Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

В пробирке Полимеризация F-актина на ранних Endosomes

Published: August 28, 2017 doi: 10.3791/55829
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry, University of Geneva, 2Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne

Summary

Ранние endosome функции зависят от F-актина полимеризации. Здесь мы описываем микроскопии основанные в vitro assay, который восстанавливает нуклеации и полимеризации F-актина на начале от англ мембраны в пробирках, делая этот комплекс серии реакций поддаются биохимических и генетических манипуляции.

Abstract

Многие ранние endosome функции, особенно грузовых белка сортировки и мембраны деформации, зависит патчи короткие F-миозина нитей, тому на мембраны от англ. Мы создали на основе микроскопии в vitro assay, который восстанавливает нуклеации и полимеризации F-актина на начале от англ мембраны в пробирках, делая этот комплекс серии реакций поддаются генетических и биохимических манипуляции. Размещения в сахарозы градиенты из клеток, выражая раннего от англ белка GFP-RAB5 готовятся дроби от англ. Цитозольной фракции готовятся из отдельных партий клеток. От англ и цитозольной фракции могут храниться в жидком азоте, при необходимости. В assay от англ и цитозольной фракции являются смешанными, и смесь инкубировали при 37 ° C при соответствующих условиях (например, ионной силы, сокращение среды). В нужное время реакционную смесь является фиксированным, и F-актина раскрывается с Фаллоидин. Актин нуклеации и полимеризации затем анализируются микроскопии флуоресцирования. Здесь мы сообщаем, что этот assay может использоваться для изучения роли факторов, которые участвуют в актина нуклеации на мембрану, или последующих удлинение, ветвление или сшивки F-миозина нитей.

Introduction

В высших эукариотических клеток белков и липидов интернализации в начале endosomes, где происходит сортировка. Некоторые белки и липиды, которые суждено быть переработке, включены в трубчатых регионов раннего endosomes и затем транспортируется к плазматической мембраны или транс Гольджи сеть (TGN)1,2. Напротив другие белки и липиды выборочно упаковываются в регионах раннего endosomes, которые экспонат multivesicular внешний вид. Эти регионы расширить и на отрыв от ранних мембран от англ, в конечном итоге Зрелые в свободной от англ перевозчик везикулы или multivesicular органов (ECV/MVBs), которые отвечают за грузового транспорта на конце endosomes1, 2.

Актина играет решающую роль в процессе реконструкции мембраны, связанные с endosome биогенеза сортировки потенциала от англ. Сортировка по утилизации пути к плазматической мембраны или TGN белка зависит от связанных белков и retromer комплекс. Этот механизм сортировки, как представляется, быть связан к формированию рециркуляции трубочки через взаимодействия retromer комплекс, с WASP и шрам гомолог (ВСГ) сложной и разветвленной актина3,4,5 . В отличие от молекул предназначенных для деградации, особенно активации сигнализации рецепторов, в внутрипросветная везикулы (ILVs), сортируются от англ, сортировка комплексы для транспорта (ESCRT)2,6, 7. Хотя возможная роль актина в процессе сортировки зависит от ESCRT не известно, F-актина играет важную роль в биогенеза ECV/MVBs и транспорта за ранней endosomes. В частности мы обнаружили, что annexin A2 связывает холестерин обогащенный регионов ранних endosome и вместе с spire1, зарождается F-актина полимеризации. Формирование сети разветвленной актина, наблюдается на endosomes требует ветвления деятельность связанных с актина белка (ARP) 2/3 комплекс, а также moesin белка ERM и актин связывания белка cortactin8,9.

Здесь мы описываем микроскопии основанные в vitro assay, который восстанавливает нуклеации и полимеризации F-актина на начале от англ мембраны в пробирках. Ранее был использован этот assay расследовать роль annexin A2 в F-актина нуклеации и moesin и cortactin в формировании от англ актина сети8,9. Этот протокол в пробирке серии сложных реакций, которые происходят на endosomes в процессе полимеризации актина стать поддаются биохимических и молекулярных анализ последовательных шагов этого процесса, включая актина нуклеации, линейный полимеризация, ветвления и сшивки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. решения и препараты

Примечание: все буферы и решения должны быть подготовлены в двойной дистиллированной (dd) H 2 O. Потому что меняется состояние гидратации сахарозы, конечная концентрация всех решений сахароза должна определяться с помощью рефрактометра.

  1. Подготовить фосфат амортизированное saline без двухвалентной катионов (PBS-): 137 мм NaCI, 2,7 мм KCl, 1,5 мм х 2 PO 4 и 6,5 мм Na 2 HPO 4. Отрегулируйте пэ-аш до 7,4. Стерилизация автоклавированием (1 цикл при температуре 121 ° C 15 мин) и хранить при комнатной температуре.
  2. Подготовить Стоковый раствор 300 мм имидазола: 0,204 g имидазола в 10 мл ddH 2 O.Adjust рН 7,4 на 4 ° C, с использованием HCl. фильтр-стерилизации с помощью 0,22 мкм поры размер фильтра и хранить при 4 ° C.
  3. Подготовка гомогенизации буфера (HB; подготовки приблизительно 100 мл): 250 мм сахарозы в 3 мм имидазола. Отрегулируйте пэ-аш до 7,4 на 4 ° C, с помощью рН метр. Фильтр стерилизации с помощью фильтра размер пор 0,22 мкм и хранить при 4 ° C. дополнение HB непосредственно перед использованием с коктейлем ингибиторов протеазы в окончательный концентрациях, соответствующий 10 мм leupeptin, А pepstatin 1 мм и 10 нг/мл Апротинин.
  4. Для размещения градиентов шаг, подготовить 62%, 39% и 35%-ая сахароза решения в 3 мм имидазола, рН 7,4, как описано ниже. Точно определить окончательный концентрации всех решений сахарозы с помощью рефрактометра.
    1. Подготовить 100 мл раствора сахарозы 62% в 3 мм имидазола, рН 7,4. Растворяют путем перемешивания 80.4 г сахарозы в ddH 2 O предварительно разогретую до 35 ° C. Добавить 1 мл 300 мм имидазола Стоковый раствор и заполнить до 100 мл с ddH 2 O. Adjust рН 7,4 на 4 ° C. фильтр-стерилизации с помощью 0,22 мкм поры размер фильтра и магазин при 4 ° C.
    2. Подготовить 100 мл раствора сахарозы 35% в 3 мм имидазола, рН 7,4. Растворяют путем перемешивания 40.6 г сахарозы в ddH 2 O. Добавить 1 мл 300 мм имидазола Стоковый раствор и заполнить до 100 мл с ddH 2 O. Регулировка рН 7,4 на 4 ° C. фильтр-стерилизации с помощью 0,22 мкм поры размер фильтра и хранить при 4 ° C.
    3. Подготовка 50 мл 39% сахарозы в 3 мм имидазола, рН 7,4. Разбавьте раствор сахарозы 62% 35% раствором сахарозы. Хранить при 4 ° C.
  5. Растворить 3 g параформальдегида (PFA) путем перемешивания в 100 мл PBS-предварительное warmed до 60 ° C при добавлении 1 M NaOH каплям; настроить окончательный рН 7,4, с использованием NaOH. Фильтр стерилизации с помощью фильтра размер пор 0,22 мкм и хранить при -20 ° с.
    Предупреждение: 3% PFA является токсичных реагентов.
  6. Раствор готовят 1 M KCl. Распустить 3.73 г KCl при перемешивании в 50 мл ddH 2 O. фильтр-стерилизации с помощью фильтра размер пор 0,22 мкм и хранить при комнатной температуре.
  7. Подготовка 50 X сосредоточены акций раствор, содержащий 0,625 М Hepes pH 7.0 и 75 мм MgOAc 2 ddH 2 O. Алиготе и хранить в -20 ° с.
  8. Подготовка монтажа среднего. Смесь, помешивая 2.4 g poly(vinyl alcohol) M w ~ 31000 (ПВА) с 6 г глицерина. Добавить 6 мл ddH 2 O и оставить по крайней мере 2 ч при комнатной температуре. Добавить 12 мл 0,2 М трис-Cl (рН 8,5) и тепла к ° C приблизительно 53 с иногда помешивая, пока не растворится ПВА.
  9. Уточнить решения центрифугированием в 5000 x g 20 мин при комнатной температуре. Собирать супернатант и добавить 2,5% (w/v) 1,4 - diazabicyclo-[2.2.2] октана (DABCO) для предотвращения Фотообесцвечивание во время флуоресценции обнаружения. Вортекс для около 30 s распустить. Аликвота в 1,5 мл пластиковых трубок и хранить при -20 ° с.

2. Клеточные культуры

  1. культуры НеЬа клетки в Дульбекко ' s Modified Eagle среднего дополнена плода теленка 10% сыворотки, 10% несущественные аминокислот, 10% L-глютамином и 1% пенициллин стрептомицином. Поддерживать их при 37 ° C в 5% CO 2 инкубатора.
  2. Transfect клетки 24 h перед эксперимент с GFP-RAB5 10, используя коммерческие трансфекции реагента по заявлению производителя ' s инструкции.
  3. При необходимости, подготовить дроби от англ и цитозоле от клетки истощены протеина интереса (то есть, используя RNAi или ТРИФОСФАТЫ/Cas9) и/или экспрессирующих форму wildtype или мутанта протеина интереса.

3. Подготовка дроби от англ

Примечание: этот протокол описывает простой подготовке субцеллюлярные фракций, содержащих endosomes и другие легкие мембраны. При необходимости, очищенный endosome фракции также может быть использоваться 11. Готовить 2 чашки Петри (наружный диаметр 10 см; 57 см 2) вырожденная клеток, выражая GFP-RAB5 как исходный материал. Общее количество вырожденная клеток HeLa в 2 чашки Петри примерно соответствует 2,5 x 10 7 клеток. Когда необходимо, endosomes также может быть получен из клетки истощены протеина интереса (то есть, используя RNAi или ТРИФОСФАТЫ/Cas9) и/или экспрессирующих форму wildtype или мутанта протеина интереса, всегда выражая GFP-RAB5.

ОСТОРОЖНОСТЬЮ: все шаги фракционирование протокола должна быть выполнена на льду

  1. Петри на влажной металлической пластиной в плоский ведро льда и немедленно вымыть клетки дважды с 5 мл ледяной PBS-.
  2. Удаления всех PBS - из последнего мыть и добавить 3 мл ледяной PBS-за блюдо. Клетки не должна сохнуть при обработке: в случае необходимости, место ведро льда на качающейся платформе адекватно охватывать клетки с жидкостью.
  3. Механически удалить ячейки в PBS из Петри, используя гибкий резиновый полицейский (т.е., домашний мобильный волокуши). Скрип клетки от блюда сначала в быстро, круговые движения вокруг вне блюдо, следуют нисходящего движения в середине блюдо. Скрип осторожно, чтобы получить " листы " прилагаемый клеток. Аккуратно перенести ячейки, используя пластиковые пипетки Пастера с широким отверстием 15 мл конические полипропиленовые трубы на ice.
  4. Центрифуги для 5 минут при 175 x g и 4 ° C.
  5. Осторожно удалить супернатант (СН) и добавить 1-3 мл HB в гранулы. С помощью Пластиковая пипетка Пастера с широким отверстием, нежно Пипетка вверх и вниз один раз чтобы Ресуспензируйте клетки.
  6. Центрифуги для 7-10 мин в 1355 x g и 4 ° C. Осторожно удалить SN.
  7. Выполняют клетки гомогенизации.
    Примечание: Условия должны быть нежным, так что плазменных мембран клеток разбиты, но endosomes остаются нетронутыми.
    1. Добавить известный объем HB с ингибиторами протеазы на каждой ячейки Пелле (примерно 100 мкл в Пелле клеток). Аккуратно с помощью микропипеткой 1000 мкл, Пипетка вверх и вниз до тех пор, пока высокомобильна клетки. Не надо ввести воздушных пузырьков.
    2. Подготовить туберкулин 1 мл шприц с иглой 22G предварительно промыть HB и свободного воздуха или пузырьков.
    3. Наполните шприц суспензию клеток сравнительно медленно (чтобы избежать создания пузырьков воздуха), место среза кончик иглы к стене трубы и высылать суспензию клеток быстро для сдвига от мембраны плазмы клеток прилагаемый.
    4. Взять небольшой Алиготе огневки (примерно 3 мкл) и развести его в 50 мкл HB на стеклянное скольжение. Mix и крышка с coverslip стекла. Осмотрите огневки под микроскопом фазово контрастной оснащены 20 X или 40 X цель.
      Примечание: При оптимальных условиях, большинство клеток нарушена, но не являются ядра, которые появляются как темно-серый и круглых структур, ( рис. 1).
    5. Повторите шаг 3.7.3 и 3.7.4 до большинства клеток сломанной; как правило, необходимы 3-6 прихваченного ударов через иглу. Храните небольшой Алиготе (10-30 мкл) огневки для определения белков.
  8. Гомогенат трутневых центрифуги для 7 мин в 1355 x g и 4 ° C.
    Примечание: после центрифугирования, гранулы (определяемой как ядерной гранулы; NP) содержит ядра и супернатант (определяемой как шпагу супернатант; ПНС) содержит цитозоле и органеллы, выпущенный после гомогенизации и свободного подвеса.
  9. Тщательно собирать ПНС. Держите небольшой аликвоты (10-30 мкл) векселей и NP для определения белков и отбросить NP.
  10. Отрегулировать ПНС на 40,6% сахарозы, разбавляя 62% раствор сахарозы с ПНС, с использованием коэффициента 1:1.1 PNS:62% сахарозы. Смесь осторожно, но тщательно, не создавая пузырьки воздуха. Проверка концентрации сахарозы с помощью рефрактометра.
  11. Место ПНС в 40,6% сахарозы в нижней части трубки ultracentrifugation. Наложение тщательно с 2,5 мл раствора сахарозы 35% и заполнить пластиковых пробирок с HB.
    Примечание: Сахароза решения следует слоистых интерфейсов явно видны.
  12. Ультрацентрифуга градиенты на 1 ч в ̴165, 000 x g и 4 ° C.
  13. Тщательно удалить белый слой липидов на вершине градиента. Далее, собирать интерфейс, содержащий endosomes, между HB и 35%-ая сахароза, используя 200 мкл микропипеткой с вырезать кончик.
    Примечание: Дроби от англ может использоваться непосредственно в assay актина полимеризации в пробирке или может быть aliquoted на льду, флэш замороженные в жидком азоте и хранятся на -80 ° C.
  14. Определения концентрации белковых фракций ПНС и от англ.
    Примечание: Эта концентрация должна быть по крайней мере 100 мкг/мл. Примерно 2,5 x 10 7 клеток, выращиваемых в 2 чашки Петри необходимы для получения ПНС с по крайней мере 100 мкг/мл (см. примечание выше).

4. Цитозоль подготовка

Примечание: подготовка 2 чашки Петри (диаметр 10 см; 57 см 2) вырожденная клеток HeLa как исходный материал. При необходимости, цитозоле также может быть получен из клетки истощены протеина интереса (то есть, используя RNAi или ТРИФОСФАТЫ/Cas9) и/или экспрессирующих wildtype или мутантные формы протеина интереса. Что касается протокола endosome фракционирования, все шаги должны выполняться на ice.

  1. Повторите пункты 3.1-3.8.
  2. Место ПНС в пластиковых пробирок и ультрацентрифугирования 45 мин в ̴250, 000 x g и 4 ° C.
  3. Тщательно удалить белый слой на вершине и собирать SN (цитозоль фракция) не нарушая микросомы Пелле. Держите Алиготе цитозоль дроби для определения белков.
    Примечание: Цитозоль может использоваться непосредственно в assay актина полимеризации в пробирке или может быть aliquoted на льду, флэш замороженные в жидком азоте и хранятся на -80 ° C.
  4. Определить концентрацию белка цитозоль.
    Примечание: Он должен быть по крайней мере 3 мг/мл.

5. Assay измеряя Endosome зависимых актина полимеризации В пробирке

Примечание: Endosome зависимых актина полимеризации может производиться с использованием двух альтернативных подходов. Первый подход материалы смешиваются в пробирке, фиксированной и переведен в coverslip и проанализированы. Второй подход, описанный здесь assay может осуществляться непосредственно в тепловизионной камере и можно фиксированной и анализировать без механических возмущений ( рис. 2 c). В этой второй подход пробирного смесь не передается из пробирки coverslip и таким образом остается невозмущенной, уменьшение опасности F-актина сетей, будучи физически возмущенных во время передачи. Кроме того этот второй подход совместим с покадровый анализ F-актина полимеризации. Следует отметить, что с любой подход было отмечено никакой разницы в анализе F-актина полимеризации.
Примечание: Использование вырезать советы по всему протоколу.

  1. В пробирке
    1. нежно микс ледяной очищенный GFP-RAB5 endosomes (шаг 3) с цитозоле (шаг 4) в соотношении 1:10 (концентрация белка) в ледяной 1,5 мл коническую пробирку.
      Примечание: Типичный эксперимент проводится с приблизительно 40-50 мкл.
    2. Настроить ледяной реакционную смесь для окончательного концентрации 125 мм KCl (с помощью Стоковый раствор KCl 1 М), 12,5 мм Hepes и 1,5 мм MgOAc 2 (с использованием 50 x Стоковый раствор). Затем настройте в смеси с ингибиторами протеазы для окончательного концентрации leupeptin 10 мм, 1 мм pepstatin A и 10 нг/мл Апротинин. Осторожно смешать все компоненты.
    3. И инкубировать на требуемое время и место пробирки, содержащие реакционной смеси при 37 ° C без встряхивания,.
      Примечание: Как правило, это займет примерно 3 мин для обнаружения актина полимеризации на endosomes и 30 минут для формирования широкой сети.
    4. В нужный момент (т.е., 3 мин или 30 мин), остановить реакции, поместив пробирки на льду и добавить 1/10 (vol:vol) помощи 3% раствора PFA.
    5. Добавить 0.3:10 (vol:vol) из 200 единиц/мл (~6.6 мкм) Фаллоидин спрягаются в красно оранжевый краситель пятно полимеризованной актина.
    6. Место 12 мкл смеси на 12 мкл ПВА монтажа среды на слайде микро стекла. Положить сверху coverslipon стекла 18 x 18 мм 2.
    7. Анализ образца с confocal микроскопии.
  2. В тепловизионной камере
    1. сделать микроскопических тепловизионных камер, используйте плазмы пылесос за 1 мин для очистки круглые диаметром 18-мм coverslip и круглых 35 мм диаметр Петри с низа стекла 20 мм (0,16-0,19 мм).
    2. Инкубировать очищенные поверхности с 1% β-казеина для 20 минут свести к минимуму связывания белков на стекло. Мыть дважды с 3 мм имидазола.
    3. Добавить endosome и цитозоле, в том же пробирного смесь как шаги 5.1.1 и 5.1.2, к помощи 1,5 мл пробирку и дополняют пробирного смесь с 0,1 мкг/мкл родамин актина.
    4. Настроить окончательный преломления смеси 1.375 (26,5% сахарозы) 39% раствором сахарозы.
      Примечание: Как правило, добавляется того же объема; Однако, это должно быть эмпирически повторно скорректированной, в зависимости от концентрации сахарозы собираемой фракции, определяется с использованием refractomer, так как концентрация сахарозы может слегка изменить от эксперимента к эксперимент.
    5. Поместить смесь в предварительно обработанные блюдо 35-мм (шаг 5.2.1) и залить предварительно обработанные coverslip 18-мм (шаг 5.2.1).
    6. Место палата при 37 ° C без встряхивания.
    7. Анализ образца с помощью конфокальной микроскопии флуоресцирования.

6. Внешние изображенияние анализа актина сети и

  1. захвата изображений
    1. приобрести изображений на Перевернутый Сканирующий конфокальный микроскоп.
      Примечание: Приобретение параметры изображения были оптимизированы для Перевернутый Сканирующий конфокальный микроскоп с целью нефти NA 63 X 1,25. Отрегулируйте мощность лазера (обычно около 50%), для достижения хорошее соотношение сигнал шум.
  2. Количественное определение сети актина
    1. анализ флуоресцентной микроскопии. Использование программного обеспечения с открытым исходным кодом CellProfiler (v2.1.1) 12 измерить количество актина за endosome (альтернативное программное обеспечение может использоваться).
      1. Во-первых, определить endosomes как основной объект с помощью GFP-RAB5 сигнал. Затем, количественно F-актина, связанные с отдельными endosomes, используя распространение сигнала актина (красно оранжевый краситель конъюгированных Фаллоидин) как вторичные объект.
      2. Средняя и нормализует количество связанного материала для каждого объекта в состояние элемента управления.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Чтобы получить понимание формирования F-актина патчи на ранних endosome мембраны, мы следовали протокол, изложенные на рисунке 2. Вкратце были transfected клеток с GFP-RAB5 и затем раннего endosomes были подготовлены субцеллюлярные фракционирования. Эти чистые раннего endosomes инкубировали с цитозоле обеспечить актина сам, а также другие факторы, возможно, участвующих в реакции. В конце инкубационного периода реакция была остановлена фиксации смеси. Образец был затем сбор и хранение на микроскопический слайд. Наконец было выявлено F-актина с Фаллоидин (рис. 3A). Нуклеации F-актина на начале от англ мембраны, а также процесс последующей полимеризации произошло быстро. Действительно F-актина уже могут быть визуализированы на endosomes в течение 1 мин после начала реакции (рис. 3A).  Эти актина структуры, которые были первоначально короткие, быстро стал больше, разветвленной и связаны друг с другом приводит к формированию сети переплетенных миозина нитей (Рисунок 3А), предположительно отражающий несбалансированным актина динамика в пробирке. Аналогичные показатели нуклеации и полимеризации были замечены, когда проба была проведена с очищенной родамин меченых актина помимо цитозоль клетки. Это было сделано в блюда с прозрачным дном, так что структуры могут быть imaged непосредственно, в отсутствие каких-либо возмущений (рис. 3B). В assay, описанные здесь ранние endosomes nucleate de novo актина полимеризации выборочно. Действительно полимеризацию миозина не происходит, когда в пробирке реакция была проведена в отсутствие endosomes или цитозоль. Таким образом, сделать вывод, что ранние endosomes обладают фундаментальных способность поддерживать нуклеации и последующей полимеризации филаментов актина9,11.

Чтобы проанализировать количество актина полимеризуется от endosomes, изображения, полученные в разное время были проанализированы с использованием CellProfiler (рис. 4A). Количество актина полимеризуется в endosome была измерена как области актина вокруг единого раннего endosome. Скорость полимеризации актина был выше в начале процесса и снизилась с течением времени (рис. 4В).  Актин сети мог быть проанализирован более подробно на ранние моменты времени после начала реакции. В эти ранние моменты времени отдельных структур, содержащих актина может быть по-прежнему быть продифференцированным друг от друга. Для того чтобы оценить организацию в сложных сетей актина, было подсчитано количество нитей актина, вытекающих из каждой endosome (то есть, основной нити). Аналогично подсчитывалось количество нитей актина, возникая от первичной нити (то есть, вторичных волокон), а также количество всех других нитей актина, которые могут быть выявлены в сетях и что не возникли от endosomes ( то есть, другие нити) (Рисунок 4 c-E. После того, как были прослежены филаментов актина, другие параметры, такие как длина отдельных миозина нитей и количество endosomes, подключенных к же филаментов актина, может быть легко рассчитывается (Рисунок 4F).

Figure 1
Рисунок 1: фаза контраст Микрофотография клеток HeLa огневки. После гомогенизации экстракт был установлен между микроскопических слайдов и coverslip. Для публикации с 100 X цели после погружения нефти были захвачены микроскопии. Однако, для обычной инспекции, под 20 X или 40 X цели без погружения нефти был визуализирован выдержки клетки. (A-B) показаны два примеры высокого увеличения просмотров огневки. Ядер (звезда) появляются в виде круглых структур темно-серый цвета, без вложенных клеток остатки. Стрелки указывают характерные гранул различного размера, формы и прозрачность, которые выпускаются на ячейку гомогенизации и соответствуют внутриклеточных материалы (т.е., органеллы). Шкалы бар = 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: Схематическое представление протокола. Схематическое описание протоколов, используемых для подготовки от англ экстракты (A) и цитозоле экстрактов (B) и следить за актина полимеризации из endosomes в пробирке (C). Супернатант (SN), гомогенизации буфер (HB), шпагу супернатант (ПНС), ядерной Пелле (NP) и параформальдегида (PFA). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: Нуклеации и полимеризации F-актина на ранних Endosomes In Vitro. Endosomes (A), очищенного от НеЬа клетки выражая GFP-Rab5 (зеленый) и цитозоле НеЬа были подготовлены отдельно. В assay, ранние endosomes (ЭЭС) были смешаны с цитозоле, и смесь была инкубированы для указанного раз. Смесь была исправлена, помечены Фаллоидин (красный) надпись F-актина и анализируемой конфокальной микроскопии флуоресцирования. Бары: 10 мкм (Верхняя панель) и 5 мкм (Нижняя панель). (B) ЕЭС, очищенного от НеЬа клетки, выражая GFP-Rab5 (зеленый) и цитозоле НеЬа были подготовлены отдельно. Эти выдержек клетки инкубировали с очищенной родамин актина (красный) для указанного раз в камеры микроскопа и были проанализированы confocal микроскопии. Шкалы бар = 10 мкм. (C) эксперимент проводился как A. НеЬа цитозоле (без ЕЭС) и HeLa endosomes (зеленый) помечены GFP-Rab5 (без цитозоль) инкубировали отдельно (левой и средней панели) или вместе (правая панель) 30 мин, фиксированной, помечены Фаллоидин (красный) надпись F-актина и анализируемой конфокальной микроскопии флуоресцирования. Шкалы бар = 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: анализ сети актина. (A) процесс анализа CellProfiler. (B) количество полимеризованной актина были количественно по сравнению с числом endosomes с помощью программного обеспечения CellProfiler. Данные являются средний ± s.e.m. (n = 3). Данные являются средством ± с.д. (n = 3). 5 мин против 15 мин (ns P= 0.0736), 5 мин по сравнению с 30 мин (* P = 0.0195) и 15 мин против 30 мин (ns P = 0.3129). (C)Начале endosomes (ЕЭС), очищенного от клеток Hela, выражая GFP-Rab5 и HeLa цитозоль готовились отдельно, и проба была проведена как показано на рисунке 2А. Образцы были исправлены после 7 мин. На средней панели показано же Микрофотография, с перекрытием следы F-актина структур с помощью плагина NeuronJ13 ImageJ программного обеспечения. На правой панели показано только следы. Шкалы бар = 10 мкм. (D) представление F-актина структура последовательность нумерации, использовано в квантификации с ImageJ программного обеспечения. (E) количественная оценка количество нитей актина, как определено в C-D. Данные являются средством ± с.д. (n = 3). Основные ветви против вторичных ветвей (ns P = 0.5262), вторичных ветвей по сравнению с другими отраслями (ns P = 0.6815) и основные ветви по сравнению с другими отраслями (ns P = 0.2254). Структуры (F) Длина F-актина и количество ЭЭС в актина структуры отображаются как примеры других параметров не могут быть проанализированы с количественной оценки, определенный в C-D. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Актин играет решающую роль в endosome мембраны динамика4,14. Мы ранее сообщали, что актина нуклеации и полимеризации происходит на начале endosomes, образуя небольшие F-актина патчи или сетей. Эти сети F-актина абсолютно необходимы для мембранный транспорт за пределами ранних endosomes по пути деградации. Вмешательства на любом этапе этого процесса нуклеации и полимеризации предотвращает endosome созревания и, таким образом, ниже по течению транспорта к поздно endosomes andlysosomes9,11,15. В частности мы использовали assay, описанные выше для анализа последовательных шагов F-актина полимеризации на ранних endosomes и характеризовать процесс на молекулярном уровне.

В этих экспериментах ранние endosomes помечены GFP-RAB5 в естественных условиях, неразделимая субцеллюлярные фракционирования и инкубировали в пробирке присутствии цитозоль для F-актина полимеризации в пробирке. В нужное время реакция будет остановлена и реакционную смесь передается на микроскопический слайд для анализа в микроскопии флуоресцирования, используя Фаллоидин ярлык F-актина. С помощью этой экспериментальной стратегии, мы показали, что annexin A2 является необходимым для зарождения F-актина на ранних endosomes, вместе с SPIRE1, в то время как ARP2/3 опосредует F-актина ветвления, как ожидалось. Мы также показали, что moesin и cortactin необходимы для формирования сети F-актина, которые посредником ECV/MVB биогенеза и созревания по пути деградации клеток млекопитающих9,11.

Это важно иметь в виду, что, хотя низкий уровень ectopically выраженной RAB5 не изменяют endosomes на любой значительной степени10, этот небольшой ГТФазы является ключевым регулятором ранних endosome мембраны динамика16,17 . В некоторых экспериментах он поэтому может быть целесообразным лейбл endosomes в assay, с использованием альтернативных протоколов. Например ранние endosomes может быть удобно помечены с помощью флуоресцентных Трейсеры endocytosed, таких как эпидермальный фактор роста или трансферрина4,14.

Следует также отметить, что это технически трудно изображение отдельных актина нити с обычными confocal микроскопии. Таким образом мы ссылаемся на F-актина структур в тексте для описания актина сетей на endosomes. Как следствие мы считаем, что формирование сети F-актина может быть определена количественно более точно путем измерения площади поверхности сетей, вместо того, чтобы их интенсивности флуоресценции.

Это не легко полностью исключать возможность, что активность нуклеации актина наблюдаемые в пробирке при посредничестве некоторые другие структуры или органеллы, которая остается привязанным к RAB5 endosomes во время очистки. Однако такое загрязнение крайне маловероятно. В то время как некоторые органеллы совместно очищают на градиенты из-за аналогичные физические свойства, они не склонны оставаться количественно связанными друг с другом после очистки. Кроме того деятельность нуклеации актина строго зависит от annexin A24,14, который присутствует на ранних endosomes, содержащих RAB514. Наконец мы находим, что F-актина структуры связаны с RAB5 endosomes в vivo выборочно и не найдены на других endosomes или другие клеточные мембраны4,14. В заключение актина нуклеации активность скорее связаны с RAB5 endosomes, так как эта деятельность совместно очищает и локализует совместно с RAB5 endosomes.

В этот assay много как в других анализов, которые воссоздания сложных биохимических реакций этого элемента управления, что динамика endosomes16 или других оболочек18 и которые выполняются в пробирке, важно обеспечить, чтобы подготовка клеточных экстрактов является оптимальным. Клетки должны гомогенизированные нежный условиях для ограничения ущерба, endosomes и другие органеллы, особенно ядер и лизосом. Кроме того endosome фракций должны храниться на льду в условиях, которые сводят к минимуму осмотического и ионных стресс, а также самопроизвольно актина полимеризации. В дополнительных, относительно высокой концентрации endosome фракции (≥0.1 мг/мл) и цитозоле (≥3 мг/мл) необходимы для адекватного F-актина полимеризации на endosomes и обнаружения, как указано в шаге 3.13 и 4.4, соответственно. Аналогичным образом, важно провести пробу с 1:10 соотношение endosome в цитозоле (: протеин), как указано в шаге 5.1.1. Наконец закупорить после актина полимеризации (то есть, чтобы добавить PFA и Фаллоидин) должно быть сделано очень аккуратно во избежание рушится или разорвать актина сети.

При необходимости, assay полимеризации в vitro актина также может осуществляться непосредственно в Микроскоп изображений камеры, после добавления пробирного смесь, чтобы ограничить механические возмущения актина сетей полимеризуется очищенный родамин актина на endosomes (см. шаг 5.2.3 и рис. 2). В этом случае, это лучше всего настроить экстракт на 26,5% (0,85 М) сахарозы (рефракционной индекс 1.375), ограничения распространения и броуновское как движения (шаг 5.2.3), и для удаления возможных агрегатов очищенный родамин актина ultracentrifugation перед использованием. Наши наблюдения, что moesin контролирует формирование сети F-актина на endosomes были полностью сведены воедино с помощью этой альтернативной версии нашего анализа4,14.

Либо версии нашего протокола, в пробирке или в тепловизионной камере, является оптимальным для глобального анализа F-актина нуклеации и полимеризации на endosomes. Однако это не легко следить за процессом полимеризации актина через время, используя этот подход, частично потому, что endosomes не неподвижна. Следовательно, это не легко для мониторинга роста отдельных нитей и, таким образом, чтобы определить истории актина сети. Например это может быть трудно различать F-актина ветвления от сшивки. Однако мы убеждены в том, что условия для наблюдения за F-актина полимеризации в режиме реального времени может быть улучшена в тепловизионной камере путем оптимизации условий для иммобилизации endosomes. Аналогичным образом это будет интересно следить за F-актина полимеризации из искусственных оболочек с использованием очищенных компонентов. В самом деле ранее мы показали, что F-актина нуклеации и полимеризации может произойти на липосомы после привязки tОн нуклеации фактор annexin A2 на липосомы бислой11. Эта стратегия будет полезным для дальнейшего изучения роли конкретных липидов и белков в процессе зарождения и полимеризации F-актина и характеризуют минимальные компоненты, необходимые для образуют сеть F-актина на мембраны от англ. Наконец мы считаем, что эта стратегия будет весьма полезным для изучения других F-актин зависимых процессов, которые происходят на endosome мембраны, особенно призыва и мобилизации retromer/мыть машины.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Acknowledgments

Поддержка была получена от швейцарского национального научного фонда; Швейцарская компания "Синергия" программы; Польско Швейцарский исследований программы (PSPB-094/2010); NCCR в химической биологии; и LipidX из швейцарской SystemsX.ch инициативы, оцениваются как Швейцарский Национальный научный фонд (с J. G.). О. м. была поддержана EMBO долгосрочных стипендий (ALTF-516-2012).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Sigma-Aldrich 71380
KCl Acros Organics 196770010
KH2PO4 AppliChem A1042
Na2HPO4 Acros Organics 424370025
Hepes AppliChem A3724
Magnesiun acetate tetrahydrate Fluka 63047
Dithiothreitol (DTT) AppliChem A2948
Imidazole Sigma-Aldrich 10125
NaOH Fluka 71690
Sucrose Merck Millipore 107687
Leupeptin Roche 11017101001
Pepstatin Roche 10253286001
Aprotinin Roche 10236624001
Paraformaldehide Polysciences. Inc 380
Alexa Fluor 555 phalloidin Molecular Probes A34055
Actin rhodamine Cytoskeleton. Inc APHR-A
Mowiol 4-88 Sigma-Aldrich 81381 poly(vinyl alcohol), Mw ~31 000
DABCO Sigma-Aldrich D-2522
Tris-HCl AppliChem A1086
β-casein Sigma-Aldrich C6905
Filter 0.22 μm Millex SL6V033RS
Round 10 cm dishes for cell culture Thermo Fisher Scientific 150350
Plastic Pasteur pipette Assistent 569/3 40569003
15-mL polypropylen tube TPP 91015
Hypodermic Needle 22G Black 30mm BD Microlance 300900
Sterile Luer-slip 1mL Syringes without needle BD Plastipak 300013
Micro glass slides Assistent 2406
18 x 18-mm glass coverslip Assistent 1000/1818
SW60 centrifuge tube Beckman coulter 344062
TLS-55 centrifuge tube Beckman coulter 343778
200-μL yellow tip Starlab S1111-0706
1,000-μL Blue Graduated Tip Starlab S1111-6801
1.5-mL test tube Axygen MCT-175-C 311-04-051
18-mm diameter round coverslip Assistent 1001/18
35-mm diameter round dish with a 20-mm glass bottom (0.16 - 0.19 mm) In vitro Scientific D35-20-1.5-N
Refractometer Carl Zeiss 79729
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Sorvall WX80 Ultracentrifuge Thermo Fisher Scientific 46900
Tabletop ultracentrifuge Beckman coulter TL-100
SW60 rotor Beckman coulter 335649
TLS-55 rotor Beckman coulter 346936
Confocal microscopy Carl Zeiss LSM-780
Fugene HD transfection reagent Promega E2311
Protein assay reagent A Bio-Rad 500-0113
Protein assay reagent B Bio-Rad 500-0114
Protein assay reagent S Bio-Rad 500-0115
Cell scraper Homemade Silicone rubber piece of about 2 cm, cut at a very sharp angle and attached to a metal bar or held with forceps
Refractometer Carl Zeiss
Minimum Essential Medium Eagle (MEM) Sigma-Aldrich M0643
FCS Thermo Fisher Scientific 10270-106
MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) Thermo Fisher Scientific 11140-035
L-Glutamine Thermo Fisher Scientific 25030-024
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140-122
pH Meter 691 Metrohm
ImageJ software NIH, Bethesda MD

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huotari, J., Helenius, A. Endosome maturation. EMBO J. 30 (17), 3481-3500 (2011).
  2. Scott, C. C., Vacca, F., Gruenberg, J. Endosome Maturation, Transport and Functions. Semin. Cell Dev Biol. 31, 2-10 (2014).
  3. Puthenveedu, M. A., et al. Sequence-dependent sorting of recycling proteins by actin-stabilized endosomal microdomains. Cell. 143 (5), 761-773 (2010).
  4. Seaman, M. N., Gautreau, A., Billadeau, D. D. Retromer-mediated endosomal protein sorting: all WASHed up! Trends Cell Biol. 23 (11), 522-528 (2013).
  5. Burd, C., Cullen, P. J. Retromer: a master conductor of endosome sorting. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (2), a016774 (2014).
  6. Woodman, P. G., Futter, C. E. Multivesicular bodies: co-ordinated progression to maturity. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 408-414 (2008).
  7. Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Emr, S. D. The ESCRT pathway. Dev Cell. 21 (1), 77-91 (2011).
  8. Morel, E., Gruenberg, J. Annexin A2 binding to endosomes and functions in endosomal transport are regulated by tyrosine 23 phosphorylation. J Biol Chem. 284 (3), 1604-1611 (2009).
  9. Muriel, O., Tomas, A., Scott, C. C., Gruenberg, J. Moesin and cortactin control actin-dependent multivesicular endosome biogenesis. Mol Biol Cell. 27 (21), 3305-3316 (2016).
  10. Sonnichsen, B., De Renzis, S., Nielsen, E., Rietdorf, J., Zerial, M. Distinct membrane domains on endosomes in the recycling pathway visualized by multicolor imaging of Rab4, Rab5, and Rab11. J Cell Biol. 149 (4), 901-914 (2000).
  11. Morel, E., Parton, R. G., Gruenberg, J. Annexin A2-dependent polymerization of actin mediates endosome biogenesis. Dev Cell. 16 (3), 445-457 (2009).
  12. Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
  13. Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
  14. Granger, E., McNee, G., Allan, V., Woodman, P. The role of the cytoskeleton and molecular motors in endosomal dynamics. Semin Cell Dev Biol. 31, 20-29 (2014).
  15. Mayran, N., Parton, R. G., Gruenberg, J. Annexin II regulates multivesicular endosome biogenesis in the degradation pathway of animal cells. EMBO J. 22 (13), 3242-3253 (2003).
  16. Gorvel, J. P., Chavrier, P., Zerial, M., Gruenberg, J. rab5 controls early endosome fusion in vitro. Cell. 64 (5), 915-925 (1991).
  17. Wandinger-Ness, A., Zerial, M. Rab proteins and the compartmentalization of the endosomal system. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (11), a022616 (2014).
  18. Balch, W. E., Glick, B. S., Rothman, J. E. Sequential intermediates in the pathway of intercompartmental transport in a cell-free system. Cell. 39 (3 Pt 2), 525-536 (1984).

Tags

Биохимия выпуск 126 актина endosome RAB5 цитоскелета трафик в пробирке пробирного
<em>В пробирке</em> Полимеризация F-актина на ранних Endosomes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Muriel, O., Scott, C. C., Larios,… More

Muriel, O., Scott, C. C., Larios, J., Mercier, V., Gruenberg, J. In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes. J. Vis. Exp. (126), e55829, doi:10.3791/55829 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter