Summary
Début endosome fonctions dépendent de la polymérisation de l’actine-F. Nous décrivons ici une analyse axée sur la microscopie in vitro qui reconstitue la nucléation et la polymérisation de l’actine F sur les membranes endosomale précoce dans des éprouvettes, rendant ainsi cette série complexe de réactions se prêtent à biochimiques et génétiques manipulations.
Abstract
Beaucoup de fonctions endosome précoce, particulièrement fret protéine membranaire de tri et de déformation, dépendent des patchs de courts filaments d’actine F nucléées sur la membrane endosomale. Nous avons établi une analyse axée sur la microscopie in vitro qui reconstitue la nucléation et la polymérisation de l’actine F sur les membranes endosomale précoce dans des éprouvettes, rendant ainsi cette série complexe de réactions se prêtent à la génétique et biochimique manipulations. Endosomale fractions sont préparées par flottaison dans les gradients de sucrose de cellules exprimant la protéine d’endosomes précoces GFP-RAB5. Fractions cytosoliques sont préparées à partir des lots distincts de cellules. Les endosomes et les fractions cytosoliques peuvent être stockées congelés dans l’azote liquide, si nécessaire. Dans l’essai, les endosomes et les fractions cytosoliques sont mélangées, et le mélange est incubé à 37 ° C dans des conditions appropriées (par exemple, force ionique, réduisant l’environnement). À l’heure souhaitée, le mélange réactionnel est fixe, et l’actine-F se révèle avec la phalloïdine. Polymérisation et nucléation de l’actine sont ensuite analysés par microscopie à fluorescence. Nous rapportons ici que ce test peut être utilisé pour étudier le rôle des facteurs qui jouent un rôle dans la nucléation de l’actine sur la membrane ou l’allongement subséquent, ramification ou réticulation des filaments d’actine-F.
Introduction
Dans les cellules eucaryotes supérieurs, les protéines et les lipides sont internalisés dans les endosomes précoces où tri se produit. Certaines protéines et les lipides, qui sont destinés à être réutilisés, sont incorporés dans des régions tubulaires des endosomes précoces et ensuite transportées vers la membrane plasmique ou pour le trans-Golgi network (TGN)1,2. En revanche, les autres protéines et des lipides sont emballés sélectivement en régions des endosomes précoces qui présentent un aspect multivésiculaires. Développer ces régions et, sur le détachement des membranes d’endosomes précoces, éventuellement mature gratuit endosomale transporteur vésicules ou multivésiculaires (VME/Mvc), qui sont chargés du transport de marchandises vers la fin des endosomes1, 2.
L’actine joue un rôle crucial dans le processus de remodelage de membrane associé à la capacité de tri endosomal et endosome biogenèse. Protéine triant le long des voies de recyclage à la membrane plasmique ou le TGN dépend de la retromer complexe et les protéines associées. Ce mécanisme de tri semble être couplée à la formation de recyclage tubules par interactions de la retromer complexe, avec la guêpe et cicatrice homologue (WASH) complexe et ramifié actine3,4,5 . En revanche, molécules destinées à la dégradation, particulièrement active les récepteurs de signalisation, sont triés dans des vésicules intraluminal (ILVs) par les endosomes tri complexes requis pour le transport (ESCRT)2,6, 7. Alors qu’on ne connaît pas le rôle éventuel de l’actine dans le processus de tri ESCRT dépendant, F-actine joue un rôle important dans la biogenèse des VME/MVC et transport au-delà des endosomes précoces. En particulier, nous avons constaté qu’annexine A2 lie régions enrichies en cholestérol et avec spire1 de l’endosome précoce, nucléation de polymérisation de l’actine-F. La formation du réseau ramifié actine observée sur les endosomes requiert l’activité de ramification de la protéine liée à l’actine (ARP) 2/3 complexe, ainsi que la moésine de protéine ERM et la liaison de l’actine protéine cortactin8,9.
Nous décrivons ici une analyse axée sur la microscopie in vitro qui reconstitue la nucléation et la polymérisation de l’actine F sur les membranes endosomes précoces dans des éprouvettes. Ce test a été utilisé précédemment pour enquêter sur le rôle de l’annexine A2 dans la nucléation de l’actine F et de la moésine et cortactin dans la formation d’endosomes actine réseaux8,9. Avec ce protocole in vitro , la série complexe de réactions qui se produisent sur les endosomes au cours de la polymérisation de l’actine se prête à l’analyse biochimique et moléculaire des étapes du processus, y compris de nucléation de l’actine, linéaire polymérisation, ramification et réticulation.
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Protocol
1. solutions et préparations
Remarque : tous les tampons et les solutions doivent être préparées en bidistillée (dd) H 2 O. Parce que l’état d’hydratation du saccharose varie, la concentration finale de toutes les solutions de saccharose doit être déterminée à l’aide d’un réfractomètre.
- Prepare tampon phosphate salin sans les cations divalents (PBS-) : 137 mM CCNI, KCl 2,7 mM, 1,5 mM KH 2 PO 4 et 6,5 mM Na 2 HPO 4. Ajuster le pH à 7,4. Stériliser à l’autoclave (1 cycle à 121 ° C pendant 15 min) et conserver à température ambiante.
- Préparer la solution mère de l’imidazole 300 mM : 0,204 g d’imidazole dans 10 mL de ddH 2 O.Adjust le pH à 7,4 à 4 ° C à l’aide de HCl filtrer-stériliser à l’aide d’un 0,22 μm filtre de taille des pores et conserver à 4 ° C. Tampon
- Prepare homogénéisation (HB ; préparer 100 mL environ) : saccharose de 250 mM à l’imidazole de 3 mM. Ajuster le pH à 7,4 à 4 ° C à l’aide d’un pH-mètre. Filtre-stériliser à l’aide d’un filtre de taille de pore de 0,22 μm et conserver à 4 ° C. complément le HB juste avant usage avec un cocktail d’inhibiteurs de la protéase à concentrations finales correspondant à leupeptine de 10 mM, 1 mM pepstatine A et 10 ng/mL aprotinine.
- Pour les gradients de flottaison étape, préparer les 62 %, 39 % et 35 % de sucrose solutions en imidazole de 3 mM, pH 7,4, tel que décrit ci-dessous. Déterminer avec précision la concentration finale de toutes les solutions de saccharose à l’aide d’un réfractomètre.
- Préparer 100 mL de solution de saccharose de 62 % en imidazole de 3 mM, pH 7,4. Dissoudre en remuant 80,4 g de saccharose à FD 2 O préchauffée à 35 ° C. Ajouter 1 mL de solution mère de 300 mM imidazole et remplissage à 100 mL avec FD 2 O. ajuster le pH à 7,4 à 4 ° C. filtre-stériliser à l’aide d’un filtre de taille de pore μm et 0,22 à 4 ° C.
- Préparer 100 mL d’une solution d’imidazole de 3 mM, pH 7,4 a 35 % de sucrose. Dissoudre en remuant 40,6 g de saccharose dans ddH 2 O. Ajouter 1 mL de solution mère de 300 mM imidazole et compléter à 100 mL avec FD 2 O. ajuster le pH à 7,4 à 4 ° C. filtre-stériliser en utilisant un 0,22 μm filtre de taille des pores et conserver à 4 ° C.
- Préparation de 50 mL de 39 % de sucrose dans imidazole de 3 mM, pH 7,4. Diluer la solution de saccharose de 62 % avec la solution de saccharose de 35 %. Conserver à 4 ° C.
- Dissoudre 3 g du paraformaldéhyde (PFA) en le remuant dans 100 mL de PBS-pre-warmed à 60 ° C tout en ajoutant goutte à goutte de 1 NaOH M ; ajuster le pH final de 7,4 à l’aide de NaOH. Filtre-stériliser à l’aide d’un filtre de taille de pore de 0,22 μm et conserver à -20 ° C.
ATTENTION : 3 % PFA est un réactif toxique. - Solution mère préparer 1 M KCl. Dissoudre 3,73 g de KCl par agitation dans 50 mL de ddH 2 O. filtre-stériliser à l’aide d’un filtre de taille de pore de 0,22 μm et conserver à température ambiante.
- Solution préparer 50 X concentré contenant 0,625 M Hepes à pH 7,0 et 75 mM MgOAc 2 ddH 2 O. aliquote et magasin à -20 ° C. Milieu de montage
- Prepare. Mélanger en remuant 2,4 g de poly(vinyl alcohol) M w ~ 31 000 (PVA) avec 6 g de glycérol. Ajouter 6 mL de ddH 2 O et laisser pendant au moins 2 h à température ambiante. Ajouter 12 mL de 0,2 M Tris-Cl (pH 8,5) et la chaleur à environ 53 ° C avec occasionnels en remuant jusqu'à ce que le PVA a dissous.
- Clarifier la solution par centrifugation à 5 000 x g pendant 20 min à température ambiante. Récupérer le surnageant et ajouter 2,5 % (p/v) 1, 4 - diazabicyclo-[2.2.2] octane (DABCO) pour empêcher le photoblanchiment pendant la détection de la fluorescence. Vortex pour environ 30 s pour dissoudre. Aliquote dans 1,5 mL tubes en plastique et les conserver à -20 ° C.
2. Culture cellulaire
- cellules HeLa Culture Dulbecco ' s Modified Eagle moyenne additionné de sérum de veau foetal de 10 %, 10 % acides aminés non essentiels 10 % L-glutamine et 1 % la pénicilline-streptomycine. Maintenir à 37 ° C dans une étuve à 5 % CO 2.
- Transfecter les cellules 24h avant l’expérience avec GFP-RAB5 10, utilisant le réactif de transfection commerciale selon le fabricant ' instructions de s.
- Si nécessaire, préparer des fractions d’endosomale et le cytosol des cellules appauvri d’une protéine d’intérêt (p. ex., à l’aide d’Arni ou CRISPR/Cas9) et/ou surexprimant une forme type sauvage ou mutant de la protéine d’intérêt.
3. Préparation de Fraction endosomale
Remarque : ce protocole décrit la préparation simple de fractions subcellulaires contenant des endosomes et les autres membranes légères. Le cas échéant, les fractions purifiées endosome peuvent également être utilisée 11. Préparer 2 boîtes de Pétri (diamètre extérieur de 10 cm, 57 cm 2) de cellules confluentes exprimant GFP-RAB5 comme matériau de départ. Le nombre total de cellules HeLa confluentes dans 2 boîtes de Pétri correspond grosso modo à 2,5 x 10 7 cellules. Lorsque nécessaire, les endosomes peuvent également être préparés de cellules appauvries d’une protéine d’intérêt (p. ex., à l’aide d’Arni ou CRISPR/Cas9) et/ou surexprimant une forme type sauvage ou mutant de la protéine d’intérêt, exprimant toujours GFP-RAB5.
attention : toutes les étapes du protocole fractionnement doivent être effectuées sur glace
- Placer les boîtes de Pétri sur une plaque de métal humide dans un seau à glace plat et laver immédiatement les cellules deux fois avec 5 mL de PBS glacee-.
- Retirer tous les PBS - le dernier lavage et ajouter 3 mL de PBS-glacee par plat. Cellules ne devraient pas sécher lors de la manipulation : si nécessaire, placer le bac à glaçons sur une plate-forme bascule de couvrir adéquatement les cellules avec le fluide.
- Supprimer mécaniquement les cellules dans du PBS depuis les boîtes de Pétri à l’aide d’un policier en caoutchouc souple (c.-à-d., racleur de cellule de maison). Grattez les cellules hors les plats tout d’abord dans un mouvement rapide et circulaire autour de l’extérieur du plat, suivi d’un mouvement vers le bas au milieu du plat. Gratter délicatement pour obtenir " feuilles " de cellules attachées. Transférer doucement les cellules à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique avec une large ouverture pour un tube en polypropylène 15 mL conique sur Ice.
- Centrifuger pendant 5 min à 175 g et 4 ° C.
- Délicatement retirer le surnageant (SN) et ajouter 1 à 3 mL de HB au culot. À l’aide d’une pipette Pasteur en plastique avec une large ouverture, Pipetez doucement monter et descendre une fois pour remettre en suspension les cellules.
- Centrifugeuse pendant 7-10 min à 1 355 x g et 4 ° C. doucement Retirez le SN.
- Effectuer l’homogénéisation de la cellule.
Remarque : Les Conditions devraient être douces afin que les membranes plasmiques des cellules sont cassées mais les endosomes restent intacts.- Ajouter un volume connu d’HB par inhibiteurs de protéase sur chaque culot cellulaire (environ 100 μL / culot cellulaire). À l’aide d’une micropipette 1 000 µL, Pipetez doucement haut et en bas, jusqu'à ce que les cellules sont remises en suspension. Ne pas introduire des bulles d’air.
- Préparer une seringue de 1 mL tuberculine avec une aiguille de 22G rincée au préalable avec HB et exempte de bulles d’air.
- Remplir la seringue avec la suspension de cellules relativement lentement (pour éviter de créer des bulles d’air), placer l’extrémité biseautée de l’aiguille contre la paroi du tube et expulser de la suspension cellulaire rapidement à cisaillement hors les membranes plasmiques des cellules attachées.
- Prendre une petite portion de l’homogénat (environ 3 µL) et le diluer dans 50 µL de HB sur une lame de verre. Mélanger et recouvrir d’une lamelle de verre. Inspecter l’homogénat sous un microscope à contraste de phase avec un 20 X ou 40 X objectif.
Remarque : Dans des conditions optimales, la plupart des cellules sont brisées, mais les noyaux, qui apparaissent comme des gris foncé et autour de structures, ne sont pas ( Figure 1). - Répéter l’étape 3.7.3 et 3.7.4 jusqu'à ce que la plupart des cellules est cassés ; 3-6 coups de va-et-vient à travers l’aiguille sont généralement nécessaires. Garder une petite aliquote (10-30 µL) de l’homogénat pour dosage de la protéine.
- Homogénat centrifugation pendant 7 min à 1 355 x g et 4 ° C.
Remarque : après centrifugation, le culot (défini comme le culot nucléaire ; NP) contient le noyau et le surnageant (défini comme le surnageant post-nucléaire ; PNS) contient le cytosol et les organites sortis après homogénéisation et en suspension libre. - Recueillir soigneusement le PNS. Conserver les petites parties aliquotes (10-30 µL) de la PNS et NP pour détermination des protéines et d’ignorer le NP.
- Régler le PNS à 40,6 % de saccharose en diluant la solution de saccharose de 62 % par PNS un ratio de 1:1.1 de PNS:62 % de sucrose. Mélanger doucement mais complètement, sans créer de bulles d’air. Vérifier la concentration de saccharose à l’aide du réfractomètre.
- Placer le PNS dans 40,6 % de sucrose au fond d’un tube d’ultracentrifugation. Overlay avec soin avec 2,5 mL de la solution de saccharose de 35 % et de remplir le tube à centrifuger de HB.
Remarque : Les solutions de saccharose devraient être superposées pour que les interfaces sont bien visibles. - Ultracentrifugeuse les gradients pendant 1 h à ̴165, 000 x g et 4 ° C.
- Retirer délicatement la couche blanche de lipides au sommet de la pente. Ensuite, recueillir l’interface contenant des endosomes, entre le HB et 35 % de sucrose, à l’aide d’une micropipette 200 μL avec une pointe coupée.
Remarque : Les fractions endosomale peut être utilisées directement dans l’analyse de la polymérisation d’actine in vitro ou peut être aliquotés sur la glace, flash-congelés dans l’azote liquide et stockées à -80 ° C. - Déterminer la concentration de protéine des fractions PNS et endosomale.
NOTE : Cette concentration doit être au moins 100 µg/mL. Environ 2,5 x 10 7 cellules cultivées dans 2 boîtes de Pétri sont nécessaires pour obtenir un PNS avec au moins 100 µg/mL (voir la Note ci-dessus).
4. Préparation du cytosol
Remarque : préparer 2 boîtes de Pétri (10 cm de diamètre ; 57 cm 2) de cellules HeLa confluentes comme matériau de départ. Lorsque nécessaire, le cytosol peut également être préparé de cellules appauvries d’une protéine d’intérêt (p. ex., à l’aide d’Arni ou CRISPR/Cas9) et/ou surexprimant un type sauvage ou la forme mutante de la protéine d’intérêt. En ce qui concerne le protocole de fractionnement endosome, toutes les étapes doivent être suivies sur Ice.
- Répétez les étapes 3.1-3.8.
- Placer le PNS dans un tube à centrifuger et ultracentrifugeuse pendant 45 min à ̴250, 000 x g et 4 ° C.
- Soigneusement retirer la couche blanche sur le dessus et recueillir le SN (fraction cytosol) sans déranger le culot microsome. Garder une partie aliquote de la fraction cytosol pour dosage de la protéine.
Remarque : Le cytosol est utilisable directement dans l’analyse de la polymérisation d’actine in vitro ou peut être aliquotés sur la glace, flash-congelés dans l’azote liquide et stockées à -80 ° C. - Déterminer la concentration de protéine du cytosol.
Remarque : Il doit être au moins de 3 mg/mL.
5. Dosage de polymérisation de l’actine Endosome dépendant de mesure In Vitro
Remarque : polymérisation de l’actine Endosome-dépendantes peut être effectuée à l’aide de deux approches alternatives. Dans la première approche, les matériaux sont mélangés dans un tube à essai, fixe et transférés à un lamelle couvre-objet et analysés. Dans la deuxième approche, décrite ici, le test peut être effectué directement dans la chambre d’imagerie et peuvent être fixes et analysé sans perturbations mécaniques ( Figure 2). Dans cette deuxième approche, le mélange d’essai n’est pas transféré d’un tube à essai à un lamelle couvre-objet et reste donc non perturbé, diminuant le danger des réseaux d’actine F étant physiquement perturbé pendant le transfert. En outre, cette seconde approche est compatible avec une analyse Time-lapse de la polymérisation de l’actine F. Il est à noter qu’on a observé aucune différence dans l’analyse de la polymérisation de l’actine F avec deux approches.
Remarque : Utilisation coupe conseils tout au long du protocole.
- Dans un tube à essai
- doucement mélange glacé purifié GFP-RAB5 endosomes (étape 3) avec le cytosol (étape 4) dans un rapport de 01:10 (concentration de protéines) dans un tube à essai conique glacé 1,5 mL.
NOTE : Une expérience typique s’effectue environ 40-50 µl. - Régler le mélange de la réaction glacée à la concentration finale de 125 mM de KCl (à l’aide de la solution mère de KCl 1 M), Hepes de 12,5 mM et 1,5 mM MgOAc 2 (en utilisant le 50 x solution mère). Ensuite, réglez le mélange avec les inhibiteurs de la protéase à la concentration finale de 10 mM leupeptine 1 mM pepstatine A et 10 ng/mL aprotinine. Mélanger délicatement tous les composants.
- Le tube à essai contenant le mélange réactionnel à 37 ° C, sans trembler et incuber pendant le temps désiré.
Remarque : En règle générale, il faudra environ 3 min pour détecter la polymérisation de l’actine sur endosomes et 30 min pour la formation d’un vaste réseau. - à l’heure souhaitée (c.-à-d., 3 min ou 30 min), arrêter la réaction en plaçant le tube à essai sur la glace et ajouter 1/10 (dilution) de la solution PFA 3 % rafraîchie.
- Ajoute 0.3:10 (dilution) de 200 unités/mL (~6.6 μM) phalloïdine, conjugué au colorant rouge-orange pour colorer l’actine polymérisée.
- Place 12 μL de mélange sur 12 μl de milieu de montage de PVA sur une lame de verre micro. Mettre un plateau en verre coverslipon 18 x 18 mm 2.
- Analyser l’échantillon avec la microscopie confocale.
- doucement mélange glacé purifié GFP-RAB5 endosomes (étape 3) avec le cytosol (étape 4) dans un rapport de 01:10 (concentration de protéines) dans un tube à essai conique glacé 1,5 mL.
- Dans la chambre d’imagerie
- pour faire des chambres d’imagerie microscopiques, utiliser plasma pendant 1 min pour nettoyer une lamelle ronde 18 mm de diamètre et un rond 35 mm de diamètre équipé d’un fond de verre de 20 mm boîte de Pétri (0,16-0,19 mm).
- Incuber les surfaces nettoyées avec 1 % de β-caséine pendant 20 min réduire au minimum la liaison aux protéines pour le verre. Laver deux fois avec de l’imidazole de 3 mM.
- Ajouter endosome et le cytosol, dans le même dosage mélange tout comme aux étapes 5.1.1 et 5.1.2, dans un tube à essai rafraîchies 1,5 mL et compléter le mélange de dosage avec 0,1 μg/μL rhodamine-actine.
- Ajuster l’indice de réfraction final du mélange à 1,375 (26,5 % de sucrose) à l’aide de la solution de sucrose à 39 %.
Remarque : En général, le même volume est ajouté ; Toutefois, cela doit être empiriquement réajustée en fonction de la concentration de saccharose de la fraction recueillie, déterminée à l’aide d’un réfractomètre, étant donné que la concentration de saccharose peut changer un peu d’expérience à expérience. - Placer le mélange sur le plat de 35 mm prétraité (étape 5.2.1) et couvrir avec la lamelle de 18 mm prétraitée (étape 5.2.1).
- Placer la chambre à 37 ° C, sans agiter.
- Analyser l’échantillon à l’aide de la microscopie confocale à fluorescence.
6. Ac de l’imagequisition et analyse du réseau d’actine
- d’acquisition d’images
- acquérir les images sur un microscope confocal balayage inversé.
NOTE : Paramètres d’acquisition Image ont été optimisées pour un microscope confocal balayage inversé avec un objectif d’huile NA 63 X 1,25. Ajuster la puissance du laser (généralement autour de 50 %) pour atteindre un bon rapport signal-bruit.
- acquérir les images sur un microscope confocal balayage inversé.
- Quantifier le réseau d’actine
- analyser les micrographies fluorescents. Utilisez le logiciel opensource CellProfiler (v2.1.1) 12 pour mesurer la quantité d’actine par endosome (logiciel alternatif peut être utilisé).
- Tout d’abord, identifiez les endosomes comme l’objet principal en utilisant le signal de GFP-RAB5. Puis, quantifier l’actine F associée à des endosomes individuels à l’aide de la propagation du signal actine (colorant rouge-orange conjuguées phalloïdine) comme un objet secondaire.
- Moyenne et normaliser le nombre de documents connexes pour chaque objet à la condition contrôle.
- analyser les micrographies fluorescents. Utilisez le logiciel opensource CellProfiler (v2.1.1) 12 pour mesurer la quantité d’actine par endosome (logiciel alternatif peut être utilisé).
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Representative Results
Mieux comprendre la formation de taches d’actine F sur les membranes endosome précoce, nous avons suivi le protocole indiqué dans la Figure 2. En bref, les cellules ont été transfectées avec GFP-RAB5 et puis les endosomes précoces ont été préparés par fractionnement subcellulaire. Ces purifiées endosomes précoces ont été incubées avec cytosol afin de fournir l’actine lui-même ainsi que d’autres facteurs éventuellement impliqués dans la réaction. À la fin de la période d’incubation, la réaction a été arrêtée par la fixation du mélange. Un échantillon a été ensuite recueilli et déposé sur une lame microscopique. Enfin, l’actine-F a été révélé avec la phalloïdine (Figure 3 a). La nucléation de l’actine F sur les membranes endosomes précoces ainsi que le processus de polymérisation subséquente s’effectue rapidement. En effet, F-actine pourrait déjà être visualisée sur les endosomes moins de 1min après le début de la réaction (Figure 3 a). Ces structures d’actine, qui étaient initialement courts, est rapidement devint plus long, ramifié et lié à un autre conduisant à la formation d’un réseau entrelacée des filaments d’actine (Figure 3 a), reflétant vraisemblablement dynamique asymétrique actine in vitro. Taux de nucléation et polymérisation similaires ont été observés lorsque le dosage a été effectué avec l’actine de rhodamine marquée purifiée en plus du cytosol cellulaire. Cela a été fait dans les plats à fond de verre afin que les structures pourraient être photographiées directement, en l’absence de toute perturbation (Figure 3 b). Dans l’essai décrit ici, endosomes précoces nucléée de novo polymérisation de l’actine sélectivement. En effet, polymérisation de l’actine ne bougèrent pas lorsque la réaction in vitro a été réalisée en l’absence d’endosomes ou cytosol. On peut donc conclure que les endosomes précoces possèdent la capacité fondamentale d’appuyer la nucléation et la polymérisation subséquente de filaments d’actine,9,11.
Pour analyser la quantité d’actine polymérisée des endosomes, images acquises à des moments différents ont été analysés à l’aide de CellProfiler (Figure 4 a). La zone de l’actine qui entourent un endosome précoce unique a été mesurée la quantité d’actine polymérisée par endosome. Le taux de polymérisation de l’actine était plus élevé au début du processus et décroît avec le temps (Figure 4 b). Le réseau d’actine puisse être analysé plus en détail au début-points dans le temps après le début de la réaction. En ces temps de début-points, structures individuelles contenant de l’actine pourrait être encore être différenciés les uns des autres. Afin d’évaluer l’organisation complexe des réseaux de l’actine, a été compté le nombre de filaments d’actine émanant de chaque endosome (c.-à-d., les filaments primaires). De même, le nombre de filaments d’actine originaires des filaments primaires (c'est-à-dire, les filaments secondaires) ont été dénombré, ainsi que le nombre de tous les autres filaments d’actine qui pourraient être identifiés dans les réseaux et qui ne proviennent pas des endosomes) c'est-à-dire, autres filaments) (Figure 4-E. Une fois que les filaments d’actine ont été tracés, d’autres paramètres, tels que la longueur des filaments d’actine individuels et nombre d’endosomes connectés aux même filaments d’actine, pourrait être facilement calculés (Figure 4F).
Figure 1 : Phase contraste micrographie d’un homogénat de cellules HeLa. Après homogénéisation, l’extrait a été monté entre une lame microscopique et une lamelle. Pour publication, micrographies ont été capturés avec un objectif X 100 après immersion dans l’huile. Pour l’inspection de routine, toutefois, l’extrait cellulaire a été visualisée sous 20 X ou un objectif X 40 sans immersion dans l’huile. Deux exemples de vues fort grossissement de l’homogénat sont indiqués (A-B). Noyaux (star) apparaissent comme des gris foncé structures rondes en couleur, sans restes de cellules attachées. Flèches pointent vers les granules caractéristiques de taille variable, la forme et translucide, qui sont libérés lors de l’homogénéisation cellule et correspondent aux matériaux intracellulaires (c.-à-d., les organites). Echelle = 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : représentation schématique du protocole. Description schématique des protocoles utilisés pour préparer les endosomes extraits (A) et le cytosol extraits (B) et de surveiller la polymérisation de l’actine des endosomes in vitro (C). Surnageant (SN), tampon d’homogénéisation (HB), surnageant post-nucléaire (PNS), nucléaire pellet (NP) et paraformaldéhyde (PFA). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Nucléation et polymérisation de l’actine F sur Endosomes précoces In Vitro. Les Endosomes (A) purifiée à partir de Hela cellules exprimant GFP-Rab5 (vert) et HeLa cytosol ont été préparées séparément. Dans l’essai, endosomes précoces (EEs) ont été mélangés avec le cytosol, et le mélange est incubé pour indiqué fois. Le mélange était ensuite fixé, étiqueté avec la phalloïdine (rouge) à étiquette actine F et analysé par microscopie confocale à fluorescence. Bars : 10 µm (panneau supérieur) et 5 µm (panneau inférieur). (B) See purifiée à partir de Hela exprimant GFP-Rab5 (vert) et HeLa cytosol des cellules ont été préparées séparément. Ces extraits de cellules ont été incubées avec purifiée rhodamine-actine (rouge) de l’indiqués fois dans des chambres de microscope et ont été analysés par microscopie confocale. Echelle = 10 µm. (C) l’expérience a été réalisée que dans A. HeLa cytosol (sans See) et HeLa endosomes (vert) étiqueté avec GFP-Rab5 (sans le cytosol) ont été incubés séparément (panneaux de gauche et du milieu) ou ensemble (panneau de droite) pendant 30 min, fixe, étiquetée avec la phalloïdine (rouge) à étiquette F-actine et analysées par microscopie confocale à fluorescence. Echelle = 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : analyse du réseau d’actine. (A) flux de travail d’analyse de CellProfiler. (B) le nombre d’actine polymérisée ont été quantifiés par rapport au nombre des endosomes en utilisant le logiciel CellProfiler. Données sont médiane ± s.e.m. (n = 3). Les données sont des moyens ± s.d. (n = 3). 5 min et 15 min (ns P= 0.0736), 5 min ou 30 min (* P = 0.0195) et 15 min ou 30 min (ns P = 0.3129). (C)Endosomes précoces (EEs) purifiées à partir de cellules Hela exprimant le cytosol GFP-Rab5 et HeLa ont été préparées séparément, et le dosage a été effectué, comme dans la Figure 2 a. Les échantillons ont été fixés après 7 min. Le panneau central montre la micrographie même, avec le chevauchement des traces de structures d’actine F dessinés à l’aide de la NeuronJ plugin13 du logiciel ImageJ. Le panneau de droite montre les traces seulement. Echelle = 10 µm. représentation (D) de l’actine F structure séquence de numérotation utilisé dans la quantification avec logiciels ImageJ. (E) Quantification du nombre de filaments d’actine, tel que défini dans le C-D. Les données sont des moyens ± s.d. (n = 3). Rameaux primaires par rapport aux branches secondaires (ns P = 0.5262), des branches secondaires par rapport aux autres branches (ns P = 0.6815) et des rameaux primaires par rapport aux autres branches (ns P = 0.2254). Ouvrages d’art (F), la longueur de l’actine F et le nombre d’EEs par la structure de l’actine sont présentés comme exemples d’autres paramètres que peuvent être analysées avec la quantification définie dans C-D. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
L’actine joue un rôle crucial dans l’endosome membrane dynamique4,14. Nous avons déjà indiqué que la polymérisation et nucléation de l’actine se produisent dans les endosomes précoces, formant des petits correctifs d’actine F ou réseaux. Ces réseaux d’actine F est absolument requis pour le transport membranaire au-delà des endosomes précoces le long de la voie de dégradation. Intervenir à n’importe quelle étape de ce processus de nucléation et polymérisation empêche l’endosome maturation et donc transport en aval vers fin endosomes andlysosomes9,11,15. En particulier, nous avons utilisé le test décrit ci-dessus pour analyser les étapes séquentielles de la polymérisation de l’actine F sur les endosomes précoces et de caractériser le processus au niveau moléculaire.
Dans ces expériences, endosomes précoces sont marqués avec GFP-RAB5 in vivo, purifiées par fractionnement subcellulaire et incubés dans un tube à essai en présence de cytosol pour F-actine polymérisation in vitro. À l’heure souhaitée, la réaction est arrêtée et le mélange réactionnel est transféré sur une lame microscopique pour analyse par microscopie de fluorescence, utilisant la phalloïdine d’étiqueter l’actine-F. En utilisant cette stratégie expérimentale, nous avons montré que l’annexine A2 est nécessaire pour la nucléation de l’actine F sur des endosomes précoces, ainsi que SPIRE1, tandis que ARP2/3 médie F-actine, ramification, comme prévu. Nous avons également montré que la moésine et cortactin sont requis pour la formation des réseaux F-actine qui médient biogenèse VME/MVB et maturation le long de la voie de dégradation des cellules de mammifères9,11.
Il est important de garder à l’esprit que, bien que les faibles niveaux de façon ectopique expresse RAB5 ne modifient pas les endosomes à n’importe quel degré significatif10, cette petite GTPase est un important régulateur du début endosome membrane dynamique16,17 . Dans certaines expériences, il peut donc être approprié d’étiquette endosomes dans l’essai à l’aide de protocoles alternatifs. Par exemple, des endosomes précoces peuvent être commodément étiquetés à l’aide de traceurs fluorescents mégacaryocyte, comme épidermiques facteur de croissance ou transferrine4,14.
Il est à noter également qu’il est techniquement difficile de filaments d’actine chaque image avec la microscopie confocale conventionnelle. Par conséquent, nous nous référons aux structures de l’actine F tout au long du texte pour décrire les réseaux de l’actine sur endosomes. En conséquence, nous estimons que la formation d’un réseau d’actine F peut être quantifiée avec plus de précision en mesurant la surface de fluorescence des réseaux plutôt que de leur intensité.
Il n’est pas facile d’écarter complètement la possibilité que l’activité de nucléation de l’actine observée in vitro est médié par une autre structure ou organite qui demeure lié à RAB5 endosomes durant la purification. Toutefois, une telle contamination est très peu probable. Tandis que certains organites purifient conjointement sur des gradients à cause des propriétés physiques similaires, ils n’ont pas tendent à restent quantitativement liés les uns aux autres après purification. En outre, l’activité de nucléation de l’actine dépend strictement annexine A24,14, qui est présent sur des endosomes précoces contenant RAB514. Enfin, nous trouvons que structures F-actine sont associés sélectivement RAB5 endosomes in vivo et ne se trouvent pas sur les autres endosomes ou les autres membranes cellulaires4,14. En conclusion, l’activité de nucléation de l’actine est probablement associées RAB5 endosomes, puisque cette activité co purifie et co se localise avec RAB5 endosomes.
Dans cet essai, tout comme dans les autres essais que reconstituer les réactions biochimiques complexes qui contrôlent que la dynamique des endosomes16 ou autres membranes18 et qui est effectuée dans un tube à essai, il est important de veiller à ce que la préparation des extraits cellulaires sont optimales. Les cellules doivent être homogénéisés dans des conditions douces de limiter les dommages aux endosomes et autres organites, particulièrement les noyaux et les lysosomes. En outre, endosome fractions doivent être conservées sur la glace dans des conditions qui réduisent au minimum le stress osmotique et ionique, ainsi que la polymérisation de l’actine spontanée. Dans supplémentaires concentrations relativement élevées de fraction de l’endosome (≥ 0,1 mg/mL) et le cytosol (≥ 3 mg/mL) sont nécessaires pour la polymérisation d’actine F adéquate endosomes et détection, comme indiqué aux étapes 3.13 et 4.4, respectivement. De même, il est important de faire le test avec un 01:10 ratio de l’endosome au cytosol (protéine : protéine), comme indiqué dans l’étape 5.1.1. Enfin, pipetage après polymérisation de l’actine (c.-à-d., d’ajouter les PFA et la phalloïdine) devrait être fait très doucement pour éviter de s’effondrer ou de casser le réseau d’actine.
Si nécessaire, l’analyse de la polymérisation d’actine in vitro peut également effectué directement dans un microscope imaging chambre, après avoir ajouté la rhodamine-actine purifiée au mélange de dosage, de limiter les perturbations mécaniques des réseaux actine polymérisées sur les endosomes (voir étape 5.2.3 et Figure 2). Dans ce cas, il est préférable de régler l’extrait à diffusion limitante de saccharose de 26,5 % (0,85 M) (indice de réfraction de 1,375) et brownien comme motion (étape 5.2.3), et d’enlever des agrégats possibles de purifié rhodamine-actine par ultracentrifugation avant utilisation. Nos observations que moésine contrôle la création de réseaux d’actine F sur endosomes ont été récapitulées entièrement à l’aide de cette version alternative de notre essai4,14.
Soit la version de notre protocole, dans le tube à essai ou dans la salle d’imagerie, est optimale pour une analyse globale de la nucléation de l’actine F et polymérisation sur endosomes. Cependant, il n’est pas facile de suivre le procédé de polymérisation de l’actine dans le temps en utilisant cette approche, en partie parce que les endosomes ne sont pas immobiles. Par conséquent, il n’est pas facile de contrôler la croissance des filaments individuels et donc à déterminer l’historique du réseau d’actine. Par exemple, il peut être difficile de discriminer l’actine F ramification de réticulation. Cependant, nous sommes confiants que les conditions pour surveiller la polymérisation de l’actine-F en temps réel peuvent être améliorées dans la salle d’imagerie en optimisant les conditions pour immobiliser des endosomes. De même, il sera intéressant de suivre la polymérisation de l’actine-F de membranes artificielles à l’aide de composantes purifiées. En fait, nous avons montré précédemment que la polymérisation et nucléation de l’actine F peuvent se produire sur des liposomes après liaison tfacteur de nucléation HE annexine A2 sur le liposome bicouche11. Cette stratégie sera utile à disséquer davantage le rôle des lipides spécifiques et des protéines dans le processus de nucléation et de la polymérisation d’actine F et de caractériser les composants minimes nécessaires pour former un réseau d’actine-F sur la membrane endosomale. Enfin, nous estimons que cette stratégie sera très utile d’étudier d’autres procédés d’actine-F-dépendante qui se produisent sur la membrane de l’endosome, particulièrement le recrutement et la mobilisation de la machine retromer/cycle de lavage.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.
Acknowledgments
Prise en charge a été reçue de la Swiss National Science Foundation ; le programme Suisse Sinergia ; le helvético-polonaise recherche Programme (PSPB-094/2010) ; PRN en biologie chimique ; et LipidX de l’initiative Suisse SystemsX.ch, évaluée par la Swiss National Science Foundation (à G.). M. O. a été soutenu par une bourse à long terme de l’EMBO (Fota-516-2012).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71380 | |
| KCl | Acros Organics | 196770010 | |
| KH2PO4 | AppliChem | A1042 | |
| Na2HPO4 | Acros Organics | 424370025 | |
| Hepes | AppliChem | A3724 | |
| Magnesiun acetate tetrahydrate | Fluka | 63047 | |
| Dithiothreitol (DTT) | AppliChem | A2948 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 10125 | |
| NaOH | Fluka | 71690 | |
| Sucrose | Merck Millipore | 107687 | |
| Leupeptin | Roche | 11017101001 | |
| Pepstatin | Roche | 10253286001 | |
| Aprotinin | Roche | 10236624001 | |
| Paraformaldehide | Polysciences. Inc | 380 | |
| Alexa Fluor 555 phalloidin | Molecular Probes | A34055 | |
| Actin rhodamine | Cytoskeleton. Inc | APHR-A | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | poly(vinyl alcohol), Mw ~31 000 |
| DABCO | Sigma-Aldrich | D-2522 | |
| Tris-HCl | AppliChem | A1086 | |
| β-casein | Sigma-Aldrich | C6905 | |
| Filter 0.22 μm | Millex | SL6V033RS | |
| Round 10 cm dishes for cell culture | Thermo Fisher Scientific | 150350 | |
| Plastic Pasteur pipette | Assistent | 569/3 40569003 | |
| 15-mL polypropylen tube | TPP | 91015 | |
| Hypodermic Needle 22G Black 30mm | BD Microlance | 300900 | |
| Sterile Luer-slip 1mL Syringes without needle | BD Plastipak | 300013 | |
| Micro glass slides | Assistent | 2406 | |
| 18 x 18-mm glass coverslip | Assistent | 1000/1818 | |
| SW60 centrifuge tube | Beckman coulter | 344062 | |
| TLS-55 centrifuge tube | Beckman coulter | 343778 | |
| 200-μL yellow tip | Starlab | S1111-0706 | |
| 1,000-μL Blue Graduated Tip | Starlab | S1111-6801 | |
| 1.5-mL test tube | Axygen | MCT-175-C 311-04-051 | |
| 18-mm diameter round coverslip | Assistent | 1001/18 | |
| 35-mm diameter round dish with a 20-mm glass bottom (0.16 - 0.19 mm) | In vitro Scientific | D35-20-1.5-N | |
| Refractometer | Carl Zeiss | 79729 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Sorvall WX80 Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46900 | |
| Tabletop ultracentrifuge | Beckman coulter | TL-100 | |
| SW60 rotor | Beckman coulter | 335649 | |
| TLS-55 rotor | Beckman coulter | 346936 | |
| Confocal microscopy | Carl Zeiss | LSM-780 | |
| Fugene HD transfection reagent | Promega | E2311 | |
| Protein assay reagent A | Bio-Rad | 500-0113 | |
| Protein assay reagent B | Bio-Rad | 500-0114 | |
| Protein assay reagent S | Bio-Rad | 500-0115 | |
| Cell scraper | Homemade | Silicone rubber piece of about 2 cm, cut at a very sharp angle and attached to a metal bar or held with forceps | |
| Refractometer | Carl Zeiss | ||
| Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Sigma-Aldrich | M0643 | |
| FCS | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Thermo Fisher Scientific | 11140-035 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| pH Meter 691 | Metrohm | ||
| ImageJ software | NIH, Bethesda MD |
References
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