Summary
Bambuspulver blev forbehandlet med NaOH og enzymatisk hydrolyseret. Hydrolysatet af bambus blev anvendt som råmateriale til 2,3-butandiol, R- acetoin, 2-ketogluconinsyre og xylonsyreproduktion ved Klebsiella pneumoniae .
Abstract
Bambus er en vigtig biomasse, og bambushydrolysat anvendes af Klebsiella pneumoniae som råmateriale til kemisk produktion. Her forbehandles bambuspulver med NaOH og vaskes til en neutral pH. Cellulase blev tilsat til det forbehandlede bambuspulver til dannelse af hydrolysatet, som indeholdt 30 g / l glucose og 15 g / l xylose og blev anvendt som carbonkilde til fremstilling af et medium til kemisk produktion. Når der dyrkes i mikroaerobe betingelser, blev 12,7 g / L 2,3-butandiol fremstillet ved vildtype K. pneumoniae . Under aerobiske betingelser blev 13,0 g / L R- acetoin produceret af budC mutanten af K. pneumoniae . En blanding af 25,5 g / L2-ketogluconinsyre og 13,6 g / l xylonsyre blev fremstillet af budA- mutanten af K. pneumoniae i en to-trins, pH-styret fermentering med højlufttilskud . I det første fermenteringsstadium blev kulturen opretholdt ved en neutral pH; Efter cellevækst, fermentatioN fortsatte til anden fase, hvorved kulturen fik lov til at blive sur.
Introduction
Klebsiella pneumoniae er en bakterie der vokser godt under både aerob og anaerobe forhold. K. pneumoniae er en vigtig industriel mikroorganisme, der anvendes til fremstilling af mange kemikalier. 1,3-propandiol er et værdifuldt kemikalie, der hovedsagelig anvendes som en monomer til syntetisering af polytrimethylenterephthalat. Polytrimethylenterephthalat er en bionedbrydelig polyester, der udviser bedre egenskaber end 1,2-propandiol, butandiol eller ethylenglycol 1 . 1,3-propandiol fremstilles ved K. pneumoniae under anvendelse af glycerol som et substrat i iltbegrænsede betingelser 2 . 2,3-butandiol og dets derivater har anvendelser inden for plastik, opløsningsmiddelproduktion og syntetisk gummi og har potentialet til at blive anvendt som biobrændstof 3 . Med glucose som substrat er 2,3-butandiol hovedmetabolitten af vildtypestammen 4 . 2,3-butandiol er syntetiskEd fra pyruvat. For det første kondenserer to molekyler pyruvat for at give a-acetolactat; Denne reaktion katalyseres af a-acetolactatsyntase. A-acetolactat omdannes derefter til acetoin ved a-acetolactat-decarboxylase. R- acetoin reduceres yderligere til 2,3-butandiol, når den katalyseres af butandioldehydrogenase. En effektiv gen-erstatningsmetode egnet til K. pneumoniae er blevet undersøgt, og mange mutanter er blevet konstrueret 5 , 6 , 7 . En budC- mutant, som mistede sin 2,3-butandioldehydrogenaseaktivitet, akkumulerer høje niveauer af acetoin i kulturbouillon. Acetoin anvendes som et additiv til forbedring af fødevarens smag 8 . Når budA , som koder for a-acetolactat-decarboxylase, muteres, akkumuleres 2-ketogluconinsyre i bouillon. 2-ketogluconinsyre anvendes til syntesen af erythorbinsyre (isoascorbinsyre), En antioxidant anvendt i fødevareindustrien 9 . 2-ketogluconinsyre er et mellemprodukt i glucoseoxidationsvejen; I denne vej, der er lokaliseret i periplasmatisk rum, oxideres glucose til gluconsyre og oxideres derefter yderligere til 2-ketogluconinsyre. Gluconsyre og 2-ketogluconinsyre produceret i periplasma kan transporteres til cytoplasma for yderligere metabolisme. Akkumuleringen af 2-ketogluconinsyre er afhængig af sure betingelser, og højere lufttilskud favoriserer 2-ketogluconsyreproduktion 10 . Gluconat dehydrogenase, kodet af gad , Katalyserer omdannelsen af gluconsyre til 2-ketolguconsyre. Gad- mutanten af K. pneumoniae producerede høje niveauer af gluconsyre i stedet for 2-ketogluconinsyre, og denne proces er også afhængig af sure betingelser. Gluconsyre er en masse organisk syre og anvendes som additiv til at forøge cementets 1 egenskaber1. Glucoseoxidation til gluconsyre katalyseres af glucose-dehydrogenase. Xylose er også et egnet substrat af glucose dehydrogenase. Når xylose anvendes som et substrat, producerer K. pneumoniae xylonsyre 12 .
Kemisk produktion med biomasse som råmateriale er et varmt emne inden for bioteknologi 13 . De vigtigste komponenter i biomasse er cellulose, hemicellulose og lignin. Imidlertid kan disse makromolekylære forbindelser ikke direkte kategoriseres af de fleste mikroorganismer (inklusiv K. pneumoniae ). Cellulose og hemicelluloser i biomassen skal hydrolyseres til glucose og xylose og kan derefter anvendes af mikroorganismer. Tilstedeværelsen af lignin i lignocelluloser skaber en beskyttende barriere, der forhindrer biomassehydrolyseringen af enzymer. Således udføres en forbehandlingsproces, der fjerner lignin og hemicelluloser og reducerer krystalliniteten af cellulose altid under biomasseudnyttelse med mikrofonroorganisms. Mange forbehandlingsmetoder er blevet udviklet: Syre, alkalisk, ammoniak og dampbehandling er almindelige.
Bambus er rigeligt i tropiske og subtropiske regioner og er en vigtig biomasse ressource. Her præsenteres fremstillingen af bambushydrolysat og kemisk produktion ved anvendelse af bambushydrolysat
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af bambushydrolysat
- Tilsæt 5 g bambuspulver til 40 ml af en NaOH-opløsning for at opnå en slutkoncentration på 10% (g / g) i en 250 ml kolbe. Brug en række NaOH-opløsninger, der strækker sig fra 0,05 M til 0,50 M i trin på 0,05 M.
- Inkuber blandingen i 60 minutter ved 60 ° C eller 100 ° C i et vandbad. Inkuber ved 121 ° C i en autoklav.
- Efter inkubering, lad blandingen stå i 4 timer ved stuetemperatur. Fjern derefter supernatanten. Tilsæt 100 ml frisk vand og bland.
- Gentag denne vask 5-6 gange, indtil supernatantens pH når 6,8. Brug det opnåede faste stof til det næste trin af enzymatisk hydrolyse.
- Til hydrolyse juster 50 ml af ovennævnte blanding til pH 5,0 ved anvendelse af 98% H2S04. Derefter tilsættes 0,5 ml 200 filterpapiraktivitet (FPU) / ml cellulase.
BEMÆRK: Det endelige forhold af cellulase til bambus shDu skal være 20 FPU pr. 1 g bambus. - Inkubér blandingen ved 50 ° C i 36 timer i en ryster.
BEMÆRK: Efter hydrolyse forbliver noget faststof i blandingen. - Hent et klart hydrolysat ved centrifugering ved 7,690 xg i 5 minutter.
- Kvantificer glucose-, xylose- og andre kemikalier med et højtryksvæskekromatografisystem udstyret med en brydningsindeksdetektor og en fotodiode array detektor. Brug en HPX-87H kolonne (300 mm x 7,8 mm) og en mobil fase af 5 mM H2S04 opløsning ved en strømningshastighed på 0,8 ml / min 12 .
- Til en stor mængde hydrolysatpræparat blandes 2 kg bambuspulver og 18 liter 0,25 M NaOH i en 30-L rustfri ståltank.
- Inkubér tanken ved 121 ° C i en autoklav i 60 minutter. Efter inkubation vaskes blandingen med 40 liter vand i en 60 l plastbeholder. Gentag denne vask 5 gange.
- Brug vand til at justere den samlede vaskede bambus til et volumen på 20 L.Juster pH af blandingen til 5,0 ved anvendelse af 98% H2S04.
- Enzymatisk hydrolyse blandingen i et modificeret rystende vandbad, udstyret med en mekanisk omrører for at sikre, at blandingen er godt fordelt. Tilsæt 200 ml 200 FPU / ml cellulase og inkuber blandingen ved 50 ° C i 36 timer.
- Efter hydrolyse centrifuger blandingen ved 4 700 xg i 10 minutter.
2. 2,3-butandiolproduktion ved Wildtype K. pneumoniae
- Brug 3 liter bambushydrolysat som opløsningsmiddel til medium forberedelse.
- Tilbered et fermentationsmedium indeholdende 4 g / l majsbrødvæske, 2 g / L (NH4) 2S04, 6 g / LK2HP04, 3 g / L KH2P04 og 0,2 g / l MgS04. Juster mediumets pH til neutral ved anvendelse af 2,5 M NaOH. Brug en 5-L bioreaktor indeholdende 3 liter autoklaveret fermenteringsmedium til fermentering.
- Brug K. pneumoniaeCeller opbevaret i -80 ° C køleskab med lav temperatur.
- For frøkulturen inkuberes en 250 ml kolbe indeholdende 50 ml Luria-Bertani (LB) medium natten over ved 37 ° C med omrystning ved 200 omdrejninger pr. Minut. Brug LB-medium indeholdende 10 g / l trypton, 5 g / l gærekstrakt og 10 g / l NaCl.
BEMÆRK: Celletætheden af frøkulturen skal nå OD 2 (optisk densitet ved 600 nm). - Inokulere en kolbe med 50 ml af frøkulturen i bioreaktoren. Oprethold kulturen ved pH 6,0 og 37 ° C. Brug en lufttilførselshastighed på 2 L / min og en omrøringshastighed på 250 omdr./min., Hvilket skaber en mikroaerob tilstand.
- Saml 5 ml prøver hver 2. time under fermenteringen og analyser dem med højtryksvæskekromatografi for at bestemme de kemiske koncentrationer i bouillon 4 .
- Overvåg alkali tilsat til bioreaktoren online ved hjælp af MFCS / DA.
BEMÆRK: Organiske syrer fremstilles i fermenteringsprocessen, aNd NaOH tilsættes for at holde kulturen pH stabil. Mængden af tilsat alkali repræsenterer mængden af produceret syre. Når de alkali-tilsatte linieplader er processen færdig, enten på grund af udledning af carbonkilder eller celledød.
- Overvåg alkali tilsat til bioreaktoren online ved hjælp af MFCS / DA.
3. R -acetoin Produktion af budC Mutant af K. pneumoniae
- Fremstil et medium til acetoinproduktion indeholdende 4 g / l majsbrødvæske, 2 g / l (NH4) 2S04, 3 g / l natriumacetat, 0,4 g / l KCI og 0,1 g / l MgSO4.
- Brug K. pneumoniae-ΔbudC til R- acetoin produktion. Gentag trin 2.4-2.5.
BEMÆRK: budC koder for 2,3-butandiol dehydrogenase. K. pneumoniae-ΔbudC mister 2,3-butandiol dehydrogenaseaktiviteten og producerer R- acetoin i stedet for 2,3-butandiol. - Oprethold kulturen ved pH 6,0 og 37 ° C. Brug en lufttilførselshastighed på 4 l / min og en agitatioN hastighed på 450 rpm, en aerob tilstand.
BEMÆRK: Oxygentilskuddet er højere end for 2,3-butandiolproduktionen. - Analysér prøverne som i trin 2.6.
4. 2-Ketogluconinsyreproduktion ved hjælp af budA-mutanten af K. pneumoniae
- Til fremstilling af 2-ketogluconinsyre anvendes det samme medium som for R -acetoinproduktion.
- Brug K. pneumoniae-ΔbudA til fremstilling af 2-ketogluconinsyre. Gentag trin 2.4-2.5.
BEMÆRK: budA koder for a-acetolactat-decarboxylase. K. pneumoniae-ΔbudA mister a-acetolactat-decarboxylaseaktiviteten og producerer 2-ketogluconinsyre ved anvendelse af glucose som et substrat.
BEMÆRK: 2-ketogluconsyre syntese er en sur betingelsesafhængig proces. En to-trins fermentering er blevet udviklet til fremstilling af 2-ketogluconinsyre 10 ; I den første fase inokuleres frøkulturen i bioreaktoren. - Analysér prøverne som i trin 2.6. Brug af blysens hydrolysat som kulstofkilde.
BEMÆRK: Glukosen i mediet omdannes til 2-ketogluconinsyre, og xylosen omdannes til xylonsyre. Således opnås en blanding af 2-ketogluconinsyre og xylonsyre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne protokol blev bambus forbehandlet ved anvendelse af alkali. De optimale inkubationsparametre - en temperatur på 121 ° C og 0,25 M NaOH - blev bestemt i figur 1 og 2 . Den forbehandlede bambus blev enzymatisk hydrolyseret, og glucose- og xylosekoncentrationerne opnået i hydrolysatet blev målt. Højere temperaturer favoriserede sukkerproduktionen, så 121 ° C blev valgt som den optimale temperatur. Glucose og xylose produceret i hydrolysatet steg med NaOH-koncentration i intervallet 0,05-0,25 M. Yderligere stigninger i NaOH-koncentrationen havde ingen positiv virkning på sukkerproduktionen. Således blev NaOH ved 0,25 M valgt som den optimale koncentration.
Figur 1: Virkningen af forbehandlingstemperatur på glucose og xylose conCentrering i bambushydrolysat. Rød søjle: glucose; Blå søjle: xylose. Højere temperaturer begunstigede sukkerproduktion, og 121 ° C blev udvalgt til hydrolyzatpræparatet i stor mængde. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Virkningen af den NaOH-koncentration, der anvendes under forbehandlingen på glucose- og xylosekoncentrationen i bambushydrolysatet. Rød linje: glukose; Blå linje: xylose. Glucose og xylose produceret i hydrolysatet steg med NaOH-koncentration i intervallet 0,05-0,50 M, og 0,25 M blev valgt til hydrolyzatpræparatet i stor mængde. Venligst klik på hanIgen for at se en større version af denne figur.
Ca. 20 g / L glucose og 10 g / L xylose blev fremstillet under hydrolysatet i enzymatisk hydrolysering af kolberne; 30 g / l glucose og 15 g / l xylose blev opnået fra hydrolyzatpræparatet i stor mængde. Dette skyldtes, at præparatet i store mængder blev udført i et rysteskum med åben vandbad, og noget vand blev inddampet under processen, hvilket resulterede i koncentrationen af hydrolysatet. Glucose og xylose i bambushydrolysatet blev anvendt af K. pneumoniae som carbonkilder til kemisk produktion. Andre forbindelser i hydrolysatet var: cellobiose (1,4 g / l), arabinose (8,9 g / l), eddikesyre (1,9 g / l) og myresyre (0,2 g / l).
2,3-butandiol blev fremstillet ved K. pneumoniae i mikroaerobe betingelser ( figur 3 ). Processen blev opdelt i to perioder. I fFørst blev glucose anvendt af cellerne til fremstilling af 7,6 g / l 2,3-butandiol, medens xyloseniveauet i bouillon forblev uændret. Glukosen var udmattet på 8 timer, og denne gang markerede skiftet til den næste periode. I den anden periode blev xylosen i bouillon brugt af cellerne, og der blev fremstillet yderligere 5,1 g / l 2,3-butandiol. Produktionen af 2,3-butandiol var langsommere i den anden periode. Ved afslutningen af processen var der totalt produceret 12,7 g / l 2,3-butandiol. Biprodukter af denne proces var mælkesyre, eddikesyre og ethanol. Mælkesyre og ethanol blev hovedsageligt syntetiseret i den første periode (når glucose blev anvendt som carbonkilde), og eddikesyre blev syntetiseret kontinuerligt.
Figur 3: 2,3-butandiolproduktion ved anvendelse af bambushydrolysat som råmaterialet. Rød linje: glukose; Blå linje: xylose; maGenta linje: 2,3-butandiol; Orange linje: mælkesyre; Sort linje: eddikesyre; Grøn linje: ethanol. Glucose og xylose i hydrolysatet blev begge anvendt til 2,3-butandiolsyntese, men glucose blev anvendt først efterfulgt af xylose. Klik her for at se en større version af denne figur.
R- acetoin blev produceret af budC- mutanten af K. pneumoniae under aerobe betingelser ( Figur 4 ). Som i 2,3-butandiolproduktion ved vildtypestammen blev glucose og derefter xylose anvendt i sekvens af K. pneumoniae-AbudC . Xylose var udtømt ved 16 timer, og forbrugshastigheden var hurtigere end den i 2,3-butandiolproduktion af vildtypen. Produktionen af R- acetoin var 13 g / l ved afslutningen af processen, og biprodukterne var 2,3-butandiol, eddikesyre og ethanol.
Figur 4: R -acetoinproduktion ved anvendelse af bambushydrolysat som råmaterialet. Rød linje: glukose; Blå linje: xylose; Violet linje: acetoin; Magenta linje: 2,3-butandiol; Sort linje: eddikesyre; Grøn linje: ethanol. Glucose og xylose i hydrolysatet blev begge anvendt til R- acetoinsyntese, og deres anvendelse var i rækkefølge. Klik her for at se en større version af denne figur.
2-ketogluconinsyre og xylonsyre blev fremstillet af budA- mutanten af K. pneumoniae ( Figur 5 ). Denne proces krævede et højt lufttilskud. Glukosen i mediet blev først omdannet til gluconIsyre, som akkumuleres i bouillon. Gluconsyre nåede et maksimalt niveau på 15 g / l ved 8 h kultur, og efterfølgende faldt koncentrationen. Ingen 2-ketogluconinsyre blev produceret til 6 timer i kulturen. Den blev derefter syntetiseret ved en høj hastighed, og 25 g / L2-ketogluconc-syre blev fremstillet ved afslutningen af processen. Xylosen i mediet blev omdannet til xylonsyre; Denne reaktion begyndte senere end glucoseomdannelsen til gluconsyre. Nogle eddikesyre blev fremstillet som et biprodukt under processen.
Figur 5: 2-ketogluconsyre og xylonsyreproduktion under anvendelse af bambushydrolysat som råmateriale. Rød linje: glukose; Orange linje: gluconsyre; Magenta linje: 2-ketogluconinsyre; Blå linje: xylose; Sort linje: eddikesyre; Grøn linje: ethanol. Glukosen i hydrolysatet blev omdannet til gluconsyreOg blev yderligere omdannet til 2-ketogluconinsyre. Xylosen i hydrolysatet blev omdannet til xylonsyre. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
K. pneumoniae tilhører slægten Klebsiella i familien Enterobacteriaceae . K. pneumoniae distribueres bredt i naturlige omgivelser som jord, vegetation og vand 14 . Vildtype K. pneumoniae- stamme anvendt i denne undersøgelse blev isoleret fra jord og anvendes til 1,3-propandiolproduktion 15 . K. pneumoniae og mutanter af denne art producerer mange kemikalier under forskellige forhold.
Kultur pH og lufttilskud er nøglefaktorer, som påvirker kemisk produktion af K. pneumoniae . Wildtype K. pneumoniae producerer 2,3-butandiol som hovedkatabolitten ved pH 6. Dog ændres 2-ketogluconinsyre til hovedkatabolitten, når den dyrkes ved pH 5 eller lavere 9 . Forøgelse af lufttilskudet nedsætter 2,3-butandiolsyntese, medens R- acetoinsyntese forbedres 8 et al. 16 , som er let at udføre i laboratoriet, især på literskalaen.
Højere forbehandlings temperaturer favoriserer sukkerproduktion under enzymatisk hydrolyse. Behandling ved <100 ° C blev udført i et vandbad og ved 121 ° C i en autoklav. Disse to stykker udstyr er almindelige i laboratorier, og flere liter væske blev behandlet i hver batch. Højere temperaturer kræver højtryksreaktorer. For eksempel har vores laboratorium 50-mL og 1-L højtryksreaktorer, men mængderne af disse reaktorer begrænser deres anvendelse under biomassebehandlinger.
Bambushydrolysatpræparatet vist i denne undersøgelse var let at udføre i kolber. Imidlertid blev der undertiden opnået lavere niveauer af glucose og xylose, når de blev udført i stort volumen. Hydrolyseblandingen skal være godt fordelt. Nedbør af biomassen ville medføre lavere hydrolyseindhold.
I modsætning til ren glucose og xylose er biomassehydrolysat kontamineret af mange giftige kemikalier, der kan hæmme væksten af mikroorganismer. Mange metoder er blevet udviklet for at fjerne sådanne inhibitorer, men de tilføjer til procesomkostninger og har en tendens til at reducere sukkerudbyttet 17 . I denne undersøgelse blev der ikke udført noget særligt arbejde for at fjerne hæmmere. Ved anvendelse af bambushydrolysatet, der blev frembragt i dette arbejde som råmateriale, var produktiviteten (0,95 g / Lh) og omdannelsesforholdet (0,25 g / g) glucose til 2,3-butandiol under det første trin, hvor glucose blev forbrugt, lavere End når renset glukose blev anvendt som carbonkilde, rapporteret tidligere (henholdsvis 1,4 g / lh og 0,3 g / gm) 4 . Produktiviteten af 2,3-butaneretIol i anden fase, hvor xylose blev brugt, var langsommere end i første fase. Omdannelsesforholdet mellem xylose og 2,3-butandiol nåede imidlertid 0,34 g / g, hvilket var højere end når renset glucose blev anvendt som carbonkilde 4 . R- acetoinproduktion under anvendelse af bambushydrolysatet som råmateriale havde produktivitets- og substratkonverteringsforhold på henholdsvis 0,92 g / Lh og 0,29 g / g. Begge disse forhold var lavere end når renset glucose blev anvendt som substratet (henholdsvis 1,7 g / lh og 0,34 g / g) 8 . Produktiviteten og omdannelsesforholdet mellem 2-ketogluconinsyre i dette studie var henholdsvis 2,3 g / lh og 0,91 g / g lavere end når reniseret glukose blev anvendt som kulindioxid (4,2 g / lh og 1 g / g henholdsvis ) 10 .
Xylose er det næststørste sukker i naturen efter glucose. I modsætning til glucose er xylose ikke let udnyttet af de fleste mikroorganismer. I denne studY, xylose blev fuldstændigt forbrugt af K. pneumoniae til kemisk produktion. 2,3-butandiol, R- acetoin, 2-ketogluconinsyre og xylonsyre er alle værdifulde kemikalier, og deres produktionsprocesser varierer fra mikroaerob til meget aerobe forhold. Gæringsresultaterne her indikerer, at sukkerarter i bambushydrolysat er egnede carbonkilder til vækst af K. pneumoniae og kemisk produktion under forskellige betingelser.
Brug af biomassehydrolysat som råmateriale er en lovende metode til kemisk produktion. Der er dog stadig mange mangler, der skal overvindes, såsom den store mængde vand, der er nødvendigt for at vaske den forbehandlede biomasse og den lange tid, der er nødvendig for enzymhydrolyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (Tilskud nr. 21576279, 20906076) og KRIBB Research Initiative Program (KGM2211531).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| autoclave | SANYO | 3780 | |
| bioreactor | Sartorius stedim biotech | Bostat Aplus | |
| agitator | IKA | RW 20 | |
| water bath shaker | Zhicheng | ZWY-110X50 | |
| high performance liquid chromatograph system | Shimadzu Corp | 20AVP | |
| centrifuge | Hitachi | CR22G III | |
| Bamboo powder | purchased from Zhejiang Province, China | mesh number, 50 | |
| cellulase | Youtell Biochemical, Shandong, China | 200 PFU/mL |
References
- Zeng, A. P., Biebl, H. Bulk chemicals from biotechnology: the case of 1, 3-propanediol production and the new trends. Adv Biochem Eng Biotechnol. 74, 239-259 (2002).
- Wei, D., Wang, M., Jiang, B., Shi, J., Hao, J. Role of dihydroxyacetone kinases I and II in the dha regulon of Klebsiella pneumoniae. J Biotechnol. 177, 13-19 (2014).
- Celińska, E., Grajek, W. Biotechnological production of 2,3-butanediol-current state and prospects. Biotechnol Adv. 27 (6), 715-725 (2009).
- Chen, C., Wei, D., Shi, J., Wang, M., Hao, J. Mechanism of 2, 3-butanediol stereoisomer formation in Klebsiella pneumoniae. Appl Microbiol Biotechnol. 98 (10), 4603-4613 (2014).
- Wei, D., Wang, M., Shi, J., Hao, J. Red recombinase assisted gene replacement in Klebsiella pneumoniae. J Ind Microbiol Biotechnol. 39 (8), 1219-1226 (2012).
- Wei, D., Sun, J., Shi, J., Liu, P., Hao, J. New strategy to improve efficiency for gene replacement in Klebsiella pneumoniae. J Ind Microbiol Biotechnol. 40 (5), 523-527 (2013).
- Chen, C., et al. Inhibition of RecBCD in Klebsiella pneumoniae by Gam and its effect on the efficiency of gene replacement. J Basic Microbiol. 56 (2), 120-126 (2016).
- Wang, D., et al. R-acetoin accumulation and dissimilation in Klebsiella pneumoniae. J Ind Microbiol Biotechnol. 42 (8), 1105-1115 (2015).
- Wei, D., Xu, J., Sun, J., Shi, J., Hao, J. 2-Ketogluconic acid production by Klebsiella pneumoniae CGMCC 1.6366. J Ind Microbiol Biotechnol. 40 (6), 561-570 (2013).
- Sun, Y., et al. Two-stage fermentation for 2-ketogluconic acid production by Klebsiella pneumoniae. J Microbiol Biotechnol. 24 (6), 781-787 (2014).
- Wang, D., et al. Gluconic acid production by gad mutant of Klebsiella pneumoniae. World J Microbiol Biotechnol. 32 (8), 1-11 (2016).
- Wang, C., et al. Production of xylonic acid by Klebsiella pneumoniae. Appl Microbiol Biotechnol. 100 (23), 10055-10063 (2016).
- Kumar, P., Barrett, D. M., Delwiche, M. J., Stroeve, P. Methods for pretreatment of lignocellulosic biomass for efficient hydrolysis and biofuel production. Ind Eng Chem Res. 48 (8), 3713-3729 (2009).
- Brisse, S., Grimont, F., Grimont, P. A. The genus Klebsiella. The Prokaryotes. , Springer. 159-196 (2006).
- Hao, J., Lin, R., Zheng, Z., Liu, H., Liu, D. Isolation and characterization of microorganisms able to produce 1, 3-propanediol under aerobic conditions. World J Microbiol Biotechnol. 24 (9), 1731-1740 (2008).
- Hong, E., et al. Optimization of alkaline pretreatment on corn stover for enhanced production of 1.3-propanediol and 2, 3-butanediol by Klebsiella pneumoniae AJ4. Biomass Bioenerg. 77, 177-185 (2015).
- Pienkos, P. T., Zhang, M. Role of pretreatment and conditioning processes on toxicity of lignocellulosic biomass hydrolysates. Cellulose. 16 (4), 743-762 (2009).
