Summary
Bambupulver förbehandlades med NaOH och enzymatiskt hydrolyserades. Hydrolysatet av bambu användes som råmaterial för 2,3-butandiol, R- aketoin, 2-ketoglukoninsyra och xylonsyraproduktion av Klebsiella pneumoniae .
Abstract
Bambu är en viktig biomassa, och bambuhydrolysat används av Klebsiella pneumoniae som ett råmaterial för kemisk produktion. Här förbehandlades bambupulver med NaOH och tvättades till ett neutralt pH. Cellulas sattes till det förbehandlade bambupulvret för att alstra hydrolysatet, som innehöll 30 g / 1 glukos och 15 g / 1 xylos och användes som kolkälla för att framställa ett medium för kemisk produktion. Vid odling i mikroaeroba betingelser framställdes 12,7 g / L 2,3-butandiol av vildtyp K. pneumoniae . Under aeroba förhållanden framställdes 13,0 g / 1 R- acetonin av budC- mutanten av K. pneumoniae . En blandning av 25,5 g / L2-ketoglukonsyra och 13,6 g / 1 xylonsyra framställdes av budA- mutanten av K. pneumoniae i en tvåstegs, pH-styrd jäsning med höglufttillskott. I det första fermenteringssteget upprätthölls kulturen vid ett neutralt pH; Efter celltillväxt, fermentatioN fortsatte till det andra steget, under vilket odlingen fick bli sur.
Introduction
Klebsiella pneumoniae är en bakterie som växer bra under både aeroba och anaeroba förhållanden. K. pneumoniae är en viktig industriell mikroorganism som används för att producera många kemikalier. 1,3-propandiol är en värdefull kemikalie som huvudsakligen används som en monomer för att syntetisera polytrimetylentereftalat. Polytrimetylentereftalat är en biologiskt nedbrytbar polyester som uppvisar bättre egenskaper än 1,2-propandiol, butandiol eller etylenglykol 1 . 1,3-propandiol framställs av K. pneumoniae med användning av glycerol som ett substrat i syre-begränsade betingelser 2 . 2,3-butandiol och dess derivat har tillämpningar inom plast, lösningsmedelsproduktion och syntetiskt gummi och har potential att användas som biobränsle 3 . Med glukos som substrat är 2,3-butandiol huvudmetaboliten av vildtypstammen 4 . 2,3-butandiol är syntetiskEd från pyruvat. Först kondenserar två molekyler pyruvat för att ge a-acetolaktat; Denna reaktion katalyseras av a-acetolaktatsyntas. A-acetolaktat omvandlas därefter till acetoin medelst a-acetolaktatdekarboxylas. R- aceton reduceras ytterligare till 2,3-butandiol när det katalyseras av butandioldehydrogenas. En effektiv genutbytesmetod lämplig för K. pneumoniae har undersökts och många mutanter har konstruerats 5 , 6 , 7 . En budC- mutant, som förlorade sin 2,3-butandioldehydrogenasaktivitet, ackumulerar höga nivåer av aketoin i odlingsbuljong. Acetoin används som tillsats för att förbättra smaken av mat 8 . När budA , som kodar för a-acetolaktatdekarboxylas, muteras, ackumuleras 2-ketoglukoninsyra i buljongen. 2-ketoglukoninsyra används för syntesen av erythorbinsyra (isoascorbinsyra), En antioxidant som används i livsmedelsindustrin 9 . 2-ketoglukoninsyra är en mellanprodukt i glukosoxidationsvägen; I denna väg, som ligger i det periplasmatiska utrymmet oxideras glukos till glukonsyra och oxideras därefter ytterligare till 2-ketoglukoninsyra. Glukonsyra och 2-ketoglukonsyra som produceras i periplasmen kan transporteras till cytoplasman för vidare metabolism. Uppbyggnaden av 2-ketoglukoninsyra är beroende av sura betingelser, och högre lufttillskott gynnar 2-ketoglukonsyraproduktion 10 . Glukonatdehydrogenas, kodad av gad , Katalyserar omvandlingen av glukonsyra till 2-ketolguconsyra. Gadmutanten av K. pneumoniae producerade höga nivåer av glukonsyra i stället för 2-ketoglukonsyra, och denna process är också beroende av sura betingelser. Glukonsyra är en stor organisk syra och används som tillsats för att öka cementens 1 egenskaper1. Glukosoxidation till glukonsyra katalyseras av glukosdehydrogenas. Xylos är också ett lämpligt substrat av glukosdehydrogenas. När xylos används som ett substrat, producerar K. pneumoniae xylonsyra 12 .
Kemisk produktion med biomassa som råmaterial är ett hett ämne inom bioteknik 13 . Huvudkomponenterna i biomassa är cellulosa, hemicellulosa och lignin. Dessa makromolekylära föreningar kan emellertid inte direkt cataboliseras av de flesta mikroorganismer (inklusive K. pneumoniae ). Cellulosa och hemicelluloser i biomassan måste hydrolyseras till glukos och xylos och kan sedan användas av mikroorganismer. Närvaron av lignin i lignocellulosor skapar en skyddande barriär som förhindrar biomasshydrolysering genom enzymer. Således utförs en förbehandlingsprocess som avlägsnar lignin och hemicellulosor och reducerar cellulosans kristallinitet alltid under biomassanvändning med mikroroorganisms. Många förbehandlingsmetoder har utvecklats: syra, alkalisk, ammoniak och ångbehandling är vanliga.
Bambu är rikligt i tropiska och subtropiska regioner och är en viktig biomassa resurs. Här presenteras beredningen av bambuhydrolysat och kemisk produktion med användning av bambuhydrolysat
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av bambuhydrolysat
- Tillsätt 5 g bambupulver till 40 ml av en NaOH-lösning för att uppnå en slutlig koncentration på 10% (g / g) i en 250 ml kolv. Använd en serie NaOH lösningar som sträcker sig från 0,05 M till 0,50 M i steg om 0,05 M.
- Inkubera blandningen i 60 minuter vid 60 ° C eller 100 ° C i ett vattenbad. Inkubera vid 121 ° C i en autoklav.
- Efter inkubation låt blandningen stå i 4 timmar vid rumstemperatur. Ta sedan bort supernatanten. Tillsätt 100 ml färskvatten och blanda.
- Upprepa tvätten 5-6 gånger tills supernatantens pH når 6,8. Använd det erhållna fastämnet för nästa steg av enzymatisk hydrolys.
- För hydrolys, justera 50 ml av ovanstående blandning till pH 5,0 med användning av 98% H2S04. Därefter tillsätt 0,5 ml 200 filterpappersaktivitet (FPU) / ml cellulas.
OBS: Slutförhållandet cellulas till bambu shDu ska vara 20 FPU per 1 g bambu. - Inkubera blandningen vid 50 ° C under 36 timmar i en skakare.
OBS! Efter hydrolys kommer vissa fasta ämnen att förbli i blandningen. - Skaffa ett klart hydrolysat genom centrifugering vid 7 690 xg under 5 min.
- Kvantifiera glukos-, xylos- och andra kemikalier med ett högtrycksvätskekromatografsystem utrustat med en brytningsindexdetektor och en fotodiodsdetektor. Använd en HPX-87H-kolonn (300 mm x 7,8 mm) och en mobil fas av 5 mM H2SO4-lösning vid en flödeshastighet på 0,8 ml / min 12 .
- För en stor mängd hydrolysatberedning, blanda 2 kg bambupulver och 18 liter 0,25 M NaOH i en 30-L rostfritt ståltank.
- Inkubera tanken vid 121 ° C i en autoklav i 60 minuter. Efter inkubation tvättar du blandningen med 40 liter vatten i en 60 liter plastbehållare. Upprepa denna tvätt 5 gånger.
- Använd vatten för att justera den totala tvättade bambu till en volym på 20 L.Justera blandningens pH till 5,0 med användning av 98% H2S04.
- Enzymatiskt hydrolyserar blandningen i ett modifierat skakningsbad, utrustat med en mekanisk omrörare för att säkerställa att blandningen är välfördelad. Tillsätt 200 ml 200 FPU / ml cellulas och inkubera blandningen vid 50 ° C under 36 timmar.
- Efter hydrolys centrifugera blandningen vid 4 700 xg under 10 min.
2. 2,3-butandiol Produktion av Wildtype K. pneumoniae
- Använd 3 liter bambuhydrolysat som lösningsmedel för mediumberedning.
- Förbered ett jäsningsmedium innehållande 4 g / l majsbrödvätska, 2 g / L (NH4) 2S04, 6 g / LK 2 HPO 4 , 3 g / L KH2P04 och 0,2 g / L MgS04. Justera mediumets pH till neutral genom att använda 2,5 M NaOH. Använd en 5-L bioreaktor innehållande 3 liter autoklaverat fermentationsmedium för jäsning.
- Använd K. pneumoniaeCeller lagrade i kylskåp med låg temperatur på -80 ° C.
- För frökulturen inkubera en 250 ml kolv innehållande 50 ml Luria-Bertani (LB) -medium över natt vid 37 ° C med skakning vid 200 rpm. Använd LB-medium innehållande 10 g / L trypton, 5 g / 1 jästextrakt och 10 g / 1 NaCl.
OBS: Celltätheten hos frökulturen bör nå OD 2 (optisk densitet vid 600 nm). - Inokulera en kolv med 50 ml fröodling i bioreaktorn. Underhålla kulturen vid pH 6,0 och 37 ° C. Använd en lufttillskottshastighet på 2 liter / min och en omrörningshastighet på 250 rpm, vilket ger ett mikroaerobt tillstånd.
- Samla 5 ml prov varje 2 h under fermenteringen och analysera dem med högtrycksvätskekromatografi för att bestämma de kemiska koncentrationerna i buljongen 4 .
- Övervaka alkalin som läggs till bioreaktorn online med hjälp av MFCS / DA.
OBS: Organiska syror produceras i jäsningsprocessen, aNd NaOH tillsättes för att hålla kulturen pH stabil. Volymen av tillsatt alkali representerar mängden producerad syra. När de alkali-tillförda linjeplattorna är processen avslutad, antingen på grund av kolkällautmattning eller celldöd.
- Övervaka alkalin som läggs till bioreaktorn online med hjälp av MFCS / DA.
3. R- aketoin Produktion av budC- mutanten av K. pneumoniae
- Förbered ett medium för aketoinproduktion innehållande 4 g / l majsbrödvätska, 2 g / L (NH4) 2S04, 3 g / 1 natriumacetat, 0,4 g / 1 KCl och 0,1 g / L MgS04.
- Använd K. pneumoniae-AbudC för produktion av R- aceton. Upprepa steg 2.4-2.5.
OBS: budC kodar 2,3-butandioldehydrogenas. K. pneumoniae-AbudC förlorar 2,3-butandioldehydrogenasaktiviteten och producerar R- aceton i stället för 2,3-butandiol. - Underhålla kulturen vid pH 6,0 och 37 ° C. Använd en lufttillskott på 4 L / min och en agitatioN-hastighet på 450 rpm, ett aerobt tillstånd.
OBS: Syretillskottet är högre än för 2,3-butandiolproduktionen. - Analysera proverna som i steg 2.6.
4. 2-ketoglukonsyraproduktion av budA- mutanten av K. pneumoniae
- För produktion av 2-ketoglukonsyra, använd samma medium som för R- aketoinproduktion.
- Använd K. pneumoniae-ΔbudA för produktion av 2-ketoglukonsyra. Upprepa steg 2.4-2.5.
OBS: budA kodar a-acetolaktatdekarboxylas. K. pneumoniae-ΔbudA förlorar a-acetolaktat-dekarboxylasaktiviteten och producerar 2-ketoglukonsyra med användning av glukos som ett substrat.
OBS: 2-ketoglukoninsyrasyntes är en sur tillståndsberoende process. En fermentation i två steg har utvecklats för 2-ketoglukoninsyraproduktion 10 ; I det första steget ympas frökulturen i bioreaktorn. - Analysera proverna som i steg 2.6. Användning av bambuens hydrolysat som kolkälla.
OBS: Glukosen i mediet omvandlas till 2-ketoglukonsyra, och xylosen omvandlas till xylonsyra. Således erhålles en blandning av 2-ketoglukonsyra och xylonsyra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I detta protokoll förbehandlades bambu med användning av alkali. De optimala inkubationsparametrarna - en temperatur av 121 ° C och 0,25 M NaOH - bestämdes i figurerna 1 och 2 . Den förbehandlade bambuen enzymatiskt hydrolyserades och glukos- och xylosakoncentrationerna erhållna i hydrolysatet mättes. Högre temperaturer favoriserad sockerproduktion, så 121 ° C valdes som optimal temperatur. Den glukos och xylos som framställdes i hydrolysatet ökade med NaOH-koncentration över intervallet 0,05-0,25 M. Ytterligare ökning av NaOH-koncentrationen hade ingen positiv effekt på sockerproduktionen. Således valdes NaOH vid 0,25 M som den optimala koncentrationen.
Figur 1: Effekten av förbehandlingstemperaturen på glukos och xylosconCentreringen i bambuhydrolysat. Röd kolonn: glukos; Blå kolonn: xylos. Högre temperaturer favoriserad sockerproduktion och 121 ° C valdes för storvolymen hydrolysatberedning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Effekten av NaOH-koncentrationen som användes under förbehandling på glukos- och xyloskoncentrationen i bambuhydrolysatet. Röd linje: glukos; Blå linje: xylos. Den glukos och xylos som framställdes i hydrolysatet ökade med NaOH-koncentration i intervallet 0,05-0,50 M och 0,25 M valdes för hydrolysatpreparatet i stor volym. Vänligen klicka på hanÅter att se en större version av denna figur.
Ca 20 g / 1 glukos och 10 g / L xylos framställdes under hydrolysatet i enzymatisk hydrolys med kolvskala; 30 g / 1 glukos och 15 g / 1 xylos erhölls från hydrolyzatpreparatet i stor volym. Detta berodde på att preparatet i stor volym utfördes i en skakare med öppen vattenbad och ett visst vatten indunstades under processen vilket ledde till koncentrationen av hydrolysatet. Glukos och xylos i bambuhydrolysatet användes av K. pneumoniae som kolkällor för kemisk produktion. Andra föreningar i hydrolysatet var: cellobios (1,4 g / 1), arabinos (8,9 g / 1), ättiksyra (1,9 g / 1) och myrsyra (0,2 g / 1).
2,3-butandiol framställdes av K. pneumoniae i mikroaeroba förhållanden ( Figur 3 ). Processen delades in i två perioder. I fFör det första användes glukos av cellerna för framställning av 7,6 g / L 2,3-butandiol, medan xylosnivån i buljongen förblev oförändrad. Glukosen var uttömd vid 8 h, och denna gång markerade skiftet till nästa period. Under den andra perioden användes xylosen i buljongen av cellerna och en ytterligare 5,1 g / l 2,3-butandiol framställdes. Produktionen av 2,3-butandiol var långsammare under den andra perioden. Vid slutet av processen hade totalt 12,7 g / L 2,3-butandiol framställts. Biprodukter av denna process var mjölksyra, ättiksyra och etanol. Mjölksyra och etanol syntetiserades huvudsakligen under den första perioden (när glukos användes som kolkälla) och ättiksyra syntetiserades kontinuerligt.
Figur 3: 2,3-butandiolproduktion med användning av bambuhydrolysat som råmaterial. Röd linje: glukos; Blå linje: xylos; maGenta linje: 2,3-butandiol; Orange linje: mjölksyra; Svart linje: ättiksyra; Grön linje: etanol. Glukos och xylos i hydrolysatet användes båda för 2,3-butandiolsyntes, men glukos användes först följt av xylos. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
R- acetoin producerades av budC- mutanten av K. pneumoniae under aeroba betingelser ( Figur 4 ). Liksom vid 2,3-butandiolproduktion av vildtypstammen användes glukos och sedan xylos i följd av K. pneumoniae-AbudC . Xylos uttömdes vid 16 h och konsumtionshastigheten var snabbare än den vid 2,3-butandiolproduktion av vildtypen. Framställning av R- aketoin var 13 g / 1 vid slutet av processen, och biprodukterna var 2,3-butandiol, ättiksyra och eThanol.
Figur 4: R- acetonproduktion med användning av bambuhydrolysat som råmaterial. Röd linje: glukos; Blå linje: xylos; Violett linje: acetoin; Magenta linje: 2,3-butandiol; Svart linje: ättiksyra; Grön linje: etanol. Glukos och xylos i hydrolysatet användes båda för R -acetoinsyntes, och deras användning var i följd. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
2-ketoglukonsyra och xylonsyra framställdes av budA- mutanten av K. pneumoniae ( Figur 5 ). Denna process krävde ett högt lufttillskott. Glukosen i mediet omvandlades först till glukonIsyra som ackumulerats i buljongen. Glukonsyran nådde en maximal nivå av 15 g / 1 vid 8 h odling, och därefter minskade koncentrationen. Ingen 2-ketoglukoninsyra framställdes till 6 timmar i odlingen. Den syntetiserades sedan i hög takt och 25 g / L2-ketoglukonsyra framställdes vid processens slut. Xylosen i mediet omvandlades till xylonsyra; Denna reaktion började senare än glukosomvandlingen till glukonsyra. Vissa ättiksyra framställdes som en biprodukt under processen.
Figur 5: 2-ketoglukonsyra och xylonsyraproduktion med användning av bambuhydrolysat som råmaterial. Röd linje: glukos; Orange linje: glukonsyra; Magenta linje: 2-ketoglukoninsyra; Blå linje: xylos; Svart linje: ättiksyra; Grön linje: etanol. Glukos i hydrolysatet omvandlades till glukonsyraOch omvandlades vidare till 2-ketoglukoninsyra. Xylosen i hydrolysatet omvandlades till xylonsyra. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
K. pneumoniae tillhör släktet Klebsiella i familjen Enterobacteriaceae . K. pneumoniae distribueras i stor utsträckning i naturliga miljöer som jord, vegetation och vatten 14 . Vildtyp K. pneumoniae- stammen som användes i denna forskning isolerades från jord och användes för 1,3-propandiolproduktion 15 . K. pneumoniae och mutanter av denna art producerar många kemikalier under olika förhållanden.
Kultur pH och lufttillskott är viktiga faktorer som påverkar kemisk produktion av K. pneumoniae . Wildtype K. pneumoniae producerar 2,3-butandiol som huvudkataboliten vid pH 6. Men 2-ketoglukoninsyra ändras till huvudkataboliten när den odlas vid pH 5 eller lägre 9 . Ökande lufttillskott minskar 2,3-butandiolsyntes, medan R- acetoninsyntesen förbättras 8 et al. 16 , vilket är lätt att utföra i laboratoriet, särskilt på liter-skala.
Högre förbehandlingstemperaturer gynnar sockerproduktion under enzymatisk hydrolys. Behandling vid <100 ° C utfördes i ett vattenbad och vid 121 ° C i en autoklav. Dessa två utrustningar är vanliga i laboratorier och flera liter vätska behandlades i varje sats. Högre temperaturer kräver högtrycksreaktorer. Till exempel har vårt laboratorium 50-mL och 1-L högtrycksreaktorer, men volymerna av dessa reaktorer begränsar deras användning under biomassbehandlingar.
Den bambuhydrolysatberedning som visades i denna forskning var lätt att utföra i flaskor. När det emellertid gjordes i stor volym erhölls ibland lägre glukos och xylosnivåer. Hydrolysblandningen måste vara välfördelad. Nedbörd av biomassan skulle leda till lägre hydrolysnivåer.
Till skillnad från ren glukos och xylos kontamineras biomasshydrolysat av många giftiga kemikalier som kan hämma tillväxten av mikroorganismer. Många metoder har utvecklats för att avlägsna sådana hämmare, men de tillför processkostnader och tenderar att minska sockerutbytet 17 . I denna forskning gjordes inget särskilt arbete för att avlägsna hämmare. Genom att använda bambuhydrolysatet som genererades i detta arbete som råmaterial var produktiviteten (0,95 g / Lh) och omvandlingsförhållandet (0,25 g / g) glukos till 2,3-butandiol under det första steget när glukos konsumeras lägre Än när renad glukos användes som kolkälla, rapporterad tidigare (1,4 g / Lh respektive 0,3 g / g) 4 . Produktiviteten av 2,3-butaneradIol under det andra steget, när xylos konsumeras, var långsammare än i det första steget. Omvandlingsförhållandet xylos till 2,3-butandiol uppnådde dock 0,34 g / g, vilket var högre än när renad glukos användes som kolkälla 4 . R- aketoinproduktion med användning av bambuhydrolysatet som råmaterial hade produktivitets- och substratomvandlingsförhållanden av 0,92 g / Lh respektive 0,29 g / g. Båda dessa förhållanden var lägre än när renad glukos användes som substratet (1,7 g / Lh respektive 0,34 g / g) 8 . Produktiviteten och omvandlingsförhållandet 2-ketoglukoninsyra i denna studie var 2,3 g / Lh respektive 0,91 g / g lägre än när renad glukos användes som kolkälla (4,2 g / Lh respektive 1 g / g ) 10 .
Xylos är det näst mest rikliga sockret i naturen efter glukos. Till skillnad från glukos används inte xylos lätt av de flesta mikroorganismer. I denna studY, xylos konsumeras fullständigt av K. pneumoniae för kemisk produktion. 2,3-butandiol, R- aketoin, 2-ketoglukoninsyra och xylonsyra är alla värdefulla kemikalier, och deras produktionsprocesser varierar från mikroaeroba till höga aeroba förhållanden. Fermenteringsresultaten här indikerar att sockerarter i bambuhydrolysat är lämpliga kolkällor för tillväxt av K. pneumoniae och kemisk produktion under olika betingelser.
Att använda biomasshydrolysat som råmaterial är en lovande metod för kemisk produktion. Det finns emellertid fortfarande många brister som måste övervinnas, såsom den stora mängden vatten som behövs för att tvätta den förbehandlade biomassen och den långa tid som krävs för enzymhydrolys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (bidrag nr 21576279, 20906076) och KRIBB Research Initiative Program (KGM2211531).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| autoclave | SANYO | 3780 | |
| bioreactor | Sartorius stedim biotech | Bostat Aplus | |
| agitator | IKA | RW 20 | |
| water bath shaker | Zhicheng | ZWY-110X50 | |
| high performance liquid chromatograph system | Shimadzu Corp | 20AVP | |
| centrifuge | Hitachi | CR22G III | |
| Bamboo powder | purchased from Zhejiang Province, China | mesh number, 50 | |
| cellulase | Youtell Biochemical, Shandong, China | 200 PFU/mL |
References
- Zeng, A. P., Biebl, H. Bulk chemicals from biotechnology: the case of 1, 3-propanediol production and the new trends. Adv Biochem Eng Biotechnol. 74, 239-259 (2002).
- Wei, D., Wang, M., Jiang, B., Shi, J., Hao, J. Role of dihydroxyacetone kinases I and II in the dha regulon of Klebsiella pneumoniae. J Biotechnol. 177, 13-19 (2014).
- Celińska, E., Grajek, W. Biotechnological production of 2,3-butanediol-current state and prospects. Biotechnol Adv. 27 (6), 715-725 (2009).
- Chen, C., Wei, D., Shi, J., Wang, M., Hao, J. Mechanism of 2, 3-butanediol stereoisomer formation in Klebsiella pneumoniae. Appl Microbiol Biotechnol. 98 (10), 4603-4613 (2014).
- Wei, D., Wang, M., Shi, J., Hao, J. Red recombinase assisted gene replacement in Klebsiella pneumoniae. J Ind Microbiol Biotechnol. 39 (8), 1219-1226 (2012).
- Wei, D., Sun, J., Shi, J., Liu, P., Hao, J. New strategy to improve efficiency for gene replacement in Klebsiella pneumoniae. J Ind Microbiol Biotechnol. 40 (5), 523-527 (2013).
- Chen, C., et al. Inhibition of RecBCD in Klebsiella pneumoniae by Gam and its effect on the efficiency of gene replacement. J Basic Microbiol. 56 (2), 120-126 (2016).
- Wang, D., et al. R-acetoin accumulation and dissimilation in Klebsiella pneumoniae. J Ind Microbiol Biotechnol. 42 (8), 1105-1115 (2015).
- Wei, D., Xu, J., Sun, J., Shi, J., Hao, J. 2-Ketogluconic acid production by Klebsiella pneumoniae CGMCC 1.6366. J Ind Microbiol Biotechnol. 40 (6), 561-570 (2013).
- Sun, Y., et al. Two-stage fermentation for 2-ketogluconic acid production by Klebsiella pneumoniae. J Microbiol Biotechnol. 24 (6), 781-787 (2014).
- Wang, D., et al. Gluconic acid production by gad mutant of Klebsiella pneumoniae. World J Microbiol Biotechnol. 32 (8), 1-11 (2016).
- Wang, C., et al. Production of xylonic acid by Klebsiella pneumoniae. Appl Microbiol Biotechnol. 100 (23), 10055-10063 (2016).
- Kumar, P., Barrett, D. M., Delwiche, M. J., Stroeve, P. Methods for pretreatment of lignocellulosic biomass for efficient hydrolysis and biofuel production. Ind Eng Chem Res. 48 (8), 3713-3729 (2009).
- Brisse, S., Grimont, F., Grimont, P. A. The genus Klebsiella. The Prokaryotes. , Springer. 159-196 (2006).
- Hao, J., Lin, R., Zheng, Z., Liu, H., Liu, D. Isolation and characterization of microorganisms able to produce 1, 3-propanediol under aerobic conditions. World J Microbiol Biotechnol. 24 (9), 1731-1740 (2008).
- Hong, E., et al. Optimization of alkaline pretreatment on corn stover for enhanced production of 1.3-propanediol and 2, 3-butanediol by Klebsiella pneumoniae AJ4. Biomass Bioenerg. 77, 177-185 (2015).
- Pienkos, P. T., Zhang, M. Role of pretreatment and conditioning processes on toxicity of lignocellulosic biomass hydrolysates. Cellulose. 16 (4), 743-762 (2009).
