird in Xylonsäure umgewandelt. So erhält man eine Mischung aus 2-Ketogluconsäure und Xylonsäure.
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Representative Results
In diesem Protokoll wurde der Bambus unter Verwendung von Alkali vorbehandelt. Die optimalen Inkubationsparameter - eine Temperatur von 121 ° C und 0,25 M NaOH - wurden in den Fig. 1 und 2 bestimmt . Der vorbehandelte Bambus wurde enzymatisch hydrolysiert und die im Hydrolysat erhaltenen Glucose- und Xylose-Konzentrationen wurden gemessen. Höhere Temperaturen begünstigten die Zuckerproduktion, so dass 121 ° C als optimale Temperatur gewählt wurde. Die im Hydrolysat erzeugte Glucose und Xylose erhöhten sich mit NaOH-Konzentration über den Bereich von 0,05-0,25 M. Weitere Erhöhungen der NaOH-Konzentration hatten keine positive Wirkung auf die Zuckerproduktion. So wurde NaOH bei 0,25 M als optimale Konzentration ausgewählt.
Abbildung 1: Die Wirkung der Vorbehandlungstemperatur auf Glukose und Xylose conZentrierung in Bambushydrolysat. Rote Säule: Glukose; Blaue säule: xylose. Höhere Temperaturen begünstigten die Zuckerproduktion und 121 ° C wurde für die großvolumige Hydrolysatpräparation ausgewählt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Die Wirkung der NaOH-Konzentration, die während der Vorbehandlung auf die Glucose- und Xylose-Konzentration im Bambushydrolysat verwendet wird. Rote Linie: Glukose; Blaue Linie: xylose. Die im Hydrolysat erzeugte Glucose und Xylose erhöhte sich mit NaOH-Konzentration über den Bereich von 0,05-0,50 M und 0,25 M wurde für die großvolumige Hydrolysatpräparation ausgewählt. Bitte klicken Sie auf ihnUm eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Etwa 20 g / l Glucose und 10 g / l Xylose wurden während des Hydrolysats in der kolbengradigen enzymatischen Hydrolyse hergestellt; 30 g / l Glucose und 15 g / l Xylose wurden aus dem großvolumigen Hydrolysatpräparat erhalten. Dies war, weil die großvolumige Vorbereitung in einem offenen Wasserbadschüttler durchgeführt wurde, und etwas Wasser verdampfte dabei, was zur Konzentration des Hydrolysats führte. Die Glukose und Xylose im Bambushydrolysat wurden von K. pneumoniae als Kohlenstoffquellen für die chemische Produktion verwendet. Andere Verbindungen im Hydrolysat waren: Cellobiose (1,4 g / l), Arabinose (8,9 g / l), Essigsäure (1,9 g / l) und Ameisensäure (0,2 g / l).
2,3-Butandiol wurde von K. pneumoniae in mikroaerobischen Bedingungen produziert ( Abbildung 3 ). Der Prozess wurde in zwei Perioden unterteilt. In der fErstens wurde Glukose von den Zellen verwendet, um 7,6 g / l 2,3-Butandiol zu erzeugen, während der Xylose-Gehalt in der Brühe unverändert blieb. Die Glukose war um 8 Uhr erschöpft, und diesmal markierte die Verschiebung in die nächste Periode. In der zweiten Periode wurde die Xylose in der Brühe von den Zellen verwendet und es wurden weitere 5,1 g / l 2,3-Butandiol hergestellt. Die Produktion von 2,3-Butandiol war in der zweiten Periode langsamer. Am Ende des Verfahrens wurden insgesamt 12,7 g / l 2,3-Butandiol hergestellt. Nebenprodukte dieses Verfahrens waren Milchsäure, Essigsäure und Ethanol. Milchsäure und Ethanol wurden hauptsächlich in der ersten Periode synthetisiert (wenn Glucose als Kohlenstoffquelle verwendet wurde), und Essigsäure wurde kontinuierlich synthetisiert.
Abbildung 3: 2,3-Butandiol-Produktion mit Bambus-Hydrolysat als Ausgangsmaterial. Rote Linie: Glukose; Blaue Linie: xylose; MaGenta-Linie: 2,3-Butandiol; Orange Linie: Milchsäure; Schwarze Linie: Essigsäure; Grüne Linie: Ethanol. Die Glucose und Xylose im Hydrolysat wurden beide für die 2,3-Butandiol-Synthese verwendet, aber Glucose wurde zuerst verwendet, gefolgt von Xylose. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
R- Acetoin wurde von der budC- Mutante von K. pneumoniae unter aeroben Bedingungen produziert ( Abbildung 4 ). Wie bei der 2,3-Butandiol-Produktion durch den Wildtyp-Stamm wurden Glucose und dann Xylose in Sequenz von K. pneumoniae-ΔbudC verwendet . Xylose war um 16 h erschöpft, und die Verbrauchsrate war schneller als die in der 2,3-Butandiol-Produktion durch den Wildtyp. Die Produktion von R- Acetoin betrug am Ende des Verfahrens 13 g / l, und die Nebenprodukte waren 2,3-Butandiol, Essigsäure und eThanol
Abbildung 4: R- Acetoin-Produktion mit Bambushydrolysat als Ausgangsmaterial. Rote Linie: Glukose; Blaue Linie: xylose; Violette Linie: Acetoin; Magentafarbene Linie: 2,3-Butandiol; Schwarze Linie: Essigsäure; Grüne Linie: Ethanol. Die Glucose und Xylose im Hydrolysat wurden beide für die R- Acetoin-Synthese verwendet, und ihre Verwendung erfolgte nacheinander. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
2-Ketogluonsäure und Xylonsäure wurden durch die budA- Mutante von K. pneumoniae produziert ( Abbildung 5 ). Dieser Prozess erforderte eine hohe Luftzufuhr. Die Glukose im Medium wurde zuerst in Glucon umgewandeltIc Säure, die in der Brühe angesammelt. Die Gluconsäure erreichte bei 8 h Kultur einen Höchstgehalt von 15 g / l und danach sank ihre Konzentration. Es wurde keine 2-Ketogluonsäure bis 6 h in die Kultur hergestellt. Es wurde dann mit hoher Geschwindigkeit synthetisiert und 25 g / l 2-Ketogluconc-Säure wurde am Ende des Verfahrens hergestellt. Die Xylose im Medium wurde in Xylonsäure umgewandelt; Diese Reaktion begann später als die Glukoseumwandlung zu Gluconsäure. Einige Essigsäure wurde als Nebenprodukt während des Verfahrens hergestellt.
Abbildung 5: 2-Ketogluonsäure- und Xylonsäureproduktion mit Bambushydrolysat als Ausgangsmaterial. Rote Linie: Glukose; Orange Linie: Glukonsäure; Magentafarbene Linie: 2-Ketoglasonsäure; Blaue Linie: xylose; Schwarze Linie: Essigsäure; Grüne Linie: Ethanol. Die Glucose im Hydrolysat wurde in Gluconsäure umgewandeltUnd wurde weiter in 2-Ketoglorkonsäure umgewandelt. Die Xylose im Hydrolysat wurde in Xylonsäure umgewandelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
K. pneumoniae gehört zur Gattung Klebsiella in der Familie Enterobacteriaceae . K. pneumoniae ist weit verbreitet in natürlichen Umgebungen wie Boden, Vegetation und Wasser 14 . Der in dieser Forschung verwendete Wildtyp- K. pneumoniae- Stamm wurde aus dem Boden isoliert und wird für die 1,3-Propandiol-Produktion verwendet 15 . K. pneumoniae und Mutanten dieser Art produzieren viele Chemikalien unter verschiedenen Bedingungen.
Kultur-pH-Wert und Luft-Supplementierung sind Schlüsselfaktoren, die die chemische Produktion durch K. pneumoniae beeinflussen . Wildtyp K. pneumoniae produziert 2,3-Butandiol als Hauptkatabolit bei pH 6. Allerdings ändert sich 2-Ketogluconsäure zum Hauptkataboliten, wenn er bei pH 5 oder niedriger 9 kultiviert wird. Die Erhöhung der Luftzufuhr verringert die 2,3-Butandiol-Synthese, während die R- Acetoin-Synthese verbessert ist 8 et al. 16 , die im Labor leicht durchzuführen ist, vor allem im Liter-Maßstab.
Höhere Vorbehandlungstemperaturen bevorzugen die Zuckerproduktion bei der enzymatischen Hydrolyse. Die Behandlung bei ≤ 100 ° C erfolgte in einem Wasserbad und bei 121 ° C im Autoklaven. Diese beiden Geräte sind in Labors üblich, und mehrere Liter Flüssigkeit wurden in jeder Charge verarbeitet. Höhere Temperaturen erfordern Hochdruckreaktoren. Zum Beispiel hat unser Labor 50-ml- und 1-L-Hochdruckreaktoren, aber die Volumina dieser Reaktoren begrenzen ihre Verwendung bei Biomasse-Vorbehandlungen.
Die in dieser Forschung gezeigte Bambushydrolysat-Präparation war leicht in Flaschen durchzuführen. Allerdings, wenn in großen Volumen getan, wurden niedrigere Mengen an Glukose und Xylose wurden manchmal erhalten. Das Hydrolysegemisch muss gut verteilt sein. Die Fällung der Biomasse würde zu niedrigeren Hydrolyse führen.
Im Gegensatz zu reinen Glukose und Xylose ist Biomasse-Hydrolysat durch viele toxische Chemikalien kontaminiert, die das Wachstum von Mikroorganismen hemmen könnten. Es wurden viele Methoden entwickelt, um solche Inhibitoren zu entfernen, aber sie addieren die Prozesskosten und neigen dazu, die Zuckererträge zu reduzieren. In dieser Forschung wurde keine spezielle Arbeit unternommen, um Inhibitoren zu entfernen. Unter Verwendung des in dieser Arbeit erzeugten Bambushydrolysats als Ausgangsmaterial wurden die Produktivität (0,95 g / lh) und das Umwandlungsverhältnis (0,25 g / g) Glucose zu 2,3-Butandiol während der ersten Stufe, wenn Glukose verbraucht wurde, niedriger Als wenn gereinigte Glucose als Kohlenstoffquelle verwendet wurde, berichtete zuvor (1,4 g / lh bzw. 0,3 g / g) 4 . Die Produktivität von 2,3-ButanedIol während der zweiten Stufe, als Xylose verbraucht wurde, war langsamer als in der ersten Stufe. Jedoch erreichte das Umwandlungsverhältnis von Xylose zu 2,3-Butandiol 0,34 g / g, was höher war, als wenn gereinigte Glucose als Kohlenstoffquelle 4 verwendet wurde . Die R- Acetin-Herstellung unter Verwendung des Bambushydrolysats als Ausgangsmaterial hatte Produktivitäts- und Substratumwandlungsverhältnisse von 0,92 g / lh bzw. 0,29 g / g. Beide dieser Verhältnisse waren niedriger als wenn gereinigtes Glucose als Substrat verwendet wurde (1,7 g / lh bzw. 0,34 g / g) 8 . Die Produktivität und das Umwandlungsverhältnis von 2-Ketoglorkonsäure in dieser Studie betrugen 2,3 g / lh bzw. 0,91 g / g, als wenn gereinigte Glucose als Kohlenstoffquelle (4,2 g / lh bzw. 1 g / g) verwendet wurde ) 10
Xylose ist der zweithäufigste Zucker in der Natur nach Glukose. Im Gegensatz zu Glukose wird Xylose von den meisten Mikroorganismen nicht leicht genutzt. In diesem studY, Xylose wurde von K. pneumoniae für die chemische Produktion völlig verbraucht. 2,3-Butandiol, R- Acetoin, 2-Ketoglorkonsäure und Xylonsäure sind alle wertvollen Chemikalien, und ihre Herstellungsprozesse variieren von mikroaeroben zu hoch aerobischen Bedingungen. Die Fermentationsergebnisse zeigen hier, dass Zucker in Bambushydrolysat geeignete Kohlenstoffquellen für K. pneumoniae Wachstum und chemische Produktion unter verschiedenen Bedingungen sind.
Mit Biomasse-Hydrolysat als Rohstoff ist eine vielversprechende Methode für die chemische Produktion. Allerdings gibt es noch viele Mängel, die überwunden werden müssen, wie die große Menge an Wasser, die benötigt wird, um die vorbehandelte Biomasse zu waschen, und die längere Zeit, die für die Enzymhydrolyse benötigt wird.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Nationalen Naturwissenschaftlichen Stiftung von China (Grant Nr. 21576279, 20906076) und dem KRIBB-Forschungsinitiative-Programm (KGM2211531) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| autoclave | SANYO | 3780 | |
| bioreactor | Sartorius stedim biotech | Bostat Aplus | |
| agitator | IKA | RW 20 | |
| water bath shaker | Zhicheng | ZWY-110X50 | |
| high performance liquid chromatograph system | Shimadzu Corp | 20AVP | |
| centrifuge | Hitachi | CR22G III | |
| Bamboo powder | purchased from Zhejiang Province, China | mesh number, 50 | |
| cellulase | Youtell Biochemical, Shandong, China | 200 PFU/mL |
References
- Zeng, A. P., Biebl, H. Bulk chemicals from biotechnology: the case of 1, 3-propanediol production and the new trends. Adv Biochem Eng Biotechnol. 74, 239-259 (2002).
- Wei, D., Wang, M., Jiang, B., Shi, J., Hao, J. Role of dihydroxyacetone kinases I and II in the dha regulon of Klebsiella pneumoniae. J Biotechnol. 177, 13-19 (2014).
- Celińska, E., Grajek, W. Biotechnological production of 2,3-butanediol-current state and prospects. Biotechnol Adv. 27 (6), 715-725 (2009).
- Chen, C., Wei, D., Shi, J., Wang, M., Hao, J. Mechanism of 2, 3-butanediol stereoisomer formation in Klebsiella pneumoniae. Appl Microbiol Biotechnol. 98 (10), 4603-4613 (2014).
- Wei, D., Wang, M., Shi, J., Hao, J. Red recombinase assisted gene replacement in Klebsiella pneumoniae. J Ind Microbiol Biotechnol. 39 (8), 1219-1226 (2012).
- Wei, D., Sun, J., Shi, J., Liu, P., Hao, J. New strategy to improve efficiency for gene replacement in Klebsiella pneumoniae. J Ind Microbiol Biotechnol. 40 (5), 523-527 (2013).
- Chen, C., et al. Inhibition of RecBCD in Klebsiella pneumoniae by Gam and its effect on the efficiency of gene replacement. J Basic Microbiol. 56 (2), 120-126 (2016).
- Wang, D., et al. R-acetoin accumulation and dissimilation in Klebsiella pneumoniae. J Ind Microbiol Biotechnol. 42 (8), 1105-1115 (2015).
- Wei, D., Xu, J., Sun, J., Shi, J., Hao, J. 2-Ketogluconic acid production by Klebsiella pneumoniae CGMCC 1.6366. J Ind Microbiol Biotechnol. 40 (6), 561-570 (2013).
- Sun, Y., et al. Two-stage fermentation for 2-ketogluconic acid production by Klebsiella pneumoniae. J Microbiol Biotechnol. 24 (6), 781-787 (2014).
- Wang, D., et al. Gluconic acid production by gad mutant of Klebsiella pneumoniae. World J Microbiol Biotechnol. 32 (8), 1-11 (2016).
- Wang, C., et al. Production of xylonic acid by Klebsiella pneumoniae. Appl Microbiol Biotechnol. 100 (23), 10055-10063 (2016).
- Kumar, P., Barrett, D. M., Delwiche, M. J., Stroeve, P. Methods for pretreatment of lignocellulosic biomass for efficient hydrolysis and biofuel production. Ind Eng Chem Res. 48 (8), 3713-3729 (2009).
- Brisse, S., Grimont, F., Grimont, P. A. The genus Klebsiella. The Prokaryotes. , Springer. 159-196 (2006).
- Hao, J., Lin, R., Zheng, Z., Liu, H., Liu, D. Isolation and characterization of microorganisms able to produce 1, 3-propanediol under aerobic conditions. World J Microbiol Biotechnol. 24 (9), 1731-1740 (2008).
- Hong, E., et al. Optimization of alkaline pretreatment on corn stover for enhanced production of 1.3-propanediol and 2, 3-butanediol by Klebsiella pneumoniae AJ4. Biomass Bioenerg. 77, 177-185 (2015).
- Pienkos, P. T., Zhang, M. Role of pretreatment and conditioning processes on toxicity of lignocellulosic biomass hydrolysates. Cellulose. 16 (4), 743-762 (2009).
