Summary
Funzioni di endosoma precoce dipendono dalla polimerizzazione di F-actina. Qui, descriviamo un saggio basato su microscopia in vitro che ricostituisce la nucleazione e la polimerizzazione di F-actina sulle prime membrane endosomal in provette, rendendo questa serie complessa di reazioni suscettibili di biochimica e genetica manipolazioni.
Abstract
Molte funzioni di endosoma precoce, particolarmente carico proteico ordinamento e membrana deformazione, dipendono dalla patch di brevi filamenti di F-actina nucleate sulla membrana endosomal. Abbiamo stabilito un dosaggio basato su microscopia in vitro che ricostituisce la nucleazione e la polimerizzazione di F-actina sulle prime membrane endosomal in provette, rendendo questa serie complessa di reazioni suscettibili di genetica e biochimica manipolazioni. Endosomal frazioni vengono preparate dal galleggiamento in pendenze del saccarosio dalle cellule che esprimono la precoce endosomal proteina GFP-RAB5. Citosoliche frazioni sono preparate da batch distinti delle cellule. Endosomal sia citosoliche frazioni possono essere congelate in azoto liquido, se necessario. Nell'analisi, la endosomal e frazioni citosoliche sono mescolate, e la miscela viene incubata a 37 ° C in condizioni appropriate (ad esempio, forza ionica, riducendo l'ambiente). Al momento desiderato, la miscela di reazione è stato risolto, e la F-actina si rivela con falloidina. Polimerizzazione e nucleazione di actina vengono poi analizzati da microscopia di fluorescenza. Qui, segnaliamo che questa analisi può essere usata per studiare il ruolo di fattori che sono coinvolti sia nella nucleazione di actina sulla membrana, o nel successivo allungamento, ramificazione o reticolazione dei filamenti di F-actina.
Introduction
Nelle cellule eucariotiche superiori, proteine e lipidi sono interiorizzati in early endosomes dove si verifica l'ordinamento. Alcune proteine e lipidi, che sono destinati ad essere riutilizzati, sono incorporati in tubolare regioni della early endosomes e poi trasportati alla membrana plasmatica o trans-Golgi network (TGN)1,2. Al contrario, altre proteine e lipidi in modo selettivo sono confezionati in regioni della early endosomes che presentano un aspetto multivesicular. Espandere queste regioni e, al momento di distacco dai primi endosomal membrane, finalmente maturo in vescicole di vettore libero endosomal o MVB (ECV/MVB), che sono responsabili di trasporto di merci verso gli endosomi ritardato1, 2.
Actina svolge un ruolo cruciale nel processo di rimodellamento della membrana associato endosomal ordinamento capacità e biogenesi endosoma. Proteina lungo le vie di riciclaggio alla membrana plasmatica o a livello di TGN dipende il retromer complessi e proteine associate. Questo macchinario ordinamento sembra essere accoppiato alla formazione di riciclaggio tubuli tramite interazioni della retromer complessa, con WASP e cicatrice omologo (WASH) complesse e ramificate actina3,4,5 . Al contrario, molecole destinati al degrado, particolarmente attiva segnalazione recettori, sono filtrate in vescicole intraluminal (ILVs) endosomal ordinamento complessi richiesti per trasporto (ESCRT)2,6, 7. Mentre non è noto il ruolo possibile di actina processo di cernita ESCRT-dipendente, F-actina svolge un ruolo importante nella biogenesi di ECV/MVB e nei trasporti oltre early endosomes. In particolare, abbiamo trovato che Annessina A2 Lega regioni colesterolo-arricchita della endosoma precoce e insieme spire1, costituisce la polimerizzazione di F-actina. La formazione della rete ramificata actina osservata su endosomi richiede l'attività di ramificazione della proteina actina-correlate (ARP) 2/3 complesso, così come l'ERM proteina moesina e i leganti l'actina proteina cortactin8,9.
Qui, descriviamo un saggio basato su microscopia in vitro che ricostituisce la nucleazione e la polimerizzazione di F-actina sulle prime membrane endosomal in provette. Questo test è stato utilizzato in precedenza per studiare il ruolo di Annessina A2 nella nucleazione di F-actina e moesin e cortactin nella formazione di endosomal actina reti8,9. Con questo protocollo in vitro , la complessa serie di reazioni che si verificano in endosomi durante la polimerizzazione dell'actina diventano suscettibile di analisi biochimica e molecolare dei passaggi sequenziali del processo, compresa la nucleazione di actina, lineare polimerizzazione, rami e reticolazione.
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Protocol
1. soluzioni e preparazioni
Nota: tutti i buffer e soluzioni devono essere preparati in bidistillata (dd) H 2 O. Poiché lo stato di idratazione di saccarosio varia, la concentrazione finale di tutte le soluzioni di saccarosio deve essere determinata utilizzando un rifrattometro.
Soluzione tampone fosfato e- preparare senza cationi bivalenti (PBS-): 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4 e 6,5 mM Na 2 HPO 4. Regolare il pH a 7.4. Sterilizzare in autoclave (1 ciclo a 121 ° C per 15 min) e conservare a temperatura ambiente.
- Preparare la soluzione di riserva di imidazolo 300mm: 0,204 g di imidazolo in 10 mL di ddH 2 O.Adjust il pH 7.4 a 4 ° C, utilizzando utilizzando un 0.22 μm a sterilizzare HCl. filtro filtro di dimensione del poro e conservare a 4 ° C. Buffer di
- Prepare omogeneizzazione (HB; preparare circa 100 mL): saccarosio 250 mM in imidazolo di 3 mM. Regolare il pH a 7,4 a 4 ° C, utilizzando un pH-metro. Filtro-sterilizzare utilizzando un filtro di dimensione dei pori di 0.22 μm e conservare a 4 ° C. complemento l'HB appena prima dell'uso con un cocktail di inibitori della proteasi alle concentrazioni finali corrispondenti a leupeptina 10 mM, 1 mM pepstatina A e 10 ng/mL aprotinina.
- Per le pendenze di galleggiamento di passaggio, preparare 62%, 39% e 35% di saccarosio soluzioni in imidazolo di 3 mM, pH 7.4, come descritto di seguito. Determinare con precisione la concentrazione finale di tutte le soluzioni di saccarosio usando un rifrattometro.
- Preparare 100 mL di soluzione di saccarosio di 62% in imidazolo di 3 mM, pH 7.4. Sciogliere agitando 80,4 g di saccarosio in ddH 2 O pre-riscaldato a 35 ° C. aggiungere 1 mL di soluzione madre di imidazolo di 300 mM e riempimento a 100 mL con ddH 2 O. Adjust il pH 7.4 a 4 ° C. filtro-sterilizzare usando un 0,22 μm filtrante di porosità e archivio a 4 ° C.
- Preparare 100 mL di soluzione di saccarosio del 35% in imidazolo di 3 mM, pH 7.4. Sciogliere mescolando 40,6 g di saccarosio in ddH 2 O. aggiungere 1 mL di soluzione di riserva di 300 mM imidazolo e riempire a 100 mL con ddH 2 O. regolare il pH a 7,4 a 4 ° C. filtro-sterilizzare usando un 0.22 μm filtro di dimensione del poro e conservare a 4 ° C.
- Preparare 50 mL di saccarosio al 39% in imidazolo di 3 mM, pH 7.4. Diluire la soluzione di saccarosio 62% con la soluzione di saccarosio del 35%. Conservare a 4 ° C.
- Sciogliere 3 g di paraformaldeide (PFA) in 100 mL di PBS-pre-warmed a 60 ° C, mentre l'aggiunta di 1 M NaOH goccia a goccia agitando; regolare il pH finale 7.4 usando NaOH. Filtro-sterilizzare utilizzando un filtro di dimensione dei pori di 0.22 μm e conservare a -20 ° C.
Attenzione: 3% PFA è un reagente tossico. - Soluzione di riserva di preparare 1 M KCl. Sciogliere 3,73 g di KCl per agitazione in 50 mL di ddH 2 utilizzando un filtro di dimensione dei pori di 0.22 μm O. filtro-sterilizzare e conservare a temperatura ambiente.
- Soluzione di riserva di preparare 50 X concentrato contenente 0,625 M Hepes pH 7.0 e 75 mm MgOAc 2 di ddH 2 parte aliquota O. e negozio a -20 ° C.
- Preparare mezzo di montaggio. Mescolare agitando 2,4 g di poly(vinyl alcohol) M w ~ 31.000 (PVA) con 6 g di glicerolo. Aggiungere 6 mL di ddH 2 O e lasciare per almeno 2 ore a temperatura ambiente. Aggiungere 12 mL di 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5) e calore a circa 53 ° C con agitazione occasionale fino a sciolta il PVA.
- Chiarire la soluzione mediante centrifugazione a 5.000 x g per 20 min a temperatura ambiente. Raccogliere il surnatante e aggiungere 2,5% (p/v) 1,4 - diazabiciclo-[2.2.2] ottano (DABCO) per evitare il photobleaching durante la rilevazione della fluorescenza. Vortice per circa 30 s a dissolversi. Aliquotare in tubi di plastica da 1,5 mL e conservare a -20 ° C.
2. Coltura di cellule
- cellule HeLa di cultura in Dulbecco ' s Modified Eagle Medium supplementato con 10% siero fetale del vitello, 10% non essenziali aminoacidi, 10% L-Glutammina e 1% di penicillina-streptomicina. Mantenerli a 37 ° C in un incubatore di 5% CO 2.
- Transfect le cellule 24 h prima dell'esperimento con GFP-RAB5 10, utilizzando il reagente di transfezione commerciale secondo il produttore ' istruzioni s.
- Quando necessario, preparare le frazioni endosomal e citosol dalle cellule impoverito di una proteina di interesse (cioè, tramite RNAi o CRISPR/Cas9) e/o che overexpressing forma wildtype o mutante della proteina di interesse.
3. Endosomal frazione preparazione
Nota: il presente protocollo descrive la preparazione semplice di frazioni subcellulari contenente gli endosomi ed altre membrane di luce. Se necessario, le frazioni purificate endosoma possono anche essere usato 11. Preparare 2 piastre di Petri (diametro esterno di 10 cm; 57 cm 2) di cellule confluenti che esprimono GFP-RAB5 come materiale di partenza. Il numero totale di cellule HeLa confluenti in 2 capsule di Petri corrisponde approssimativamente a 2.5 x 10 7 cellule. Quando necessario, gli endosomi può anche essere preparati dalle cellule impoverite di una proteina di interesse (cioè, tramite RNAi o CRISPR/Cas9) e/o che overexpressing forma wildtype o mutante della proteina di interesse, sempre che esprimono GFP-RAB5.
Attenzione: tutti i passaggi del protocollo frazionamento devono essere eseguiti su Ice.
- Posizionare le piastre Petri su un di piastra metallico bagnato in un secchio di ghiaccio piatto e lavare immediatamente le cellule due volte con 5 mL di PBS ghiacciata-.
- Rimuovere tutti PBS - dall'ultimo lavaggio e aggiungere 3 mL di PBS ghiacciata-per ogni piatto. Le cellule non dovrebbero asciugarsi durante la manipolazione: se necessario, posizionare il secchio di ghiaccio su una piattaforma a dondolo per coprire adeguatamente le cellule con fluido.
- Rimuovere meccanicamente le cellule in PBS dai piatti Petri utilizzando un poliziotto di gomma flessibile (cioè, ruspa spianatrice di cella fatti in casa). Raschiare le cellule fuori i piatti in primo luogo in un rapido movimento circolare intorno alla parte esterna del piatto, seguito da un movimento verso il basso al centro del piatto. Raschiare delicatamente per ottenere " fogli " di cellule allegate. Trasferire delicatamente le celle utilizzando una pipetta di Pasteur plastica con un'ampia apertura per un tubo in polipropilene conico di 15 mL su Ice.
- Centrifugare per 5 min a 175 x g a 4 ° C.
- Delicatamente rimuovere il supernatante (SN) e aggiungere 1-3 mL di HB al pellet. Utilizzando una pipetta di Pasteur plastica con un'ampia apertura, delicatamente Pipettare su e giù una volta per risospendere le cellule.
- Centrifuga per 7-10 min a 1.355 x g e 4 ° C. delicatamente togliere il SN.
- Eseguire omogeneizzazione cell.
Nota: Le condizioni dovrebbero essere delicate affinché le membrane plasmatiche delle cellule sono rotte ma gli endosomi rimangono intatti.- Aggiungi un volume noto di HB con inibitori della proteasi sul pellet ogni cella (circa 100 μL a pellet cellulare). Utilizzando una micropipetta di 1.000-µ l, delicatamente Pipettare su e giù fino a quando le cellule sono risospese. Non introdurre bolle d'aria.
- Preparare una siringa per tubercolina 1 mL con ago 22G pre-risciacquato con HB e privo di aria o bolle.
- Riempire la siringa con la sospensione cellulare relativamente lentamente (per evitare di creare bolle d'aria), posizionare la punta smussata dell'ago contro la parete del tubo ed espellere la sospensione cellulare rapidamente al taglio fuori le membrane plasmatiche delle cellule allegate.
- Prendere una piccola aliquota dell'omogenato (circa 3 µ l) e diluirlo in 50 µ l di HB su un vetrino. Mix e coprire con un vetrino coprioggetti. Ispezionare l'omogenato sotto un microscopio a contrasto di fase con un 20x o obiettivo 40x.
Nota: In condizioni ottimali, la maggior parte delle cellule sono rotta, ma i nuclei, che appaiono come grigio scuro e rotondo strutture, non sono ( Figura 1). - Ripetere il punto 3.7.3 e 3.7.4 fino alla maggior parte delle cellule sono rotti; di solito, sono necessari 3-6 colpi alti e bassi attraverso l'ago. Mantenere una piccola aliquota (10-30 µ l) dell'omogenato per la determinazione della proteina.
- Centrifuga omogeneato per 7 min a 1.355 x g e 4 ° C.
Nota: dopo la centrifugazione, il pellet (definito come la pallina nucleare; NP) contiene i nuclei e il surnatante (definito come il surnatante postnuclear; PNS) contiene il citosol e gli organelli rilasciati all'omogeneizzazione e in libera sospensione. - Raccogliere con cura il PNS. Tenere piccole aliquote (10-30 µ l) del PNS e NP per la determinazione della proteina e scartare il NP.
- Regolare il PNS al 40,6% saccarosio diluendo la soluzione di saccarosio 62% con PNS utilizzando un rapporto di 1:1.1 di PNS:62% di saccarosio. Mescolare delicatamente ma a fondo, senza creare bolle d'aria. Controllare la concentrazione di saccarosio utilizzando il rifrattometro.
- Posto il PNS a 40,6% saccarosio nella parte inferiore di un tubo di ultracentrifugazione. Overlay attentamente con 2,5 mL di soluzione di saccarosio al 35% e riempire la provetta da centrifuga con HB.
Nota: Le soluzioni di saccarosio devono essere stratificate affinché le interfacce sono chiaramente visibili. - Ultracentrifuga i gradienti per 1 h a ̴165, 000 x g e 4 ° C.
- Rimuovere con attenzione lo strato bianco di lipidi sopra il gradiente. Successivamente, raccogliere l'interfaccia contenente gli endosomi, tra la HB e 35% di saccarosio, utilizzando una micropipetta 200 μL con un taglio punta.
Nota: Le frazioni di endosomal può essere utilizzate direttamente nell'analisi della polimerizzazione dell'actina in vitro o può essere aliquotati sul ghiaccio, flash-congelati in azoto liquido e conservati a -80 ° C. - Determinare la concentrazione di proteina delle frazioni PNS ed endosomal.
Nota: Questa concentrazione deve essere almeno 100 µ g/mL. Circa 2,5 x 10 7 cellule sviluppate in 2 capsule di Petri sono necessari per ottenere un PNS con almeno 100 µ g/mL (vedere la nota riportata sopra).
4. Cytosol preparazione
Nota: preparare 2 capsule di Petri (diametro di 10 cm; 57 cm 2) delle cellule HeLa confluenti come materiale di partenza. Quando necessario, il citosol possono essere preparati anche da cellule impoverite di una proteina di interesse (cioè, tramite RNAi o CRISPR/Cas9) e/o che overexpressing una wildtype o la forma mutata della proteina di interesse. Per quanto riguarda il protocollo di frazionamento endosoma, tutti i passaggi devono essere eseguiti su Ice.
- Ripetere i passaggi da 3.1-3.8.
- Mettere il PNS in una provetta da centrifuga e ultracentrifuga per 45 min a ̴250, 000 x g e 4 ° C.
- Attentamente rimuovere lo strato bianco sulla parte superiore e raccogliere la SN (frazione di cytosol) senza disturbare il pellet del microsoma. Mantenere un'aliquota della frazione cytosol per la determinazione della proteina.
Nota: Il citosol può essere utilizzato direttamente nell'analisi della polimerizzazione dell'actina in vitro o può essere aliquotati sul ghiaccio, flash-congelati in azoto liquido e conservati a -80 ° C. - Determinare la concentrazione di proteine del citosol.
Nota: Dovrebbe essere almeno 3 mg/mL.
5. Analisi di misurazione endosoma dipendente dalla polimerizzazione dell'actina In Vitro
Nota: polimerizzazione dell'actina Endosome-dipendente può essere eseguita utilizzando due approcci alternativi. Nel primo approccio, i materiali sono mescolati in una provetta, fisso e trasferiti a un vetrino coprioggetto e analizzati. Nel secondo approccio, descritto qui, il dosaggio può essere effettuato direttamente nella camera di imaging e può essere risolto e analizzato senza perturbazione meccanica ( Figura 2). In questo secondo approccio, la miscela di analisi non viene trasferita da una provetta di un vetrino coprioggetto e così rimane imperturbata, diminuendo il pericolo delle reti di F-actina fisicamente essere perturbato durante il trasferimento. Inoltre, questo secondo approccio è compatibile con un'analisi time-lapse di polimerizzazione di F-actina. Va notato che nessuna differenza nell'analisi della polimerizzazione di F-actina è stata osservata con entrambi gli approcci.
Nota: Uso tagliata punte in tutto il protocollo.
- In una provetta
- delicatamente mix ghiacciata purificata GFP-RAB5 endosomi (passaggio 3) con citosol (passaggio 4) con un rapporto di 01:10 (concentrazione proteica) in una provetta conica ghiacciata 1,5 mL.
Nota: Un tipico esperimento effettuato con circa 40-50 µ l. - Regolare la miscela di reazione ghiacciata a concentrazioni finali di 125 mM KCl (utilizzando la soluzione di riserva del KCl 1m), 12,5 mM Hepes e 1,5 mM MgOAc 2 (utilizzando il 50 x soluzione di riserva). Quindi, regolare la miscela con gli inibitori di proteasi a concentrazioni finali di 10 mM leupeptina e pepstatina 1 mM A 10 ng/mL aprotinina. Mescolare delicatamente tutti i componenti.
- Mettere la provetta contenente la miscela di reazione a 37 ° C, senza agitarli e incubare per il tempo desiderato.
Nota: In genere, ci vorranno circa 3 minuti per rilevare la polimerizzazione dell'actina su endosomes e 30 min per la formazione di una vasta rete. - Al momento desiderato (cioè, 3 min o 30 min), fermare la reazione ponendo la provetta sul ghiaccio e aggiungere 1/10 (soluzioni) della soluzione PFA 3% preraffreddata.
- Aggiungere 0.3:10 (soluzioni) di 200 unità/mL (~6.6 μM) falloidina coniugata di colorante rosso-arancione per l'actina polimerizzata.
- Posto 12 µ l della miscela sul 12 μL di mezzo di montaggio PVA su un vetrino micro. Mettere un piano in coverslipon vetro 2 18x18 mm.
- Analizzare il campione con microscopia confocal.
- delicatamente mix ghiacciata purificata GFP-RAB5 endosomi (passaggio 3) con citosol (passaggio 4) con un rapporto di 01:10 (concentrazione proteica) in una provetta conica ghiacciata 1,5 mL.
- Nella camera di imaging
- per rendere microscopico imaging chambers, utilizzare plasma pulitore per 1 min per pulire un vetrino coprioggetto rotondo diametro 18 mm e un diametro tondo 35 mm dotato di un fondo di vetro di 20 mm di Petri (0.16-0.19 mm).
- Incubare le superfici pulite con 1% β-caseina per 20 min per ridurre al minimo il legame alle proteine al vetro. Lavare due volte con imidazolo di 3 mM.
- Aggiungi endosoma e citosol, nello stesso dosaggio miscela come nei passaggi 5.1.1 e 5.1.2, in una provetta da 1,5 mL preraffreddato e completano la miscela di analisi con 0,1 μg/μL rodamina-actina.
- Regolare l'indice di rifrazione finale della miscela di 1.375 (26,5% saccarosio) utilizzando la soluzione di saccarosio al 39%.
Nota: In genere, il volume stesso viene aggiunto; Tuttavia, questo deve essere empiricamente ri-regolato a seconda della concentrazione di saccarosio della frazione raccolta, determinata utilizzando un refractomer, poiché la concentrazione di saccarosio può variare leggermente da esperimento a esperimento. - Mettere il composto sul piatto da 35 mm pretrattato (punto 5.2.1) e coprirlo con il coprioggetto 18 mm pretrattato (punto 5.2.1).
- Posizionare la camera a 37 ° C, senza agitarli.
- Analizzare il campione mediante microscopia confocale a fluorescenza.
6. Immagine Acl'acquisizione e analisi di actina rete
- acquisizione immagine
- acquisire le immagini su un microscopio confocale scansione invertito.
Nota: Le impostazioni di acquisizione di immagine sono state ottimizzate per un microscopio confocale scansione invertito con un obiettivo di olio NA 63 X 1,25. Regolare la potenza del laser (solitamente intorno 50%) per ottenere un buon rapporto segnale-rumore.
- acquisire le immagini su un microscopio confocale scansione invertito.
- Quantificazione della rete actina
- analizzare le micrografie fluorescente. Utilizzare il software opensource CellProfiler (v 2.1.1) 12 per misurare la quantità di actina per endosoma (software alternativo può essere utilizzato).
- In primo luogo, identificare gli endosomi come oggetto primario utilizzando il segnale di GFP-RAB5. Quindi, quantificare la F-actina associato con gli endosomi individuali utilizzando la propagazione del segnale dell'actina (rosso-arancio colorante coniugato falloidina) come un oggetto secondario.
- Medio e normalizzare il numero del materiale associato per ogni oggetto per la condizione di controllo.
- analizzare le micrografie fluorescente. Utilizzare il software opensource CellProfiler (v 2.1.1) 12 per misurare la quantità di actina per endosoma (software alternativo può essere utilizzato).
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Representative Results
Per approfondire la formazione di patch di F-actina sulle membrane endosoma precoce, abbiamo seguito il protocollo descritto nella Figura 2. Brevemente, le cellule sono state trasfettate con GFP-RAB5 e quindi gli endosomi precoce sono stati preparati da frazionamento subcellulare. Questi purificato endosomi precoce sono stati incubati con citosol al fine di fornire l'actina stessa, nonché altri fattori probabilmente coinvolti nella reazione. Alla fine del periodo d'incubazione, la reazione è stata bloccata tramite la fissazione della miscela. Un campione è stato poi raccolto e depositato su un vetrino al microscopio. Infine, F-actina è stata rivelata con falloidina (Figura 3A). La nucleazione di F-actina su membrane endosomal precoce così come il processo di polimerizzazione si è presentata velocemente. Infatti, F-actina potrebbe già essere visualizzato su endosomi entro 1min dopo l'inizio della reazione (Figura 3A). Queste strutture di actina, che erano inizialmente breve, divennero rapidamente più lunghi, ramificati e collegati uno a altro che portano alla formazione di una rete intrecciata di filamenti di actina (Figura 3A), presumibilmente riflettendo la dinamica dell'actina sbilanciato in vitro. Tassi di nucleazione e polimerizzazione simili sono stati osservati quando il dosaggio è stato effettuato con l'actina rodamina-labeled purificato oltre al cytosol delle cellule. Questo è stato fatto in piatti con fondo di vetro in modo che strutture potrebbero essere imaged direttamente, in assenza di qualsiasi perturbazione (Figura 3B). Nel saggio qui descritto, early endosomes nucleano selettivamente de novo polimerizzazione dell'actina. Infatti, polimerizzazione dell'actina non ha accaduto quando la reazione in vitro è stata condotta in assenza di endosomi o citosol. Si può quindi concludere che gli endosomi primi possiedono l'abilità fondamentale per sostenere la nucleazione e successiva polimerizzazione dell'actina filamenti9,11.
Per analizzare la quantità di actina polimerizzata da endosomi, immagini acquisite in tempi diversi sono stati analizzati usando CellProfiler (Figura 4A). La quantità di actina polimerizzata a endosoma è stata misurata come la zona di actina che circonda un singolo endosoma precoce. Il tasso di polimerizzazione dell'actina era più alto all'inizio del processo e diminuita con il tempo (Figura 4B). La rete di actina poteva essere analizzata in dettaglio agli intervalli di tempo presto dopo l'inizio della reazione. In questi primi momenti, singole strutture contenenti actina potrebbero essere ancora essere differenziati gli uni dagli altri. Al fine di valutare la complessa organizzazione di reti di actina, è stato contato il numero di filamenti di actina che emana da ogni endosoma (cioè, primari filamenti). Allo stesso modo, sono state contate il numero di filamenti di actina che proviene dai filamenti primari (cioè, filamenti secondari), così come il numero di tutti gli altri filamenti di actina che potrebbe essere identificato nelle reti e che non ha avuto origine da endosomi ( cioè, altri filamenti) (Figura 4-E. Una volta che i filamenti di actina sono stati rintracciati, altri parametri, come lunghezza dei filamenti dell'actina individuali e numero di endosomi collegati i filamenti di actina stessa, potrebbe essere facilmente calcolati (Figura 4F).
Figura 1: fase micrografo di contrasto di un omogeneato delle cellule HeLa. Dopo omogeneizzazione, l'estratto è stato montato tra una diapositiva al microscopio e un vetrino coprioggetti. Per la pubblicazione, micrografie sono stati catturati con un obiettivo 100x dopo immersione in olio. Per ispezione di routine, tuttavia, l'Estratto di cellule è stato visualizzato sotto un 20 X o un obiettivo 40x senza olio da immersione. (A-B) vengono illustrati due esempi di visite di alto ingrandimento dell'omogenato. I nuclei (star) appaiono come il grigio scuro strutture rotonde in colore, senza resti di cella collegata. Frecce puntano ai caratteristici granuli di varie dimensioni, forma e traslucenza, che vengono rilasciati all'omogeneizzazione delle cellule e corrispondono ai materiali intracellulari (cioè, organelli). Barra della scala = 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: rappresentazione schematica del protocollo. Descrizione schematica dei protocolli utilizzati per preparare estratti endosomal (A) e citosol estratti (B) e per monitorare la polimerizzazione dell'actina da endosomi in vitro (C). Surnatante (SN), buffer di omogeneizzazione (HB), postnuclear surnatante (PNS), pallina nucleare (NP) e paraformaldeide (PFA). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Nucleazione e polimerizzazione di F-actina su Early Endosomes In Vitro. (A) gli endosomi purificato da Hela delle cellule che esprimono GFP-Rab5 (verde) e citosol HeLa sono stati preparati separatamente. Nell'analisi, early endosomes (EEs) sono stati mescolati con citosol, e la miscela è stata incubata per indicato volte. La miscela è stata quindi fisso, etichettata con falloidina (rossa) all'etichetta di F-actina e analizzata mediante microscopia confocale a fluorescenza. Bar: 10 µm (pannello superiore) e 5 µm (pannello inferiore). (B) EEs purificato da Hela cellule che esprimono GFP-Rab5 (verde) e citosol HeLa sono state preparate separatamente. Questi estratti delle cellule sono stati incubati con purificato rodamina-actina (rosso) per l'indicato volte negli alloggiamenti di microscopio e sono state analizzate mediante microscopia confocale. Barra della scala = 10 µm. (C) l'esperimento è stato effettuato come in A. HeLa citosol (senza SEO) e HeLa endosomi (verde) etichettati con GFP-Rab5 (senza cytosol) sono stati incubati separatamente (pannelli di sinistro e centrali) o insieme (pannello di destra) per 30 min, fisso, etichettati con falloidina (rosso) all'etichetta di F-actina e analizzati da microscopia confocale a fluorescenza. Barra della scala = 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: analisi della rete actina. (A) flusso di lavoro di analisi CellProfiler. (B) numero di actina polimerizzata sono stati quantificati rispetto al numero di endosomi utilizzando il software CellProfiler. Dati sono mediano ± s.e.m. (n = 3). Dati sono mezzi ± s.d. (n = 3). 5 min e 15 min (ns P= 0.0736), 5 min contro 30 min (* P = 0.0195) e 15 minuti contro 30 min (ns P = 0.3129). (C)Early endosomes (EEs) purificato da cellule Hela esprimendo cytosol GFP-Rab5 e HeLa sono stati preparati separatamente, e il test è stato effettuato come in Figura 2A. I campioni sono stati risolti dopo 7 min. Il pannello centrale mostra il Micrografo stesso, con la sovrapposizione delle tracce di strutture di F-actina disegnate utilizzando il plugin di NeuronJ13 del software ImageJ. Il pannello di destra mostra le tracce solo. Barra della scala = 10 µm. (D) rappresentazione di F-actina struttura sequenza di numerazione utilizzato nella quantificazione con software ImageJ. (E) quantificazione del numero di filamenti di actina, come definito in C-D. Dati sono mezzi ± s.d. (n = 3). Rami principali contro rami secondari (ns P = 0.5262), rami secondari contro altri rami (ns P = 0.6815) e rami primari contro altri rami (ns P = 0,2254). Strutture (F), la lunghezza di F-actina e il numero di EEs per struttura di actina sono mostrati come esempi di altri parametri che possono essere analizzati con la quantificazione definita in C-D. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Actina svolge un ruolo cruciale nell'endosoma membrana dinamica4,14. Precedentemente abbiamo segnalato che la polimerizzazione e actina nucleazione verificarsi su early endosomes, formando piccole patch di F-actina o reti. Queste reti di F-actina sono assolutamente necessari per il trasporto di membrana oltre early endosomes lungo la via di degradazione. Interferire in ogni fase di questo processo di nucleazione e polimerizzazione previene endosoma maturazione e quindi il trasporto a valle verso la fine gli endosomi andlysosomes9,11,15. In particolare, abbiamo usato l'analisi sopra descritto per analizzare i passaggi sequenziali di polimerizzazione di F-actina su early endosomes e di caratterizzare il processo a livello molecolare.
In questi esperimenti, early endosomes sono etichettati con GFP-RAB5 in vivo, purificato mediante frazionamento subcellulare e incubati in una provetta in presenza di cytosol per consentire F-actina polimerizzazione in vitro. Al momento desiderato, la reazione viene arrestata e la miscela di reazione viene trasferita su un vetrino al microscopio per analisi mediante microscopia a fluorescenza, mediante falloidina per etichettare la F-actina. Utilizzando questa strategia sperimentale, abbiamo mostrato che l'Annessina A2 è necessaria per la nucleazione di F-actina su early endosomes, insieme a SPIRE1, mentre ARP2/3 media F-actina ramificazione, come previsto. Abbiamo anche dimostrato che sono richiesti per la formazione delle reti di F-actina che mediano ECV/MVB biogenesi e maturazione lungo la via di degradazione di cellule di mammifero9,11moesina e cortactin.
È importante tenere a mente che, anche se i bassi livelli di ectopically espresso RAB5 non alterano gli endosomi a qualsiasi in misura significativa10, questo piccolo GTPase è un regolatore chiave della precoce endosoma membrana dinamica16,17 . In alcuni esperimenti, può quindi essere opportuno etichetta endosomi nel dosaggio utilizzando protocolli alternativi. Ad esempio, early endosomes possono essere convenientemente etichettati utilizzando traccianti fluorescenti di stimolazione, come ad esempio epidermico di fattore di crescita o transferrina4,14.
Si noti inoltre che è tecnicamente difficile immagine singoli filamenti dell'actina con microscopia confocale convenzionale. Di conseguenza, ci riferiamo alle strutture di F-actina in tutto il testo per descrivere reti actina su endosomi. Di conseguenza, riteniamo che la formazione di una rete di F-actina può essere quantificata con maggiore precisione misurando l'area della superficie di fluorescenza di reti piuttosto che la loro intensità.
Non è facile escludere completamente la possibilità che l'attività di nucleazione di actina osservato in vitro è mediata da qualche altra struttura o organello che rimane legata a RAB5 endosomi durante la purificazione. Tuttavia, tale contaminazione è altamente improbabile. Mentre alcuni organelli, co-purificano su pendenze a causa delle proprietà fisiche simili, non tendono a rimanere quantitativamente legati a vicenda dopo la purificazione. Inoltre, l'attività di nucleazione di actina dipende strettamente Annessina A24,14, che è presente su early endosomes contenente RAB514. Infine, troviamo che strutture di F-actina sono associati in modo selettivo con RAB5 endosomi in vivo e non si trovano su altri endosomi o su altre membrane cellulari4,14. In conclusione, l'actina nucleazione attività è probabilmente associato a RAB5 endosomi, poiché questa attività co-purifica e co-localizza con RAB5 endosomi.
In questo saggio, molto come in altri saggi che ricostituire le complesse reazioni biochimiche che controllano che le dinamiche di endosomi16 o altre membrane18 e che vengono eseguite in una provetta, è importante garantire che la preparazione degli estratti cellulari sono ottimali. Cellule dovrebbero essere omogeneizzate condizioni delicato per limitare i danni per gli endosomi e altri organelli, in particolare i nuclei ed i lisosomi. Inoltre, endosoma frazioni dovrebbero essere tenute su ghiaccio in condizioni tali da ridurre al minimo lo stress osmotico e ionico, come pure la polimerizzazione dell'actina spontanea. In ulteriori, relativamente elevate le concentrazioni di endosoma frazione (≥ 0,1 mg/mL) e citosol (≥ 3 mg/mL) sono necessari per un'adeguata polimerizzazione di F-actina su endosomes e rilevamento, come indicato nei passaggi 3.13 e 4.4, rispettivamente. Allo stesso modo, è importante effettuare il test con un 01:10 rapporto di endosoma citosol (proteina/proteina), come indicato al punto 5.1.1. Infine, il pipettaggio dopo polimerizzazione dell'actina (vale a dire, aggiungere PFA e falloidina) dovrebbe essere fatto molto delicatamente per evitare di collassare o rompere la rete di actina.
Se necessario, analisi della polimerizzazione dell'actina in vitro può anche essere effettuato direttamente in un microscopio imaging camera, dopo l'aggiunta la miscela di analisi, di limitare perturbazioni meccaniche delle reti actina polimerizzate purificata rodamina-actina sul endosomi (Vedi punto 5.2.3 e Figura 2). In questo caso, è meglio regolare l'estratto alla diffusione limitante del 26,5% (0,85 M) saccarosio (indice di rifrazione di 1.375) e simil-Brownian motion (punto 5.2.3) e per rimuovere possibili aggregazioni di purificato rodamina-actina mediante ultracentrifugazione prima dell'uso. Le nostre osservazioni che moesina controlla la formazione di reti di F-actina su endosomi erano completamente ricapitolati utilizzando questa versione alternativa delle nostre analisi4,14.
Entrambe le versioni del nostro protocollo, nella provetta o nel vano di imaging, sono ottimale per un'analisi globale di nucleazione di F-actina e polimerizzazione su endosomi. Tuttavia, non è facile da seguire il processo di polimerizzazione dell'actina attraverso il tempo utilizzando questo approccio, in parte perché gli endosomi non sono immobili. Di conseguenza, non è facile monitorare la crescita dei singoli filamenti e quindi a determinare la storia della rete dell'actina. Ad esempio, può essere difficile da discriminare F-actina diramazione dalla reticolazione. Tuttavia, siamo fiduciosi che le condizioni per monitorare la polimerizzazione di F-actina in tempo reale possono essere migliorate nella camera di imaging ottimizzando le condizioni per immobilizzare gli endosomi. Allo stesso modo, sarà interessante monitorare la polimerizzazione di F-actina da membrane artificiali utilizzando componenti purificate. Infatti, precedentemente abbiamo indicato che la polimerizzazione e nucleazione di F-actina può accadere su liposomi dopo associazione tfattore di nucleazione egli Annessina A2 sul doppio strato del liposoma11. Questa strategia sarà utile scomporre ulteriormente il ruolo di specifici lipidi e proteine nel processo di nucleazione e polimerizzazione di F-actina e caratterizzare i componenti minimi necessari per formare una rete di F-actina sulle membrane endosomal. Infine, riteniamo che questa strategia sarà molto utile per lo studio di altri processi di F-actina-dipendente che si verificano sulle membrane endosoma, in particolare il reclutamento e la mobilitazione della macchina lavaggio/retromer.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Supporto è stato ricevuto da Swiss National Science Foundation; il programma svizzero Sinergia; il polacco-Swiss ricerca programma (PSPB-094/2010); il PRN in biologia chimica; e LipidX dall'iniziativa Svizzera SystemsX.ch, valutati da Swiss National Science Foundation (di J. G.). O. M. è stato sostenuto da una borsa di studio a lungo termine dell'EMBO (ALTF-516-2012).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71380 | |
| KCl | Acros Organics | 196770010 | |
| KH2PO4 | AppliChem | A1042 | |
| Na2HPO4 | Acros Organics | 424370025 | |
| Hepes | AppliChem | A3724 | |
| Magnesiun acetate tetrahydrate | Fluka | 63047 | |
| Dithiothreitol (DTT) | AppliChem | A2948 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 10125 | |
| NaOH | Fluka | 71690 | |
| Sucrose | Merck Millipore | 107687 | |
| Leupeptin | Roche | 11017101001 | |
| Pepstatin | Roche | 10253286001 | |
| Aprotinin | Roche | 10236624001 | |
| Paraformaldehide | Polysciences. Inc | 380 | |
| Alexa Fluor 555 phalloidin | Molecular Probes | A34055 | |
| Actin rhodamine | Cytoskeleton. Inc | APHR-A | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | poly(vinyl alcohol), Mw ~31 000 |
| DABCO | Sigma-Aldrich | D-2522 | |
| Tris-HCl | AppliChem | A1086 | |
| β-casein | Sigma-Aldrich | C6905 | |
| Filter 0.22 μm | Millex | SL6V033RS | |
| Round 10 cm dishes for cell culture | Thermo Fisher Scientific | 150350 | |
| Plastic Pasteur pipette | Assistent | 569/3 40569003 | |
| 15-mL polypropylen tube | TPP | 91015 | |
| Hypodermic Needle 22G Black 30mm | BD Microlance | 300900 | |
| Sterile Luer-slip 1mL Syringes without needle | BD Plastipak | 300013 | |
| Micro glass slides | Assistent | 2406 | |
| 18 x 18-mm glass coverslip | Assistent | 1000/1818 | |
| SW60 centrifuge tube | Beckman coulter | 344062 | |
| TLS-55 centrifuge tube | Beckman coulter | 343778 | |
| 200-μL yellow tip | Starlab | S1111-0706 | |
| 1,000-μL Blue Graduated Tip | Starlab | S1111-6801 | |
| 1.5-mL test tube | Axygen | MCT-175-C 311-04-051 | |
| 18-mm diameter round coverslip | Assistent | 1001/18 | |
| 35-mm diameter round dish with a 20-mm glass bottom (0.16 - 0.19 mm) | In vitro Scientific | D35-20-1.5-N | |
| Refractometer | Carl Zeiss | 79729 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Sorvall WX80 Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46900 | |
| Tabletop ultracentrifuge | Beckman coulter | TL-100 | |
| SW60 rotor | Beckman coulter | 335649 | |
| TLS-55 rotor | Beckman coulter | 346936 | |
| Confocal microscopy | Carl Zeiss | LSM-780 | |
| Fugene HD transfection reagent | Promega | E2311 | |
| Protein assay reagent A | Bio-Rad | 500-0113 | |
| Protein assay reagent B | Bio-Rad | 500-0114 | |
| Protein assay reagent S | Bio-Rad | 500-0115 | |
| Cell scraper | Homemade | Silicone rubber piece of about 2 cm, cut at a very sharp angle and attached to a metal bar or held with forceps | |
| Refractometer | Carl Zeiss | ||
| Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Sigma-Aldrich | M0643 | |
| FCS | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Thermo Fisher Scientific | 11140-035 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| pH Meter 691 | Metrohm | ||
| ImageJ software | NIH, Bethesda MD |
References
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