Summary
Tidlig endosome funksjoner avhenger av F-utgangen polymerisasjon. Her beskriver vi en mikroskopi-basert i vitro analysen som rekonstruerer nucleation og polymerisering av F-utgangen på tidlig endosomal membraner i test-rør, dermed gjengi dette komplekse rekke reaksjoner mottakelig for biokjemiske og genetiske manipulasjoner.
Abstract
Mange tidlige endosome funksjoner, spesielt Last protein sortering og membran deformasjon, avhengig av flekker av kort F-utgangen filamenter nucleated på endosomal membranen. Vi har etablert en mikroskopi-basert i vitro analysen som rekonstruerer nucleation og polymerisering av F-utgangen på tidlig endosomal membraner i test-rør, dermed gjengi dette komplekse rekke reaksjoner mottakelig for genetiske og biokjemiske manipulasjoner. Endosomal fraksjoner tilberedes av floatation i sukrose forløpninger fra celler uttrykke tidlig endosomal protein GFP-RAB5. Cytosolic fraksjoner tilberedes fra separate grupper av celler. Både endosomal og cytosolic fraksjoner kan lagres frosset i flytende nitrogen, hvis nødvendig. I analysen, endosomal og cytosolic fraksjoner blandes og blandingen er ruges på 37 ° C under riktige forhold (f.eks ioniske styrke, redusere miljø). Samtidig ønsket reaksjonsblandingen er fast, og F-utgangen er avslørt med phalloidin. Utgangen nucleation og polymerisasjon analyseres deretter av fluorescens mikroskopi. Her rapporterer vi at denne analysen kan brukes til å undersøke hvilken rolle faktorer som er involvert i utgangen nucleation membranen eller i påfølgende forlengelse, forgrening eller crosslinking av F-utgangen filamenter.
Introduction
I høyere eukaryote celler, er proteiner og lipider internalisert i tidlig endosomes der sortering oppstår. Noen proteiner og lipider, som er forutbestemt til å være reutilized, er innlemmet i rørformede regioner av tidlig endosomes og deretter transportert til plasma membranen eller trans-Golgi nettverk (TGN)1,2. Andre proteiner og lipider pakkes derimot selektivt i områder av tidlig endosomes som viser en multivesicular utseende. Disse regionene utvide og på løsgjøring fra tidlig endosomal membraner, til slutt moden til gratis endosomal bærer blemmer eller multivesicular organer (ECV/MVBs), som er ansvarlig som mot slutten endosomes1, 2.
Utgangen spiller en avgjørende rolle i membranen remodeling prosessen knyttet endosomal sortering kapasitet og endosome biogenesis. Protein sortering langs resirkulering veiene plasma membranen eller TGN avhenger retromer komplekse og tilhørende proteiner. Dette sortering maskiner synes å være knyttet til dannelsen av resirkulering tubuli via samhandling retromer komplekset, med VEPS og Scar homologue (vask) komplekse og forgrenede begrepsordbok3,4,5 . Derimot molekyler skjebnebestemt til fornedrelse, spesielt aktivert signalnettverk reseptorer, sorteres i intraluminal blemmer (ILVs) av endosomal sortering komplekser kreves for transport (ESCRT)2,6, 7. Mens mulige rolle begrepsordbok i ESCRT-avhengige sortering prosessen ikke er kjent, spiller F-utgangen en viktig rolle i biogenesis av ECV/MVBs og transport utover tidlig endosomes. Spesielt fant vi at annexin A2 binder kolesterol-beriket regioner av tidlig endosome, og spire1, nucleates F-utgangen polymerisasjon. Dannelsen av forgrenede begrepsordbok nettverket observert på endosomes krever forgrening aktiviteten til utgangen-relaterte protein (ARP) 2/3 kompleks, samt ERM protein moesin og utgangen-bindende protein cortactin8,9.
Her beskriver vi en mikroskopi-basert i vitro analysen som rekonstruerer nucleation og polymerisering av F-utgangen på tidlig endosomal membraner i test-rør. Denne analysen er brukt tidligere å undersøke rollen til annexin A2 i F-utgangen nucleation og moesin og cortactin i dannelsen av endosomal utgangen nettverk8,9. Med denne i vitro protokollen blir de komplekse reaksjoner som oppstår på endosomes under begrepsordbok polymerisasjon mottakelig for biokjemiske og molekylære analyse av de sekvensielle trinnene av prosessen, inkludert begrepsordbok nucleation, lineær polymerisasjon forgrening og crosslinking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. løsninger og forberedelser
Merk: alle buffere og løsninger bør være forberedt i dobbel-destillert (dd) H 2 O. Fordi hydration delstaten sukrose varierer, siste konsentrasjonen av alle sukrose løsninger må bestemmes ved hjelp av en refractometer.
- Forberede fosfat-bufret saline uten divalent kasjoner (PBS-): 137 mM Born, 2.7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4 og 6.5 mM Na 2 HPO 4. Justere pH 7,4. Sterilisere av autoklavering (1 syklus ved 121 ° C i 15 min) og lagre ved romtemperatur.
- Forberede lager løsning av 300 mM imidazole: 0.204 g imidazole i 10 mL av ddH 2 O.Adjust pH 7,4 på 4 ° C bruker HCl. Filter-sterilisere bruker en 0.22 μm pore størrelse filter og lagre på 4 ° C.
- Forberede homogenisering buffer (HB; forberede ca 100 mL): 250 mM sukrose i 3 mM imidazole. Justere pH 7,4 på 4 ° C med en pH-meter. Filter-sterilisere bruke filtere 0.22 μm pore størrelse og lagre på 4 ° C. supplement på HB like før bruk med en cocktail av proteasehemmere i siste konsentrasjoner tilsvarer 10 mM leupeptin, 1 mM pepstatin A og 10 ng/mL aprotinin.
- For trinn floatation graderinger, forberede 62%, 39% og 35% sukrose løsninger i 3 mM imidazole, pH 7.4, som beskrevet nedenfor. Nøyaktig bestemme endelige konsentrasjonen av alle sukrose løsninger ved hjelp av en refractometer.
- Forberede 100 mL 62% sucrose løsning i 3 mM imidazole, pH 7.4. Oppløsning ved røring 80,4 g av sukrose i ddH 2 O pre oppvarmet til 35 ° C. Legg 1 mL av 300 mM imidazole lagerløsning og fyll til 100 mL med ddH 2 O. justere pH 7,4 på 4 ° C. Filter-sterilisere bruker 0.22 μm pore størrelse filter og store på 4 ° C.
- Forberede 100 mL 35% sucrose løsning i 3 mM imidazole, pH 7.4. Oppløses av stirring 40.6 g av sukrose i ddH 2 O. legge 1 mL av 300 mM imidazole lager løsning og fyll til 100 mL med ddH 2 O. justere pH 7,4 på 4 ° C. Filter-sterilisere med en 0.22 μm pore størrelse filter og lagre på 4 ° C.
- Forberede 50 mL av 39% sukrose i 3 mM imidazole, pH 7.4. Fortynne 62% sukrose løsningen med 35% sukrose løsning. Butikken på 4 ° C.
- Oppløse 3 g av paraformaldehyde (PFA) ved røring i 100 mL PBS-pre-warmed til 60 ° C legger 1 M NaOH dropwise; justere siste pH 7,4 bruker NaOH. Filter-sterilisere bruke filtere 0.22-μm pore størrelse og lagre på -20 ° C.
FORSIKTIG: 3% PFA er en giftig reagens. - Forberede 1 M KCl lagerløsning. Oppløse 3,73 g KCl ved røring i 50 mL av ddH 2 O. Filter-sterilisere bruke filtere 0.22-μm pore størrelse og lagre ved romtemperatur.
- Forberede 50 X konsentrert lager løsning som inneholder 0.625 M Hepes på pH 7.0 og 75 mM MgOAc 2 i ddH 2 O. Aliquot og store på -20 ° C.
- Forberede montering medium. Bland ved røring 2.4 g poly(vinyl alcohol) M w ~ 31.000 (PVA) med 6 g glyserol. Legge til 6 mL av ddH 2 O og la i minst 2 timer ved romtemperatur. Legge til 12 mL 0,2 M Tris-Cl (pH 8.5) og varme ca 53 ° c med sporadisk røring til PVA har oppløst.
- Avklare løsningen med sentrifugering 5000 x g for 20 min ved romtemperatur. Samle nedbryting og legge til 2,5% (w/v) 1,4 - diazabicyclo-[2.2.2] oktan (DABCO) for å forhindre photobleaching under fluorescens gjenkjenning. Vortex for om 30 å oppløse. Aliquot 1.5-mL plast rør og butikk på -20 ° C.
2. Celle kultur
- kultur HeLa celler i Dulbecco ' s endret Eagle Medium med 10% fosterets kalv serum, 10% ikke-essensielle aminosyrer, 10% L-glutamin, og 1% penicillin-streptomycin. Opprettholde dem på 37 ° C i en 5% CO 2 inkubator.
- Transfect cellene 24 timer før forsøket med GFP-RAB5 10, bruke kommersielle transfection reagens ifølge produsenten ' s instruksjoner.
- Ved behov, forberede endosomal brøker og stoffer fra celler utarmet av et protein av interesse (dvs. bruker RNAi eller CRISPR/Cas9) og/eller overexpressing en wildtype eller mutant form av proteinet rundt.
3. Endosomal brøkdel forberedelse
Merk: denne protokollen beskriver enkel utarbeidelsen av subcellular brøker som inneholder endosomes og andre lette membraner. Om nødvendig kan også renset endosome fraksjoner brukte 11. Forberede 2 Petri retter (10 cm ytre diameter, 57 cm 2) av confluent celler uttrykke GFP-RAB5 som starter materiale. Totalt antall confluent HeLa celler i 2 Petri retter tilsvarer omtrent 2,5 x 10 7 celler. Når nødvendig, endosomes kan også tilberedes fra celler utarmet av et protein av interesse (dvs. bruker RNAi eller CRISPR/Cas9) og/eller overexpressing en wildtype eller mutant form av protein av interesse, alltid uttrykke GFP-RAB5.
forsiktig: alle trinn av fraksjoneres protokollen skal utføres på ice.
- Sett Petri retter på en våt metallplate i en flat is bøtte og vasker cellene to ganger med 5 mL av iskalde PBS-.
- Fjerne alle PBS - fra siste vask og legge 3 mL iskald PBS-per fat. Celler bør ikke tørr under håndtering: eventuelt plassere is bøtte på en rocking plattform å dekke tilstrekkelig celler med væske.
- Mekanisk fjerne celler i PBS fra Petri retter med en fleksibel gummi politimann (dvs. hjemmelaget celle skraper). Skrape cellene av rettene først i en rask, sirkulær bevegelse rundt utsiden av fatet, etterfulgt av en nedadgående bevegelse i fatet. Skrape forsiktig å få " ark " med tilknyttede celler. Forsiktig overføre cellene med en plastikk Pasteur pipe med en stor åpning til en 15-mL konisk polypropylen tube på ice.
- Sentrifuger i 5 min på 175 x g og 4 ° C.
- Forsiktig fjerne nedbryting (SN) og Legg til 1-3 mL HB pellet. Bruker en plast Pasteur pipette med en stor åpning, forsiktig Pipetter opp og ned én gang for å resuspend cellene.
- Sentrifuge for 7-10 minutter til 1,355 x g og 4 ° C. forsiktig fjerne SN.
- Utføre celle homogenisering.
Merk: Forhold bør være forsiktig slik at plasma membraner cellene brytes, men endosomes forblir intakt.- Legg til et kjent volum av HB med proteasehemmere på hver celle pellet (ca 100 μL per celle pellet). Bruker 1000-µL brønnene, forsiktig Pipetter opp og ned til cellene er resuspended. ikke introdusere luftbobler.
- Forberede en 1-mL tuberkulin sprøyte med en 22G nål pre skylles med HB og luft eller bobler.
- Fylle sprøyten med cellen suspensjon relativt langsomt (for å unngå å opprette luftbobler), plassere skrå nålen mot veggen av røret og utvise celle suspensjon raskt å skjære av plasma membraner av tilknyttede cellene.
- Ta en liten aliquot av homogenate (ca. 3 µL) og fortynne den i 50 µL av HB på et glass lysbilde. Mix og dekket med et glass dekkglassvæske. Kontroller homogenate under fase kontrast mikroskop utstyrt med en 20 X eller 40 X målet.
Merk: Under optimale forhold, de fleste cellene er brutt, men kjerner, som vises som mørk grå og runde strukturer, ikke ( figur 1). - Gjenta trinn 3.7.3 og 3.7.4 til de fleste cellene brytes, vanligvis 3-6 opp slag gjennom nålen er nødvendig. Holde en liten aliquot (10-30 µL) av homogenate for protein besluttsomhet.
- Sentrifuge homogenate i 7 min 1,355 x g og 4 ° C.
Merk: etter sentrifugering, pellet (definert som den kjernefysiske pellet; NP) inneholder kjerner og nedbryting (definert som postnuclear nedbryting; PNS) inneholder stoffer og organeller utgitt ved homogenisering og i gratis suspensjon. - Samle nøye PNS. Holde små dele (10-30 µL) PNS og NP for protein vilje og forkaste NP.
- Juster PNS til 40,6% sukrose fortynne 62% sukrose løsningen med PNS bruker 1:1.1 forholdet PNS:62% sukrose. Bland forsiktig men grundig, uten luftbobler. Sjekk sukrose konsentrasjonen med refractometer.
- Sett PNS i 40,6% Sukrose på bunnen av en ultracentrifugation. Overlegg med 2,5 mL av 35% sukrose løsningen og fylle sentrifuge røret med HB.
Merk: Sukrose løsninger skal være lagvis slik at grensesnitt er klart synlig. - Ultracentrifuge graderingene 1t ̴165, 000 x g og 4 ° C.
- Forsiktig fjerne det hvite laget av lipider på graderingen. Deretter samle grensesnittet som inneholder endosomes, mellom HB og 35% sukrose, med et kutt tips 200 μL brønnene.
Merk: Endosomal fraksjoner kan brukes direkte i vitro begrepsordbok polymerisasjon analysen eller kan være aliquoted på is, flash-frosne i flytende nitrogen, og lagret på-80 ° C. - Bestemme protein konsentrasjonen av PNS og endosomal fraksjoner.
Merk: Denne konsentrasjonen bør være minst 100 µg/mL. Omtrent 2,5 x 10 7 celler dyrket i 2 Petri retter er nødvendig for å oppnå en PNS med minst 100 µg/mL (se merknaden ovenfor).
4. Stoffer forberedelse
Merk: forberede 2 Petri retter (10 cm diameter, 57 cm 2) confluent HeLa celler som starter materiale. Ved behov kan også stoffer tilberedes fra celler utarmet av et protein av interesse (dvs. bruker RNAi eller CRISPR/Cas9) og/eller overexpressing en wildtype eller mutant form av protein av interesse. Som for endosome fraksjoneres-protokollen, alle trinnene bør utføres på ice.
- Gjenta trinn 3.1-3.8.
- Plasserer PNS i en sentrifuge rør og ultracentrifuge for 45 min på ̴250, 000 x g og 4 ° C.
- Nøye fjerne det hvite laget på toppen og samle SN (stoffer brøkdel) uten å forstyrre microsome pellets. Holde en aliquot av stoffer brøken for protein besluttsomhet.
Merk: Stoffer kan brukes direkte i vitro begrepsordbok polymerisasjon analysen eller kan være aliquoted på is, flash-frosne i flytende nitrogen, og lagret på-80 ° C. - Bestemme protein konsentrasjonen av stoffer.
Merk: Det bør være minst 3 mg/mL.
5. Analysen måle Endosome-avhengige begrepsordbok polymerisasjon I Vitro
Merk: Endosome-avhengige begrepsordbok polymerisasjon utføres med to alternative tilnærminger. I den første tilnærmingen, er materialer blandet i et reagensrør, faste, og overført til en dekkglassvæske og analysert. I den andre tilnærmingen, beskrevet her, kan analysen utføres direkte i tenkelig kammeret og kan fast og analyseres uten mekanisk forstyrrelsene ( figur 2C). I denne andre analysen blandingen overføres ikke fra et til en dekkglassvæske og dermed gjenstår Uaffisert, redusere faren for F-utgangen nettverk blir fysisk opprørt under overføringen. I tillegg er denne andre tilnærming kompatibel med en time-lapse analyse av F-utgangen polymerisasjon. Det bør bemerkes at ingen forskjell i analyse av F-utgangen polymerisasjon ble observert med enten tilnærming.
Merk: Bruk kuttet tips hele protokollen.
- i et reagensrør
- forsiktig blanding iskald renset GFP-RAB5 endosomes (trinn 3) med stoffer (trinn 4) i forholdet 1:10 (protein konsentrasjon) i en iskald 1.5-mL konisk reagensrør.
Merk: En typisk eksperiment er gjennomført med omtrent 40-50 µL. - Juster iskald reaksjonsblandingen å endelig konsentrasjoner av 125 mM KCl (med 1 M KCl lager løsningen), 12.5 mM Hepes og 1,5 mM MgOAc 2 (med 50 x lagerløsning). Juster deretter blandingen med proteasehemmere til siste konsentrasjoner av 10 mM leupeptin, 1 mM pepstatin A og 10 ng/mL aprotinin. Bland forsiktig alle komponenter.
- Plasser reagensglasset som inneholder reaksjonsblandingen ved 37 ° C, uten risting, og ruge for tiden.
Merk: Vanligvis vil det ta ca 3 min å oppdage begrepsordbok polymerisasjon på endosomes og 30 min for dannelsen av et omfattende nettverk. - På tiden (dvs. 3 min eller 30 min), stoppe reaksjonen ved å plassere reagensglasset på is og legge til 1/10 (vol:vol) av forkjøles 3% PFA løsningen.
- Legg til 0.3:10 (vol:vol) på 200 enheter/mL (~6.6 μM) phalloidin konjugert til rød-oransje farge stain polymerized utgangen.
- Sted 12 μL blandingen på 12 μL PVA montering mediet på en mikro objektglass. Sette en 18 x 18 mm 2 glass coverslipon top.
- Analysere prøven med AC confocal mikroskopi.
- forsiktig blanding iskald renset GFP-RAB5 endosomes (trinn 3) med stoffer (trinn 4) i forholdet 1:10 (protein konsentrasjon) i en iskald 1.5-mL konisk reagensrør.
- i tenkelig chamber
- for å gjøre mikroskopiske tenkelig kamre, bruke plasma renere for 1 min å rengjøre en runde 18 mm diameter dekkglassvæske og rundt 35 mm diameter Petriskål utstyrt med 20 mm glass bunn (0,16-0,19 mm).
- Ruge av rensede overflater med 1% β-kasein for 20 min å minimere protein binding til glasset. Vask to ganger med 3 mM imidazole.
- Legg til endosome og stoffer i samme analysen blanding som trinn 5.1.1 og 5.1.2, slik forkjøles 1,5 mL test utfylle analysen blandingen med 0,1 μg/μL rhodamine-utgangen.
- Justerer den endelige brytningsindeksen av blandingen å 1.375 (26,5% sukrose) bruker 39% sukrose løsning.
Merk: Vanligvis samme volum er lagt; men dette må være empirisk re-justert avhengig av sukrose konsentrasjonen av den innsamlede fraksjon, bestemmes ved hjelp av en refractomer, siden sukrose konsentrasjonen variere litt fra eksperimentet å eksperiment. - Plasser blandingen på forbehandlet 35 mm parabolen (trinn 5.2.1 Oppgi) og dekke det med forbehandlet 18 mm dekkglassvæske (trinn 5.2.1 Oppgi).
- Sett kammeret ved 37 ° C, uten risting.
- Analysere prøven bruker fluorescens AC confocal mikroskopi.
6. Bildet Acquisition og analyse av utgangen nettverk
- bildeopptak
- kjøpe bildene på en invertert skanning AC confocal mikroskop.
Merk: Bildeinnstillinger oppkjøpet var optimalisert for en invertert skanning AC confocal mikroskop med en 63 X 1,25 NA oljeobjektiv. Justere laser makt (vanligvis rundt 50%) til å oppnå et godt signal-til-støy-forhold.
- kjøpe bildene på en invertert skanning AC confocal mikroskop.
- Kvantifisering av utgangen nettverket
- analysere fluorescerende micrographs. Bruk opensource programvare CellProfiler (v2.1.1) 12 å måle mengden av utgangen per endosome (alternativ programvare kan brukes).
- Først identifisere endosomes som det primære objektet med GFP-RAB5 signalet. Deretter kvantifisere F-utgangen forbundet med individuelle endosomes med utbredelsen av utgangen signalet (rød-oransje farge konjugert Phalloidin) som en sekundær objekt.
- Gjennomsnittlig og normalisere antall tilknyttede materialet for hvert objekt til betingelsen kontroll.
- analysere fluorescerende micrographs. Bruk opensource programvare CellProfiler (v2.1.1) 12 å måle mengden av utgangen per endosome (alternativ programvare kan brukes).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å få innsikt i dannelsen av F-utgangen flekker på tidlig endosome membraner, fulgte vi protokollen i figur 2. Kort, celler var transfekterte med GFP-RAB5 og deretter tidlig endosomes ble utarbeidet av subcellular fraksjoneres. Disse renset tidlig endosomes ble inkubert med stoffer for å gi begrepsordbok selv, samt andre faktorer muligens involvert i reaksjonen. På slutten av inkubasjonstiden, ble reaksjonen stoppet av fiksering av blandingen. Et eksempel var samles og avsatt på et mikroskopisk lysbilde. Til slutt, F-utgangen ble avslørt med phalloidin (figur 3A). Nucleation av F-utgangen på tidlig endosomal membraner samt etterfølgende polymerisasjon prosessen oppstod raskt. Faktisk kan F-utgangen allerede bli visualisert på endosomes innen 1min etter reaksjonen (figur 3A). Disse begrepsordbok strukturene, som var utgangspunktet kort, ble raskt lenger, forgrenede og koblet til hverandre fører til dannelsen av en innvevd nettverk av utgangen filamenter (figur 3A), trolig som reflekterer ubalansert begrepsordbok dynamikken i vitro. Lignende nucleation og polymerisasjon priser ble observert når analysen ble gjennomført med renset rhodamine-merket begrepsordbok i tillegg til celle stoffer. Dette ble gjort i glassbunn retter slik at strukturer kan avbildes direkte, i fravær av noen forstyrrelsene (figur 3B). I analysen beskrevet her, nucleate tidlig endosomes de novo begrepsordbok polymerisasjon selektivt. Faktisk oppstår begrepsordbok polymerisasjon ikke når i vitro reaksjonen ble gjennomført i fravær av endosomes eller stoffer. Det kan derfor konkluderes at tidlig endosomes ha grunnleggende muligheten til å støtte nucleation og påfølgende polymerisasjon begrepsordbok filamenter9,11.
For å analysere mengden begrepsordbok polymerized fra endosomes, ble bilder kjøpt på forskjellige tider analysert ved hjelp av CellProfiler (figur 4A). Mengden av utgangen polymerized per endosome ble målt som området begrepsordbok rundt en enkelt tidlig endosome. Utgangen polymerisasjon var høyere i begynnelsen av prosessen og redusert med tiden (figur 4B). Utgangen nettverket kan analyseres nærmere på tidlig tidspunkt etter starten av reaksjonen. På disse tidlige tidspunkt, kan individuelle utgangen inneholder strukturer være fortsatt være differensiert fra hverandre. Antall begrepsordbok filamenter fra hver endosome regnes for å vurdere komplekse organiseringen av utgangen nettverk, (dvs. primære filamenter). Tilsvarende ble antall begrepsordbok filamenter som stammer fra primære filamenter (dvs., sekundær filamenter) telt, og alle andre begrepsordbok filamenter som kan identifiseres i nettverk og som ikke stammer fra endosomes (nummeret dvs, andre filamenter) (figur 4C-E. Når utgangen filamenter ble sporet, beregnet andre parametere, som personlige begrepsordbok filamenter og antall endosomes koblet til samme begrepsordbok filamenter, kunne lett (figur 4F).
Figur 1: fase kontrast mikroskop-bilde av en HeLa celle Homogenate. Etter homogenisering var ekstrakt montert mellom et mikroskopisk lysbilde og en dekkglassvæske. For publisering, ble micrographs tatt med en 100 X mål etter oljeneddyp. For rutinemessig inspeksjon, men var cellen ekstrakt visualisert under en 20 X eller et 40 X mål uten oljeneddyp. To eksempler på høy forstørrelse utsikt over homogenate vises (A-B). Kjerner (stjerne) vises som runde strukturer mørk grå i fargen, uten vedlagte celle restene. Piler peker til de karakteristiske granulater av varierende størrelse, form og translucence, som utgis på cellen homogenisering og tilsvarer intracellulær materialer (dvs. organeller). Skala bar = 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: skjematisk fremstilling av protokollen. Skjematisk beskrivelse av protokollene som brukes til å forberede endosomal ekstrakter (A) og stoffer ekstrakter (B) og overvåke begrepsordbok polymerisasjon fra endosomes i vitro (C). Nedbryting (SN), homogenisering buffer (HB), postnuclear nedbryting (PNS), kjernefysiske pellet (NP) og paraformaldehyde (PFA). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Nucleation og av F-utgangen på tidlig Endosomes In Vitro. (A) Endosomes renset fra Hela celler uttrykke GFP-Rab5 (grønn) og HeLa stoffer var forberedt separat. I analysen, tidlig endosomes (EØS) ble blandet med stoffer, og blandingen ble inkubert for angitt tid. Blandingen ble deretter fast, merket med phalloidin (rød) etiketten F-utgangen og analyseres av fluorescens AC confocal mikroskopi. Barer: 10 µm (topp panel) og 5 µm (nedre panelet). (B) EØS renset fra Hela celler uttrykke GFP-Rab5 (grønn) og HeLa stoffer var forberedt separat. Disse celle ekstrakter ble inkubert med renset rhodamine-utgangen (rød) for det angitte ganger i mikroskopet kamre og ble analysert av AC confocal mikroskopi. Skala bar = 10 µm. (C) eksperimentet ble utført som i A. HeLa stoffer (uten EØS) og HeLa endosomes (grønn) merket med GFP-Rab5 (uten stoffer) ble inkubert separat (venstre og den midterste panel) eller sammen (høyre panel) i 30 min, fast, merket med phalloidin (rød) etiketten F-utgangen og analyseres av fluorescens AC confocal mikroskopi. Skala bar = 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: analyse av utgangen nettverket. (A) arbeidsflyt CellProfiler analyse. (B) antall polymerized utgangen kvantifisert i forhold til antall endosomes ved hjelp av CellProfiler programvare. Data er median ± s.e.m. (n = 3). Dataene er ± SD (n = 3). 5 min versus 15 min (ns P= 0.0736), 5 min versus 30 min (* P = 0.0195), og 15 minutter versus 30 min (ns P = 0.3129). (C)Tidlig endosomes (EØS) renset fra Hela celler uttrykke GFP-Rab5 og jakten stoffer var forberedt separat, og analysen ble utført som i figur 2A. Prøvene ble løst etter 7 minutter. Midtre panelet viser den samme mikroskop-bilde med overlapping av spor av F-utgangen strukturer tegnet med NeuronJ plugin13 ImageJ programvaren. Panelet til høyre viser spor bare. Skala bar = 10 µm. (D) representasjon av F-utgangen struktur nummereringen i kvantifiseringen med ImageJ programvare. (E) kvantifisering av antall begrepsordbok filamenter, som definert i C-D. Dataene er ± SD (n = 3). Primære grener kontra sekundære grener (ns P = 0.5262), sekundære grener mot andre (ns P = 0.6815), og primære grener mot andre (ns P = 0.2254). (F) lengden på F-utgangen strukturer og antall EØS per utgangen struktur vises som eksempler på andre parametere enn kan analyseres med kvantifiseringen definert i C-D. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utgangen spiller en avgjørende rolle i endosome membran dynamics4,14. Tidligere rapporterte vi at utgangen nucleation og polymerisasjon forekommer på tidlig endosomes, danner små F-utgangen flekker eller nettverk. Disse F-utgangen nettverkene er absolutt nødvendig for membran transport utover tidlig endosomes langs veien degradering. Virker på alle trinn i denne nucleation og polymerisasjon prosessen hindrer endosome modning og således nedstrøms transport mot slutten endosomes andlysosomes9,11,15. Spesielt brukte vi analysen beskrevet ovenfor analysere de sekvensielle trinnene av F-utgangen polymerisasjon på tidlig endosomes og karakteriserer prosessen på molekylært nivå.
I disse eksperimentene, er tidlig endosomes merket med GFP-RAB5 i vivo, renset ved subcellular fraksjoneres, og ruges i et reagensrør i nærvær av stoffer å tillate F-utgangen polymerisasjon i vitro. Samtidig ønsket reaksjonen er stoppet og reaksjonsblandingen er overført til et mikroskopisk lysbilde for analyse av fluorescens mikroskopi, bruker phalloidin for å merke F-utgangen. Med dette eksperimentelle strategi, viste vi at annexin A2 er nødvendig for nucleation av F-utgangen på tidlig endosomes, sammen med SPIRE1, mens ARP2/3 formidler F-utgangen forgrening, som forventet. Vi viste også at moesin og cortactin er nødvendig for dannelsen av F-utgangen nettverk som megle ECV/MVB biogenesis og modning langs fornedrelse veien pattedyrceller9,11.
Det er viktig å huske på at selv om lave nivåer av ectopically uttrykt RAB5 ikke endrer endosomes til noen betydelig grad10, dette lille GTPase er en viktig regulator av tidlig endosome membran dynamics16,17 . I noen eksperimenter, kan det derfor være hensiktsmessig å etiketten endosomes i analysen bruker alternative protokoller. For eksempel kan tidlig endosomes enkelt merkes med endocytosed fluorescerende tracers, som epidermal vekstfaktor eller transferrin4,14.
Det bør også bemerkes at det er teknisk vanskelig å bildet personlige begrepsordbok filamenter med konvensjonelle AC confocal mikroskopi. Derfor referere vi til F-utgangen strukturene i teksten som beskriver begrepsordbok nettverk på endosomes. Som en konsekvens, føler vi at dannelsen av en F-utgangen nettverk kan kvantifiseres mer nøyaktig ved å måle fluorescens areal på nettverk i stedet for intensitet.
Det er ikke lett å helt utelukke muligheten for at utgangen nucleation aktiviteten observert i vitro er formidlet av en annen struktur eller organelle som forblir bundet til RAB5 endosomes under rensing. Men er slike forurensning svært usannsynlig. Mens noen organeller rense co på graderinger på grunn av lignende fysiske egenskaper, pleier de ikke å forblir kvantitativt bundet til hverandre etter rensing. Videre avhenger begrepsordbok nucleation aktiviteten strengt annexin A24,14, som finnes på tidlig endosomes som inneholder RAB514. Til slutt, finner vi at F-utgangen strukturer er tilknyttet selektivt RAB5 endosomes i vivo og ikke finnes på andre endosomes eller andre mobilnettet membraner4,14. Avslutningsvis er begrepsordbok nucleation aktivitet mest sannsynlig knyttet RAB5 endosomes, ettersom denne aktiviteten co renser og co regionaliserer med RAB5 endosomes.
I denne analysen er mye som i andre analyser som gjeninnføre de komplekse biokjemiske reaksjonene kontrollen dynamikken i endosomes16 eller18 andre membraner og som utføres i et reagensrør, det viktig å sikre at forberedelsene av mobilnettet ekstrakter er optimal. Cellene skal være homogenisert under mild forhold å begrense skade endosomes og andre organeller, spesielt kjerner og lysosomer. Også bør endosome fraksjoner holdes på is under forhold som minimerer osmotisk og ioniske stress, samt spontan begrepsordbok polymerisasjon. I tillegg, relativt høye konsentrasjoner av endosome brøk (≥0.1 mg/mL) og stoffer (≥3 mg/mL) er nødvendig for tilstrekkelig F-utgangen polymerisasjon på endosomes og oppdagelse, som indikert i trinn 3,13 og 4.4, henholdsvis. Tilsvarende er det viktig å utføre analysen med en 1:10 forholdet mellom endosome til stoffer (protein: protein), som angitt i trinn 5.1.1. Endelig pipettering etter utgangen polymerisasjon (dvs. legge til PFA og phalloidin) bør gjøres svært forsiktig for å unngå skjuling eller bryte utgangen.
Eventuelt i vitro begrepsordbok polymerisasjon analysen kan også utføres direkte i et mikroskop imaging kammer, etter tilføyer renset rhodamine-utgangen til analysen blanding, begrense mekanisk forstyrrelser av utgangen nettverk polymerized på endosomes (se trinn 5.2.3 og figur 2). I dette tilfellet det er best å justere pakke til 26,5% (0,85 M) sukrose (refraktiv indeks av 1.375), begrensende diffusjon og Brownsk-lignende bevegelse (trinn 5.2.3), og fjerne mulig aggregater av renset rhodamine-utgangen av ultracentrifugation før bruk. Våre observasjoner at moesin styrer dannelsen av F-utgangen nettverk på endosomes var fullt recapitulated denne alternative versjonen av våre analysen4,14.
Begge versjonene av våre protokollen, i reagensglasset eller tenkelig kammeret, er optimal for en global analyse av F-utgangen nucleation og polymerisasjon på endosomes. Men er det ikke lett å følge om utgangen polymerisasjon prosessen ved hjelp av denne metoden, delvis fordi endosomes ikke er immobile. Derfor er det ikke lett å overvåke veksten av personlige filamenter og dermed finne ut historien til utgangen nettverket. For eksempel kan det være vanskelig å diskriminere F-utgangen forgrening fra crosslinking. Men er vi sikre at betingelsene for å overvåke F-utgangen polymerisasjon i sanntid kan forbedres i tenkelig kammeret ved å optimalisere betingelsene som nakkens endosomes. Tilsvarende vil det være interessant å overvåke F-utgangen polymerisasjon fra kunstig membraner bruker renset komponenter. Faktisk viste vi tidligere at F-utgangen nucleation og polymerisasjon kan oppstå på liposomer etter bindende tHan nucleation faktor annexin A2 til liposome bilayer11. Denne strategien vil være nyttig å ytterligere analysere rollen bestemt lipider og proteiner i F-utgangen nucleation og polymerisasjon og å karakterisere minimal komponentene som er nødvendige å danne en F-utgangen nettverk på endosomal membraner. Til slutt, vi tror at denne strategien vil være svært nyttig å studere andre F-utgangen-avhengige prosesser på endosome membraner, særlig rekruttering og mobilisering av retromer/vask maskiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Støtte ble mottatt fra Swiss National Science Foundation; Swiss Sinergia programmet; den polsk-sveitsiske forskning program (PSPB-094/2010); NCCR i kjemisk biologi; og LipidX fra det sveitsiske SystemsX.ch initiativet, evaluert av Swiss National Science Foundation (å J. G.). O. M. ble støttet av en EMBO langsiktige fellesskap (ALTF-516-2012).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71380 | |
| KCl | Acros Organics | 196770010 | |
| KH2PO4 | AppliChem | A1042 | |
| Na2HPO4 | Acros Organics | 424370025 | |
| Hepes | AppliChem | A3724 | |
| Magnesiun acetate tetrahydrate | Fluka | 63047 | |
| Dithiothreitol (DTT) | AppliChem | A2948 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 10125 | |
| NaOH | Fluka | 71690 | |
| Sucrose | Merck Millipore | 107687 | |
| Leupeptin | Roche | 11017101001 | |
| Pepstatin | Roche | 10253286001 | |
| Aprotinin | Roche | 10236624001 | |
| Paraformaldehide | Polysciences. Inc | 380 | |
| Alexa Fluor 555 phalloidin | Molecular Probes | A34055 | |
| Actin rhodamine | Cytoskeleton. Inc | APHR-A | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | poly(vinyl alcohol), Mw ~31 000 |
| DABCO | Sigma-Aldrich | D-2522 | |
| Tris-HCl | AppliChem | A1086 | |
| β-casein | Sigma-Aldrich | C6905 | |
| Filter 0.22 μm | Millex | SL6V033RS | |
| Round 10 cm dishes for cell culture | Thermo Fisher Scientific | 150350 | |
| Plastic Pasteur pipette | Assistent | 569/3 40569003 | |
| 15-mL polypropylen tube | TPP | 91015 | |
| Hypodermic Needle 22G Black 30mm | BD Microlance | 300900 | |
| Sterile Luer-slip 1mL Syringes without needle | BD Plastipak | 300013 | |
| Micro glass slides | Assistent | 2406 | |
| 18 x 18-mm glass coverslip | Assistent | 1000/1818 | |
| SW60 centrifuge tube | Beckman coulter | 344062 | |
| TLS-55 centrifuge tube | Beckman coulter | 343778 | |
| 200-μL yellow tip | Starlab | S1111-0706 | |
| 1,000-μL Blue Graduated Tip | Starlab | S1111-6801 | |
| 1.5-mL test tube | Axygen | MCT-175-C 311-04-051 | |
| 18-mm diameter round coverslip | Assistent | 1001/18 | |
| 35-mm diameter round dish with a 20-mm glass bottom (0.16 - 0.19 mm) | In vitro Scientific | D35-20-1.5-N | |
| Refractometer | Carl Zeiss | 79729 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Sorvall WX80 Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46900 | |
| Tabletop ultracentrifuge | Beckman coulter | TL-100 | |
| SW60 rotor | Beckman coulter | 335649 | |
| TLS-55 rotor | Beckman coulter | 346936 | |
| Confocal microscopy | Carl Zeiss | LSM-780 | |
| Fugene HD transfection reagent | Promega | E2311 | |
| Protein assay reagent A | Bio-Rad | 500-0113 | |
| Protein assay reagent B | Bio-Rad | 500-0114 | |
| Protein assay reagent S | Bio-Rad | 500-0115 | |
| Cell scraper | Homemade | Silicone rubber piece of about 2 cm, cut at a very sharp angle and attached to a metal bar or held with forceps | |
| Refractometer | Carl Zeiss | ||
| Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Sigma-Aldrich | M0643 | |
| FCS | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Thermo Fisher Scientific | 11140-035 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| pH Meter 691 | Metrohm | ||
| ImageJ software | NIH, Bethesda MD |
References
- Huotari, J., Helenius, A.
- Scott, C. C., Vacca, F., Gruenberg, J. Endosome Maturation, Transport and Functions. Semin. Cell Dev Biol. 31, 2-10 (2014).
- Puthenveedu, M. A., et al. Sequence-dependent sorting of recycling proteins by actin-stabilized endosomal microdomains. Cell. 143 (5), 761-773 (2010).
- Seaman, M. N., Gautreau, A., Billadeau, D. D. Retromer-mediated endosomal protein sorting: all WASHed up! Trends Cell Biol. 23 (11), 522-528 (2013).
- Burd, C., Cullen, P. J. Retromer: a master conductor of endosome sorting. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (2), a016774 (2014).
- Woodman, P. G., Futter, C. E. Multivesicular bodies: co-ordinated progression to maturity. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 408-414 (2008).
- Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Emr, S. D.
- Morel, E., Gruenberg, J. Annexin A2 binding to endosomes and functions in endosomal transport are regulated by tyrosine 23 phosphorylation. J Biol Chem. 284 (3), 1604-1611 (2009).
- Muriel, O., Tomas, A., Scott, C. C., Gruenberg, J. Moesin and cortactin control actin-dependent multivesicular endosome biogenesis. Mol Biol Cell. 27 (21), 3305-3316 (2016).
- Sonnichsen, B., De Renzis, S., Nielsen, E., Rietdorf, J., Zerial, M. Distinct membrane domains on endosomes in the recycling pathway visualized by multicolor imaging of Rab4, Rab5, and Rab11. J Cell Biol. 149 (4), 901-914 (2000).
- Morel, E., Parton, R. G., Gruenberg, J. Annexin A2-dependent polymerization of actin mediates endosome biogenesis. Dev Cell. 16 (3), 445-457 (2009).
- Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
- Granger, E., McNee, G., Allan, V., Woodman, P. The role of the cytoskeleton and molecular motors in endosomal dynamics. Semin Cell Dev Biol. 31, 20-29 (2014).
- Mayran, N., Parton, R. G., Gruenberg, J. Annexin II regulates multivesicular endosome biogenesis in the degradation pathway of animal cells. EMBO J. 22 (13), 3242-3253 (2003).
- Gorvel, J. P., Chavrier, P., Zerial, M., Gruenberg, J. rab5 controls early endosome fusion in vitro. Cell. 64 (5), 915-925 (1991).
- Wandinger-Ness, A., Zerial, M. Rab proteins and the compartmentalization of the endosomal system. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (11), a022616 (2014).
- Balch, W. E., Glick, B. S., Rothman, J. E. Sequential intermediates in the pathway of intercompartmental transport in a cell-free system. Cell. 39 (3 Pt 2), 525-536 (1984).
