Summary
초기 endosome 함수 F 말라 합에 따라 달라 집니다. 여기, 우리가 설명 체 외에 현미경 기반 분석 결과 nucleation와 테스트 튜브에서 초기 endosomal 막에 F 걸의 중 합을 재구성 하는 따라서 반응의 복잡 한 시리즈가 생화학 및 유전 의무가 렌더링 조작입니다.
Abstract
많은 초기 endosome 기능, 특히 화물 단백질 정렬 및 막 변형, endosomal 막에 nucleated 짧은 F 걸 필 라 멘 트의 따라 달라 집니다. 우리는 설립 체 외에 현미경 기반 분석 결과 nucleation와 테스트 튜브에서 초기 endosomal 막에 F 걸의 중 합을 재구성 하는 따라서 의무가 유전 그리고 생 화 확 적인 반응의이 복잡 한 시리즈를 렌더링 조작입니다. Endosomal 분수 부양 초기 endosomal 단백질 GFP RAB5을 표현 하는 세포에서 자당 기온 변화도에 의해 준비 된다. Cytosolic 분수 셀의 별도 일괄 처리에서 준비 된다. Endosomal와 cytosolic 분수 저장할 수 있습니다 액체 질소에서 냉동 필요한 경우. 분석 결과, endosomal와 cytosolic 분수, 혼합 한 혼합물은 적절 한 조건 (예를 들어, 이온 강도, 감소 환경)에서 37 ° C에서 알을 품을. 원하는 시간에 반응 혼합물을 고정 하 고 F 걸 phalloidin로 드러났습니다. 말라 nucleation와 중 합 후 형광 현미경 검사 법에 의해 분석 된다. 여기, 우리는이 분석 결과 말라 nucleation 막, 또는 후속 신장, 분기, 또는 F 걸 필 라 멘 트의 가교에 관련 된 요인의 역할을 조사 하기 위해 사용할 수 있습니다 보고 합니다.
Introduction
높은 진 핵 세포, 단백질 및 지질 초기 endosomes 정렬이 발생 하는 위치에 내 면 됩니다. 일부 단백질과 지질, reutilized 될 운명, 초기 endosomes의 관 지역에 통합은 그리고 그 때 수송 된다 원형질 막 또는 trans Golgi 네트워크 (TGN)1,2. 대조적으로, 다른 단백질과 지질 선택적으로 multivesicular 모양을 전시 초기 endosomes의 지역에 포장 됩니다. 이 지역 확장 하 고, 초기 endosomal 막에서 분리, 시 무료 endosomal 캐리어 소포 또는 multivesicular 시체 (ECV/MVBs), 결국 성숙한는 늦은 endosomes1, 으로 화물 운송에 대 한 책임 2.
말라는 endosomal 정렬 용량과 endosome 속과 관련 된 막 개장 과정에서 중요 한 역할을 한다. 원형질 막 또는 TGN 재활용 경로 따라 정렬 단백질 복잡 한 retromer와 관련 된 단백질에 따라 달라 집니다. 이 정렬 기계 재활용 tubules 통해 상호 작용의 복잡 한, retromer의 말 벌 및 흉터 homologue (세척) 복잡 하 고 분기 말라3,4,5 형성에 결합 될 것 . 반면, 분자 저하에 대 한 운명, 특히 신호 수용 체 활성화, endosomal 단지 전송 (ESCRT)2,6,에 필요한 정렬 정렬할 intraluminal 소포 (ILVs)으로 7. ESCRT-종속 정렬 과정에서 말라의 가능한 역할을 알 수 없습니다 하는 동안 F-걸 ECV/MVBs의 속에 그리고 이른 endosomes 넘어 전송에 중요 한 역할을 재생 합니다. 특히, 우리 콜레스테롤 풍부한 지역 초기 endosome의 spire1 함께 바인딩합니다 annexin A2, F-말라 합 nucleates 발견. Endosomes에서 분기 말라 네트워크의 형성 필요 걸 관련 단백질 (ARP) 2/3의 분기 활동, 복합 음 단백질 moesin 고 말라-바인딩 단백질 cortactin8,9.
여기, 우리가 시험관에 현미경 기반 분석 결과 nucleation와 시험관에서 이른 endosomal 막에 F 걸의 중 합을 재구성 하는 설명 합니다. 이 분석 결과 이전 F-말라 nucleation에서 A2 annexin의 moesin 및 cortactin endosomal 걸 네트워크8,9의 형성에의 역할을 조사 하기 위해 사용 되었습니다. 이 생체 외에서 프로토콜 말라 합 동안 endosomes에 발생 하는 반응의 복잡 한 시리즈 될 걸 nucleation, 선형을 포함 하 여 과정의 순차적 단계의 생 화 학적 및 분자 분석에 순종 중 합, 분기, 고 가교입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 솔루션 및
참고: 모든 버퍼 및 솔루션 이중 증 류 (dd) H 2 o.에에서 준비 되어야 한다 자당의 수 분 상태가 다르기 때문에 모든 자당 솔루션의 최종 농도 결정 되어야 합니다은 굴절 계를 사용 하 여.
Divalent 양이온 (PBS-) 없이- 준비 인산 염 버퍼 염 분: 137 m NaCI m, 2.7 m KCl m, 1.5 m m KH 2 포 4 및 6.5 m m 나 2 HPO 4. PH 7.4에 조정 합니다. 압력가 마로 소독 (1 개 주기 121 ° C에서 15 분)으로 소독 하 고 상 온에서 저장.
- 이미 300 mM의 재고 솔루션을 준비: ddH 2 O.Adjust HCl. 여과기 소독 0.22 μ m를 사용 하 여 사용 하 여 4 ° C에서 7.4에 pH 크기 필터 기 공 및 4에서 저장의 10 mL에 이미의 0.204 g ° c.
- 준비 균질 버퍼 (HB; 준비 약 100 mL): 250 m m 3 m m 이미에 자당. PH 미터를 사용 하 여 4 ° C에서 7.4에 pH를 조정 합니다. 필터-0.22 μ m 기 공 크기 필터를 사용 하 여 소독 하 고 4에서 저장 protease 억제제 10 m m leupeptin, 1 mM pepstatin A, 및 10 ng/mL aprotinin에 해당 하는 최종 농도에서 칵테일 ° C. 보수는 HB 사용 직전.
- 단계 부양 그라디언트에 대 한 준비 62%, 39%, 및 35% 자당 해결책 3mm 이미, pH 7.4, 아래 설명 된 대로. 굴절 계를 사용 하 여 모든 자당 솔루션의 최종 농도 정확 하 게 결정.
- 준비 100 mL 3 m m 이미, pH 7.4에에서 62% 자당 해결책의
- . DdH 2 O 80.4 g 자당의 감동에 의해 해산 사전 예 열 300mm 이미 재고 솔루션 및 ddH 2 O. 조정 100 mL를 채우기의 35 ° C. 추가 1 mL에 pH 7.4 4 ° C. 필터 소독 0.22 μ m 기 공 크기 필터 및 저장소를 사용 하 여 4 ° c.에
- 이미 3 m m, pH 7.4에에서 35% 자당 해결책의 100ml 준비합니다. 40.6 g 300 밀리미터 이미 재고 솔루션의 ddH 2 오 추가 1 mL에 자당의 감동에 의해 해산 하 고 ddH 2 O. 조정 100 mL에 pH 7.4 4 ° C. 필터를 소독을 사용 하 여 0.22 μ m 기 공 크기 필터와 4에 저장를 채우기 ° c.
- 이미 3 m m, pH 7.4에에서 39% 자당의 50 mL를 준비합니다. 35% 자당 해결책으로 62% 자당 해결책을 희석. 4 ° c.에 게
주의: 3 %PFA 독성 시 약.
2. 세포 배양
- 문화 헬러 셀 Dulbecco ' s 10% 태아 종 아리 혈 청, 10% 비 본질적인 아미노산, 보완 수정이 글 중간 10 %L-글루타민, 및 1% 페니실린-스. 37 ° c 5% CO 2 배양 기에서 그들을 유지 하는 것.
- Transfect 세포 GFP RAB5 10, 제조 업체에 따라 상업 transfection 시 약을 사용 하 여 실험 하기 전에 24 시간 ' s 지침.
- 필요할 때, 준비 endosomal 분수와 셀 (즉, RNAi 또는 CRISPR/Cas9를 사용 하 여) 관심의 관심사의 단백질의 돌연변이 또는 wildtype 형태 overexpressing 단백질의 고갈에서 cytosol.
3. Endosomal 분수 준비
참고: endosomes 및 다른 가벼운 막 subcellular 분수의 간단한 준비가이 프로토콜에 설명 합니다. 필요한 경우, 순화 된 endosome 분수는 사용된 11 수 있습니다. GFP RAB5 시작 물자로 표현 confluent 셀 2 접시 (10 cm 외경; 57 c m 2)를 준비 합니다. 2 접시에 confluent HeLa 세포의 총 수는 대략 2.5 x 10 7 셀에 해당합니다. 때, 필요는 endosomes 또한 준비 될 수 있다 세포 관심 (즉, RNAi 또는 CRISPR/Cas9를 사용 하 여) 그리고/또한 관심사의 단백질의 돌연변이 또는 wildtype 형태 overexpressing, 항상 표현 GFP-RAB5의 단백질의 고갈에서.
주의: 얼음에 분별 법 프로토콜의 모든 단계를 수행 해야
- 평평한 얼음 양동이에 젖은 금속 접시에 배양 접시를 놓고 즉시 두 번의 얼음 처럼 차가운 PBS-5 mL로 세포 세척.
- 모든 PBS-마지막 세척에서 제거 하 고의 얼음 처럼 차가운 PBS-접시 당 3 mL를 추가 합니다. 셀 처리 동안 건조 하지 한다: 필요한 경우 적절 하 게 커버 액체와 셀 락 플랫폼에 얼음 양동이 놓습니다.
- 는 기계적으로 유연한 고무 경찰관 (즉, 직접 만든 셀 긁는 도구)를 사용 하 여 배양 접시에서 PBS에서 셀을 제거 합니다. 빠르고, 원형 모션 접시, 접시 중간 하강 운동 뒤의 외부 주위에 먼저 요리에서 세포를 다쳤어요. 부드럽게 긁어 " 시트 " 연결 된 세포의. 부드럽게 얼음에 15 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브에 넓은 개방으로 플라스틱 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 셀을 전송
- 175 x g에 5 분 동안 원심 분리기와 4 ° C
- 부드럽게 상쾌한 (SN)을 제거 하 고 펠 릿에 HB의 1-3 mL를 추가 합니다. 넓은 개방으로 플라스틱 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 부드럽게 플라스틱 아래로 한 번 셀 resuspend 하.
- X g와 4 ° C. 부드럽게 제거 SN 1,355에서 7-10 분 동안 원심 분리기.
- 셀 균질 수행.
참고: 조건 해야 부드러운 셀의 플라즈마 막 끊어집니다는 endosomes 그대로 남아 있도록 합니다. - 추가 각 셀 펠 릿 (약 100 μ 셀 펠 릿 당)에 protease 억제제와 HB의 알려진된 볼륨
- . 사용 하 여 1000 µ L micropipette, 부드럽게 플라스틱 아래로 셀 resuspended 때까지. 안 함 공기 방울을 소개.
- 1 mL 투베르쿨린 주사기 22 G 바늘 HB와 미리 씻어 서와 공기 또는 거품의 무료 준비.
- 주사기 셀 서 스 펜 션 상대적으로 천천히 ()을 피하기 위해 공기 방울을 만드는, 튜브의 벽에 바늘의 경사진된 끝 배치를 신속 하 게 연결 된 셀의 플라즈마 막에서 전단에 세포 현 탁 액을 추방.
- 는 Homogenate (약 3 µ L)의 작은 약 수를가지고 고 유리 슬라이드에 HB의 50 µ L로 희석. 혼합 그리고 덮개 유리 coverslip로. Homogenate X 20 또는 40 X 목표 단계 대조 현미경 검사.
참고: 최적의 조건에서 대부분의 세포는 고장, 하지만 핵, 어두운 회색으로 표시 하 고 라운드 구조, ( 그림 1). - 반복 단계 3.7.3 대부분 셀까지 3.7.4 깨집니다; 일반적으로 3-6는 바늘을 통해 위아래 선 필요 하다. 단백질 결정에 대 한 homogenate의 작은 약 수 (10-30 µ L) 유지.
참고: 후 원심 분리, 펠 릿 (핵 펠 릿;로 정의 핵 및 (postnuclear 상쾌한;으로 정의 하는 상쾌한 NP) 포함 PNS)는 cytosol와 균질 그리고 무료에 출시 세포 포함.
참고: 인터페이스는 명확 하 게 볼 수 있도록 계층 되어야 한다 자당 솔루션.
참고: endosomal 분수 체 외에서 말라 합 시험에서 직접 사용할 수 있습니다 또는 얼음, 액체 질소, 플래시 동결에 aliquoted 그리고-80에 저장 될 수 있습니다 ° c.
참고:이 농도 적어도 100 µ g/mL 해야 합니다. 적어도 100 µ g/mL와 PNS를 약 2.5 x 10 7 셀 2 페 트리 접시에 성장 필요 (위의 참고 참조).
4. Cytosol 준비
참고: 준비 2 접시 (10 cm 직경; 57 cm 2) 시작 물자로 confluent HeLa 세포의. 필요할 때는 cytosol 셀 (즉, RNAi 또는 CRISPR/Cas9를 사용 하 여) 관심 wildtype 또는 관심사의 단백질의 돌연변이 형태를 overexpressing의 단백질의 고갈에서 준비 또한 수 있습니다. Endosome 분별 프로토콜에 관해서는 얼음에 모든 단계를 수행
- 반복 단계 3.1-3.8.
- PNS는 원심 분리기와 ultracentrifuge ̴250, 000 x g, 4 시 45 분에 대 한 배치 ° c.
- 신중 하 게 위에 흰색 레이어를 제거 하 고 microsome 펠 렛을 방해 하지 않고 SN (cytosol 분수)를 수집 합니다. 단백질을 위한 cytosol 분수의 약 수를 유지.
참고:는 cytosol 생체 외에서 말라 합 시험에서 직접 사용할 수 있습니다 또는 얼음, 액체 질소, 플래시 동결에 aliquoted 그리고-80에 저장 될 수 있습니다 ° c. - 는 cytosol의 단백질 농도 결정.
참고: 3 mg/mL 이상 이어야 한다.
5. 시험 측정 Endosome 종속 말라 합 체 외에서
참고: Endosome 종속 말라 합 두 가지 대체 방법을 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 첫 번째 접근 방법에서 자료는 테스트 튜브에 혼합, 고정 및는 coverslip로 전송 하며 분석 여기서 설명 하는 두 번째 방법은에서 분석 결과 수 이미징 챔버에 직접 실시 하 고 고정 고 기계적 섭 동 ( 그림 2C) 없이 분석. 이 두 번째 방법에서는, 분석 결과 혼합 하는 coverslip 테스트 튜브에서 전송 되지 않습니다 그리고 이렇게 교란, F-말라 네트워크 전송 하는 동안 물리적으로 교란 되 고의 위험을 감소 남아 있습니다. 또한,이 두 번째 방법은 F 걸 중의 시간 경과 분석와 호환 됩니다. 어느 방식으로 F-말라 합 분석에 차이가 관찰 했다에 주목 한다.
참고: 사용 하 여 잘라 프로토콜에 걸쳐 팁.
- 에 테스트 튜브에
- 부드럽게 혼합 차가운 순화 GFP RAB5 endosomes (3 단계)는 얼음 처럼 차가운 1.5 mL 원뿔 테스트 튜브에 (단백질 농도)를 1시 10분의 비율로 cytosol (4 단계)와
- .
참고: 일반적인 실험은 실시 약 40-50 µ L. - 125 m m KCl (1 개 M KCl 재고 솔루션을 사용 하 여), 12.5 mM Hepes, 및 1.5 m m MgOAc 2 (재고 솔루션 x 50를 사용 하 여)의 최종 농도에 얼음 처럼 차가운 반응 혼합물을 조정 합니다. 다음, 10 m m leupeptin, 1 m m pepstatin, 그리고 10 ng/mL aprotinin의 최종 농도 protease 억제제와 혼합을 조정 합니다. 모든 구성 요소를 부드럽게 혼합.
- 테스트 튜브 없이 떨고, 37 ° C에서 반응 혼합물을 포함 하 고 원하는 시간에 품 어.
참고: 일반적으로, 그것을 감지 말라 합 endosomes와 광범위 한 네트워크의 형성에 대 일 분에 약 3 분. - 원하는 시간에 (즉, 3 분 또는 30 분), 얼음에 테스트 튜브를 배치 하 여 반응을 중지 하 고 precooled 3 %PFA 솔루션의 1/10 (vol:vol) 추가.
- Polymerized 말라 얼룩 레드 오렌지 염색에 활용 된 200 단위/mL (~6.6 μ M) phalloidin의 0.3:10 (vol:vol) 추가.
- 12에 혼합물의 장소 12 μ μ 마이크로 유리 슬라이드에 PVA 장착 매체의. 18 x 18 m m 2 유리 coverslipon 상단에 넣어.
- Confocal 현미경 검사 법으로 샘플 분석.
- 이미징 챔버에
- 현미경 이미징 챔버를 사용 플라즈마 청소기 1 분 라운드 18 m m 직경 coverslip 및 라운드 35 m m 직경 20 m m 유리 바닥을 갖춘 페 트리 접시를 청소 (0.16 0.19 m m).
- 1% β-카 세 인 단백질 바인딩 유리를 최소화 하기 위해 20 분에 있는 청소 표면 품 어. 3mm 이미와 두 번 세척.
- 추가 endosome 고 cytosol, 같은 단계 5.1.1, 5.1.2, precooled 1.5 mL 테스트 튜브에서 혼합물 분석 결과 분석 결과 혼합물 0.1 μ g/μ rhodamine-걸을 보완.
- 최종 굴절률 1.375 (26.5% 자당) 혼합물의 39% 자당 해결책을 사용 하 여 조정.
참고: 일반적으로, 동일한 볼륨 추가 됩니다; 그러나, 이것은 경험적으로 다시 자당 농도 약간 실험에서 실험을 변경 될 수 있습니다 이후는 refractomer를 사용 하 여 결정 하는 수집 된 분수의 자당 농도에 따라 조정 되어야 합니다. - 청소용된 35 m m 접시 (5.2.1 단계)에 혼합물을 놓고 청소용된 18 m m coverslip (5.2.1 단계)으로 커버.
- 동요 없이 37 ° C에서 챔버 장소.
- 형광 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 샘플 분석.
6. 이미지 Acquisition 및 분석의 말라 네트워크
- 이미지 수집
- 거꾸로 스캔 confocal 현미경에서 이미지를 수집.
참고: 이미지 수집 설정 63 X 1.25 나 오일 목적으로 거꾸로 스캔 confocal 현미경에 최적화 했다. 좋은 신호 대 잡음 비율을 달성 하기 위해 레이저 전원 (일반적으로 약 50%)을 조정.
- 거꾸로 스캔 confocal 현미경에서 이미지를 수집.
- 말라 네트워크의 정량화
- 형광 현미경 분석. Endosome 당 걸의 양을 측정 하는 opensource 소프트웨어 CellProfiler (v2.1.1) 12를 사용 하 여 (대체 소프트웨어를 사용할 수 있습니다).
- 먼저, GFP RAB5 신호를 사용 하 여 기본 개체 endosomes 식별. 그런 다음 F-말라 말라 신호 전파를 사용 하 여 개별 endosomes와 관련 된 계량 (레드 오렌지 염색 활용 Phalloidin) 보조 개체로.
- 평균 제어 조건에 각 개체에 대 한 관련된 자료의 수를 정규화.
- 형광 현미경 분석. Endosome 당 걸의 양을 측정 하는 opensource 소프트웨어 CellProfiler (v2.1.1) 12를 사용 하 여 (대체 소프트웨어를 사용할 수 있습니다).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
초기 endosome 막에 F 걸 패치의 형성에 대 한 통찰력을 얻으려면, 우리 그림 2에 설명 된 프로토콜을 따 랐 다. 간단히, 셀 GFP RAB5와 페 했다 고 초기 endosomes subcellular 분류에 의해 준비 되었다. 이러한 정화 초기 endosomes 자체 뿐만 아니라 다른 요인 가능성이 반응에 관련 된 걸 수 있도록 cytosol와 인 큐베이 팅 했다. 잠복기의 끝에, 반응 혼합물의 고정에 의해 중단 됐다. 샘플 수집 그리고 현미경 슬라이드에 입금 했다. 마지막으로, F 걸 phalloidin (그림 3A)으로 밝혀졌다. 다음 중 합 과정 뿐만 아니라 초기 endosomal 막에 F 걸의 nucleation 급속 하 게 발생 했습니다. 실제로, F 걸 수 이미 구상 될 endosomes 1 분 이내에 반응 (그림 3A)의 시작 후. 처음 짧은 했다,이 말라 구조는 급속 하 게 분기 길고 걸 필 라 멘 트 (그림 3A), 아마도 불균형된 말라 역동성 생체 외에서 반영에의 한 네트워크의 형성에 지도 한 다른 연결 된 되었다. 유사한 nucleation 및 중 합 속도 분석 결과 셀 cytosol 뿐만 아니라 순화 rhodamine 표시 된 걸으로 실시 되었다 때 관찰 되었다. 이 구조를 직접, 어떤 섭 동 (그림 3B)의 부재에 이미지로 수 있도록 유리 바닥 요리에서 이루어졌다. 여기서 설명 하는 분석 결과에서 초기 endosomes nucleate 드 노 보 걸 합 선택적으로. 실제로, 생체 외에서 반응 endosomes 또는 cytosol의 부재에서 수행 되었다 말라 합 발생 하지 않았다. 따라서 초기 endosomes nucleation 고 걸 필 라 멘 트9,11의 연속적인 합을 지원 하기 위해 기본 능력을 보유 결론 수 있습니다.
말라 endosomes에서 생산의 양을 분석, 이미지에 서로 다른 시간에 인수 CellProfiler (그림 4A)를 사용 하 여 분석 되었다. 말라 endosome 당 생산 금액 말라 단일 초기 endosome 주변 지역으로 측정 했다. 말라 중 합 속도 프로세스의 시작 부분에서 더 높은 고 시간 (그림 4B) 감소. 말라 네트워크 반응 시작 후 초기 시간 포인트에서 좀 더 자세하게에서 분석 수 있습니다. 이러한 초기 시간 지점에서 개별 말라 포함 된 구조 수 수 아직도 분화 될 서로에서. 말라 네트워크의 복잡 한 조직, 평가 하기 위해 각 endosome에서 나오는 걸 필 라 멘 트의 수 계산 되었다 (즉, 기본 필 라 멘 트). 마찬가지로, 모든 다른 걸 필 라 멘 트를 네트워크에서 식별 될 수 및 그 endosomes (에서 기 인하지 않았다 수 뿐만 아니라 기본 필 라 멘 트 (즉, 보조 필 라 멘 트)에서 발생 하는 걸 필 라 멘 트의 수 계산 했다 즉, 다른 필 라 멘 트) (그림 4C-E. 일단 걸 필 라 멘 트 추적, 다른 매개 변수를 개별 걸 필 라 멘 트와 같은 걸 필 라 멘 트에 연결 endosomes의 수의 길이 쉽게 될 수와 같은 계산 (4 층 그림).
그림 1: 단계 대조 현미경 사진 HeLa 세포 Homogenate의. 균질, 후 추출 현미경 슬라이드 사이 coverslip 탑재 했다. 게시에 대 한 현미경 기름 침수 후 100 X 목적으로 점령 했다. 그러나 일상적인 검사에 대 한, 세포 추출 물 20 X 또는 기름 침수 없이 40 X 목표 시각 이었다. homogenate의 높은 확대 보기의 두 가지 예 (A-B) 표시 됩니다. 핵 (별) 색상, 연결 된 셀 나머지 없이 라운드 구조 어두운 회색으로 표시 됩니다. 화살표는 특성의 립 세포 균질에 따라 발표 되 고 세포내 물질 (즉, 세포)에 해당 하는 다양 한 크기, 모양, 및 반투명, 가리킵니다. 눈금 막대 = 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 프로토콜의 도식 대표. Endosomal 추출 물 (A)과 cytosol 추출 (B)을 준비 하 고 말라 합 endosomes에서 생체 외에서 (C)에서 모니터링 하는 데 사용 되는 프로토콜의 개요 설명입니다. 상쾌한 (SN), 균질 버퍼 (HB), postnuclear 상쾌한 (PNS), 핵 펠 릿 (NP), 고 paraformaldehyde (PFA). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: Nucleation 및 F-말라 초기 Endosomes에 생체 외에서의 중 합. (A) Endosomes 헬러에서 정화 세포 표현 GFP-Rab5 (녹색) 및 헬러 cytosol 별도로 준비 했다. 분석 결과, 초기 endosomes (EEs) cytosol, 혼합 했다 고 혼합물은 알을 품는 표시에 대 한 시간. 혼합물 다음 고정, 레이블 F 걸을 (빨간색) phalloidin으로 표시 되었고 형광 confocal 현미경 검사 법에 의해 분석. 바: 10 µ m (맨 위 패널) 그리고 5 µ m (하단 패널). (B)에 스 헬러 세포 GFP-Rab5 (녹색)와 헬러 cytosol 별도로 준비에서 정화. 이러한 셀 추출 했다 제시 된에 대 한 정화 rhodamine-걸 (레드)와 알을 품을 현미경 실에서 시간 그리고 confocal 현미경 검사 법에 의해 분석 되었다. 눈금 막대 = 10 µ m. (C) 실험 A에서 수행 되었다. (EEs) 없이 헬러 cytosol 그리고 헬러 endosomes (그린) (cytosol) 없이 GFP-Rab5로 표시 별도로 incubated 했다 (왼쪽 및 가운데 패널) 또는 함께 (오른쪽 패널) 30 분, 고정, 레이블 F 걸을 phalloidin (레드)으로 표시 및 분석 형광 confocal 현미경 검사 법입니다. 눈금 막대 = 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 말라 네트워크의 분석. (A) 워크플로 CellProfiler 분석의. (B) 수가 생산 말라 endosomes CellProfiler 소프트웨어를 사용 하 여 수를 감안 정량 했다. 데이터는 평균 ± s.e.m. (n = 3). 데이터는 ± 사 우 스 다코타 (n = 3). 15 분 대 5 분 (ns P= 0.0736), 5 분 30 분 대 (* P = 0.0195), 그리고 15 분 30 분 대 (ns P = 0.3129). (C)헬러 세포 표현 GFP Rab5 그리고 HeLa cytosol에서에서 정화 초기 endosomes (EEs) 별도로 준비 하 고 분석 결과 그림 2A에서 실시 되었다. 샘플 7 분 후 고정 했다. 중간 패널 같은 현미경 사진, F 걸 구조 ImageJ 소프트웨어의13 NeuronJ 플러그인 사용 하 여 그린의 흔적의 중복을 보여줍니다. 오른쪽 패널 추적만 표시 됩니다. 눈금 막대 = 10 µ m. F-말라의 (D) 표현 구조 ImageJ 소프트웨어 정량화에 사용 하는 번호 매기기 시퀀스. 말라 필 라 멘 트, C D에 정의 된 수의 (E) 정량화. 데이터는 ± 사 우 스 다코타 (n = 3). 보조 지점 대 기본 분기 (ns P = 0.5262), 다른 지점 대 보조 지점 (ns P 0.6815 =), 그리고 다른 분기 대 기본 분기 (ns P 0.2254 =). (F) F 걸의 길이 구조와 말라 구조 당에 스 수 C D에 정의 된 정량화와 분석 될 수 있다 보다 다른 매개 변수의 예제로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
말라는 endosome 막 역학4,14에서 중요 한 역할을 한다. 우리 이전 보고 말라 nucleation 및 중 합 초기 endosomes에 발생 작은 F 걸 패치 또는 네트워크 형성. 이러한 F-말라 네트워크는 초기 endosomes 저하 통로 넘어 막 전송 절대적으로 필요 합니다. 이 nucleation 및 중 합 프로세스의 어떤 단계에서 방해 endosome 성숙 및 따라서 늦은 endosomes andlysosomes9,,1115쪽으로 다운스트림 전송 방지 합니다. 특히, 우리는 초기 endosomes에 F-말라 합의 순차적 단계를 분석 하 고 특성을 분자 수준에서 과정을 설명한 분석 결과 사용 합니다.
이 실험에서 초기 endosomes vivo에서GFP-RAB5로 표시, subcellular 분류에 의해 순화 되며 알을 품을 수 있도록 F-말라 중 합에서 체 외에cytosol 존재 테스트 튜브에. 원하는 시간에 반응 중지 되 고 반응 혼합물 분석에 대 한 현미경 슬라이드에 형광 현미경 검사 법, F-말라를 phalloidin를 사용 하 여 전송 됩니다. 이 실험적인 전략을 사용 하 여, 우리는 annexin a 2는 SPIRE1, 함께 초기 endosomes에 F 걸의 nucleation에 필요한 예상 대로 ARP2/3 F-말라 분기, 중재 하는 동안 보였다. 우리는 또한 moesin 및 cortactin는 중재 ECV/MVB 속 및 포유류 세포9,11의 저하 통로 성숙 F 말라 네트워크의 형성에 필요한 것을 보여주었다.
Ectopically 표현된 RAB5의 낮은 수준 팬 들은 어떤 뜻깊은 넓이10endosomes의 정보를 변경 하지 않습니다, 하지만이 작은 GTPase는 초기 endosome 막 역학16,17의 키 레 귤 레이 터에에서 유지 하는 것이 중요 하다 . 일부 실험에 따라서 라벨 endosomes 대체 프로토콜을 사용 하 여 분석 결과에서 적절 한 수 있습니다. 예를 들어 초기 endosomes 수 있습니다 편리 하 게 표시 표 피 성장 인자 또는 처리가4,14같은 endocytosed 형광 추적기를 사용 하 여.
또한 그것은 기술적으로 어려운 전통적인 confocal 현미경 검사 법으로 이미지 개별 걸 필 라 멘 트에 주목 한다. 따라서, 우리는 endosomes에 말라 네트워크를 설명 하는 텍스트에 걸쳐 F 걸 구조를 참조 하십시오. 결과적으로, 우리는 F-말라 네트워크의 형성 수 있습니다 그들의 강도 보다는 네트워크의 형광 표면적을 측정 하 여 보다 정확 하 게 측정할 수 느낀다.
그것은 완전히 말라 nucleation 활동은 체 외에 어떤 다른 구조 또는 정화 하는 동안 RAB5 endosomes에 바인딩된 남아 있는 세포 기관이 중재 관찰 하는 가능성을 배제 하기 쉽지 않다. 그러나, 이러한 오염을 매우 가능성이 크다. 반면 일부 세포 공동 그라디언트에 비슷한 물리적 특성 때문에 정화, 정화 후 서로 양적 바인딩된 남아 경향이 하지. 또한, 말라 nucleation 활동은 엄격 하 게는 RAB514를 포함 하는 초기 endosomes에 A24,14, annexin에 따라 다릅니다. 마지막으로, 우리는 F-말라 구조 연관 된 선택적으로 RAB5 endosomes에서 vivo에서 및 다른 endosomes에 또는 다른 세포 막4,14에서 찾을 수 없는 찾을. 결론적으로, 말라 nucleation 활동 이후이 정화 공동 활동과 공동으로 RAB5 endosomes localizes RAB5 endosomes와 관련 된 가장 가능성이 높습니다.
이 분석 결과에 훨씬 같은 복잡 한 생 화 확 적인 반응을 endosomes16 또는 다른 막18 의 역학 테스트 튜브에서 수행 되는 컨트롤을 다시 구성 하는 다른 분석 실험에서는 되도록 준비 하는 것이 중요 세포 추출의 최적입니다. 세포는 부드러운 조건 endosomes 및 다른 세포, 특히 핵와 리소좀에 손상을 제한 하에서 무 균 한다. 또한, endosome 분수 삼 투 이온 스트레스 뿐만 아니라 자연 스러운 걸 합을 최소화 하는 조건 하에서 얼음에 보관 한다. Endosome 분수 (≥0.1 mg/mL)와 cytosol (≥3 mg/mL)의 추가, 상대적으로 높은 농도에 대해서는 endosomes 및 탐지, 3.13, 4.4, 단계에 표시 된 적절 한 F-말라 합 각각. 유사 하 게, 1:10 시험을 수행 하는 것이 중요 하다 cytosol (단백질: 단백질), 단계 5.1.1 같이 하 endosome의 비율. 마지막으로, 말라 합 (즉, PFA와 phalloidin 추가) 후 pipetting 할 수 매우 부드럽게 축소 또는 말라 네트워크 침입을 피하기 위해.
필요한 경우, 체 외에서 말라 합 분석 결과 또한 실시 될 수 있습니다 직접 현미경 분석 결과 혼합물 생산 말라 네트워크의 기계적 섭 제한 하에 정화 rhodamine 말라를 추가한 후 챔버, 이미징에 에 endosomes (단계 5.2.3 및 그림 2참조). 이 경우에, 그것은 최고의 조정 26.5% (0.85 M) 자당 (1.375 굴절 인덱스), 제한 확산을 추출 하 고 브라운 모션 (5.2.3 단계), 및 제거의 가능한 집계를 사용 하기 전에 ultracentrifugation 여 rhodamine 걸 정화. 우리의 관측 endosomes에 F-말라 네트워크의 형성을 제어 하는 그 moesin 완벽 하 게 우리의 분석 결과4,14이 대체 버전을 사용 하 여 지 했다.
테스트 튜브 또는 이미징 챔버, 우리의 프로토콜의 버전 F 걸 nucleation 글로벌 분석 합 endosomes에 최적입니다. 그러나, 그것은 일부 endosomes 움직이지 않기 때문에이 접근을 사용 하 여 시간을 통해 걸 중 합 과정을 따라 하기 쉬운. 따라서, 개별 필 라 멘 트의 그리고 이렇게 성장 모니터링 쉽지 않다 말라 네트워크의 역사를 확인. 예를 들어 F-말라 가교에서 분기를 구별할 수 어려울 수 있습니다. 그러나, 우리는 확신 F-말라 합 실시간으로 모니터링 하는 조건 endosomes를 무력화 하는 조건을 최적화 하 여 이미징 챔버에 향상 시킬 수 있습니다. 마찬가지로, 그것은 순화 된 구성 요소를 사용 하 여 인공 세포 막에서 F-말라 합 모니터링 흥미로울 것입니다. 사실, 우리가 이전 보여주었다는 F-말라 nucleation 및 중 합 바인딩 t 후 리에 발생할 수 있습니다.그는 nucleation liposome bilayer11에 annexin a 2 요소. 이 전략 더 특정 지질과 F 걸 nucleation 및 중 합 과정에서 단백질의 역할을 해 부하 고 endosomal 세포 막에는 F-말라 네트워크를 형성 하는 데 필요한 최소한의 구성 요소 특성화에 유용할 것 이다. 마지막으로, 우리는이 전략 유학 endosome 막, 특히 모집 및 동원 retromer/세척 기계에 발생 하는 다른 F-말라-종속 프로세스에 매우 도움이 될 것입니다 믿습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
스위스 국립 과학 재단;에서 지원 받은 스위스 Sinergia 프로그램; 폴란드어-스위스 연구 프로그램 (PSPB-094/2010); 화학 생물학; NCCR 그리고 스위스 SystemsX.ch 이니셔티브에서 LipidX (J. G.)에 스위스 국립 과학 재단에 의해 평가. O. M. EMBO 장기 친교 (ALTF-516-2012)에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71380 | |
| KCl | Acros Organics | 196770010 | |
| KH2PO4 | AppliChem | A1042 | |
| Na2HPO4 | Acros Organics | 424370025 | |
| Hepes | AppliChem | A3724 | |
| Magnesiun acetate tetrahydrate | Fluka | 63047 | |
| Dithiothreitol (DTT) | AppliChem | A2948 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 10125 | |
| NaOH | Fluka | 71690 | |
| Sucrose | Merck Millipore | 107687 | |
| Leupeptin | Roche | 11017101001 | |
| Pepstatin | Roche | 10253286001 | |
| Aprotinin | Roche | 10236624001 | |
| Paraformaldehide | Polysciences. Inc | 380 | |
| Alexa Fluor 555 phalloidin | Molecular Probes | A34055 | |
| Actin rhodamine | Cytoskeleton. Inc | APHR-A | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | poly(vinyl alcohol), Mw ~31 000 |
| DABCO | Sigma-Aldrich | D-2522 | |
| Tris-HCl | AppliChem | A1086 | |
| β-casein | Sigma-Aldrich | C6905 | |
| Filter 0.22 μm | Millex | SL6V033RS | |
| Round 10 cm dishes for cell culture | Thermo Fisher Scientific | 150350 | |
| Plastic Pasteur pipette | Assistent | 569/3 40569003 | |
| 15-mL polypropylen tube | TPP | 91015 | |
| Hypodermic Needle 22G Black 30mm | BD Microlance | 300900 | |
| Sterile Luer-slip 1mL Syringes without needle | BD Plastipak | 300013 | |
| Micro glass slides | Assistent | 2406 | |
| 18 x 18-mm glass coverslip | Assistent | 1000/1818 | |
| SW60 centrifuge tube | Beckman coulter | 344062 | |
| TLS-55 centrifuge tube | Beckman coulter | 343778 | |
| 200-μL yellow tip | Starlab | S1111-0706 | |
| 1,000-μL Blue Graduated Tip | Starlab | S1111-6801 | |
| 1.5-mL test tube | Axygen | MCT-175-C 311-04-051 | |
| 18-mm diameter round coverslip | Assistent | 1001/18 | |
| 35-mm diameter round dish with a 20-mm glass bottom (0.16 - 0.19 mm) | In vitro Scientific | D35-20-1.5-N | |
| Refractometer | Carl Zeiss | 79729 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Sorvall WX80 Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46900 | |
| Tabletop ultracentrifuge | Beckman coulter | TL-100 | |
| SW60 rotor | Beckman coulter | 335649 | |
| TLS-55 rotor | Beckman coulter | 346936 | |
| Confocal microscopy | Carl Zeiss | LSM-780 | |
| Fugene HD transfection reagent | Promega | E2311 | |
| Protein assay reagent A | Bio-Rad | 500-0113 | |
| Protein assay reagent B | Bio-Rad | 500-0114 | |
| Protein assay reagent S | Bio-Rad | 500-0115 | |
| Cell scraper | Homemade | Silicone rubber piece of about 2 cm, cut at a very sharp angle and attached to a metal bar or held with forceps | |
| Refractometer | Carl Zeiss | ||
| Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Sigma-Aldrich | M0643 | |
| FCS | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Thermo Fisher Scientific | 11140-035 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| pH Meter 691 | Metrohm | ||
| ImageJ software | NIH, Bethesda MD |
References
- Huotari, J., Helenius, A.
- Scott, C. C., Vacca, F., Gruenberg, J. Endosome Maturation, Transport and Functions. Semin. Cell Dev Biol. 31, 2-10 (2014).
- Puthenveedu, M. A., et al. Sequence-dependent sorting of recycling proteins by actin-stabilized endosomal microdomains. Cell. 143 (5), 761-773 (2010).
- Seaman, M. N., Gautreau, A., Billadeau, D. D. Retromer-mediated endosomal protein sorting: all WASHed up! Trends Cell Biol. 23 (11), 522-528 (2013).
- Burd, C., Cullen, P. J. Retromer: a master conductor of endosome sorting. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (2), a016774 (2014).
- Woodman, P. G., Futter, C. E. Multivesicular bodies: co-ordinated progression to maturity. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 408-414 (2008).
- Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Emr, S. D.
- Morel, E., Gruenberg, J. Annexin A2 binding to endosomes and functions in endosomal transport are regulated by tyrosine 23 phosphorylation. J Biol Chem. 284 (3), 1604-1611 (2009).
- Muriel, O., Tomas, A., Scott, C. C., Gruenberg, J. Moesin and cortactin control actin-dependent multivesicular endosome biogenesis. Mol Biol Cell. 27 (21), 3305-3316 (2016).
- Sonnichsen, B., De Renzis, S., Nielsen, E., Rietdorf, J., Zerial, M. Distinct membrane domains on endosomes in the recycling pathway visualized by multicolor imaging of Rab4, Rab5, and Rab11. J Cell Biol. 149 (4), 901-914 (2000).
- Morel, E., Parton, R. G., Gruenberg, J. Annexin A2-dependent polymerization of actin mediates endosome biogenesis. Dev Cell. 16 (3), 445-457 (2009).
- Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
- Granger, E., McNee, G., Allan, V., Woodman, P. The role of the cytoskeleton and molecular motors in endosomal dynamics. Semin Cell Dev Biol. 31, 20-29 (2014).
- Mayran, N., Parton, R. G., Gruenberg, J. Annexin II regulates multivesicular endosome biogenesis in the degradation pathway of animal cells. EMBO J. 22 (13), 3242-3253 (2003).
- Gorvel, J. P., Chavrier, P., Zerial, M., Gruenberg, J. rab5 controls early endosome fusion in vitro. Cell. 64 (5), 915-925 (1991).
- Wandinger-Ness, A., Zerial, M. Rab proteins and the compartmentalization of the endosomal system. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (11), a022616 (2014).
- Balch, W. E., Glick, B. S., Rothman, J. E. Sequential intermediates in the pathway of intercompartmental transport in a cell-free system. Cell. 39 (3 Pt 2), 525-536 (1984).
