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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

इन विट्रो बहुलकीकरण के F प-actin पर जल्दी Endosomes

Published: August 28, 2017 doi: 10.3791/55829
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry, University of Geneva, 2Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne

Summary

अर्ली endosome फ़ंक्शंस F-actin बहुलकीकरण पर निर्भर करते हैं. यहां, हम वर्णन एक माइक्रोस्कोपी इन विट्रो परख है कि nucleation और बहुलकीकरण के परीक्षण ट्यूबों में जल्दी endosomal झिल्ली पर actin का पुनर्गठन, इस प्रकार की प्रतिक्रियाओं के इस जटिल श्रृंखला का प्रतिपादन जैव रासायनिक और आनुवंशिक के लिए उत्तरदायी जोड़तोड़.

Abstract

कई जल्दी endosome कार्यों, विशेष रूप से कार्गो प्रोटीन छंटाई और झिल्ली विकृति, endosomal झिल्ली पर nucleated लघु F-actin तंतुओं के धब्बे पर निर्भर करते हैं । हम एक माइक्रोस्कोपी की स्थापना की है-इन विट्रो परख है कि nucleation और बहुलकीकरण के परीक्षण ट्यूबों में जल्दी endosomal झिल्ली पर actin, इस प्रकार आनुवंशिक और जैव रासायनिक के लिए उत्तरदायी प्रतिक्रियाओं के इस जटिल श्रृंखला प्रतिपादन का पुनर्गठन जोड़तोड़. जल्दी Endosomal प्रोटीन GFP-RAB5 व्यक्त कोशिकाओं से सुक्रोज ढाल में फ्लोटेशन द्वारा Endosomal अंश तैयार कर रहे हैं । Cytosolic अंशों को कक्षों के पृथक बैच से तैयार किया जाता है. दोनों endosomal और cytosolic अंश तरल नाइट्रोजन में जमे हुए संग्रहीत किया जा सकता है, अगर जरूरत है । परख में, endosomal और cytosolic भागों मिश्रित कर रहे हैं, और मिश्रण ३७ डिग्री सेल्सियस पर उपयुक्त परिस्थितियों में मशीन है (जैसे, ईओण ताकत, पर्यावरण को कम करने) । वांछित समय पर, प्रतिक्रिया मिश्रण तय हो गया है, और एफ actin phalloidin के साथ पता चला है । Actin nucleation और बहुलकीकरण तो प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं । यहां, हम रिपोर्ट है कि इस परख कारकों है कि या तो झिल्ली पर actin nucleation में शामिल है की भूमिका की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, या बाद में बढ़ाव, शाखाओं में, या एफ actin रेशा के crosslinking ।

Introduction

उच्च युकेरियोटिक कोशिकाओं में, प्रोटीन और लिपिड जल्दी endosomes में आंतरिक है जहां छंटाई होती है । कुछ प्रोटीन और लिपिड, जो भाग्य का उपयोग किया जा करने के लिए कर रहे हैं, जल्दी endosomes के ट्यूबलर क्षेत्रों में शामिल कर रहे है और फिर प्लाज्मा झिल्ली या ट्रांस Golgi नेटवर्क (TGN)1,2तक पहुंचाया । इसके विपरीत, अंय प्रोटीन और लिपिड चुनिंदा जल्दी endosomes है कि एक multivesicular उपस्थिति प्रदर्शन के क्षेत्रों में पैक कर रहे हैं । इन क्षेत्रों का विस्तार और, जल्दी endosomal झिल्ली से टुकड़ी पर, अंततः मुक्त endosomal वाहक बुलबुले या multivesicular निकायों में परिपक्व (ECV/MVBs), जो देर से endosomes1की दिशा में कार्गो परिवहन के लिए जिंमेदार हैं, 2.

Actin endosomal छंटाई क्षमता और endosome उत्पत्ति के साथ जुड़े झिल्ली remodeling प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । प्लाज्मा झिल्ली या TGN के लिए रीसाइक्लिंग रास्ते के साथ छंटाई प्रोटीन retromer परिसर और जुड़े प्रोटीन पर निर्भर करता है । इस छंटाई मशीनरी retromer परिसर की बातचीत के माध्यम से रीसाइक्लिंग नलिकाओं के गठन के लिए युग्मित किया जा लगता है, ततैया और निशान homologue (धो) परिसर और शाखाओं में actin3,4,5 . इसके विपरीत, क्षरण के लिए किस्मत में अणुओं, विशेष रूप से संकेत रिसेप्टर्स सक्रिय, intraluminal बुलबुले में हल कर रहे हैं (ILVs) endosomal छँटाई परिवहन के लिए आवश्यक परिसरों (ESCRT)2,6, 7. जबकि ESCRT-निर्भर छंटाई प्रक्रिया में actin की संभव भूमिका ज्ञात नहीं है, F-actin ECV/MVBs की उत्पत्ति में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और जल्दी endosomes से परे परिवहन में । विशेष रूप से, हमने पाया कि annexin A2 जल्दी endosome के कोलेस्ट्रॉल समृद्ध क्षेत्रों को बांधता है, और spire1, nucleates F-actin बहुलकीकरण के साथ मिलकर । endosomes पर मनाया शाखाई actin नेटवर्क के गठन actin से संबंधित प्रोटीन (ARP) 2/3 जटिल की शाखाकरण गतिविधि की आवश्यकता है, साथ ही साथ एर्म प्रोटीन moesin और actin-बाध्यकारी प्रोटीन cortactin8,9।

यहां, हम वर्णन एक माइक्रोस्कोपी इन विट्रो परख कि nucleation और बहुलकीकरण के परीक्षण ट्यूबों में जल्दी endosomal झिल्ली पर एफ actin का पुनर्गठन आधारित है । इस परख पहले इस्तेमाल किया गया है F-actin nucleation में annexin A2 की भूमिका की जांच और moesin और cortactin के endosomal actin नेटवर्क8,9के गठन में । इसके साथ इन विट्रो प्रोटोकॉल, प्रतिक्रियाओं कि actin बहुलकीकरण के दौरान endosomes पर होने की जटिल श्रृंखला जैव रासायनिक और आणविक विश्लेषण करने के लिए उत्तरदायी बन प्रक्रिया के क्रमिक चरणों की, actin nucleation सहित, रैखिक बहुलकीकरण, बंटी, और crosslinking ।

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Protocol

< p class = "jove_title" > 1. समाधान और तैयारी

< p class = "jove_content" > नोट: सभी बफ़र्स और समाधान डबल-आसुत (dd) में तैयार किया जाना चाहिए H 2 O. क्योंकि सुक्रोज के जलयोजन राज्य बदलता है, सभी सुक्रोज समाधान के अंतिम एकाग्रता एक refractometer का उपयोग कर निर्धारित किया जाना चाहिए ।

  1. divalent के बिना फास्फेट बफर खारा तैयार cations (पंजाब-): १३७ मिमी नचि, २.७ मिमी KCl, १.५ मिमी KH 2 पो 4 , और ६.५ मिमी न 2 HPO 4 . ७.४ के लिए पीएच समायोजित करें । autoclaving द्वारा बंध्याकरण (1 चक्र पर १२१ & #176; ग के लिए 15 मिनट) और कमरे के तापमान पर स्टोर.
  2. ३०० mM imidazole के शेयर समाधान तैयार: ०.२०४ जी की 10 मिलीलीटर में imidazole के ddH 2 हे. पीएच को ७.४ पर 4 & #176; c एचसीएल का उपयोग कर समायोजित करें । फिल्टर-बंध्याकरण का प्रयोग एक ०.२२ & #956; मी पोरे साइज फिल्टर और स्टोर पर 4 & #176; ग.
  3. तैयार homogenization बफर (एचबी; तैयार लगभग १०० मिलीलीटर): २५० मिमी सुक्रोज में 3 मिमी imidazole. पीएच को ७.४ पर 4 & #176; C का उपयोग कर पीएच-मीटर समायोजित करें । फिल्टर-बंध्याकरण ०.२२ & #956 का प्रयोग; m पोरे आकार के फिल्टर और स्टोर पर 4 & #176; C. बस का उपयोग करने से पहले एचबी के पूरक 10 मिमी leupeptin, 1 मिमी pepstatin एक, और 10 एनजी/एमएल aprotinin.
    4. के लिए इसी अंतिम सांद्रता पर छेड़ने अवरोधकों के एक कॉकटेल के साथ
  4. चरण फ़्लोटिंग ग्रेडिएंट के लिए, ६२%, ३९%, और ३५% सुक्रोज समाधान 3 mM imidazole, pH ७.४, तैयार करें जैसा कि नीचे वर्णित है । ठीक एक refractometer. का उपयोग कर सभी सुक्रोज समाधान के अंतिम एकाग्रता का निर्धारण
    1. 3 एमएम imidazole, पीएच ७.४ में ६२% सुक्रोज सॉल्यूशन की १०० एमएल तैयार करते हैं । चमचे से भंग ८०.४ जी च्या सुक्रोज च्या ddH २ हे प्री-वार्म टू ३५ & #176; c. ३०० mM imidazole स्टॉक सॉल्यूशन के 1 मिलीलीटर जोड़ें और ddH 2 O के साथ १०० ml को भरें । 4 & #176 पर ७.४ को पीएच समायोजित करें; C. फ़िल्टर-एक ०.२२ & #956 का उपयोग कर निष्फल; m पोरे आकार फिल्टर और स्टोर पर 4 & #176; ग.
    2. 3 मिमी imidazole, पीएच ७.४ में ३५% सुक्रोज समाधान की १०० मिलीलीटर तैयार करते हैं । चमचे से भंग ४०.६ जी च्या सुक्रोज ddH २ हे. ३०० mM imidazole स्टॉक सॉल्यूशन की 1 मिलीलीटर जोड़ें और ddH 2 O के साथ १०० ml को भरें । पीएच को ७.४ पर 4 & #176; c. फिल्टर-बंध्याकरण का उपयोग कर एक ०.२२ & #956; मी पोरे साइज फिल्टर और स्टोर पर 4 & #176; C.
    3. 3 मिमी imidazole, पीएच ७.४ में ३९% सुक्रोज की ५० मिलीलीटर तैयार करते हैं । ३५% सुक्रोज समाधान के साथ ६२% सुक्रोज समाधान पतला । दुकान पर 4 & #176; ग.
  5. को भंग कर के 3 गाम के paraformaldehyde (पीएफए) के १०० मिलीलीटर में चमचे से-पूर्व-गरम करने के लिए ६० & #176; C जबकि 1 M NaOH dropwise जोड़ना; अंतिम पीएच को ७.४ NaOH का उपयोग कर समायोजित करें । फ़िल्टर-नसबंदी का उपयोग कर एक ०.२२-& #956; मी पोरे आकार फिल्टर और स्टोर पर-20 & #176; C.
    चेतावनी: 3% पीएफए एक विषाक्त एजेंट है ।
  6. 1 मीटर KCl स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करें । भंग ३.७३ KCl के ५० मिलीलीटर में सरगर्मी से ddH २ हे. फ़िल्टर-एक ०.२२ का उपयोग कर बंध्याकरण-& #956; m ताकना आकार फिल्टर और कमरे के तापमान पर स्टोर ।
  7. ०.६२५ मीटर Hepes युक्त 50X केंद्रित स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करता है जिसमें pH ७.० और ७५ mM MgOAc 2 में ddH 2 ओ. Aliquot और स्टोर पर-20 & #176; C.
  8. बढ़ते माध्यम तैयार करते हैं. चमचे से मिलाइये २.४ जी की पॉली (विनील अल्कोहल) M w ~ ३१,००० (PVA) के साथ 6 g with ग्लिसरॉल. ddH 2 O के 6 मिलीलीटर जोड़ें और कमरे के तापमान पर कम से 2 ज के लिए छोड़ दें । ०.२ मीटर Tris-सीएल (पीएच ८.५) और हीट लगभग ५३ & #176 के 12 मिलीलीटर जोड़ें-सामयिक सरगर्मी के साथ जब तक PVA भंग हो गया है ।
  9. ५,००० x जी में कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए केंद्रापसारक द्वारा समाधान स्पष्ट । supernatant को इकट्ठा करें और प्रतिदीप्ति डिटेक्शन के दौरान photobleaching को रोकने के लिए २.५% (w/v) 1, 4-diazabicyclo-[ -8] ऑक् सीजन (DABCO) जोड़ें । भंवर के बारे में 30 को भंग करने के लिए एस । Aliquot में १.५-एमएल प्लास्टिक ट्यूब और स्टोर पर-20 & #176; ग.
< p class = "jove_title" > 2. सेल कल्चर

  1. culture हेला cells in Dulbecco & #39; s संशोधित ईगल मध्यम 10% भ्रूण बछड़ा सीरम के साथ पूरक, 10% गैर-आवश्यक अमीनो एसिड, 10% L-glutamine, और 1% पेनिसिलिन-streptomycin. उन पर बनाए रखें ३७ & #176; ग में एक 5% सह 2 मशीनी.
  2. Transfect के साथ प्रयोग करने से पहले कोशिकाओं को 24 ज GFP-RAB5 < सुप वर्ग = "xref" > 10 , निर्माता के अनुसार कमर्शियल अभिकर्मक रिएजेंट का प्रयोग & #39; s निर्देश.
  3. जब जरूरत है, endosomal भागों और cytosol की एक प्रोटीन की घट कोशिकाओं से तैयार ( यानी, या RNAi का उपयोग कर CRISPR/Cas9) और/या ब्याज की प्रोटीन के एक wildtype या उत्परिवर्ती रूप व्यक्त ।
< p class = "jove_title" > 3. Endosomal अंश वडा

< p class = "jove_content" > नोट: इस प्रोटोकॉल endosomes और अन्य प्रकाश झिल्ली युक्त उपसेलुलर भागों की सीधी तैयारी का वर्णन. यदि आवश्यक हो, तो शुद्ध endosome अंशों का भी उपयोग किया जा सकता है < सुप वर्ग = "xref" > ११ . तैयार 2 पेट्री व्यंजन (10 सेमी बाहरी व्यास; ५७ सेमी 2 ) धाराप्रवाह कोशिकाओं के रूप में शुरू सामग्री GFP-RAB5 व्यक्त की । 2 पेट्री व्यंजन में धाराप्रवाह हेला कोशिकाओं की कुल संख्या लगभग २.५ x 10 7 कोशिकाओं से मेल खाती है । जब जरूरत हो, endosomes भी ब्याज की एक प्रोटीन की घट कोशिकाओं से तैयार किया जा सकता है ( यानी, का उपयोग RNAi या CRISPR/Cas9) और/या ब्याज के प्रोटीन के एक wildtype या उत्परिवर्ती फार्म का इजहार, हमेशा GFP-RAB5 व्यक्त.

< p class = "jove_content" > सावधानी: भिन्नीकरण प्रोटोकॉल के सभी कदम बर्फ पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए.

  1. एक फ्लैट बर्फ की बाल्टी में एक गीला धातु की थाली पर पेट्री व्यंजन जगह और तुरंत दो बार कोशिकाओं को धोने के साथ 5 बर्फ की मिलीलीटर-ठंड पंजाब-.
  2. सभी पंजाबियों-पिछले धोने से हटा दें और बर्फ के 3 मिलीलीटर-ठंडे पंजाब-प्रति पकवान जोड़ें । हैंडलिंग के दौरान कोशिकाओं को शुष्क नहीं करना चाहिए: यदि आवश्यक हो, एक चट्टानी मंच पर बर्फ की बाल्टी पर्याप्त तरल पदार्थ के साथ कोशिकाओं को कवर करने के लिए जगह है ।
  3. एक लचीले रबर पुलिसकर्मी ( यानी, घर का बना सेल खुरचना) का उपयोग करके पेट्री व्यंजन से पंजाब में कोशिकाओं को यांत्रिक रूप से निकालते हैं । डिश के बाहर के आसपास एक त्वरित, परिपत्र गति में पहले व्यंजन से कोशिकाओं को परिमार्जन, पकवान के बीच में एक नीचे गति के बाद । संलग्न कोशिकाओं के & #34; शीट्स & #34; प्राप्त करने के लिए धीरे से परिमार्जन करें । धीरे बर्फ पर एक 15 मिलीलीटर शंकु के लिए एक विस्तृत खोलने के साथ एक प्लास्टिक पाश्चर पिपेट का उपयोग कर कोशिकाओं को हस्तांतरण.
    4. 5 मिनट के लिए
  4. केंद्रापसारक पर १७५ x g और 4 & #176; C.
  5. धीरे supernatant (SN) को हटा दें और गोली को एचबी के 1-3 मिलीलीटर जोड़ें । एक व्यापक खोलने के साथ एक प्लास्टिक पाश्चर पिपेट का उपयोग करना, धीरे पिपेट ऊपर और नीचे एक बार कोशिकाओं reसस्पेंड करने के लिए ।
  6. केंद्रापसारक के लिए 7-10 मिनट पर १,३५५ x g और 4 & #176; C. धीरे से निकालें SN.
  7. परफॉर्म सैल homogenization.
    नोट: परिस्थितियां कोमल होनी चाहिए जिससे कोशिकाओं की प्लाज्मा झिल्ली टूट जाए लेकिन endosomes बरकरार रहें ।
    1. प्रत्येक कोशिका गोली पर छेड़ने अवरोधकों के साथ एचबी का एक ज्ञात मात्रा जोड़ें (लगभग १०० & #956; एल प्रति सेल गोली). एक १,०००-& #181 का उपयोग करना; L micropipette, धीरे पिपेट ऊपर और नीचे कोशिकाओं reसस्पैंड कर रहे हैं जब तक. नहीं एयर बुलबुले परिचय ।
    2. एक 22G सुई पूर्व एचबी के साथ कुल्ला और हवा या बुलबुले से मुक्त के साथ एक 1 मिलीलीटर ट्यूबरकुलिन सिरिंज तैयार करते हैं ।
    3. सेल निलंबन के साथ सिरिंज को भरने अपेक्षाकृत धीरे (हवा के बुलबुले बनाने से बचने के लिए), ट्यूब की दीवार के खिलाफ सुई के बेवल्ड टिप जगह है, और सेल निलंबन को निष्कासित तेजी से संलग्न कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली कतरनी करने के लिए ।
    4. का एक छोटा सा aliquot ले homogenate (लगभग 3 & #181; l) और उसे पतला करने के लिए ५० & #181; l एक गिलास स्लाइड पर एचबी का. मिश्रण और एक गिलास coverslip के साथ कवर । एक 20X या 40X उद्देश्य से सुसज्जित एक चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप के तहत homogenate का निरीक्षण ।
      नोट: इष्टतम स्थितियों के अंतर्गत, अधिकांश कक्ष टूट जाते हैं, लेकिन नाभिक, जो गहरे धूसर और गोल संरचनाओं के रूप में दिखाई देते हैं, (< सशक्त वर्ग = "xfig" > आरेख 1 ) नहीं हैं.
    5. दोहराएँ चरण 3.7.3 और 3.7.4 जब तक अधिकांश कक्ष भंग कर रहे हैं; आमतौर पर, 3-6 अप और डाउन सुई के माध्यम से स्ट्रोक आवश्यक हैं. प्रोटीन निर्धारण के लिए homogenate का छोटा aliquot (10-30 & #181; L) रखें ।
  8. केंद्रापसारक homogenate के लिए 7 मिनट पर १,३५५ x g और 4 & #176; ग.
    नोट: के बाद केंद्रापसारक, गोली (परमाणु गोली के रूप में परिभाषित; NP) में नाभिक और supernatant (postnuclear supernatant के रूप में परिभाषित है; पीएन) शामिल है cytosol और organelles पर जारी homogenization और नि: शुल्क निलंबन में ।
  9. जतन पीएन एकत्र करा. प्रोटीन निर्धारण के लिए पीएन और एनपी के छोटे aliquots (10-30 & #181; L) रखें और np को त्यागें.
  10. ४०.६% सुक्रोज को कमजोर सुक्रोज के साथ ६२% पीएन समाधान को समायोजित पीएन के एक 1:1.1 अनुपात का उपयोग करते हुए पीएन: 62% सुक्रोज । हवा के बुलबुले बनाने के बिना धीरे लेकिन अच्छी तरह से मिश्रण । refractometer.
    11. का उपयोग कर सुक्रोज एकाग्रता की जाँच करें
  11. पीएन को एक ultracentrifugation ट्यूब के नीचे ४०.६% सुक्रोज में रखें । ३५% सुक्रोज समाधान के २.५ मिलीलीटर के साथ ध्यान से ओवरले और एचबी के साथ केंद्रापसारक ट्यूब भरें ।
    नोट: सुक्रोज समाधान लेयर्ड होना चाहिए ताकि इंटरफ़ेस स्पष्ट रूप से दृश्यमान होते हैं ।
  12. Ultracentrifuge के लिए ढाल 1 ज पर & #160; & #820; १६५,००० x g र 4 & #176; ग.
  13. सावधानीपूर्वक ग्रैडिएंट के शीर्ष पर लिपिड की सफेद परत को हटा दें । अगला, endosomes युक्त अंतरफलक, एचबी और ३५% सुक्रोज के बीच, एक २००-& #956; L micropipette एक कट टिप के साथ का उपयोग कर लीजिए ।
    नोट: endosomal अंशों सीधे में इन विट्रो actin बहुलकीकरण परख में इस्तेमाल किया जा सकता है या बर्फ पर aliquoted जा सकता है, फ्लैश-तरल नाइट्रोजन में जमे हुए, और पर संग्रहित-८० & #176; ग.
  14. पीएन और endosomal अंश के प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण ।
    नोट: इस एकाग्रता में कम से १०० & #181; g/mL होना चाहिए । लगभग २.५ x 10 7 कोशिकाओं में उगाया 2 पेट्री व्यंजन के साथ एक पीएन प्राप्त करने के लिए आवश्यक है कम से १०० & #181; g/mL (नोट ऊपर देखें).
< p class = "jove_title" > 4. Cytosol वडा

< p class = "jove_content" > नोट: शुरू सामग्री के रूप में धाराप्रवाह कोशिकाओं के 2 पेट्री व्यंजन (10 सेमी व्यास; ५७ सेमी 2 हेला) तैयार करें । जब जरूरत हो, cytosol भी ब्याज की एक प्रोटीन की घट कोशिकाओं से तैयार किया जा सकता है ( यानी, का उपयोग RNAi या CRISPR/Cas9) और/या ब्याज की प्रोटीन के एक wildtype या उत्परिवर्ती रूप व्यक्त । endosome भिन्नीकरण प्रोटोकॉल के लिए के रूप में, सभी कदम बर्फ पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए.

  1. दोहराएँ चरण ३.१-३.८.
  2. एक केंद्रापसारक ट्यूब और ultracentrifuge में ४५ मिनट के लिए पीएन जगह पर & #820; २५०,००० x g और 4 & #176; C.
  3. ध्यान से शीर्ष पर सफेद परत को दूर करने और microsome गोली परेशान बिना SN (cytosol अंश) इकट्ठा । प्रोटीन निर्धारण के लिए cytosol अंश का एक aliquot रखें.
    नोट: cytosol सीधे में इन विट्रो actin बहुलकीकरण परख में इस्तेमाल किया जा सकता है या बर्फ पर aliquoted जा सकता है, फ्लैश-तरल नाइट्रोजन में जमे हुए, और पर संग्रहित-८० & #176; ग.
  4. cytosol के प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण.
    ध्यान दें: यह होना चाहिए कम से कम 3 मिलीग्राम/एमएल
< p class = "jove_title" > 5. परख मापने Endosome-आश्रित Actin बहुलकीकरण इन विट्रो

< p class = "jove_content" > नोट: Endosome-निर्भर Actin बहुलकीकरण दो वैकल्पिक तरीकों का उपयोग किया जा सकता है । पहले दृष्टिकोण में, सामग्री एक परीक्षण ट्यूब में मिश्रित कर रहे हैं, तय, और एक coverslip को हस्तांतरित और विश्लेषण किया । दूसरे दृष्टिकोण में, यहां वर्णित, परख सीधे इमेजिंग चैंबर में किया जा सकता है और स्थिर किया जा सकता है और यांत्रिक गड़बड़ी के बिना विश्लेषण (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 2c ). इस दूसरे दृष्टिकोण में, परख मिश्रण एक परीक्षण ट्यूब से एक coverslip को हस्तांतरित नहीं है और इस तरह बेफिक्र रहता है, एफ के खतरे को कम-actin शारीरिक रूप से स्थानांतरण के दौरान परेशान जा रहा है नेटवर्क । इसके अलावा, यह दूसरा दृष्टिकोण F-actin बहुलकीकरण के समय-चूक विश्लेषण के साथ संगत है । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि F-actin बहुलकीकरण के विश्लेषण में कोई अंतर या तो दृष्टिकोण के साथ मनाया गया ।
नोट: प्रोटोकॉल भर में कटौती युक्तियों का उपयोग करें.

  1. एक टेस्ट ट्यूब
    1. लिएर मिक्स आइस-कोल्ड शुद्धि GFP-RAB5 endosomes (स्टेप 3) विथ cytosol (स्टेप 4) एक आइस-कोल्ड १.५-एमएल शंकु टेस्ट ट्यूब में 1:10 (प्रोटीन एकाग्रता) के अनुपात में ।
      नोट: एक ठेठ प्रयोग लगभग ४० के साथ किया जाता है-५० & #181; L.
    2. १२५ mm KCl के अंतिम सांद्रता के लिए बर्फ ठंडा प्रतिक्रिया मिश्रण को समायोजित (1 मीटर KCl स्टॉक समाधान का उपयोग), १२.५ mm Hepes, और १.५ mm MgOAc 2 (50x स्टॉक समाधान का उपयोग) । फिर, 10 मिमी leupeptin, 1 मिमी pepstatin एक, और 10 एनजी/एमएल aprotinin के अंतिम सांद्रता के लिए टीज़ अवरोधकों के साथ मिश्रण को समायोजित करें । धीरे सभी घटकों को मिलाएं ।
    3. जगह परीक्षण ट्यूब पर प्रतिक्रिया मिश्रण युक्त ३७ & #176; सी, मिलाते हुए बिना, और इच्छित समय के लिए मशीन ।
      नोट: आमतौर पर, यह लगभग 3 मिनट लेने के लिए endosomes पर actin बहुलकीकरण का पता लगाने और एक व्यापक नेटवर्क के गठन के लिए 30 मिनट होगा ।
      4. वांछित समय पर
    4. ( यानी, 3 मिनट या 30 मिनट), बर्फ पर परीक्षण ट्यूब रखकर प्रतिक्रिया बंद करो और 1/10 (vol: vol) से ठंडा 3% पीएफए समाधान में जोड़ें ।
    5. जोड़ें 0.3:10 (vol: vol) की २०० इकाइयों/एमएल (~ ६.६ & #956; M) phalloidin संयुग्मित को लाल-नारंगी डाई को पॉलिमर actin दाग.
    6. जगह 12 & #956; l पर मिश्रण का 12 & #956; l एक माइक्रो ग्लास स्लाइड पर PVA बढ़ते मीडियम के. एक 18 x 18 मिमी 2 ग्लास coverslipon शीर्ष रखो ।
    7. फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ नमूना विश्लेषण.
  2. इमेजिंग चैंबर में
    1. सूक्ष्म इमेजिंग चैंबर बनाने के लिए, 1 मिनट के लिए प्लाज्मा क्लीनर का उपयोग एक दौर 18 मिमी व्यास coverslip और एक दौर ३५ मिमी व्यास पेट्री डिश एक 20 मिमी ग्लास नीचे (0.16-0.19 मिमी) से लैस साफ करने के लिए ।
    2. 1% & #946 के साथ साफ सतहों की मशीन;-कैसिइन ग्लास करने के लिए प्रोटीन बाध्यकारी को कम करने के लिए 20 मिनट के लिए । 3 मिमी imidazole.
      3. के साथ दो बार धो
    3. जोड़ें endosome और cytosol, चरणों में के रूप में एक ही परख मिश्रण में 5.1.1 और 5.1.2, एक ठंडा करने के लिए १.५ मिलीलीटर टेस्ट ट्यूब और पूरक परख मिश्रण के साथ ०.१ & #956; g/& #956; L rhodamine-actin.
    4. मिश्रण के अंतिम अपवर्तन सूचकांक को १.३७५ (२६.५% सुक्रोज) का उपयोग कर ३९% सुक्रोज समाधान को समायोजित करें ।
      नोट: सामान्यतया, एक ही वॉल्यूम जोड़ा जाता है; हालांकि, यह empirically फिर से संग्रहीत अंश की सुक्रोज एकाग्रता पर निर्भर करता है समायोजित किया जा करने के लिए, एक refractomer का उपयोग कर निर्धारित है, क्योंकि सुक्रोज एकाग्रता प्रयोग से थोड़ा प्रयोग करने के लिए बदल सकते हैं ।
    5. का इलाज ३५-mm डिश (step 5.2.1) पर मिश्रण को लगाएं और इसे 18-मिमी coverslip (step 5.2.1) के साथ कवर करें ।
    6. स्थान पर चैंबर ३७ & #176; ग, मिलाते हुए बिना.
    7. प्रतिदीप्ति फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग नमूना का विश्लेषण.
< p class = "jove_title" > 6. छवि एसीActin नेटवर्क की जांच और विश्लेषण

  1. छवि अधिग्रहण
    1. एक औंधा स्कैनिंग फोकल माइक्रोस्कोप पर छवियों का अधिग्रहण ।
      नोट: छवि अधिग्रहण सेटिंग्स एक 63X १.२५ ना तेल उद्देश्य के साथ एक औंधा स्कैनिंग फोकल माइक्रोस्कोप के लिए अनुकूलित किया गया । लेजर शक्ति को समायोजित (आमतौर पर लगभग ५०%) एक अच्छा संकेत करने वाली शोर अनुपात को प्राप्त करने के लिए ।
  2. ठहराव के actin नेटवर्क
    1. फ्लोरोसेंट माइक्रोग्राफ का विश्लेषण करते हैं. स्रोत सॉफ़्टवेयर CellProfiler (v 2.1.1) का उपयोग करें < सुप वर्ग = "xref" > १२ प्रति endosome actin की मात्रा मापने के लिए (वैकल्पिक सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल किया जा सकता है).
      1. पहले, endosomes GFP-RAB5 संकेत का उपयोग करते हुए प्राथमिक ऑब्जेक्ट के रूप में पहचान । फिर, एक द्वितीयक ऑब्जेक्ट के रूप में actin सिग्नल (red-ऑरेंज डाई संयुग्मित Phalloidin) के प्रचार-प्रसार का उपयोग करके व्यक्तिगत endosomes के साथ संबद्ध F-actin को बढ़ाता है ।
      2. औसत और नियंत्रण शर्त करने के लिए प्रत्येक ऑब्जेक्ट के लिए संबद्ध सामग्री की संख्या को सामान्य.

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Representative Results

जल्दी endosome झिल्ली पर एफ-actin पैच के गठन में अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए, हम चित्रा 2में उल्लिखित प्रोटोकॉल का पालन किया । संक्षेप में, कोशिकाओं GFP-RAB5 के साथ transfected थे और फिर जल्दी endosomes उपसेलुलर अंश द्वारा तैयार किया गया । ये शुद्ध जल्दी endosomes cytosol के साथ थे क्रम में actin के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अंय संभवतः प्रतिक्रिया में शामिल कारकों प्रदान करने के लिए । मशीन अवधि के अंत में, प्रतिक्रिया मिश्रण के निर्धारण के द्वारा रोका गया था । एक नमूना तो एकत्र किया गया था और एक सूक्ष्म स्लाइड पर जमा । अंत में, एफ-actin phalloidin (चित्रा 3) के साथ पता चला था । जल्दी endosomal झिल्ली पर एफ actin के nucleation के रूप में अच्छी तरह के रूप में बाद में बहुलकीकरण प्रक्रिया तेजी से हुई । दरअसल, एफ actin पहले से ही प्रतिक्रिया की शुरुआत के बाद 1min के भीतर endosomes पर कल्पना की जा सकता है (चित्र 3) ।  इन actin संरचनाओं, जो शुरू में कम थे, तेजी से लंबे समय तक बन गया, बंटी और एक दूसरे actin रेशा के एक बुने हुए नेटवर्क के गठन के लिए अग्रणी करने के लिए जुड़ा हुआ (चित्रा 3), संभवतः इन विट्रो में असंतुलित actin गतिशीलता को दर्शाती है. इसी तरह nucleation और बहुलकीकरण दरों जब परख बाहर शुद्ध rhodamine के साथ किया गया था actin सेल cytosol के अलावा लेबल देखा गया । यह ग्लास तली के बर्तन में किया गया था ताकि संरचनाओं सीधे छवि, किसी भी गड़बड़ी के अभाव में किया जा सकता है (चित्र बी) । यहां बताई गई परख में अर्ली endosomes nucleate डी नोवो actin बहुलकीकरण चुनिंदा. दरअसल, actin बहुलकीकरण तब उत्पंन नहीं हुआ जब इन विट्रो प्रतिक्रिया या तो endosomes या cytosol के अभाव में किया गया था । यह इस प्रकार निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि जल्दी endosomes मौलिक करने के लिए nucleation और बाद में बहुलकीकरण का समर्थन करने की क्षमता के अधिकारी actin रेशा9,11.

endosomes से बहुलक actin की राशि का विश्लेषण करने के लिए, छवियों अलग समय पर अधिग्रहीत CellProfiler (चित्र 4a) का उपयोग कर विश्लेषण किया गया. endosome प्रति actin पॉलिमर की मात्रा एक जल्दी endosome आसपास के actin के क्षेत्र के रूप में मापा गया था । इस प्रक्रिया की शुरुआत में actin बहुलकीकरण दर अधिक थी और समय के साथ घटी (चित्रा 4B) ।  actin नेटवर्क के प्रारंभिक समय में और अधिक विस्तार में विश्लेषण किया जा सकता है प्रतिक्रिया की शुरुआत के बाद अंक । इन प्रारंभिक समय-बिंदुओं पर, व्यक्तिगत actin-युक्त संरचनाओं को अभी भी एक दूसरे से विभेदित किया जा सकता है । actin नेटवर्क्स के जटिल संगठन का मूल्यांकन करने के लिए, प्रत्येक endosome से निकलने actin रेशा की संख्या (यानी, प्राथमिक रेशा) गिना गया था । इसी प्रकार, प्राथमिक रेशा (अर्थात, द्वितीयक रेशा) से उत्पन्न होने वाले actin रेशा की संख्या को गिना गया, साथ ही अन्य सभी actin तंतुओं की संख्या भी जो कि नेटवर्क्स में पहचानी जा सकती थी और जो endosomes से उत्पन्न नहीं हुई थी ( अर्थात, अन्य रेशा) (चित्रा 4c-इ. एक बार actin रेशा का पता लगा लिया गया था, जैसे अन्य मापदंडों, जैसे व्यक्तिगत actin रेशा की लंबाई और endosomes की संख्या एक ही actin रेशा से जुड़े, आसानी से गणना की जा सकती (चित्रा 4F).

Figure 1
चित्र 1: एक हेला कक्ष Homogenate के चरण कंट्रास्ट Micrograph. homogenization के बाद, निकालने एक सूक्ष्म स्लाइड और एक coverslip के बीच बढ़ गया था । प्रकाशन के लिए, माइक्रोग्राफ तेल विसर्जन के बाद एक 100X उद्देश्य के साथ कब्जा कर लिया गया । नियमित निरीक्षण के लिए, तथापि, सेल निकालने एक 20X या तेल विसर्जन के बिना एक 40X उद्देश्य के तहत कल्पना की थी । homogenate के उच्च आवर्धन दृश्यों के दो उदाहरण (A-B) दिखाए गए हैं । नाभिक (स्टार) रंग में गोल संरचनाओं डार्क ग्रे के रूप में दिखाई देते हैं, बिना संलग्न सेल अवशेष । अलग आकार, आकार, और translucence, जो सेल homogenization पर जारी कर रहे है और intracellular सामग्री (यानी, organelles) के अनुरूप के लक्षण granules को तीर बिंदु । स्केल बार = 10 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध प्रस्तुतिकरण. endosomal अर्क (A) और cytosol अर्क (B) तैयार करने के लिए उपयोग किए गए प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध वर्णन और इन विट्रो (C) में endosomes से actin बहुलकीकरण पर नजर रखने के लिए. Supernatant (एसएन), homogenization बफर (एचबी), postnuclear Supernatant (पीएन), परमाणु गोली (एनपी), और paraformaldehyde (पीएफए) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: Nucleation और बहुलकीकरण के जल्दी Endosomes पर F-actin इन विट्रो. (क) हेला कोशिकाओं से Endosomes शुद्धि GFP-Rab5 (हरा) और हेला cytosol अलग से तैयार की गई. परख में, अर्ली endosomes (ईज) cytosol के साथ मिलाया गया था, और मिश्रण संकेत बार के लिए मशीन था । मिश्रण तो तय हो गया था, phalloidin के साथ लेबल (लाल) के लिए लेबल एफ actin, और प्रतिदीप्ति फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण किया । सलाखों: 10 µm (शीर्ष पैनल) और 5 µm (नीचे पैनल) । (ख) ईज शुद्धि हेला कोशिकाओं से GFP-Rab5 (हरा) और हेला cytosol को अलग से तैयार किया गया. इन कोशिकाओं के अर्क शुद्ध rhodamine-actin (लाल) खुर्दबीन चैंबर में संकेत समय के लिए और फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण किया गया के साथ मशीन थे । स्केल बार = 10 µm. (C) प्रयोग Aके रूप में किया गया था । हेला cytosol (ईज के बिना) और हेला endosomes (हरा) GFP के साथ लेबल-Rab5 (बिना cytosol) अलग से (बाएं और मध्य पैनलों) या एक साथ (सही पैनल) के लिए 30 मिनट, तय, phalloidin के साथ लेबल (लाल) लेबल के लिए एफ-actin, और द्वारा विश्लेषण किया गया प्रतिदीप्ति फोकल माइक्रोस्कोपी । स्केल बार = 10 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: Actin नेटवर्क का विश्लेषण. (क) CellProfiler विश्लेषण का कार्यप्रवाह. (B) बहुलक actin की संख्या CellProfiler सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके endosomes की संख्या के सापेक्ष मात्रा की गई थी । डेटा माध्य ± s.e.m. (n = 3) हैं । डेटा का अर्थ है ± s.d. (n = 3) । 5 min बनाम 15 min (ns p= ०.०७३६), 5 min बनाम 30 min (* P = ०.०१९५), और 15 min बनाम 30 min (ns p = ०.३१२९). (ग)अर्ली endosomes (ईज) हेला कोशिकाओं से शुद्ध GFP एक्सप्रेस-Rab5 और हेला cytosol अलग से तैयार किए गए थे, और परख चित्रा 2aके रूप में किया गया था । नमूने 7 मिनट के बाद तय किए गए । मध्य पैनल एक ही micrograph से पता चलता है, F-actin संरचनाओं के निशान के ओवरलैप के साथ ImageJ सॉफ्टवेयर के NeuronJ प्लगइन13 का उपयोग कर तैयार । सही पैनल केवल निशान दिखाता है । स्केल बार = 10 µm. (D) ImageJ सॉफ़्टवेयर के साथ ठहराव में उपयोग किए गए F-actin संरचना क्रमांकन अनुक्रम का प्रतिनिधित्व करते हैं । (E) actin रेशा की संख्या का ठहराव, जैसा कि सी-डीमें परिभाषित किया गया है । डेटा का अर्थ है ± s.d. (n = 3) । प्राथमिक शाखाओं बनाम माध्यमिक शाखाओं (एन एस पी = ०.५२६२), अंय शाखाओं बनाम माध्यमिक शाखाओं (एन एस पी = ०.६८१५), और अंय शाखाओं बनाम प्राथमिक शाखाओं (एन एस पी = ०.२२५४) । (च) एफ-actin संरचनाओं की लम्बाई और ईज ऑफ actin स्ट्रक्चर की संख्या को अन्य मापदंडों के उदाहरण के रूप में दर्शाया गया है, जिनकी तुलना में सी-डीमें परिभाषित ठहराव के साथ विश्लेषण किया जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

Actin endosome झिल्ली गतिशीलता4,14में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । हम पहले की सूचना है कि actin nucleation और बहुलकीकरण जल्दी endosomes पर होते हैं, छोटे F-actin पैच या नेटवर्क बनाने । इन एफ actin नेटवर्क बिल्कुल गिरावट मार्ग के साथ जल्दी endosomes परे झिल्ली परिवहन के लिए आवश्यक हैं । इस nucleation और बहुलकीकरण प्रक्रिया के किसी भी कदम में हस्तक्षेप endosome परिपक्वता को रोकता है और इस प्रकार देर endosomes andlysosomes9,11,15की ओर परिवहन बहाव । विशेष रूप से, हम जल्दी endosomes पर एफ actin बहुलकीकरण के क्रमिक चरणों का विश्लेषण करने के लिए और आणविक स्तर पर प्रक्रिया को चिह्नित करने के लिए ऊपर वर्णित परख का इस्तेमाल किया.

इन प्रयोगों में, जल्दी endosomes GFP के साथ लेबल कर रहे हैं-RAB5 vivo में, उपसेलुलर अंश से शुद्ध, और cytosol की उपस्थिति में एक परीक्षण ट्यूब में मशीन एफ के लिए अनुमति देने के लिए-actin इन विट्रोबहुलकीकरण. वांछित समय पर, प्रतिक्रिया बंद कर दिया है और प्रतिक्रिया मिश्रण प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण के लिए एक सूक्ष्म स्लाइड पर स्थानांतरित कर रहा है, phalloidin का उपयोग करने के लिए एफ-actin लेबल. इस प्रायोगिक कार्यनीति का प्रयोग करते हुए हमने दिखाया कि annexin A2 के nucleation के लिए आवश्यक है, जल्दी endosomes पर actin, SPIRE1 के साथ मिलकर, जबकि ARP2/3 मध्यस्थों f-actin शाखाओं में, अपेक्षित रूप से । हम यह भी पता चला है कि moesin और cortactin F-actin नेटवर्क के गठन के लिए आवश्यक है कि मध्यस्थता ECV/MVB की गिरावट मार्ग के साथ उत्पत्ति और परिपक्वता के साथ स्तनधारी कोशिकाओं9,11.

यह ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है कि, हालांकि ectopically व्यक्त की निंन स्तर RAB5 किसी भी महत्वपूर्ण हद तक endosomes बदल नहीं है10, इस छोटे से GTPase जल्दी endosome झिल्ली गतिशीलता के एक प्रमुख नियामक है16,17 . कुछ प्रयोगों में, यह इसलिए उपयुक्त हो सकता है वैकल्पिक प्रोटोकॉल का उपयोग परख में endosomes लेबल । उदाहरण के लिए, जल्दी endosomes आसानी से इस तरह के एपिडर्मल वृद्धि कारक या कैल्सीटोनिन4,14के रूप में endocytosed फ्लोरोसेंट अनुरेखक, का उपयोग कर लेबल किया जा सकता है ।

यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि यह पारंपरिक फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ छवि व्यक्तिगत actin रेशा करने के लिए तकनीकी रूप से मुश्किल है । इसलिए, हम endosomes पर actin नेटवर्क का वर्णन करने के लिए पाठ भर में एफ actin संरचनाओं को देखें । एक परिणाम के रूप में, हमें लगता है कि एक एफ actin नेटवर्क के गठन के बजाय उनकी तीव्रता नेटवर्क के प्रतिदीप्ति सतह क्षेत्र को मापने के द्वारा और अधिक सही मात्रा जा सकता है ।

यह पूरी तरह से संभावना है कि actin nucleation गतिविधि इन विट्रो में मनाया कुछ अंय संरचना या organelle है कि शुद्धि के दौरान RAB5 endosomes के लिए बाध्य रहता है द्वारा मध्यस्थता है बाहर शासन करने के लिए आसान नहीं है । हालांकि, इस तरह के संदूषण अत्यधिक संभावना नहीं है । जबकि कुछ organelles समान भौतिक गुणों के कारण ग्रेडिएंट पर शुद्ध होते हैं, लेकिन शुद्धिकरण के बाद वे एक दूसरे के लिए मात्रात्मक रूप से आबद्ध नहीं रहते हैं । इसके अलावा, actin nucleation गतिविधि सख्ती से annexin A24,14है, जो RAB514युक्त जल्दी endosomes पर मौजूद है पर निर्भर करता है । अंत में, हम पाते है कि F-actin संरचनाओं चुनिंदा vivo में RAB5 endosomes के साथ जुड़े रहे हैं और अन्य endosomes या अन्य सेलुलर झिल्ली पर4,14पर नहीं पाए जाते हैं. अंत में, actin nucleation गतिविधि RAB5 endosomes के साथ सबसे अधिक संभावना है, क्योंकि यह गतिविधि सह-शुद्धि और RAB5 endosomes के साथ सह-स्थानीयकृत है ।

इस परख में, बहुत अंय परख कि जटिल जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं कि endosomes16 या अंय झिल्ली18 की गतिशीलता नियंत्रण और है कि एक परीक्षण ट्यूब में प्रदर्शन कर रहे है पुनर्गठन में पसंद है, यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि तैयारी के सेलुलर निष्कर्षों इष्टतम है । कोशिकाओं को कोमल परिस्थितियों में homogenized के लिए endosomes और अंय organelles, विशेष रूप से नाभिक और lysosomes को नुकसान सीमा होनी चाहिए । इसके अलावा, endosome भागों शर्तों के तहत बर्फ पर रखा जाना चाहिए कि परासरणी और ईओण तनाव को कम करने, साथ ही सहज actin बहुलकीकरण । अतिरिक्त, अपेक्षाकृत उच्च सांद्रता में endosome अंश (≥ ०.१ mg/एमएल) और cytosol (≥ 3 mg/एमएल) के लिए पर्याप्त F-actin बहुलकीकरण पर endosomes और पता लगाना, के रूप में क्रमशः चरणों ३.१३ और ४.४ में इंगित करने के लिए आवश्यक हैं । इसी प्रकार, cytosol (प्रोटीन: प्रोटीन), endosome के 1:10 अनुपात के साथ परख करने के लिए महत्वपूर्ण है के रूप में कदम 5.1.1 में संकेत दिया । अंत में, pipetting के बाद actin बहुलकीकरण (यानी, पीएफए और phalloidin जोड़ने के लिए) बहुत धीरे से बचने के लिए या टूट actin नेटवर्क को तोड़ने के लिए किया जाना चाहिए ।

यदि आवश्यक हो, इन विट्रो actin बहुलकीकरण परख भी सीधे एक माइक्रोस्कोप इमेजिंग चैंबर में किया जा सकता है, शुद्ध rhodamine जोड़ने के बाद परख मिश्रण करने के लिए actin, perturbations नेटवर्क के यांत्रिक actin को सीमित करने के लिए बहुलक पर endosomes (चरण 5.2.3 और चित्रा 2देखें). इस मामले में, यह २६.५% (०.८५ मीटर) सुक्रोज (१.३७५ के अपवर्तन सूचकांक), प्रसार और Brownian की तरह गति (कदम 5.2.3) सीमित करने के लिए निकालने को समायोजित करने के लिए, और उपयोग करने से पहले actin द्वारा शुद्ध rhodamine-ultracentrifugation के संभावित समुच्चय को दूर करने के लिए सबसे अच्छा है । हमारी टिप्पणियों है कि moesin एफ के गठन नियंत्रण endosomes पर actin नेटवर्क पूरी तरह से हमारे परख4,14के इस वैकल्पिक संस्करण का उपयोग कर रहे थे recapitulated ।

हमारे प्रोटोकॉल का या तो संस्करण, परीक्षण ट्यूब में या इमेजिंग चैंबर में, एफ के एक वैश्विक विश्लेषण के लिए इष्टतम है-actin nucleation और बहुलकीकरण पर endosomes. हालांकि, इस दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए समय के माध्यम से actin बहुलकीकरण प्रक्रिया का पालन करने के लिए आसान नहीं है, भाग में क्योंकि endosomes मोबाइल नहीं हैं । नतीजतन, व्यक्तिगत रेशा के विकास पर नजर रखने के लिए आसान नहीं है और इस तरह actin नेटवर्क के इतिहास का निर्धारण करने के लिए । उदाहरण के लिए, यह crosslinking से भेदभाव एफ actin शाखाओं में मुश्किल हो सकता है । हालांकि, हमें विश्वास है कि शर्तों एफ-actin बहुलकीकरण वास्तविक समय में निगरानी करने के लिए स्थितियों को अनुकूलित करने के लिए endosomes स्थिर द्वारा इमेजिंग चैंबर में सुधार किया जा सकता है । इसी तरह, यह कृत्रिम झिल्ली से शुद्ध घटकों का उपयोग कर एफ-actin बहुलकीकरण पर नजर रखने के लिए दिलचस्प हो जाएगा । वास्तव में, हम पहले से पता चला है कि एफ actin nucleation और बहुलकीकरण liposomes पर बाध्यकारी टी के बाद हो सकता हैवह nucleation फैक्टर annexin A2 पर liposome bilayer11। इस रणनीति को और अधिक विशिष्ट लिपिड और एफ-actin nucleation और बहुलकीकरण प्रक्रिया में प्रोटीन की भूमिका टुकड़े और ंयूनतम actin झिल्ली पर एक एफ endosomal नेटवर्क बनाने के लिए आवश्यक घटकों को चिह्नित करने के लिए उपयोगी होगा । अंत में, हम मानते है कि इस रणनीति endosome झिल्ली पर होने वाले अंय एफ actin-निर्भर प्रक्रियाओं, विशेष रूप से भर्ती और retromer के जमावड़े और धोने मशीनरी का अध्ययन करने के लिए बहुत उपयोगी हो जाएगा ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

समर्थन स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन से प्राप्त किया गया था; स्विस Sinergia कार्यक्रम; पोलिश-स्विस अनुसंधान कार्यक्रम (पीएसपीबी-094/ रासायनिक जीवविज्ञान में NCCR; और स्विस SystemsX.ch पहल से LipidX, स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा मूल्यांकन (जे. जी.) । ओ. एम. एक EMBO दीर्घकालिक फैलोशिप (ALTF-516-2012) द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Sigma-Aldrich 71380
KCl Acros Organics 196770010
KH2PO4 AppliChem A1042
Na2HPO4 Acros Organics 424370025
Hepes AppliChem A3724
Magnesiun acetate tetrahydrate Fluka 63047
Dithiothreitol (DTT) AppliChem A2948
Imidazole Sigma-Aldrich 10125
NaOH Fluka 71690
Sucrose Merck Millipore 107687
Leupeptin Roche 11017101001
Pepstatin Roche 10253286001
Aprotinin Roche 10236624001
Paraformaldehide Polysciences. Inc 380
Alexa Fluor 555 phalloidin Molecular Probes A34055
Actin rhodamine Cytoskeleton. Inc APHR-A
Mowiol 4-88 Sigma-Aldrich 81381 poly(vinyl alcohol), Mw ~31 000
DABCO Sigma-Aldrich D-2522
Tris-HCl AppliChem A1086
β-casein Sigma-Aldrich C6905
Filter 0.22 μm Millex SL6V033RS
Round 10 cm dishes for cell culture Thermo Fisher Scientific 150350
Plastic Pasteur pipette Assistent 569/3 40569003
15-mL polypropylen tube TPP 91015
Hypodermic Needle 22G Black 30mm BD Microlance 300900
Sterile Luer-slip 1mL Syringes without needle BD Plastipak 300013
Micro glass slides Assistent 2406
18 x 18-mm glass coverslip Assistent 1000/1818
SW60 centrifuge tube Beckman coulter 344062
TLS-55 centrifuge tube Beckman coulter 343778
200-μL yellow tip Starlab S1111-0706
1,000-μL Blue Graduated Tip Starlab S1111-6801
1.5-mL test tube Axygen MCT-175-C 311-04-051
18-mm diameter round coverslip Assistent 1001/18
35-mm diameter round dish with a 20-mm glass bottom (0.16 - 0.19 mm) In vitro Scientific D35-20-1.5-N
Refractometer Carl Zeiss 79729
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Sorvall WX80 Ultracentrifuge Thermo Fisher Scientific 46900
Tabletop ultracentrifuge Beckman coulter TL-100
SW60 rotor Beckman coulter 335649
TLS-55 rotor Beckman coulter 346936
Confocal microscopy Carl Zeiss LSM-780
Fugene HD transfection reagent Promega E2311
Protein assay reagent A Bio-Rad 500-0113
Protein assay reagent B Bio-Rad 500-0114
Protein assay reagent S Bio-Rad 500-0115
Cell scraper Homemade Silicone rubber piece of about 2 cm, cut at a very sharp angle and attached to a metal bar or held with forceps
Refractometer Carl Zeiss
Minimum Essential Medium Eagle (MEM) Sigma-Aldrich M0643
FCS Thermo Fisher Scientific 10270-106
MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) Thermo Fisher Scientific 11140-035
L-Glutamine Thermo Fisher Scientific 25030-024
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140-122
pH Meter 691 Metrohm
ImageJ software NIH, Bethesda MD

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References

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जैव रसायन अंक १२६ Actin endosome RAB5 cytoskeleton यातायात इन विट्रो परख
इन <em>विट्रो</em> बहुलकीकरण के F प-actin पर जल्दी Endosomes
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Muriel, O., Scott, C. C., Larios, J., Mercier, V., Gruenberg, J. In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes. J. Vis. Exp. (126), e55829, doi:10.3791/55829 (2017).

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